Agrobiotecnología. Curso 2011 Micropropagación comercial La micropropagación masiva en la práctica comercial Transparencias 3-22 En los últimos 20 años, el conocimiento sobre cómo propagar plantas creció en forma considerable. Sin embargo, no se han encontrado todavía métodos de producción a gran escala para la propagación masiva de plantas diferentes al método clásico de división de vástagos axilares. En la mayoría de las especies, esta técnica requiere una intensa labor de mano de obra en todos los estadios del cultivo de tejidos, especialmente en las etapas que requieren mayor manipulación: las etapas de iniciación del cultivo in vitro (Etapa I) y de la división de macollos e introducción de los plantines en recipientes con medio de cultivo semisólido (Etapa II). Estas tareas originan altos costos de mano de obra y hacen de la micropropagación masiva un proceso relativamente caro. A pesar de ello, las plantas micropropagadas siguen teniendo ventajas. Estas son: a) generación de vástagos pequeños a partir de pequeñas porciones de tejido vegetal (lo que economiza espacio físico); b) obtención de plantas libres de microorganismos contaminantes; c) clonado de especies difíciles de propagar vegetativamente; d) producción continua durante todo el año. La mayor desventaja son los altos costos implicados en establecer rutinariamente una operativa óptima de multiplicación en cada una de las especies y variedades de interés. Uno de los mayores riesgos del proceso se localiza en la etapa de aclimatación y rusticación de los plantines que provienen del cultivo in vitro. No existen muchas empresas dedicadas a la micropropagación comercial, ya que resulta más económico reproducir plantas por semilla botánica o por propagación vegetativa (“macropropagación”). La posibilidad de utilizar micropropagación se ve muchas veces limitada por los costos asociados a esta técnica. Algunas estimaciones indican que, si se lograse un 50% de reducción en los costos, la micropropagación masiva podría expandirse 10 veces respecto del volumen actual. Si la reducción de costos alcanzara un 90%, el mercado potencial se tornaría 1.000 veces mayor respecto del actual. Actualmente, la micropropagación masiva se focaliza en las especies que presentan dificultades para su propagación por técnicas convencionales, ya sea por su velocidad de crecimiento, por ser susceptibles a contaminaciones microbianas o fúngicas, por requerir la eliminación de contaminaciones virales o por la necesidad de obtener una gran cantidad de plantas homogéneas en un corto período de tiempo. Antes de emprender la clonación masiva, se deben considerar minuciosamente las características del material vegetal inicial (plantas madre; transparencia 6). Este debe ser óptimo, tanto desde el punto de vista fenotípico como sanitario. Un primer paso obligatorio es establecer fehacientemente la ausencia de patógenos. Si no se pudiese disponer de plantas madres sanas, existen varias estrategias efectivas para eliminar las enfermedades y lograr iniciar la micropropagación a partir de explantos sanos. Las características del explanto (meristemas, segmentos internodales, yemas, organogénesis, embriogénesis) se decidirán de acuerdo con la especie en cuestión y según los objetivos de la micropropagación. Deberá constatarse el aspecto morfológico de los vástagos regenerantes, así como ausencia de contaminantes en el medio de cultivo. Una vez establecida la estrategia de clonación, se procederá a obtener plantínes completos, implementando la etapa de enraizamiento. Esta puede efectuarse in vitro o ex vitro. Murashige, profesor de la Universidad de California (Riverside) definió inicialmente las tres etapas principales (Etapas I a III) de la multiplicación in vitro de plantas (transparencia 7). Esta definición se ha adoptado ampliamente tanto en investigación como en los laboratorios comerciales de cultivo de tejidos, ya que no sólo describen los pasos del procedimiento sino que también definen los puntos en que debe ser modificado el medio de cultivo. Deberg y Maene propusieron que el tratamiento y preparación de las plantas madres sea considerado una etapa separada y que por lo tanto sea llamada Etapa 0. Más tarde se definió la Etapa IV, en la cual las plantas son transferidas al ambiente ex vitro. Si bien las etapas sirven como guía general, no son aplicadas de manera rígida. Si el objetivo es reproducir plantas idénticas a las seleccionadas, lo ideal es iniciar el proceso con un tejido diferenciado como el meristema, los ápices caulinares o segmentos internodales (transparencia 8). En la medida de lo posible, se trata de no permitir la desdiferenciación de los tejidos, ya que ello aumenta la posibilidad de variantes somaclonales. Se puede partir del meristema propiamente dicho (2-3 mm) o aislar el meristema junto con los primordios foliares. Si solamente se cuenta con plantas madres infectadas, es posible sanearlas mediante exposición de los meristemas a altas temperaturas, o a sucesivos tratamientos con concentraciones crecientes de agentes desinfectantes. Estos procedimientos pueden resultar letales para porciones de tejido pequeñas, por lo que es conveniente realizarlos en paralelo con segmentos más grandes (meristema más primordios foliares). Si se parte de una planta sana factible de ser propagada por segmentos nodales, éstos se extraen y, se exponen a agentes desinfectantes. Luego se cultiva el material in vitro y se procede a su establecimiento y a su pasaje a la Etapa II. La transparencia 9 muestra meristemas de caña de azúcar en crecimiento cultivados en frascos separados para evitar la propagación de contaminaciones. De esta manera, si algún explanto no ha sido correctamente desinfectado en la etapa inicial, se evita que la contaminación alcance a otros explantos limpios. Las características de la desinfección inicial implican una solución de compromiso entre lograr la eliminación de todos los microorganismos externos y no dañar apreciablemente el explanto con el agente desinfectante. El número ideal de explantos iniciales varía según la especie de que se trate. Se tiene en cuenta la exposición a contaminantes, la supervivencia de los tejidos a la desinfección y la tasa de multiplicación. Se parte de un número inicial basado en la cantidad de plantines viables que quieran obtenerse en las etapas posteriores. También ha de considerarse el estado fisiológico de la planta de la que se extrae el tejido inicial. Se puede considerar que el cultivo se ha establecido in vitro si se observa crecimiento de tallos y de hojas. En este punto, la planta ha completado su desarrollo y es apta para ser transplantada al medio de proliferación (Etapa II). En esta etapa, pueden reunirse los plantines en recipientes comunes, aunque todavía es posible que afloren contaminaciones tardías. Por lo tanto, conviene agrupar los plantines en números pequeños e ir incrementando las cantidades en los pasajes sucesivos. La transparencia 10 muestra un plantín de arándano ya desarrollado a los 30 días de crecimiento in vitro. La subdivisión (Etapa II) resulta sencilla para aquellas especies que pueden micropropagarse mediante segmentos nodales, pero ofrece cierto grado de dificultad en aquellas especies que crecen mediante regeneración adventicia de vástagos. En este caso, la subdivisión debe ser realizada con criterio, dejando vástagos no muy pequeños, capaces de dar origen a nuevos vástagos en el medio de cultivo donde van a ser implantados. Un plantín separado de su macollo y de tamaño demasiado pequeño, corre el riesgo de no proliferar y morir. Es en esta etapa que deben ajustarse al máximo los tiempos de crecimiento y las tasas proliferativas de los plantines para poder establecer un esquema productivo organizado. Este esquema debe satisfacer, las necesidades del cliente en términos de cantidad y tiempos calendarios. Cabe remarcar la importancia de los recaudos que se toman para asegurar condiciones asépticas de trabajo, tanto desde el punto de vista ambiental como de los operarios que realiza las subdivisiones. El incremento de la cantidad de plantines es geométrico y un mínimo descuido en estos parámetros puede echar a perder toda una producción. El escalado de la propagación debe realizarse en condiciones de absoluta esterilidad (transparencia 11). Los vástagos o plantines en crecimiento son divididos para formar vástagos individuales, que serán sembrados en un nuevo medio de cultivo. En la foto de la transparencia se muestra la subdivisión de vástagos de arándano, una especie que se propaga por segmentos internodales. Esto facilita una rápida multiplicación y generalmente trae aparejada una alta productividad. Es común emplear técnicas de micropropagación para multiplicar muchas especies ornamentales, como el Syngonium rosado que se observa en la transparencia 12. Ello se debe a que: a) permite eliminar bacterias endógenas de las plantas madres, lo que facilita la propagación por macollos realizada habitualmente por los viveristas; b) permite abastecer incrementos de la demanda, produciendo una gran cantidad de plantas homogéneas en un período de tiempo relativamente corto; c) permite la obtención de plantas más vigorosas. Esto se debe a la aparición de vástagos adventicios que se van formando en cada nuevo subcultivo por la acción de las citoquininas. Además de una buena tasa proliferativa, se busca lograr calidad y homogeneidad en el aspecto de los plantines que están siendo multiplicados (transparencia 13). Esto puede realizarse mediante una observación minuciosa de todos los plantines en crecimiento. Si el número de subcultivos in vitro es elevado, la observación visual puede acompañarse por un muestreo al azar de plantines transferidos a condición ex vitro para realizar observaciones fenotípicas y comparaciones con los parámetros característicos de las plantas madre. La situación puede ser muy diferente para cada especie. Por ejemplo, en el caso de la caña de azúcar, los subcultivos no pueden superar los 6 ó 7, ya que es frecuente la aparición de variantes somaclonales en cultivo in vitro. La transparencia 14 muestra otras vías de obtención de plantines completos a partir de tejidos diferentes de los meristemas, yemas apicales o yemas axilares. Esto puede ocurrir a través de dos vías morfogéneticas: la morfogénesis directa o indirecta. En la morfogénesis directa, el crecimiento del nuevo vástago se inicia desde segmentos de hoja o pecíolos sin pasar previamente por un estadio de callo (células indiferenciadas). Esto acarrea beneficios en términos de disminuir la aparición de variantes somaclonales. Esta estrategia de clonado puede emplearse en distintas especies, de acuerdo con su morfología y siempre que la planta se encuentre en buen estado fitosanitario. En la morfogénesis indirecta, se forma primero un agrupamiento de células sin diferenciación (llamado comúnmente callo), que es previo a la formación del vástago. Tanto la concentración como el tipo de regulador de crecimiento presente en el medio de cultivo, afectan el grado de aparición de variantes entre los regenerantes. Una concentración elevada de auxinas sintéticas, como el 2-4D, o su uso prolongado en el tiempo, puede originar variantes genéticas. La transparencia 15 muestra un esquema de la vía morfogenética directa, por medio de la cual los plantines se desarrollan sin que el tejido pase previamente por el estadio de callo. Un ejemplo de esta vía es el desarrollo de vástagos a partir de nervaduras de hoja. Esto genera una cantidad de plantines mayor a la que se obtiene por crecimiento de yemas adventicias, lo cual permite acortar los tiempos del proceso de multiplicación. La factibilidad de esta técnica depende de la morfología de la especie en cuestión. La embriogénesis directa (o embriogénesis somática), permite obtener plantines completos mediante un proceso similar al de la formación de embriones en las semillas. Esta vía de morfogénesis ocurre mayoritariamente cuando se utilizan explantos derivados del gametofito femenino. La tendencia de estos tejidos a generar embriones somáticos adventicios es alta en aquellas plantas en que ocurre naturalmente poli-embrionía, como es el caso de muchas variedades de Citrus y otros géneros cercanamente relacionados. En el cultivo de anteras, donde el objetivo es la obtención de plantas haploides, éstas pueden obtenerse directamente a partir del polen por embriogénesis somática. La transparencia 16 muestra plantines de Begonia rex obtenidos mediante morfogénesis directa. Los plantines se desarrollan a partir de las nervaduras de las hojas, generando una gran cantidad de nuevos vástagos, sin que el tejido haya pasado previamente por un estadio de callo. En la morfogénesis indirecta, como se grafica en la transparencia 17, las células diferenciadas de un explanto, son inducidas a dividirse como un agrupamiento indiferenciado para luego reprogramarse hacia la formación de un órgano. A partir de este callo, pueden originarse yemas adventicias que darán origen al plantín completo. Un medio subóptimo puede prolongar la duración de la fase callosa antes de la regeneración, y probablemente perturbe la mitosis en las células del callo para dar origen a variantes. Esto podría ser una alternativa a utilizar en el caso en que se desee obtener variantes somaclonales. En algunas especies, como Daucus carota, se favorece el crecimiento desdiferenciado cultivando las células en medio líquido. Este tipo de cultivos se denominan cultivos en suspensión. A continuación, se puede inducir la formación de embriones somáticos modificando los reguladores de crecimiento o introduciendo cambios físicos (luz/oscuridad). Los embriones somáticos son estructuras bipolares que tienen un polo de crecimiento de vástago y otro de raíz. Los embriones pueden originarse de una sola célula sin conexión vascular con los tejidos maternos, o de una masa globular de tejido, dando origen luego a un plantín completo. Los métodos que permiten la regeneración de plantas completas constituyen un complemento indispensable de los métodos de transformación genética. Debido a que la eficiencia de regeneración a partir de embriones somáticos es muy alta, esta vía es utilizada muy frecuentemente en especies en que este proceso es ineficiente por otras vías. La eficiencia de la etapa de regeneración incide directamente sobre el número de plantas transgénicas que pueden recuperarse y tiene fuerte incidencia sobre la viabilidad y reproducibilidad de un protocolo de transformación. Ejemplos típicos de especies que han sido transformadas siguiendo esta vía de regeneración son el maíz, la soja y la caña de azúcar. La transparencia 18 muestra el crecimiento diferencial en medio selectivo de callos embriogénicos de caña de azúcar que han sido transformados por técnicas de biobalística. El desarrollo de callos en este medio es fuertemente indicativo de la presencia de callos transgénicos. El tejido pasará luego por la etapa de desarrollo de embriones somáticos a partir de los cuales se regenerarán plantines completos. La transparencia 19 muestra un callo embriogénico de una especie dicotiledónea (alfalfa), iniciando la regeneración. Para las dicotiledóneas, los pasos en la formación de embriones somáticos son más marcados que para las monocotilidóneas, en las cuales el callo embriogénico no siempre adquiere un aspecto que permita distinguirlo frente al callo de crecimiento en masa no embriogénico. Para las dicotiledóneas, los pasos en la formación de embriones somáticos comprenden: a) formación de proembriones de 6-8 células; b) estadio globular, formado por células que aún carecen de características embrionarias; c) estadio de corazón, en que el aspecto del embrión es trilobulado y los inicios cotiledonares se separan del polo radicular; d) estadio de torpedo, donde se elonga el estadio anterior; e) embrión con clara diferenciación de vástago y raíz. Los callos embriogénicos se desarrollan en un medio sin contenido de auxinas. Sin embargo, la inducción de la embriogénesis requiere un medio de cultivo con auxinas, pues estos reguladores estimulan la división celular y la formación de embriones. En la transparencia 20 se esquematiza la Etapa III del proceso de micropropagación, en la que se inicia el enraizamiento y se muestran los distintos caminos que pueden seguirse en la transición de in vitro a ex vitro. Hay especies que enraízan espontáneamente in vitro, como es el caso de muchas ornamentales (por ejemplo, begonias, Syngonium, Spathyphillum, Aloe que se observa en la transparencia 21), mientras que otras deben ser inducidas a enraizar in vitro, con medios especiales de enraizamiento, para luego ser transferidas a rusticación ex Vitro en sustrato (por ejemplo, espárragos, caña de azúcar). Otras especies pueden no ser inducidas a enraizamiento in vitro y llevarse sin raíz a condición ex vitro e inducir formación radicular ya en el sustrato (por ejemplo, arándano). La inducción del enraizamiento implica generalmente el uso de auxinas. La rusticación-aclimatación de la planta (Etapa IV) es tal vez la etapa más crítica. El desarrollo in vitro ya ha finalizado, como vemos en la transparencia 22, y ahora deben procurarse condiciones adecuadas para la adaptación gradual a las condiciones ex vitro. Las instalaciones requeridas para ello no implican costos elevados, pero es fundamental el ajuste de las condiciones ambientales para que los plantines continúen su crecimiento en una atmósfera no controlada. En algunas plantas (por ejemplo, Malus, Prunus) los estomas de las hojas formadas in vitro comienzan a adquirir una función normal durante la aclimatación en invernáculo. En otras plantas (por ejemplo, Brassica) las hojas que no han desarrollado mecanismos efectivos de cierre de estomas no logran recuperarse en la aclimatación. Respecto al desarrollo de raíces, una buena inducción radicular contribuye a la aclimatación del plantín. Para establecer un calendario apropiado de entregas de material, se deben establecer los tiempos necesarios para que las plantas alcancen un tamaño comercial. Esto a su vez determina el resto del esquema de producción, incluyendo las épocas convenientes de plantación. Costos versus productividad Transparencias 23-32 Los costos de micropropagación están afectados por los siguientes factores: a) los costos de instalación del laboratorio; b) los costos de mano de obra; c) los costos de materiales e insumos; d) las características de la planta in vitro; e) las pérdidas ocasionales que ocurran en las distintas etapas del proceso de producción (pérdidas por contaminación, por hiperhidricidad irreversible; por falta de enraizamiento, por muerte durante la aclimatación). Entre las características propias de la planta, se debe considerar su facilidad para multiplicarse a lo largo del tiempo en condiciones de cultivo. En el caso de plantas leñosas, se requiere un tiempo para rejuvenecer parcialmente el cultivo y obtener así un crecimiento suficientemente rápido para encarar la multiplicación. A su vez, la frecuencia con que puede ser multiplicado un cultivo dependerá del número de nuevos vástagos producidos en cada subcultivo, así como del intervalo de tiempo entre cada subcultivo. Otra característica a considerar es si los vástagos necesitan ser enraizados in vitro o pueden hacerlo ex vitro. El laboratorio de micropropagación a escala comercial implica una estructura productiva mínima, con instalaciones que permitan el manejo de al menos unos 10.000 plantines diarios, una capacidad de albergar 1.000.000 de plantines por año en cámaras de crecimiento y sistemas automatizados de control de fotoperíodo, temperatura y humedad (transparencia 24). Estas instalaciones deben estar diseñadas considerando la gran cantidad de recipientes contenedores de plantines que fluyen por el laboratorio: esto implica pasillos aptos para desplazar carros y estantes con medidas ajustadas para la ubicación de canastos que contengan los recipientes con plantines. Es importante considerar que cada movimiento implica un tiempo y un determinado riesgo de manipulación y que la calidad de las instalaciones contribuye a un desarrollo más eficiente, más higiénico y menos costoso de la actividad. Una buena disposición de los recipientes en las cámaras de crecimiento para que puedan ser periódicamente revisados por el personal a cargo también resulta indispensable. En el área destinada a los flujos laminares, es importante contar con suficiente espacio para el ingreso de carros con plantines. Entre el instrumental necesario para la micropropagación, es conveniente disponer de esterilizadores eléctricos, lo cual evita los riesgos de incendio asociados la utilización de mecheros y de alcohol. La tarea de subdividir los plantines en forma manual es la más costosa. Un elemento clave para lograr calidad y rapidez es el entrenamiento del personal. Un operario bien capacitado puede realizar en una jornada de trabajo entre 1.600 y 2.800 plantines diarios, dependiendo de la especie que esté siendo micropropagada. Pese a los intentos de automatización y de incorporación de nuevas tecnologías, la micropropagación por división manual de vástagos axilares sigue siendo hasta el presente el método por excelencia de micropropagación masiva. La infraestructura y el instrumental deben apoyar y hacer más eficiente la labor manual. Por ejemplo, es importante llevar un registro detallado de los procesos que se realizan. Esto permite hacer seguimientos detallados en los casos en que se registran desarrollos anómalos en las plantas micropropagadas. Dentro de los objetivos de producción, es clave: a) la calidad de la división de los plantines, de forma tal que todos tengan potencialidad de crecimiento y proliferación. Como se mencionó anteriormente, una especie que pueda subdividirse por segmentos nodales, será más productiva (se producen más plantines/hora) que otra cuya división requiera separación de macollos y vástagos adventicios; b) la manipulación de las plantas en total esterilidad, evitando contaminaciones accidentales que sean arrastradas en siguientes subcultivos. La transparencia 26 ilustra el proceso de subdivisión de plantines en un área estéril. Para elaboración a gran escala de medios de cultivo, un laboratorio necesita contar con aparatos que permitan el procesamiento de grandes volúmenes de líquidos. Las soluciones madres que sirven para suplementar los medios con distintos micronutrientes y vitaminas pueden preparase en concentraciones de 10, 100 y 1000x. Entre el instrumental necesario para la elaboración y manejo (transparencia 27), se cuentan contenedores de 5, 10 y 20 L, agitadores magnéticos, hornos de microondas para facilitar la solubilidad de algunos compuestos, balanza y un medidor de pH. Las autoclaves deberán tener una capacidad suficiente para ingresar los grandes volúmenes a ser esterilizados y un registro de los tiempos y temperaturas alcanzadas. Los recipientes utilizados para el crecimiento in vitro de plantines pueden ser de formatos variables. Los recipientes contenedores de plantines, son una elección que a simple vista puede ser considerada trivial, pero que sin embargo requiere cuidadosa atención. Las preferencias de los laboratorios difieren en esto; algunos utilizan recipientes grandes capaces de contener un alto número de plantines (lo que incrementa la rapidez de las tareas manuales). Otros prefieren utilizar recipientes pequeños con poca cantidad de plantas (lo que disminuye los riesgos de contaminación). Un recipiente grande permite menor acumulación de etileno, lo que disminuye la aparición de fenómenos de senescencia y facilita la proliferación en algunas especies. Los recipientes deben ser traslúcidos para visualizar a simple vista la aparición eventual de contaminaciones. Su diseño debe permitir que el manipuleo se realice con facilidad y rapidez (transparencia 29). En caso de no ser descartables, deben poder ser esterilizados por algún método que asegure esterilidad total (calor, radiación, gases). La transparencia 29 muestra un ejemplo de recipiente circular de plástico descartable. Este modelo se encuentra más fácilmente en el mercado. También existen recipientes rectangulares, traslúcidos, altos y con buen cierre de tapa, pero no se encuentran tan fácilmente disponibles. La ventaja de éstos últimos es que resultan más apropiados para su ordenamiento y para la manipulación por parte del operario. La transparencia 30 muestra un área de trabajo apta para que el operador pueda realizar su tarea con máxima eficiencia. Los siguientes elementos deben estar fácilmente disponibles: a) carro con recipientes conteniendo las plantas a ser subdivididas y recipientes con los medios frescos para recibir los nuevos vástagos; b) alcohol y gasa estéril para limpiar los recipientes a ser introducidos al área de flujos laminares; c) pinzas y bisturíes; d) soporte donde serán subdivididos los plantines; e) esterilizador eléctrico (en lo posible, evitar mecheros a gas y alcohol para reducir los riesgos de incendio). La transparencia 31 muestra las condiciones de rusticación necesarias para la aclimatación gradual de los plantines obtenidos in vitro. Esta debe realizarse en condiciones controladas, particularmente de temperatura y humedad. Es importante dedicar un tiempo a rotular las nuevas plantas que ingresan. Dichos rótulos deberán permitir la trazabilidad de los plantines que están siendo procesados en su etapa final. Además, para preservar la sanidad obtenida mediante el proceso in vitro, debe restringirse el acceso de cualquier planta no testeada en su condición fitosanitaria al ambiente en que se realiza la rusticación. Si bien en la etapa de laboratorio se considera que un plantín está completo cuando ha desarrollado su parte radicular, en términos comerciales el plantín “completo” es aquel que cumple las expectativas del solicitante. Un ejemplo típico que ilustra este punto es el de las plantas fruti-hortícolas. Se consideran que éstas están listas para la comercialización cuando han alcanzado un buen crecimiento y son aptas para su desarrollo en las condiciones ambientales naturales. En la transparencia 32 se observa la última fase de invernáculo, donde las plantas están bajo media sombra, en su etapa final, previo a ser entregadas. Control fitosanitario y varietal Transparencias 33-36 El control fitosanitario es esencial en todas las etapas de la micropropagación, ya que cualquier agente infeccioso se reproducirá en forma exponencial conjuntamente con el aumento del número de plantines (transparencia 34). El material contaminado se debe eliminar lo más temprano posible del stock de plantas a micropropagar para evitar incurrir en graves pérdidas económicas. Las contaminaciones bacterianas o fúngicas suelen detectarse mediante simples observaciones visuales. Las mismas son más frecuentes en las primeras etapas de la micropropagación, y se originan en los microorganismos que no han sido eliminados en la etapa de desinfección. Por otra parte, existen bacterias endógenas que permanecen latentes dentro de la planta y afloran en subcultivos avanzados. Según cómo las mismas afecten al crecimiento de la planta y a la intensidad de su aparición, puede tratarse al cultivo con algún compuesto antibacteriano para eliminar o reducir su crecimiento. Respecto de las contaminaciones virales, el diagnóstico se realiza en las plantas madres, antes de introducirlas en el cultivo in vitro. Generalmente, se realizan ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) o con plantas indicadoras para detectar presencia o ausencia de micoplasmas o virus conocidos en cada cultivo particular. Los métodos de PCR son más aptos para detectar cantidades mínimas de estos agentes infecciosos. Cuando sólo se dispone de plantas infectadas para iniciar un proceso de micropropagación, una estrategia eficaz y relativamente inocua es tratar a la planta madre o a los meristemas ya extraídos con incubaciones a alta temperatura. Luego de dicho tratamiento y de la desinfección inicial para introducir el material en el cultivo in vitro, los meristemas en crecimiento se analizarán nuevamente para detectar presencia/ausencia de virosis. Dependiendo del grado de infección de la planta madre, siempre será posible eliminar un cierto porcentaje de los agentes infecciosos en los meristemas tratados. No deben escatimarse cuidados para establecer la sanidad del stock material inicial. El criterio principal en esta etapa es asegurarse que el material que sirve como base a todo el proceso de micropropagación es sano por todos los criterios disponibles. Antes de iniciar un proceso de micropropagación masiva, es fundamental constatar la identidad de las plantas madres con patrones varietales bien establecidos. Como es obvio, la introducción de material poco caracterizado al comienzo de la micropropagación puede tener graves consecuencias económicas en la medida que se avanza en la multiplicación. Los procedimientos más empleados en la actualidad hacen uso de distintos tipos de marcadores moleculares, tales como RAPDs, AFLPs y SSRs. En la transparencia 36 vemos un gel de poliacrilamida mostrando bandas obtenidas por microsatélites que permiten diferenciar variedades de arándanos. La caracterización de variedades por técnicas de biología molecular garantiza un control interno eficaz sobre la uniformidad del material vegetal que se está produciendo. Existen diversos métodos con distintas ventajas y desventajas según la facilidad de su implementación; su reproducibilidad y los costos involucrados. Gestión productiva Transparencias 37-42 Para llevar adelante un plan de micropropagación masiva, es fundamental optimizar la gestión en todas las etapas y coordinar las mismas en forma precisa (transparencia 38) Se deben considerar parámetros como: a) las tasas de proliferación de las plantas; b) la posibilidad de decaimiento de las tasas proliferativas; c) las épocas de multiplicación de las distintas especies para mantener una labor continuada; d) el requerimiento de mano de obra para la multiplicación de cada variedad/especie. Resulta clave la observación constante del estado de los plantines para poder predecir cambios en las tasas de proliferación y visualizar la aparición de contaminaciones. En base a las mismas, se podrán anticipar cambios en los rendimientos esperados y modificar anticipadamente los períodos de multiplicación para ajustar la producción. Asimismo, el conocimiento de tasas y de rendimientos permite prever la cantidad de medio de cultivo a elaborar. Es conveniente contar siempre con medio de cultivo listo para anticipar eventuales incrementos en la tasa proliferativa, o para el caso de que se adelante la multiplicación de algún cultivo que presente buen crecimiento. Sin embargo, no conviene tener medios en stock por más de 30 d sin ser utilizados. Las consideraciones sobre la etapa de enraizamiento dependen del tipo de planta y de si el mismo se realizará in vitro o ex vitro. El enraizamiento ex vitro es siempre más conveniente, ya que implica un paso menos de cultivo in vitro y menos utilización de cámaras de crecimiento. Finalmente, una gestión eficaz de la aclimatación es crítica para lograr un plantín completo bien terminado. La introducción de alternativas al cultivo en medio semisólido en alguna etapa del proceso de micropropagación puede incrementar la productividad y la calidad de las plantas. Los biorreactores que permiten inmersión temporaria, facilitan la oxigenación de los cultivos, así como la dilución de compuestos tóxicos que puedan acumularse alrededor del plantín en crecimiento en un medio semisólido. La transparencia 39 muestra un conjunto de biorreactores de tipo RITA en el que se cultivan plantines de caña de azúcar. El flujo de medio y la aireación son controlados por un temporizador. Durante el seguimiento de la micropropagación pueden implementarse cambios que tiendan a una mejora en la calidad de las plantas o un incremento en la productividad. Algunos ejemplos están mencionados en la transparencia 40. Utilizar un agregado de medio de cultivo líquido sobre la base de un medio semisólido implica una reposición de nutrientes para los plantines sin que ello requiera un subcultivo a medio fresco, con el consiguiente ahorro de mano de obra. También pueden alternarse los medios de cultivo, mediante modificaciones en la composición de reguladores de crecimiento u otros componentes del medio. Debe considerarse que una prolongada exposición a un único medio de cultivo puede producir un acostumbramiento o agotamiento de los plantines a los reguladores de crecimiento empleados. También pueden contribuir a incrementar el crecimiento los cambios en la aireación de los recipientes o en la intensidad lumínica. El calendario de producción debe ajustarse a los requerimientos de los productores o de los viveristas, quienes generalmente requieren las plantas en una determinada época del año (transparencia 41). Tanto la preparación de las plantas como la expedición de las mismas, deben ser conducidas con sumo cuidado. El cliente debe recibir las plantas encargadas en excelente estado. Es importante realizar un seguimiento post-venta del material vegetal entregado, lo que permitirá obtener un mayor conocimiento del mercado y de sus posibles alcances. Puede ocurrir que el cliente solicite exclusividad en cuanto a la propagación de un determinado material vegetal proporcionado por él mismo. En este caso, si las cantidades permiten fijar costos razonables, se realizan contratos exclusivos de propagación. La micropropagación comercial, ha tenido profundo impacto social en muchas regiones de Latinoamérica (transparencia 42). Por ejemplo, en la localidad de Simoca, situada a 60 km de San Miguel de Tucumán, un grupo de pequeños productores cañeros minifundistas decidieron cambiar su estrategia productiva y se volcaron al cultivo del arándano. Se requieren como mínimo 5 ha de este cultivo para tener una producción rentable. La micropropagación de material sano y de calidad comercial les permitió vincularse con el mercado de exportación a los países del hemisferio norte, con el consiguiente incremento de sus beneficios económicos. Asociaciones como está pueden organizarse en el caso de muchas otras producciones especializadas (frutícolas, hortícolas, ornamentales y forestales) en que la provisión de materiales propagativos de calidad certificada constituye un requerimiento productivo importante. Como es obvio, el impacto social y regional de este tipo de experiencia es, potencialmente, muy grande. Otras aplicaciones de la micropropagación Transparencias 43-50 Las transparencias 45 a 50 muestran otras aplicaciones en que se puede utilizar la micropropagación masiva como un instrumento auxiliar de otros procedimientos. Uno de los ejemplos se relaciona con la utilización de la técnica de micropropagación vinculada al caso de una planta transgénica (en este caso, plantas de papa resistentes al virus PVY). Para poder evaluar dicha planta y hacer selecciones y ensayos a campo, se necesita multiplicar la línea transgénica en cantidades suficientes y obtener plantas en idénticas condiciones para su evaluación a campo en diferentes localidades y bajo distintas condiciones ambientales. Estos ensayos son imprescindibles para satisfacer las exigencias de los organismos responsables de la evaluación y liberación de OGMs al medio ambiente (transparencia 49).