Procedimientoparadeterminarlapotenciabactericidaenselladores

Procedimiento para determinar la potencia bactericida en selladores.
PRUEBAS BIOLÓGICAS
Evaluación de la concentración mínima inhibitoria.
Prueba para determinar la difusión en agar del sellador y el halo de inhibición del producto
hacia el crecimiento bacteriano sobre el agar. El principio y objetivo de esta prueba consiste
en preparar una placa de Petri de 9 cm de diámetro previamente esterilizada y verter el agar
previamente preparado (agar Mueller Hinton). Permitir la solidificación del agar. Preparar el
caldo de cultivo bacteriano a una concentración de 10 8 UFC/ ml. Puede ajustar esta
concentración utilizando el método de MacFarland a 0.5. Diluir la suspensión bacteriana 1:
10 UFC/ml. Colocar de 1 a 2 ul de la suspensión bacteriana 10 7 en una área con diámetro de
5-8 mm para obtener una concentración final de la suspensión bacteriana de 10 4 UFC por
área. El inóculo se homogeniza en la placa mediante la aplicación de un hisopo estéril.
En forma separada se preparan y esterilizan los cilindros de acero inoxidable por autoclave.
Cuando los productos a probar son de alta densidad (Como los selladores CondoVac), se
sustituyen los cilindros de acero por cilindros de plástico (parte superior de puntas azules
para micro pipeta de 100 microlitros). Se dejan enfriar y se colocan sobre la superficie del
agar ya inoculado. Por la parte superior del cilindro se depositan 100 ul de CondoVac y
CondoVac PRE, se permite la interacción incubando a 37 ° C durante 12 horas. Se procede
a la lectura del halo de inhibición del crecimiento bacteriano con una regla, midiendo el
diámetro del mismo.
Desafío contra gérmenes Gram positivos.
Se preparan cultivos jóvenes de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes , en cajas
de Petri conteniendo agar Müller Hinton. En el momento de la siembra, se colocan cilindros
de acero inoxidable que quedan en contacto con la superficie del Agar. En los cilindros se
depositan 100 ug. del producto con potencial efecto bactericida y se permite su libre difusión
sobre el agar. En caso de que el producto tenga efecto bactericida o bacteriostático, el
crecimiento bacteriano se detiene en los límites de difusión del halo sobre el agar. El halo de
inhibición se mide en su diámetro y es correspondiente en su medida con la capacidad de
inhibir el crecimiento bacteriano.
Desafío contra gérmenes Gram negativos.
Se preparan cultivos jóvenes de Escherichia coli , Pseudomona aureoginosa, Proteus
vulgaris en agar Müller Hinton. Se procede a la siembra de la caja con la colocación de
cilindros de acero inoxidable con la aplicación del producto bactericida y a la incubación
durante 24 horas a 37 o C. Se realizan las lecturas del halo de inhibición.
Procedimiento para determinar reto bacteriano contra tiempos.
1. Preparar suspensión de bacterias (E.coli y Staph.aureus ), a una densidad de 0.5
según Macfarland.
2. Colocar en tubo vacutainer 1 ml de producto de prueba (Un tubo para el desafío con
E.coli y otro para Staph.aureus .
3. Marcar una caja de petri con Agar Mueller-Hinton en secciones de manera que se
tenga espacio suficiente para sembrar los desafíos en sus diferentes tiempos.
4. Comenzar el reto (Producto-Bacteria), agregando 100 ul de la suspensión bacteriana
al mililitro de producto prueba. A partir de este instante empieza a correr el tiempo de
prueba. Durante 10 segundos se homogeniza el Producto-Bacteria para que a los 15
segundos se tome una azada y se siembre en la placa, y así sucesivamente en los
tiempos 30, 45 y 60 segundos.
5. La placa sembrada se incuba por 18 – 24 horas a 37 °C.
6. Se leen los resultados;
a. Presencia de colonias significa no inhibición a ese tiempo.
b. Ausencia de colonias significa inhibición completa desde los 15 segundos.