El sistema de expresión Baculovirus-células de insecto Oscar Taboga Instituto de Biotecnología INTA 1 – Introducción a los baculovirus 2 – Baculovirus para la expresión de proteínas 3 – Puesta en práctica, ejemplos Preguntas y discusión Parte 1 – Introducción a los baculovirus ¿Qué son los baculovirus? • Su ciclo de vida y cómo podemos hacer uso de él Los baculovirus son un grupo de virus encontrados mayormente en insectos (Baculoviridae). Tienen una estructura de varilla (baculum=bastón), un diámetro de entre 40-50 nm y una longitud de entre 200-400 nm. Su información genética está almacenada en una molécula de ADN doble cadena, circular, de aproximadamente 80-200 Kpb. Spodoptera frugiperda Trichoplusia ni En cultivos celulares o cuando se multiplican dentro de un insecto permisivo, los baculovirus forman dos tipos de viriones: virus ocluidos y virus brotados. peplómeros envoltura nucleocápside Para una sobrevida a largo plazo se forman los cuerpos de oclusión o poliedros dentro del núcleo que ocluyen los virus ocluidos. matriz nucleocápsides envoltura cálix Ciclo de replicación Liberación de viriones por lisis celular Poliedros Solubilización en el intestino de la larva Brotación Endocitosis Liberación del genoma Virus brotados Infección secundaria Fusión Infección primaria Virus derivados de cuerpos de oclusión ¡Película! Su ciclo de multiplicación La proteína poliedrina se acumula hasta alcanzar el 50% del total de proteínas celulares, pero no es indispensable: el virus puede multiplicarese en cultivos celulares sin formar cuerpos de oclusión (virus pol -). ¿Qué significa en términos de expresión de proteínas? =>Pueden expresarse genes heterólogos bajo el control del promotor de poliedrina => La expresión ocurre en un estadío muy tardío de la infección => Los niveles de expresión serán probablemente muy altos Parte 1 – Introducción a los baculovirus Parte 2 – Baculovirus para la expresión de proteínas Modificaciones postraduccionales Parte 3 – Puesta en práctica Seguridad Riesgo personal o de contaminación de células de mamífero. Estudios mostraron que pueden entrar en células de mamífero, pero no se transcriben genes Pueden considerarse entonces que no poseen riesgo de seguridad adicional y son clasificados como Clase I Contaminación de otras células de insecto Aunque su rango de hospedador es bastante limitado, pueden penetrar otras células de insecto pero no replican ni entran en estadíos tardíos De todas maneras, cuidado de no contaminar otros trabajos y como todo organismo recombinante, debe ser considerado potencialmente peligroso Características generales del BVES Producción de proteínas en un hospedador eucariota Siendo un sistema eucariota el BVES es capaz de: •Plegamiento apropiado •Modificaciones postraduccionales Estos requisitos son cruciales para proteínas con actividad biológica Características generales del BVES Altos niveles de expresión El BVES tiene el potencial de una muy fuerte expresión de genes heterólogos: se han alcanzado niveles de hasta 2550%de las proteínas totales (1g/l). Sin embargo, usualmente los niveles de expresión están en orden de: •1- 3 mg /l (proteínas intracelulares) •3-15 mg /l (proteínas secretadas) •Tan poco como 0.1 mg /l (algunas integrinas) •Hasta 50 mg /l (algunas kinasas) Características generales del BVES Expresión de proteínas tóxicas o termosensibles La mayor fase de producción de proteínas ocurre tardíamente en la infección. Esto significa que: •Pueden expresarse proteínas heterólogas tóxicas a pesar de posibles efectos sobre funciones celulares esenciales •Hay poca presión de selección contra el gen tóxico ya que este no interfiere con la producción de virus brotado La expresión ocurre a 27°C, lo que puede ser permisivo para proteínas termosensibles Características generales del BVES • Construcciones largas o múltiples Debido a que el genoma de los baculovirus puede acomodar grandes porciones de ADN, el sistema permite la expresión de largas construcciones o múltiples genes simultáneos • Simplicidad de la tecnología Los vectores son accesibles para el clonado directo La construcción de un baculovirus recombinante es considerablemente más rápida que la de una línea celular eucariota (CHO, por ejemplo) Hay un rango muy amplio de vectores comerciales disponibles y kits para la construcción de virus recombinantes. Costos Los costos son significativamente más altos que los sistemas de expresión bacterianos y de levaduras, tanto en materiales como en equipamiento. Modificaciones postraduccionales Las células de insecto son capaces de lidiar con modificaciones postraduccionales como: •Clivaje de péptido señal (incluidos los de mamífero) •Fosforilación •N y O glicosilaciones •Miristilación •Plegamiento, formación de puentes S-S, oligomerización •Modificaciones lipídicas Modificaciones postraduccionales Limitaciones: •Clase y grado de modificación puede no ser idéntico al encontrado en la especie o tejido original •El muy alto nivel de expresión puede disminuir la capacidad de la célula de modificar correctamente el producto •Secreción, fosforilación y glicosilación pueden verse particularmente afectadas •Algunos de estos inconvenientes pueden resolverse usando promotores más tempranos Diferencias en las rutas de glicosilación 1 – Introducción a los baculovirus 2 – Baculovirus para la expresión de proteínas 3 – Puesta en práctica Preguntas y discusión Sistemas de expresión Vector Hospedador Metodología Características Ambiente eucariota para la producción de proteínas Expresión excepcionalmente alta Expresión durante la fase de oclusión Expresión a 27ºC Capacidad de grandes inserciones Expresión eficiente de genes no “spliceados” (cDNAs) Simplicidad de la tecnología Crecer virus parental Preparar ADN viral Clonar gen en vector de transferencia Preparar ADN plasmídico Cotransfectar Screening de recombinantes Purificar recombinantes Amplificar recombinantes Confirmar identidad Caracterizar expresión génica Scaling-up Historia Placas de lisis occ+ vs pacas occ- (1:1000) Gen reportero (igual frecuencia) Linealización del genoma (eficiencia 30%) Bsu361 Deleción en orf letal y linealización (eficiencia 100%) Bsu361 Bsu361 Variaciones Bácmidos como fuente de ADN viral Generación de recombinantes por transposición Bácmido bAcGOZA Ppol marker Mini F Pp10 poliedrina ∆orf1629 Generación de baculovirus recombinantes por el sistema Bac to Bac Elección del virus y especie hospedadora 500 especies AcNPV y BmNPV 90% identidad rango de hospedador y líneas susceptibles muy diferentes y con distintas propiedades AcNPV vs BmNPV Crecimiento y niveles de expresión de las líneas Rango de plásmidos de transferencia Expresión en larvas de insecto (tamaño, voumen de hemolinfa, canibalismo, bioseguridad, métodos de infección Cultivo de células vs larvas Células: Igual sistema al usado en la caracterización inicial Más “limpio” (medio libre de suero) Más homogéneas purificaciónes postraduccionales Caro Equipamiento Cultivo de células vs larvas Larvas: Más alta eficiencia de modificaciones postraduccionales Bajo costo Se necesita mantener insectos Más difícil purificación Elección de células Propiedades Tiempo de duplicación Capacidad de crecimiento en monocapa o suspensión Tamaño Susceptibilidad Modificaciones postraduccionales Elección del plásmido de transferencia Método de producción (transposición vs. recombinación) Proteína auténtica vs. fusión Secretada vs citoplasmática Complementación de la deleción letal en orf 1629 Bajo la regulación de qué promotor Una o más proteínas Fenotipo occ + vs occ- Proteína auténtica Acortar región 5’ no traducida entre promotor y ATG (hasta 100 pb) Evaluar secuencias que rodean ATG Consenso: A YAUG Y consenso TAAG 100 pb ATG UAA Proteínas secretadas Señales propias Señales probadas (gp64, melitina, etc) Promotores Immediate early no usados (usados en líneas celulares) Early poco usados Late durante y luego de S! de ADN, 39K, proteína básica Very late P10, Pol Más de un gen simultaneamente Heterodímeros Necesidad de coexpresión de enzima modificante tejido o célula-específica 1 p10 + 1 pol en locus poliedrina 2 p10 + 1 pol en locus poliedrina 1 p10 + 1 pol en locus p10 Fenotipo del virus Mantener una copia de poliedrina bajo su promotor o el de p10 Conclusiones básicas Usar genes sin intrones Remover secuencias heterólogas en región 5’ no codificante Buen contexto para el codón ATG (A a -3) No son necesarias secuencias para poliA Secuencias TAAG o CTTA dentro de la secuencia del gen de interés pueden ser perjudiciales El uso de codones parece tener poca influencia Emplear secuencias de secreción comprobadas Baculovirus vs. otros sistemas de expresión de proteínas eucariotas Rapidez Trangénicos Bajo Costo Trangénicos Glicosidación Bacterias Plantas Células de mamiferos Levaduras Plegamiento Bacterias Levaduras Células de mamiferos Plantas Baculovirus Baculovirus Plantas Baculovirus Levaduras Levaduras Bacterias Bacterias Trangénicos Células de mamiferos Baculovirus Plantas Trangénicos Células de mamiferos Sistemas de expresión Baculovirus Display en cápside o superficie recombinantes Gene delivery Control biológico de plagas Antiviral/Inmunomodulador Expresión de proteínas a partir de células infectadas con el baculovirus Ac3AB1pol+: clon 1 clon2 clon 1 clon 2 AcNPV MPM AcNPV MPM 47,5 Kda 47,5 Kda 32,5 kDa 32,5 kDa 25 kDa Tinción con azul de Coomassie poliedrina 3AB1 3AB1 25 kDa Western blot Reconocimiento de la proteína no estructural 3AB1 por sueros de animales infectados con VFA Sueros bovinos Sueros positivos infectados VFA Sueros bovinos VFA Sueros negativos negativos VFA A C Sueros Sueros bovinos vacunados vacunados contra VFA O Western blot de extractos de células infectadas ELISA para diferenciar animales vacunados de infectados con FMDV Producción de VLPs de rotavirus (coexpresión de VP2 y VP6) en larvas y células Display de la glicoproteína gD de BHV-1 en la superficie de baculovirus AcSup-gD • Exposición en sup. de gp64-gD • Competencia por el receptor celular: plegamiento similar a la proteína nativa • Inducción de Ac seroneutralizantes gD Microscopía electrónica y marcación (específica para gD) con oro Display de OVA en cápside vp39 vp39OVA Se agrega una copia extra de vp39 fusionada a la secuencia del antígeno OVA. Los BV que transportan OVA en la cápside son eficientemente internalizados por DCs y presentan OVA en la vía MHC I Molinari et al. 2011 Los BV inducen maduración de BMDCs Molinari et al. 2011 BV-OVA induce activación de células CD8 T Molinari et al. 2011 Respuesta CTL anti-OVA en ratones inyectados con BV-OVA Molinari et al. 2011 B V O VA C ap N V O VA ap SD C Su p B V O eu VA tr al C A iz G ad o co n V1 B V O VA O VA B V B V B % specific lysis (in vivo killing) Sup vs Cap vs Transd 100 Transd 75 50 25 0 Cap SD Molinari et al. 2011 La respuesta citotóxica protege contra la implantación de tumores Molinari et al. 2011 Respuesta inmune innata de ratones inyectados con BV Abe et al. 2005 Respuesta inmune innata de ratones inyectados con BV Molinari et al. 2011 Transducción de células de mamífero BHK (uv) A11 moi180 Efecto antiviral Muchas gracias