Efecto del espesor y del pH del agar Mueller

Rev Panam Infectol 2008;10 (4 Supl 1):S64-69
Efecto del espesor y del pH del agar Mueller-Hinton
en el antibiograma
Effect of Mueller-Hinton agar thickness and pH in the antibiogram
Esteban B. Riera1
Gustavo Chamorro1
Miriam Noemí Zárate1
Miryan Falcón1
Rosana Franco1
Departamento de Bacteriología Referencial,
Laboratorio Central de Salud Pública, Ministerio de Salud Pública y Bienestar Social, Asunción, Paraguay.
1
Rev Panam Infectol 2008;10 (4 Supl 1):S64-69
Resumen
Se determinó el efecto del pH y espesor del agar Mueller-Hinton
(AMH) en los diámetros de los halos de inhibición para determinar si
los cambios en uno o ambos elementos afecta la interpretación del
antibiograma. El efecto del espesor del agar se ensayó con cepas de
Staphylococcus aureus ATCC 25923 frente a oxacilina, vancomicina,
trimetoprima-sulfametoxazol, tetraciclina, gentamicina y eritromicina; Escherichia coli OPS 101 frente a ciprofloxacina, imipenem,
gentamicina y cefotaxima, y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
frente a ciprofloxacina, piperacilina, gentamicina y ceftazidima. Para
medir el efecto del pH, se ensayó también cefoxitina con cepas de
S. aureus ATCC 25923. Se encontró que el pH del agar afecta los
halos de inhibición según el antibiótico de que se trate, dando halos
más grandes que lo establecido por las normas para gentamicina,
ciprofloxacina y eritromicina con un pH alcalino y más pequeños con
un pH ácido. Por otra parte, el halo para piperacilina y cefoxitina fue
más grande con pH ácido y más pequeño con pH alcalino. No se
vieron afectados los diámetros del halo de inhibición de vancomicina,
trimetoprima-sulfametoxazol, imipenem, cefotaxima, ceftazidima y
piperacilina. La temperatura adecuada para medir el pH del AMH
fue de 25 °C ± 3 °C. La variación del pH del agar no afectó la interpretación del antibiograma en las cepas estudiadas, excepto en el
caso de la combinación E. coli OPS 101 con gentamicina a un pH
de 5,97 y 6,52, que dio un resultado falso resistente. El espesor
afectó por igual a todos los antimicrobianos ensayados, generando
halos más pequeños con un agar Mueller-Hinton de más de 4 mm
de espesor, y halos más grandes cuando el agar tenía menos de
4 mm. La variación del espesor del agar no afectó la interpretación del
antibiograma de las cepas estudiadas, excepto cuando se ensayaron
cepas de E. coli OPS 101 frente a cefotaxima, en que se obtuvo un
resultado falso sensible con un agar de 2,1 mm.
Palabras clave: Antibióticos, antimicrobianos, pruebas de laboratorio.
Abstract
The effect of Mueller-Hinton agar (MHA) thickness and pH on
the diameter of the zone of inhibition was studied to determine
whether changes in one or both elements affect interpretation of
antibiotic sensitivity profiles. The study considered the effect of
agar thickness on the resistance of Staphylococcus aureus strain
ATCC 25923 to oxacillin, vancomycin, trimethoprim-sulfametho-
64
Riera EB, et al • Efecto del espesor y del pH del agar...
xazole, tetracycline, gentamicin, and erythromycin; of
Escherichia coli OPS 101 to ciprofloxacin, imipenem,
gentamicin and cefotaxime; and of Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853 to ciprofloxacin, piperacillin,
gentamicin and ceftazidime.
In order to measure the effect of pH, cefoxitin was
also tested with S. aureus strain ATCC 25923. It was
found that the effect of agar pH on the zone of inhibition
varies with the antibiotic. With alkaline pH, the zones of
inhibition were larger than those established by the standards for gentamicin, ciprofloxacin, and erythromycin.
Smaller zones of inhibition were found with acidic pH.
In addition, the zone of inhibition for piperacillin
and cefoxitin was larger with acidic pH and smaller
with alkaline pH. The diameter of the zone of inhibition for vancomycin, trimethoprim-sulfamethoxazole,
imipenem, cefotaxime, ceftazidime, and piperacillin
was not affected. The appropriate temperature for measuring the pH of MHA is 25°C ± 3ºC. The variations in
agar pH did not affect interpretation of the antibiotic
sensitivity profile studied, except in the case of strain
E. coli OPS 101 with gentamicin combination at a pH
of 5.97-6.52, which recorded a false resistant result.
All of the antimicrobial drugs tested were equally
affected by agar thickness. Smaller zones of inhibition
were produced with Mueller-Hinton agar thickness of
more than 4 mm, and larger zones of inhibition were
detected when agar thickness was less than 4 mm. The
variations in agar thickness did not affect interpretation of the antibiotic sensitivity profile for the strains
studied, with the exception of the resistance of strains
of E. coli OPS 101 to cefotaxime. In this case, a false
sensitive result was obtained with 2.1 mm agar.
Key words: Kirby-Bauer, antibiotics, antimicrobials,
laboratory testing
Introducción
La prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos
de difusión por disco (antibiograma de Kirby-Bauer)
es actualmente de rutina y ampliamente usada en el
laboratorio de bacteriología. Los microbiólogos la han
utilizado por casi siete décadas,(1,2,3,4) e incluso ha sido
adoptada por redes de vigilancia de la resistencia a los
antimicrobianos nacionales e internacionales.(5) Uno de
los aportes más significativos a la bacteriología clínica
fue realizado por Bauer, Kirby, Sherrys y Turck(3) al
desarrollar una técnica de difusión con discos de una
sola carga por antibiótico, que puede interpretarse
cuantitativamente. La técnica, comúnmente denominada prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos
por disco de Kirby Bauer (KB), tiene por finalidad
correlacionar el diámetro del halo de inhibición con
la sensibilidad de un microorganismo a un antibiótico
determinado en una infección clínica.
En 1971, se realizó un estudio colaborativo para
estudiar los factores que influyen en la prueba de
sensibilidad a los antimicrobianos por disco,(3) como
son el tipo de agar que se debe utilizar, la carga de
los discos, el tiempo y la temperatura de incubación,
el espesor y pH del agar, el inóculo bacteriano y el
modo de lectura del halo de inhibición. El método fue
adoptado por el entonces llamado Comité Nacional de
Estándares de Laboratorio Clínico (National Committee
on Clinical Laboratory Standards, NCCLS).(6)
Muchos laboratorios de análisis bacteriológico de
América Latina preparan sus propias placas de agar
Mueller-Hinton a partir de polvo comercial. El fabricante
del medio de cultivo es responsable de que el medio
esté libre de timina/timidina y tenga el número adecuado
de cationes (calcio, magnesio, zinc), pero el laboratorio
de microbiología debe cerciorarse de que así sea. En el
laboratorio también se debe controlar el pH y espesor
del agar en las placas de cada lote que se prepare. Estos
medios no siempre reúnen los requerimientos de calidad
para el antibiograma, sobre todo en lo que respecta al
pH y al espesor del agar en las placas, aunque en varios
estudios se ha demostrado que esos elementos afectan
el diámetro del halo de inhibición.(1) El CLSI, que ha
establecido los estándares de desempeño de la prueba
de Kirby-Bauer,(7) fijó un rango de 7,2 a 7,4 para el pH
del agar, medido a temperatura ambiente y después de
su solidificación. El espesor del agar en las placas de
Petri debe ser de 4 mm, lo que se logra con un volumen
de AMH de 60mL a 70 mL de medio para placas de
150 mm de diámetro, y de 25 mL a 30 mL para placas
de 85-100 mm de diámetro interno.
El objetivo del presente trabajo es determinar si
el pH y espesor del AMH afectan los resultados de la
interpretación del antibiograma cuando sus valores
están por fuera de los estandarizados.
Materiales y método
Medio: Para todo el estudio se utilizó un mismo lote
de agar Mueller-Hinton de marca Oxoid, lote No.382853,
con fecha de vencimiento abril de 2010.
Cepas de estudio: Staphylococcus aureus ATCC
25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y
Escherichia coli OPS 101. La cepa de E. coli OPS
101 es la que envía la Organización Panamericana
de la Salud (OPS) a los laboratorios de referencia nacionales para la evaluación externa de calidad. Esta
cepa tiene una betalactamasa tipo Amp C plasmídica
(cefotaximasa).
Discos: Se utilizaron discos de antimicrobianos
de la marca Oxoid: oxacilina (1 µg), gentamicina
(10 µg), eritromicina (15 µg), trimetoprima-sulfametoxazol (1,25/23,75 µg), tetraciclina (30 µg), vancomicina (30 µg), ciprofloxacina (5 µg), cefotaxima (30 µg),
65
Rev Panam Infectol 2008;10 (4 Supl 1):S64-69
imipenem (10 µg), piperacilina (100 µg), ceftazidima
(30 µg), cefoxitina (30 µg).
Preparación del agar Mueller-Hinton con diferentes
valores de pH: Se prepararon placas de AMH con pH
de 6,0 a 8,0. Las mediciones se realizaron con un
potenciómetro Mettler Toledo modelo MP220, con
un electrodo de superficie plana marca Mettler Toledo Modelo In Lab 426 y Sonda ATC de compensa­
ción automática de temperatura, modelo NTC 30Kv
(51300164), también de marca Mettler Toledo. Las
mediciones se realizaron a 25°C para determinar el
pH final del agar Mueller-Hinton.
Efecto de la temperatura en la medición del pH del
AMH: Teniendo en cuenta que hay laboratorios que
preparan su propio AMH miden el pH cuando el medio
está aún fundido (aproximadamente 40°C a 45°C)
o a temperatura ambiente, se evaluó el efecto de la
temperatura en la determinación del pH del agar. Con
ese objeto se realizaron mediciones de pH a partir de
40°C (AMH fundido) con intervalos de 1,0°C, a medida
que el medio se iba solidificando.
Preparación del AMH con diferentes espesores: Para
preparar el AMH en placas de Petri de 85 mm de
diámetro interno, se colocaron los siguientes volúmenes de agar: 14,0 mL, 19,4 mL, 22,6 mL, 24,5 mL,
25,8 mL, 27,1 mL, 29,0 mL, 32,2 mL y
38,6 mL, obtenién­dose espesores de 2,1 mm, 2,9 mm,
3,5 mm, 3,8 mm, 4,0 mm, 4,3 mm,4,6 mm, 5,2 mm, y
6,2 mm, respectivamente. Estos espesores son el
promedio de 10 mediciones por placa. Para medir el
espesor del AMH se utilizó un calibre con precisión de
0,1 mm y un micrómetro marca Peacock (de fabricación japonesa), con 0,01 mm de precisión.
Método del antibiograma: Se utilizó el método
propuesto por el CLSI.(8) Un día antes del experimento
se aislaron las cepas de estudio en agar sangre, previamente incubadas durante 4 horas a 35°C. Se utilizó
AMH de diferente espesor y pH, a fin de medir el efecto
de los cambios en esas variables. Se colocaron hasta
seis discos por placa y se incubaron a 35°C durante
16 a 18 horas. Cada antibiograma se realizó cinco
veces distintas en las mismas condiciones. La lectura
de los halos de inhibición fue realizada por dos o tres
operadores, en consecuencia, los resultados son el
promedio de lectura de 10 a 15 placas por dos o tres
operadores diferentes.
Para la interpretación de los antibiogramas se
utilizaron las tablas del CLSI.(7)La experiencia del laboratorio indica que las diferencias en la lectura del
diámetro del halo de inhibición por un solo operador
son de ± 1 mm.
Espesor del agar de Mueller-Hinton: Un mismo operador midió 10 veces cada espesor de agar diferente
en una misma placa, utilizando calibre y micrómetro,
66
no encontrándose diferencia estadísticamente significativa en las lecturas (P < 0,05). Sin embargo, la
medición con micrómetro fue más precisa (coeficiente
de variación [CV] = 2,43) que la realizada con calibre
(CV = 3,32). El intervalo de confianza (I.C.) de 95%
que se logró en la lectura con calibre y con micrómetro
fue de ± 0,20 mm y ± 0,16 mm, respectivamente.
Resultados
Efecto de la temperatura en la medición del pH del
AMH
A medida que la temperatura del AMH disminuye,
el pH aumenta. La figura 1 muestra que a 25ºC, el pH
de este agar fue de 7,25. Sin embargo, a 28°C, el pH
fue de 7,18, fuera del rango establecido por el CLSI
(de 7,2 a 7,4).(7) El pH del AMH aun fundido (40°C)
fue de 6,79. Por ejemplo, si a 40ºC se lleva el pH del
agar a 7,3, cuando el agar esté a 25°C tendrá un pH
alcalino, de aproximadamente 7,8, fuera del rango
aceptable (datos no mostrados). La figura 1 muestra
datos representativos de 10 ensayos.
Efecto del pH del AMH en el halo de inhibición del
antibiograma
El tamaño del halo de inhibición en el antibiograma se ve afectado por el pH del agar, dependiendo
del antibiótico ensayado (cuadros 1, 2 y 3). En este
estudio, los antimicrobianos más afectados por el pH
fueron oxacilina, cefoxitina, gentamicina y eritromicina cuando se ensayaron con cepas de S. aureus;
gentamicina, cuando se ensayó con la cepa de E. coli,
y gentamicina y ciprofloxacina, cuando el ensayo se
hizo con cepas de P. aeruginosa. De estos antimicrobianos, oxacilina y cefoxitina son los que dieron un
diámetro de halo de inhibición más grande con un pH
< 7,3 cuando se ensayaron con cepas de S. aureus
(véase el cuadro 1). A un pH < 7,3, las pruebas que
dieron halos de inhibición más pequeños fueron las de
gentamicina y eritromicina con S. aureus (cuadro 1);
gentamicina con E. coli (cuadro 2) y gentamicina y
ciprofloxacina con cepas de P. aeruginosa (cuadro 3).
Con un pH > 7,3 se obtuvieron se obtuvieron diámetros
del halo de inhibición más pequeños para oxacilina y
cefoxitina frente a cepas de S. aureus, y más grandes
para gentamicina y eritromicina frente a cepas de
S. aureus (cuadro 1), gentamicina frente a cepas de
E. coli (cuadro 2) y gentamicina y ciprofloxacina frente
a las de P. aeruginosa (cuadro 3). Sin embargo, las
variaciones del pH del AMH con respecto al pH estándar de 7,3 no afectaron los halos de inhibición de
vancomicina y trimetoprima-sulfametoxazol cuando se
ensayaron con la cepa de S. aureus; los de imipenem
y cefotaxima con la cepa de E. coli y el de ceftazidima
con la de P. aeruginosa.
Riera EB, et al • Efecto del espesor y del pH del agar...
Figura 1. Efecto de la temperatura en la medición del
pH del agar Mueller-Hinton
cefotaxima e imipenem en la cepa de E. coli no fue
afectada por variaciones de pH en el rango estudiado,
por lo que en su interpretación siempre coincidió con
el diámetro del halo de las pruebas realizadas con el
pH estándar. La variación del pH de 6,31 a 7,77 no
afectó el diámetro del halo de inhibición de las cepas
de P. aeruginosa con piperacilina ni ciprofloxacina
(cuadro 3). Sin embargo, el diámetro resultante de la
prueba de esas cepas con gentamicina a pH de 7,77
cayó fuera del rango por una diferencia de 0,7 mm;
asimismo, con ceftazidima el diámetro resultante
estuvo fuera del rango ATCC para pH entre 6,31 y
7,77 por hasta 1 mm, diferencia que está dentro de
las variaciones propias del antibiograma. En ninguna
circunstancia los cambios en el pH modificaron la interpretación clínica de los antimicrobianos ensayados
con la cepa de P. aeruginosa.
Efecto del pH del AMH en la interpretación del
antibiograma: En el caso de las cepas de S. aureus
se observaron diámetros del halo que estaban fuera
del rango aceptable para oxacilina a pH de 7,13 y
8,11; cefoxitina a pH 6,30 y 6,61, y eritromicina a
pH 6,30, 6,61 y 8,11 (cuadro 1). De los casos anteriores, los cambios de interpretación del antibiograma
de oxacilina a pH de 7,13, cefoxitina a pH de 6,61
y eritromicina a pH de 6,61 estuvieron a menos de
1 mm del rango ATCC aceptable, o sea, dentro del
error propio de lectura del antibiograma. Al usar AMH
con pH diferentes del estándar (7,2 a 7,4), se produjeron cambios en la interpretación del antibiograma
de las cepas de E. coli con gentamicina a pH 5,97 y
6,52 (sensible a resistente) (cuadro 2). La acción de
Efecto del espesor del AMH en el halo de inhibición
del antibiograma
Con cada espesor del AMH se realizaron cinco
antibiogramas para cada una de las siguientes combinaciones de microorganismo y antibiótico: S. aureus y
oxacilina, vancomicina, trimetoprima-sulfametoxazol,
tetraciclina, gentamicina y eritromicina (cuadro 4);
E. coli y ciprofloxacina, imipenem, gentamicina y cefotaxima (cuadro 5); y P. aeruginosa y ciprofloxacina,
piperacilina, gentamicina y ceftazidima (cuadro 6). A
medida que aumentó el espesor del AMH, disminuyeron los diámetros del halo de inhibición; inversamente,
a menor espesor del AMH se observó una tendencia al
aumento del tamaño del halo. Asimismo, se observó
mayor variación en el diámetro
del halo de inhibición cuando
Cuadro 1. Halos de inhibición e interpretación del antibiograma de la cepa de Staphylococcus aureus
el agar de Mueller-Hinton
ATCC 25923, según el pH y espesor del agar Mueller-Hinton
tenía un espesor de menos
Tamaño del halo de inhibición (en mm)*
Oxacilina
Vancomicina Trimetoprima- Cefoxitina
Gentamicina Eritromicina
de 4,0 mm. Esta asimetría es
pH del agar
(IC = 17-21) ‡ sulfametoxazol (IC = 24-30) ‡ (IC = 19-27) ‡ (IC = 22-30) ‡
Mueller-Hinton (IC = 18-24)‡
marcada al probar la cepa de
(IC = 24-32) ‡
S. aureus con gentamicina y
8,11
16,8†
19,8
30,7
25,7
29,8†
32,4†
7,33
18,5
18,4
31,0
28,0
25,1
27,5
vancomicina (cuadro 1), la de
7,18
18,2
18,9
31,8
28,5
24,4
25,4
E. coli con ciprofloxacina, gen7,13
17,5†
18,0
30,8
28,1
24,4
25,8
7,00
18,6
19,0
31,1
29,6
23,4
25,5†
tamicina y cefotaxima (cuadro
6,61
19,3
19,1
30,5
31,0†
21,2
21,7†
2) y la de P. aeruginosa con
6,30
20,1
19,4
29,8
33,8†
20,1
19,5†
imipenem (cuadro 3).
Espesor del agar Tamaño del halo de inhibición (en mm)*
(en mm)
6,2
5,2
4,6
4,3
4,0
3,8
3,5
2,9
2,1
17,3†
18,2
19,6
19,7
18,5
20,1
20,1
20,5
23,4
19,5
19,2
19,8
19,5
19,7
19,9
19,8
20,5
21,9†
31,8
33,8†
36,3†
37,5†
32,0
35,6†
36,2†
38,0†
38,0†
Tetraciclina
29,8
31,0†
33,1†
32,0†
30,0
31,6†
31,6†
34,2†
33,8†
25,7
24,5
25,4
25,4
25,5
26,6
25,5
27,3†
28,7†
26,8
27,1
29,1
28,6
27,9
30,1
29,2
29,8
31,0
*Excepto donde se indica lo contrario (†), los halos de inhibición estuvieron dentro del rango; ‡ IC (Interpretación clínica). Para la interpretación
clínica se usaron las tablas del CLSI. Todos los resultados fueron sensibles al antibiótico correspondiente. Rangos aceptables de halos para la
cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 e interpretación clínica según las tablas CLSI.(7)
Efecto del espesor del
AMH en la interpretación del
antibiograma: Al ensayar oxacilina con la cepa de S.
aureus con un espesor de
agar de 6,2 mm, el diámetro del halo cayó fuera del
rango ATCC, al igual que con
vancomicina y un espesor de
67
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Cuadro 2. Halos de inhibición e interpretación clínica del antibiograma de la cepa Escherichia coli OPS 101, según el pH y el espesor
del agar Mueller-Hinton
Tamaño del halo de inhibición (en mm)
Interpretación clínica*
Gentamicina Cefotaxima Imipenem
pH del agar
Mueller-Hinton
7,63
22,1/S
7,33
18,0/S
7,15
16,9/S
7,13
17,1/S
7,03
16,0/S
6,52
12,5/R
5,97
10,6/R
Espesor del agar
6,2
17,4/S
5,2
17,2/S
4,6
17,4/S
4,3
17,7/S
4,0
17,7/S
3,8
17,3/S
3,5
17,7/S
2,9
19,0/S
2,1
21,0/S
21,1/I
21,2/I
20,7/I
20,3/I
20,9/I
20,8/I
20,6/I
26,7/S
28,6/S
25,7/S
29,9/S
27,0/S
27,0/S
26,3/S
18,5/I
19,0/I
19,7/I
19,9/I
20,0/I
20,6/I
20,7/I
21,6/I
22,8/S
26,8/S
26,4/S
26,8/S
26,9/S
27,4/S
27,1/S
28,2/S
28,8/S
29,0/S
Ciprofloxacina
6,0/R
6,0/R
6,0/R
6,0/R
6,9/R
7,5/R
7,8/R
8,3/R
10,6/R
* Para la interpretación clínica se usaron las tablas del CLSI. (7); R = resistente; I = [resistencia]
intermedia; S = sensible
6,2 mm y 2,1 mm; trimetoprima-sulfametoxazol con
un espesor de 2,1 a 3,8 y 4,3 a 6,2; tetraciclina con
un espesor de 2,1 a 3,8 y 4,3 a 5,2, y gentamicina y
un espesor de 2,1 a 2,9. Las pruebas con eritromicina no generaron halos que estuvieran fuera de rango
ATCC, al margen del espesor del agar (cuadro 1).
Las interpretaciones fuera del rango ATCC en el
caso de oxacilina, vancomicina y gentamicina pueden haberse debido a las variaciones propias del
método utilizado para el antibiograma. En cuando
a la cepa de P. aeruginosa, se observaron valores
del diámetro de inhibición fuera del rango ATCC en
las pruebas con ciprofloxacina y espesores de 2,1 y
2,9; gentamicina con espesor de 2,1 y ceftazidima
con espesor de 2,1 (cuadro 3).
Las variaciones del espesor del agar Mueller-Hinton
no cambiaron la interpretación clínica de las pruebas
con cepas de S. aureus ni P. aeruginosa, que dieron
resultados sensibles en todos los casos. En cuanto a
la cepa clínica de E. coli, no se observó cambio en
la prueba con ciprofloxacina, que resultó resistente
con todos los espesores de AMH. Tampoco hubo
cambios al probar imipenem y gentamicina, ante los
cuales las pruebas resultaron sensibles con todos los
espesores. Sí se observó cambio en la interpretación
de la sensibilidad de la cepa de E. coli a cefotaxima,
que pasó de intermedia a sensible con un espesor de
2,1 mm (cuadro 2).
Discusión
El antibiograma de Kirby-Bauer sigue siendo el
método de elección en muchos laboratorios, dadas
sus ventajas de costo y fácil ejecución, además de
68
Cuadro 3. Halos de inhibición e interpretación del antibiograma de la
cepa de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, según el pH y espesor
del agar Mueller-Hinton
pH del agar Tamaño del halo de inhibición (en mm),* por antibiótico
Piperacilina Ceftazidima Gentamicina Ciprofloxacina
Mueller(IC = 25-33)‡ (IC = 22-29) ‡ (IC = 16-21) ‡ (IC = 25-33) ‡
Hinton
7,77
30,3
30,1†
21,7†
30,6
7,42
32,6
30,0†
19,8
28,7
7,25
32,2
29,2†
20,1
29,7
7,00
32,6
29,8†
18,9
29,8
6,72
32,7
29,8†
17,2
27,4
6,31
32,8
29,7†
16,5
26,9
Espesor del agar (en mm)
6,2
27,7
27,1
17,6
29,0
5,2
27,9
27,6
18,0
30,6
4,6
29,1
28,5
18,1
30,9
4,3
29,5
29,5
18,8
31,1
4,0
29,8
29,3
19,2
32,0
3,8
29,8
28,9
18,9
32,6
3,5
30,1
28,9
19,2
32,2
2,9
29,7
29,0
19,4
33,7†
2,1
31,0
30,4†
21,2†
36,0†
Excepto donde se indica lo contrario (†), todos los halos de inhibición estuvieron dentro del rango;
‡ IC (Interpretación clínica). Para la interpretación clínica se usaron las tablas del CLSI. Todos los
resultados fueron sensibles al antibiótico correspondiente. Rangos aceptables de halos para la cepa
de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e interpretación clínica según las tablas CLSI.(7)
que sus resultados guardan buena correlación con el
diagnóstico clínico. No obstante, hay muchas variables que afectan el diámetro del halo de inhibición,
entre ellas, las relacionadas con el agar MuellerHinton (espesor; pH; y contenido de cationes, timina
y timidina). Los resultados también varían según el
operador que haga la lectura del halo de inhibición y
las condiciones en que se realiza tal lectura, como la
dirección de la luz, y las características del halo de
inhibición. Otras variables que afectan los resultados
son el método de análisis (forma de hisopado, temperatura, atmósfera y tiempo de incubación; fase de
crecimiento bacteriano; inóculo bacteriano y otros)(6).
En este trabajo evaluamos dos variables críticas: el
pH del agar Mueller-Hinton y su espesor. Según los
resultados obtenidos con las 3 cepas estudiadas
(2 cepas ATCC y 1clínica), el efecto del pH en el
diámetro del halo de inhibición depende más del
antimicrobiano ensayado que de la cepa estudiada.
Un pH fuera del rango aceptable (7,2 a 7,4) puede
aumentar, disminuir o dejar igual el diámetro del
halo, según el antibiótico ensayado. Así, por ejemplo,
el diámetro del halo de inhibición que resulta de la
prueba de gentamicina con la cepa de S. aureus es
más pequeño a pH ácido que el diámetro del halo de
inhibición obtenido en el rango aceptable de pH (7,2
a 7,4). El pH ácido, por otro lado, aumenta el diámetro del halo de inhibición a oxacilina y cefoxitina,
aunque no afecta el de vancomicina y trimetroprimasulfametoxazol.
En el presente estudio, los cambios de pH no
fueron suficientes para modificar la interpretación
clínica de las pruebas de las cepas estudiadas,
Riera EB, et al • Efecto del espesor y del pH del agar...
excepto en el caso de la de E. coli frente a gentamicina con pH 5,97 y 6,52, que dio resultados falsos
resistentes. El que los cambios de pH no afecten la
interpretación clínica de las pruebas con las cepas
estudiadas puede deberse, en parte, a que dos de
ellas son ATCC, sin mecanismos de resistencia y
con halos de inhibición muy distintos de los de las
categorías intermedia o resistente. La única cepa
clínica estudiada fue la de E. coli OPS 101 que tiene
una betalactamasa tipo Amp-C plasmídica, con resistencia intermedia a cefotaxima. No obstante, aun
en este caso, la interpretación no cambió, a pesar
de las variaciones de pH ensayadas. Esto se debe a
que la acción de cefotaxima no fue afectada por las
variaciones de pH del agar. Sin embargo, sí varió
la interpretación de la prueba con gentamicina, ya
que este antimicrobiano es muy sensible al pH del
medio. Se demostró también que la temperatura es
un factor importante en la medición del pH del agar
Mueller-Hinton, que debe estar a 25ºC (± 3ºC). El
efecto del pH sobre la actividad de un antibiótico
no sólo ocurre in vitro, según quedó demostrado en
este estudio, también puede ocurrir in vivo, como
por ejemplo, en el caso de un absceso bacteriano,
que es un ambiente ácido donde los aminoglucósidos
(gentamicina) son menos activos. Esta disminución
de actividad antibiótica in vivo podría comportarse
como “resistente in vivo”. El efecto del pH in vivo es
una de las causas de disociación clínico-laboratorial
que el médico debe tener en cuenta al extrapolar
el resultado del antibiograma al tratamiento de su
paciente.
El efecto del espesor del agar fue igual para todos
los antimicrobianos probados, generando un diámetro
de halo de inhibición menor mientras más espeso el
agar y más grande con menos espesor, al margen del
antimicrobiano y la cepa ensayados. Las variaciones
de espesor del agar que estaban entre 2,1 mm y
6,2 mm generaron diferencias en el tamaño del halo
insuficientes para cambiar la interpretación clínica de
los ensayos. La única excepción fue la prueba de la
cepa de E. coli OPS 101 frente a cefotaxima con un
espesor de agar de 2,1 mm, que dio un resultado falso
sensible en vez de resistencia intermedia. En varios
casos, las variaciones más grandes del diámetro del
halo de inhibición se obtuvieron con espesores de agar
de menos de 4 mm.
Las variaciones del pH y espesor del AMH generaron variaciones en el diámetro del halo de inhibición
de los antimicrobianos ensayados frente a las cepas
estudiadas. Solo en algunos casos estas variaciones
modificaron la interpretación clínica. A fin de evitar
errores de interpretación en el antibiograma, el pH y
espesor del AMH deben ser controlados en cada lote
de producción. El pH del AMH debería controlarse
con un potenciómetro a una temperatura de 25ºC. El
espesor del AMH debe ser controlado con un calibre
de 0,1 mm de precisión en el centro de la placa del
agar de Mueller-Hinton, y no con una regla en el borde
de la placa.
Agradecimiento
Este estudio no habría sido posible sin el aporte
financiero de la Agencia para el Desarrollo Internacional de los Estados Unidos de América, por medio
del subsidio LAC-G-00-04-00002-00 otorgado a la
Organización Panamericana de la Salud.
Los autores agradecen la colaboración de las señoras Estela Castro y Nelly Benítez en la preparación de
los medios de cultivos
Referencias
1. Informe Anual de la Red de Monitoreo/Vigilancia de la
Resistencia a los Antibióticos, 2005. Washington, DC:
Organización Panamericana de la Salud;2005 (OPS/
DPC/CD/332/05).
2. Vincent JC, Vincent HW. Filter paper disc modification
of the Oxford cup penicillin determination Proc Soc Exp
Bio Med 1994;55:162-164.
3. Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic
susceptibility testing by a standardized single disk method Am J Clinl Pathol 1966;45(4):493-496.
4. Bondi A, Spaulding EH, Smith DE, Dietz CC. A routine
method for the rapid determination of susceptibility
to penicillin and other antibiotics. Amer J Med Sci
1947;213:221-225.
5. Petersdorf RG, Sherris JC. Methods and significances
of in vitro testing of bacterial sensitivity to drugs. Am J
Med 965;39(5):766-779.
6. The National Committee for Clinical Laboratory Standards Performance Standards for Antimicrobial Disk
Susceptibility tests; Approved Standard – Eighth Edition.
Vol. 23, n. 1, 2003 .(NCCLS document M2 – A8).
7. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance
and standards for antimicrobial susceptibility testing.
Sixteenth informational supplement. Wayne:Clinical and
Laboratory Standards Institute; 2006 (CLSI document
M100-S26).
8. Ericsson HM, Sherris JC. Antibiotic sensitivity testing.
Report of an International Collaborative Study. Acta Path
Microbiol Scand Sect B 1971;(Suppl. 217):27-39.
Correspondencia
Esteban B. Riera
Venezuela esq. Florida - CP 1430
Asunción - Paraguay.
Tel. +595 21 292653; Fax +595 21 294999
e-mail: [email protected]
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