Puré de Cereza y Gota: Estudio In Vitro

Universidad Veracruzana
Instituto de Ciencias Básicas
Evaluación de la actividad biológica in vitro del puré de
cereza como potencial nutracéutico en la gota.
Tesis de investigación para obtener el grado de
Maestro en Ciencias Alimentarias
Presenta:
L. en N. Juan Jesús Virgen Gen
Directores:
Dra. Rosa Isela Guzmán Gerónimo.
Dra. Yessica Eduviges Zamudio Cuevas.
Xalapa, Veracruz
Enero, 2019
DEDICATORIAS
Este trabajo está dedicado principalmente a mi familia, ya que han sido
y serán para siempre mi más grande inspiración y fortaleza.
A mi madre, María Concepción Gen Islas, gracias por ser mi pilar más
importante, por todo el apoyo y confianza que me has brindado, por los valores
y el conocimiento que has compartido a lo largo de la vida, eres un ejemplo a
seguir, una persona que tengo el gusto de llamar mamá.
A mi hermano, Mario Alberto Virgen Gen, pilar importante también en mi
vida, por impulsarme a ser mejor persona, y por su paciencia cuando me he
encontrado en momentos de desesperación y no he sabido cómo actuar.
A mi padre, cuyas experiencias me han demostrado que los errores no
se deben repetir, y siempre se debe ser mejor ante todo.
A mis amigos de la preparatoria, los cuales siempre me han apoyado, y
demostrado estar ahí cuando más los necesito, especialmente a Roberto
Giovanni Vázquez López y Alejandra Salas Gil.
A mis conocidos, ya que me han motivado a ser mejor persona,
mediante el aprendizaje adquirido.
A la vida, que gracias a pesar de todas las situaciones que he vivido, me
ha demostrado que siempre se puede seguir adelante, siempre y cuando te lo
propongas, luchando por lo que más quieres.
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto de Ciencias Básicas de la Universidad Veracruzana, y al
Instituto Nacional de Rehabilitación “Luis Guillermo Ibarra Ibarra”, por el apoyo
brindado para la elaboración de este proyecto, así mismo al Consejo Nacional
de Ciencia y Tecnología (CONACyT), ya que gracias a su financiamiento pude
desarrollar y elaborar mi estancia durante mi investigación en la Ciudad de
México.
A la Dra. Rosa Isela Guzmán Gerónimo y la Dra. Yessica Eduviges
Zamudio Cuevas, por brindarme su conocimiento y paciencia, para desarrollar
y culminar este proyecto, ya que fueron mi fuente de inspiración e iluminación
para desenvolverme completamente en el ámbito de investigación.
Al Dr. Alberto Gabriel López Reyes, la Dra. Karina Martínez Flores, la
Dra. Gabriela Angélica Martínez Nava, el M. Javier Fernández Torres y la Biol.
Mónica Guadalupe Santamaria Olmedo, por su conocimiento, y su amistad,
durante mi estancia en el Instituto Nacional de Rehabilitación.
A la Dra. Maribel Jiménez Fernández por su apoyo y disposición de
tiempo como tutora durante mi posgrado. A la Dra. Elia Nora Aquino Bolaños,
al Dr. Oscar García Barradas, al Dr. Micloth López Del Castillo Lozano, al Dr.
Iñigo Verdalet Guzmán y al Dr. Armando Jesús Martínez Chacón, por su
conocimiento y enseñanza durante el periodo de posgrado en Ciencias
Alimentarias.
A mi comité evaluador conformado por el Dr. Oscar García Barradas, el
Dr. Ebner Azuara Nieto, y el Dr. Micloth López Del Castillo Lozano, agradezco
enormemente su apoyo brindado.
A mis compañeros del posgrado, por esos momentos tan agradables
que pasamos juntos, así como por su conocimiento adquirido en sus distintas
áreas de investigación y desarrollo académico.
El presente trabajo fue presentado como parte de un proyecto de
investigación y sus resultados publicados en un capítulo de libro.

Congreso de la Liga Panamericana de Asociaciones de
Reumatología (PANLAR) llevado acabo del 7-10 de Abril del
2018, en Buenos Aires, Argentina.

Congreso Internacional de Ciencias Químicas e Ingeniería
(ChemSciE) efectuado del 26-27 de Abril del 2018, en Xalapa,
Veracruz.
ÍNDICE
Resumen
IV
Summary
V
1. Introducción……………………………………………………………………… 1
2. Marco teórico…………………………………………………………………….. 3
2.1 Antecedentes………………………………………………………………....... 3
2.1.1 Clasificación botánica, composición y propiedades biológicas
de la cereza…………………………………………………………………………. 3
2.1.2 Radicales libres y estrés oxidante…………………………………………. 5
2.1.3 Inhibición de radicales libres……………………………………………….. 6
2.1.4 Polifenoles totales y antocianinas…………………………………………. 7
2.2 Procesamiento con microondas……………………………………………… 9
2.3 Artritis gotosa…………………………………………………………………... 10
2.3.1 Estrés oxidante y la artritis gotosa………………………………………… 11
2.3.2 Métodos de evaluación de la capacidad antioxidante de un compuesto
in vitro e in vivo……………………………………………………………………... 12
3. Planteamiento del problema…………………………………………………… 15
4. Objetivos……………………………………...………………………………….. 16
4.1 Objetivo general……………………………………………………………….. 16
4.2 Objetivos específicos………………………………………………………….. 16
5. Hipótesis…………………………………………………………………………. 16
6. Material y métodos……………………………………………………………… 17
6.1 Materia prima…………………………………………………………………... 17
6.2 Metodología…………………………………………………………………….. 17
6.2.1 Obtención del puré………………………………………………………….. 17
6.2.2 Procesamiento con microondas…………………………………………… 17
6.2.3 Obtención del extracto de cereza………………………………………….. 18
6.2.4 Cuantificación de polifenoles totales………………………………………. 18
6.2.5 Cuantificación de antocianinas monoméricas……………………………. 19
6.2.6 Determinación de actividad antioxidante…………………………………. 20
6.3 Actividad antioxidante del extracto procesado y sin procesar en modelo
in vitro……………………………………………………………………………….. 21
6.3.1 Preparación y estandarización de cultivo celular………………………… 21
I
6.3.2 Preparación de cristales de urato monosódico monohidratado………... 21
6.3.3 Viabilidad celular…………………………………………………………….. 21
6.3.4 Estimulación de las células con el extracto y los CUM………………….. 22
6.3.5 Determinación de ERO intracelulares…………………………………….. 23
6.3.6 Determinación de pro-citosina IL-1β………………………………………. 23
6.3.7 Análisis estadístico………………………………………………………….. 24
7. Resultados y discusión…………………………………………………………. 25
7.1 Determinaciones del extracto de puré de cereza………………………….. 25
7.1.1 Polifenoles totales…………………………………………………………… 25
7.1.2 Antocianinas monoméricas………………………………………………… 25
7.1.3 Actividad antioxidante por medio de FRAP………………………………. 26
7.2 Evaluación de la actividad antioxidante in vitro del extracto de cereza
27
7.2.1 Viabilidad celular…………………………………………………………….. 27
7.2.2 Estrés oxidante por CellRox………………………………………………... 30
7.2.3 Actividad del extracto de cereza en interleucina IL-1β………………….. 31
8. Conclusiones…………………………………………………………………….. 35
9. Referencias………………………………………………………………………. 36
10. Apéndice………………………………………………………………………... 40
II
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Cereza dulce (Prunus avium)………………………………………….. 3
Figura 2. Estructura de cianidina-3-O-glucósido……………………………….. 4
Figura 3. Clasificación de polifenoles……………………………………………. 7
Figura 4. Estructura básica de flavonoides……………………………………… 8
Figura 5. Clasificación de flavonoides…………………………………………… 8
Figura 6. Preparación de diluciones……………………………………………… 22
Figura 7. Contenido de polifenoles totales………………………………………. 25
Figura 8. Contenido de antocianinas monoméricas……………………………. 26
Figura 9. Actividad antioxidante por método de FRAP………………………… 27
Figura 10. Viabilidad celular de extracto T0…………………………………….. 28
Figura 11. Viabilidad celular de extracto T60…………………………………… 28
Figura 12. Morfología de THP-1 a 100 µm expuestas a diluciones de extracto
T0………………………………………………………………………… 29
Figura 13. Morfología de THP-1 a 100 µm expuestas a diluciones de extracto
T60………………………………………………………………………. 29
Figura 14. Estrés oxidante de THP-1 a 24 h como tratamiento simultáneo…… 30
Figura 15. Estrés oxidante de THP-1 a 24H como pre-tratamiento……………. 32
Figura 16. Determinación de IL-1β en tratamiento simultáneo de THP-1 a 24
h………………………………………………………………………..... 33
Figura 17. Determinación de IL-1β en pre-tratamiento THP-1 a 24 h………….. 34
Figura 18. Mecanismo de producción del inflamasoma a nivel celular………... 34
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Contenido nutricional de cereza dulce……………………………… 4
Cuadro 2. Curva de calibración de polifenoles totales………………………… 18
Cuadro 3. Curva estándar de trolox……………………………………………... 20
III
RESUMEN
La fruta de la cereza es rica en antioxidantes como polifenoles y ha
demostrado ser activa contra algunas de las enfermedades más comunes de la
actualidad, incluida la gota. Sin embargo, el mecanismo de acción es aún
desconocido. El objetivo del estudio fue evaluar el estrés oxidativo en fibroblastos
humanos expuestos a cristales de urato monosódico (CUM), que desencadenan un
proceso inflamatorio. El puré de cereza se colocó en un horno de microondas con
una mesa giratoria con una potencia de 433 W. Los tiempos de tratamiento fueron
0 y 60 s. Los extractos de puré de cereza se obtuvieron por centrifugación. Los
fibroblastos humanos se estimularon con cristales de CUM durante 24 h. La
viabilidad celular se evaluó mediante tinción con azul de tripano. Se realizaron
experimentos tanto preventivos como simultáneos y se analizó el contenido celular
de las especies reactivas de oxígeno, así como las citoquinas proinflamatorias (IL1β). Los resultados obtenidos indican que ambos extractos disminuyeron los niveles
de ERO y procitosinas. Estos resultados sugirieron la aplicación potencial del puré
de cereza como tratamiento terapéutico en un ataque de gota aguda.
Palabras Clave: Cereza, Gota, In vitro, Especies Reactivas de Oxígeno, Citocinas
Proinflamatorias.
IV
SUMMARY
Cherry fruit is rich in antioxidants as polyphenols and it had shown to be
active against some of today's most common diseases, including gout. However the
mechanism of action is still unknown. The aim of the study was to evaluate the
oxidative stress in human fibroblast exposed to monosodium urate (MSU) crystals,
which trigger an inflammatory process. Cherry purée was placed in a microwave
oven with a turntable with a power of 433 W. The treatment times were 0 and 60 s.
Cherry purée extracts were obtained by centrifugation. Human fibroblastes were
stimulated with MSU crystals for 24 h. Cellular viability was evaluated by trypane
blue staining. Both preventive and simultaneous experiments were performed and
the cellular content of reactive oxygen species as well as pro-inflammatory cytokines
(IL-1β) were analyzed. The results obtained indicate that both extracts decreased
the levels of ROS and procytosines. These results suggested the potential
application of cherry purée as therapeutic treatment in an acute gout attack.
Keywords:
Cherry,
Polyphenols,
In
Proinflammatory Cytokines.
V
vitro,
Reactive
Oxygen
Species,
1. INTRODUCCIÓN
En la industria alimentaria existe una creciente demanda por productos cuyo
consumo además de aportar nutrimentos, contribuyan a la salud de los
consumidores. Existen reportes que indican que el consumo de frutas y vegetales
está relacionado con una menor incidencia de enfermedades crónico-degenerativas
(Oliviero et al., 2017). La cereza es una fruta que se caracteriza por ser una fuente
rica de compuestos polifenólicos como las antocianinas, las cuales poseen diversas
propiedades biológicas como son capacidad antioxidante, anticancerígena y
antiinflamatoria (McCune et al., 2011). Sin embargo, estos compuestos se degradan
durante el procesamiento, por lo que resulta de interés explorar la aplicación de
tecnologías no convencionales como las microondas, las cuales generan altas
temperaturas en cortos períodos de tiempo permitiendo mantener en mayor grado
los compuestos bioactivos (Dorantes-Alvarez et al., 2017), teniendo un potencial de
aplicación para el desarrollo de productos alimenticios ricos en polifenoles cuya
ingesta contribuya a la salud.
La prevalencia de gota en el mundo es variable según los países, pero afecta
entre el 1-2 % de las personas adultas, los principales factores de riesgo son la
hiperuricemia avanzada, la edad, el consumo de alcohol, dietas altas en purinas y
la obesidad y, según datos recogidos en Reino Unido, es superior al 7 % en
hombres y alcanza casi el 3 % en mujeres mayores de 75 años (Goicoechea et al.,
2012). Alrededor del 0.3-0.4 % de la población mexicana padece gota (Kuo et al.,
2015). Si esta no se trata adecuadamente puede desarrollar granulomas,
comúnmente llamados tofos gotosos, los cuales son un conjunto de células,
cristales y tejidos, llegando a causar enrojecimiento, hinchazón, dolor, hasta rigidez
en la articulación, principalmente afectando el dedo gordo de los pies.
En México, el 15 % de la población adulta padece hiperuricemia, es decir
unos 10 millones de personas (Vazquez-Mellado & Torres, 2016); esto debido al
exceso de ácido úrico (AU) en la sangre, superando concentraciones de 6.8 mg/dL
en hombres y de 6.5 mg/dL en mujeres (Urbina et al., 2017).
1
La hiperuricemia puede cursar con periodo asintomático; sin embargo, una
minoría de personas acaba desarrollando gota. La gota es una enfermedad crónica
metabólica, comúnmente relacionada con una de las artritis inflamatorias más
dolorosas, que puede llegar a ser incapacitante; esto debido a la formación de
cristales de urato monosódico (CUM) tanto en articulaciones como en tejidos
convexos.
Existen escasos informes clínicos y experimentales sobre la utilización de
cerezas como tratamiento eficaz, por ello en el presente trabajo se planteó el
desarrollo de un puré de cereza procesado con microondas con la finalidad de
obtener una mayor concentración de compuestos bioactivos y evaluar en un modelo
in vitro expuesto a CUM mimetizando un ataque agudo de gota, el efecto
antioxidante del extracto de cereza (EC) empleando una línea celular de monocitos
THP-1. Este estudio es importante para identificar los efectos protectores del
extracto de puré de cereza procesado, durante el estrés oxidante (EO) provocado
por los CUM presentes en un ataque agudo de gota.
2
3
2. MARCO TEÓRICO
2.1 Antecedentes
2.1.1 Clasificación botánica, composición y propiedades biológicas de la
cereza
El árbol de cerezo pertenece a la familia de las Rosaceae que incluye 95
géneros, entre los cuales se encuentra el género Prunus y se divide en varios
subgéneros: Prunus, Amygdalus, Padus y Cerasus. Entre el subgénero Cerasus, el
cerezo (Prunus avium L.) es la especie más cultivada, la cual tuvo su origen en Asia,
en la región comprendida entre el Mar Negro y el Mar Caspio en el año 1600, siendo
introducida y cultivada en América hasta el año 1800 por los colonos ingleses
(Lemus et al., 2005).
La cereza es la fruta del árbol de cerezo, es una drupa roja no climatérica,
globosa que contiene un solo hueso, y es apreciada por los consumidores debido a
su sabor agradable (Figura 1).
Figura 1. Cereza dulce (Prunus avium).
La cereza es un fruto rico en macronutrientes, principalmente en
carbohidratos, así como en vitaminas y minerales (Cuadro 1) (McCune et al., 2011).
3
Nutrimento
Energía (Kcal)
Proteína (g)
Grasa (g)
Carbohidratos (g)
Fibra (g)
Índice glicémico
Vitamina C (mg)
Vitamina A (IU)
Potasio (mg)
β-Carotenos (µg)
Antocianinas totales (mg)
Quercetina (mg)
Cereza dulce
63
1.06
0.2
16.0
2.1
22
7
64
222
38
80.2
2.64
Cuadro 1. Contenido nutricional de cereza dulce.
Entre los compuestos polifenólicos que se encuentran en la cereza se tiene
a las antocianinas, como cianidina-3-O-rutinósido, cianidina-3-O-glucósido y
peonidina-3-O-rutinósido (Wu et. al., 2004); los ácidos fenólicos principalmente
derivados del ácido hidroxicinámico y del ácido p-cumárico; flavanoles y flavonoles
como catequina, epicatequina, quercitina-3-O-glucósido, quercetina-3-O-rutinósido
y kampferol- 3-O-rutinósido (Mozetic et al., 2005; Jacobek et al., 2007). Sin embargo
la biomolécula de mayor importancia es la cianidina-3-O-glucósido ya que posee
propiedades biológicas como la actividad antioxidante, antiinflamatoria, analgésica,
entre otras (McCune et al., 2011) (Figura 2).
Figura 2. Estructura de Cianidina-3-O-Glucósido.
Se ha reportado que el consumo de cerezas dulces incrementa la capacidad
antioxidante plasmática (Prior et al., 2007) y disminuye el óxido nítrico (ON),
4
actuando como un inhibidor de la inflamación (Kelley et al., 2006). De igual manera,
estudios previos realizados en ratas alimentadas con jugo de cerezas amargas
reportan un incremento de la actividad de las enzimas superóxido dismutasa (SOD)
en hígado y sangre, y glutatión peroxidasa (GPx), cuyas enzimas participan en la
triada antioxidante endógena (Šarić et al., 2009).
Es por ello, que dicho fruto podría tener un papel de gran importancia en la
artropatía gotosa, ya que debido a sus propiedades biológicas podría actuar como
un tratamiento preventivo y/o coadyuvante durante ataques agudos de gota.
Debido a lo anterior, el desarrollo de productos de cereza resulta de especial
interés para la industria de alimentos ante la demanda de los consumidores por
alimentos ricos en antioxidantes que inhiban a los radicales libres (RL). Sin
embargo, se sabe que las tecnologías tradicionales degradan los compuestos
fenólicos, por lo que es de vital importancia explorar la aplicación de tecnologías no
convencionales.
2.1.2 Radicales libres y estrés oxidante
Los radicales libres son átomos o moléculas que contiene un electrón
desapareado en su orbital exterior. En un organismo el metabolismo aerobio
produce especies reactivas de oxígeno (ERO), tales como: el anión superóxido (O2), radical hidroxilo (OH-), el oxígeno singlete y el peróxido de hidrógeno (H2O2), las
cuales participan en el estallido respiratorio de las células fagocíticas, activadas por
el contacto de partículas extrañas (Saavedra et al., 2010). En condiciones normales,
el organismo neutraliza los radicales libres con enzimas antioxidantes como la SOD,
GPx y Catalasa (CAT), dichas enzimas forman parte de la triada antioxidante, las
cuales participan en la producción de compuestos microbicidas cuando hay
presencia de agentes extraños en el organismo (Zhang et al., 2016).
El mecanismo principal de la SOD es convertir al O2- en H2O2, un radical libre
menos dañino, esto debido a que el superóxido es el radical más poderoso y
peligroso. Por otro lado, el GPx y la CAT se encargan de eliminar el H2O2, sin
5
embargo los mecanismos son diferentes, la GPx cataliza la reducción del H2O2
evitando su oxidación en radicales de peróxido, mediante un mecanismo
antioxidante GPx/GRd (Glutatión reductasa), mientras dicho mecanismo de la CAT
es SOD/CAT. Ambos mecanismos no actúan a la par, la CAT actúa en presencia
de altas concentraciones de H2O2 y la GPx lo hace a concentraciones bajas, lo que
demuestra una correlación inversa en la actividad de ambas enzimas (Prego et al.,
1997).
Cuando las especies oxidantes superan a los sistemas antioxidantes se
presenta un desbalance a favor de la oxidación, generando un estado de estrés
oxidante celular, el cual puede provocar daños a células y biomoléculas, como
ácidos nucleicos, proteínas, polisacáridos y lípidos. Actualmente se sabe que el
estrés oxidante contribuye a procesos inflamatorios induciendo daños a la
membrana sinovial y otros tejidos articulares, así mismo provocando disfunción
endotelial, considerado este último como el factor de riesgo principal de
enfermedades cardiovasculares (Saavedra et al, 2010).
2.1.3 Inhibición de radicales libres
Los antioxidantes son biomoléculas que poseen la capacidad de ceder
electrones, de tal manera que inhiben el estrés oxidante generado por determinadas
situaciones, como la autoxidación de la glucosa, la vía del sorbitol, la glicosilación
de proteínas, los productos de glicosilación avanzada, el gasto excesivo de
cofactores reducidos; esto aunado a la reducción de las defensas antioxidantes, la
capacidad redox de la célula y de la capacidad amortiguadora antioxidante (Salinas
et al., 2013), de tal manera, que se reduce la producción de las ERO durante el EO,
dichos antioxidantes se encuentran de manera endógena y exógena.
Los antioxidantes endógenos son aquellos que se encuentran presentes en el
organismo, dentro de los cuales están las enzimas SOD, GPx y CAT (Zhang et al.,
2016). Por otro lado, los antioxidantes exógenos son aquellos que provienen de los
6
alimentos dentro de la dieta, estos se encuentran en frutos y vegetales, como el
ácido ascórbico, los tocoferoles y carotenos (Coronado-H. et al., 2015).
Por ello, el consumo de alimentos ricos en antioxidantes es de vital importancia,
ya que intervienen en enfermedades cardiovasculares, artropatías, cáncer, y
enfermedades
neurodegenerativas
como
el
Alzheimer,
ya
que
dichas
enfermedades están asociadas por la producción descontrolada de radicales libres
(Oliviero et al., 2017).
2.1.4 Polifenoles totales y antocianinas
En la naturaleza existe una amplia variedad de alimentos, cuyos compuestos
presentan una estructura molecular caracterizada por la presencia de anillos
fenólicos, dichos compuestos son llamados polifenoles.
Estos se originan principalmente en las plantas y frutos, y se clasifican de
acuerdo a la cantidad de anillos y sustituyentes que poseen, así como al tipo de
enlace que presentan. Los principales grupos de polifenoles son: ácidos fenólicos
(derivados del ácido hidroxibenzoico o del ácido hidroxicinámico), estilbenos,
lignanos y flavonoides (Quiñones et al., 2012) (Figura 3).
a)
c)
b)
d)
Figura 3. Clasificación de polifenoles. a) Lignanos b) Flavonoides c) Ácidos
fenólicos d) Estilbenos.
Dentro de los grupos mencionados, los flavonoides son de gran relevancia para
nuestro estudio, estos son compuestos de bajo peso molecular que comparten un
esqueleto común difenilpirano (C6-C3-C6’), compuesto por dos anillos fenilo (A y B)
ligados a través de un anillo C de pirano heterocíclico (Figura 4).
7
Figura 4. Estructura básica de flavonoides.
Los flavonoides se encuentran principalmente como glucósidos, pero también
pueden aparecer en forma libre, también llamados agliconas. Los glucósidos se
pueden encontrar de dos formas: como O-glucósidos con los carbohidratos ligados
a través de átomos de oxígeno (enlace hemiacetal), o como C-glucósidos con los
carbohidratos ligados a través de enlaces carbono-carbono (Quiñones et al., 2012).
Los flavonoides se clasifican de acuerdo al estado de oxidación del anillo
heterocíclico C y la posición del anillo B (Figura 5).
Figura 5. Clasificación de flavonoides.
Dichos grupos se clasifican de la siguiente manera:

Flavonoles: Se encuentran principalmente en verduras y las frutas, así
mismo el té y el vino son también alimentos ricos en flavonoles.
8

Flavonas: Son los flavonoides menos abundantes en los alimentos. El
perejil y apio son la única fuente comestible de flavonas.

Flavanonas: Aparecen a altas concentraciones en cítricos y en tomates,
se localizan mayoritariamente en las partes sólidas de la fruta.

Isoflavonas: Se pueden presentar como agliconas, o a menudo
conjugadas con glucosa, pero son termosensibles, la soya y sus
derivados son la principal fuente de isoflavonas.

Flavanoles: Aparecer como monómeros (catequinas), como dímeros
condensados entre sí y como oligómeros (procianidinas), o bién pueden
aparecer
como
polímeros
(proantocianidinas)
se
encuentran
principalmente en fresas y arándanos.

Antocianinas: Son compuestos termolábiles e hidrosolubles, por ello se
requiere de tecnologías que disminuyan su degradación, constituyen
uno de los grupos más importantes de pigmentos vegetales. Las
antocianidinas están ampliamente distribuidas en la dieta humana. Se
pueden encontrar en ciertas variedades de cereales, el vino tinto y en
algunos vegetales, pero principalmente se encuentran en los frutos rojos
o frutas del bosque. (Castañeda-Sánchez & Guerrero-Beltrán, 2015).
2.2 Procesamiento con microondas
La tecnología de microondas se caracteriza principalmente por la aplicación de
altas temperaturas en cortos períodos de tiempo, permitiendo mantener en mayor
grado la calidad sensorial, y nutrimental de los alimentos; esto debido a la
inactivación de enzimas, reducción del volumen del material, expulsión del aire
atrapado intracelularmente, disminución de la carga microbiana y eliminación de
aromas o sabores indeseables (Montiel, 2008).
Una de las aplicaciones del microondas es el escaldado, el cual generalmente
se realiza por ebullición o con vapor; sin embargo, diversos reportes indican que los
frutos y vegetales escaldados por métodos convencionales presentan una mayor
pérdida de nutrimentos y compuestos bioactivos debido a la lixiviación. Recientes
investigaciones han sido enfocadas a su aplicación como un pretratamiento en
9
diversos procesos, con la finalidad de mantener o incrementar los compuestos
bioactivos en productos como purés, jugos, botanas, entre otros (Dorantes-Alvarez
et al., 2017).
En purés de manzana variedad red y champion que fueron escaldados con
microondas durante 2 min a 80 °C se mantuvo en mayor concentración el contenido
de sustancias fenólicas como procianidinas, quercetina, catequina y ácido
clorogénico, en comparación con muestras escaldadas en agua durante 4 min a 90
°C, mientras que la actividad antioxidante fue ligeramente superior en las muestras
procesadas con microondas (Gerard & Roberts, 2004). La aplicación del escaldado
asistido con microondas en diversos procesos de frutos y vegetales ricos en
polifenoles podría significar una ventaja desde el punto de vista de salud al
minimizar la degradación de estos compuestos.
2.3 Artritis gotosa
La artritis gotosa o comúnmente llamada gota, es una enfermedad metabólica
que se desarrolla por la sobreproducción de ácido úrico, generándose una
cristalización en las articulaciones, como urato monosódico, dichos cristales
provocan una reacción inflamatoria aguda, caracterizada por un acumulamiento
masivo de leucocitos, de manera que se liberan citoquinas, quimioquinas, ERO y
enzimas proteolíticas (Oliviero & Scanu, 2017) provocando enrojecimiento,
inflamación y dolor, por lo que es considerada una enfermedad incapacitante
(González, 2003).
En México 3 % de la población padece dicha enfermedad, afectando
principalmente a varones adultos. Cuando la gota cursa un período crónico existe
una formación de granulomas, dicha formación se encuentra estructurada por un
conjunto de células, CUM y tejidos, formando cúmulos en las articulaciones, los
cuales son llamados tofos gotosos (Goicoechea et al., 2012).
Esencialmente, los CUM se forman en la superficie del cartílago articular, sobre
fibras colágenas del cartílago que han sido alteradas por un proceso de artrosis.
Una vez formados los cristales, nuevos cristales encuentran la situación ideal de
10
nucleación y crecimiento sobre ellos, lo que facilita la formación de los tofos, que
pueden alcanzar gran tamaño.
De acuerdo con Lozano (2004), la gota se puede clasificar en dos tipos;

Primaria; Abarca los trastornos hereditarios del metabolismo de las
purinas, que cursan con la hiperproducción de ácido úrico.

Secundaria; Abarca aquellos casos donde el origen de la hiperuricemia
es adquirido, es decir, secundario a otros procesos, puede deberse a la
hiperproducción de ácido úrico, bien de origen exógeno (dietas
hiperproteícas e hipercalóricas), ingestión excesiva de etanol, entre
otros.
2.3.1 Estrés oxidante y la artritis gotosa
Debido a la acción oxidante de las ERO sobre los lípidos de la membrana, las
proteínas celulares y los ácidos nucleicos (ADN, ARN), el estrés oxidante ha sido
asociado al desarrollo de diversas enfermedades como la artritis gotosa.
Se sabe que los CUM generan un EO y un estado inflamatorio con la liberación
de ERO, como el O2-, H2O2 y del nitrógeno como ON, los cuales inducen daños a la
membrana sinovial y otros tejidos articulares (Pineda et al., 2015).
Recientemente se demostró que el resveratrol y su precursor la polidatina
inhiben la producción de ERO en monocitos expuestos a CUM (Datos no
publicados). Se ha reportado que una taza de cerezas consumidas de forma regular,
puede reducir el riesgo de un ataque agudo de gota, sin embargo, es necesario
corroborar estos hallazgos a través de ensayos clínicos y observacionales, antes de
la recomendación de las cerezas como tratamiento complementario para prevenir
ataques de gota (Zhang et al., 2012).
Existen dos teorías acerca del mecanismo de acción de las cerezas, la primera
es que por su contenido de ascorbato, ejerce una actividad biológica sobre los
receptores tubulares renales impactando en la filtración de urato, y la segunda está
relacionada a su contenido de vitamina C o de antocianinas, las cuales han
11
mostrado propiedades antiinflamatorias al inhibir a la ciclooxigenasa y la modulación
de la secreción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Gelber & Solomon,
2012).
Se reportó que el jugo concentrado de cerezas inhibe hasta un 60 % la
producción de Interleucina-1 beta (IL-1β). Por tal motivo, resulta importante evaluar
si los mecanismos de generación del EO son inhibidos por el extracto del puré de
cereza (Schlesinger et al., 2012). Este estudio será importante para diseñar un
alimento funcional, que sean parte de la dieta de individuos con la enfermedad de
la gota.
2.3.2 Métodos de evaluación de la capacidad antioxidante de un compuesto
in vitro e in vivo
Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que
permiten el mantenimiento de las células in vitro, manteniendo al máximo sus
propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Los cultivos celulares se utilizan
tanto en la investigación básica como en la aplicada.
En la investigación aplicada, las técnicas del cultivo celular son utilizadas para
áreas como;

Virología: Cultivo de virus animales y de plantas, producción de
vacunas, etc.

Biotecnología: Producción industrial de fármacos en birreactores como
interferón, insulina, hormona del crecimiento, etc.

Inmunología: Producción de anticuerpos monoclonales, señalización de
fenómenos de inflamación, etc.

Farmacología: Efecto de diversos fármacos, interacciones con el
receptor, fenómenos de resistencia, etc.
12

Ingeniería de tejidos: Producción de tejidos artificiales, injertos o
autotrasplantes, desdiferenciación y diferenciación inducida, etc.

Toxicología: Citotoxicidad, mutagénesis, carcinogénesis, etc.
Los modelos de células en cultivo son empleadas para la evaluación de la
eficacia de diversas sustancias, esto debido a que tienen una serie de ventajas
frente a otros modelos experimentales, como su menor costo económico, la
criopreservación de las líneas celulares y la facilidad de control de las condiciones
experimentales.
En la investigación enfocada a la validación de alimentos funcionales, los
modelos celulares proporcionan información valiosa sobre los mecanismos de
acción y la eficacia protectora de sustancias bioactivas presentes en los productos
alimenticios. Para ello, las células son incubadas con la sustancia pura o el extracto
y posteriormente son expuestas a la acción de una sustancia oxidante.
La evaluación del efecto protector proporcionado por la muestra, se realiza
mediante el análisis de diversos biomarcadores o bioindicadores del daño causado
por el EO (Guerra, 2001).
La línea THP-1 es una línea celular de células monocíticas de leucemia
humana, que ha sido ampliamente utilizada para estudiar funciones, mecanismos,
vías de señalización y el transporte de nutrientes de los monocitos/macrófagos.
Forman parte del compartimento inmunológico innato, en el que su principal función
es el reconocimiento de patógenos extraños como bacterias, hongos y virus
(Chanput et al., 2014).
Los monocitos son células circulantes en la sangre, mientras que los
macrófagos sólo se pueden encontrar en el sitio de la infección/inflamación (los
llamados macrófagos derivados del monocito inflamatorio) o en los nódulos de
tejido/linfocitos (los denominados macrófagos residentes en el tejido).
13
Estudios realizados en enfermedades inflamatorias reportan que una vez que
fueron expuestas a los lipopolisacáridos (LPS) los monocitos respondieron
rápidamente con un cambio en la expresión de genes relacionados con la
inflamación en comparación con el forbol 12-miristato-13-acetato (PMA) (IL-1β, IL6, IL-8, IL-10 y TNF-α) (Chanput et al., 2010).
Gracias a la capacidad de dicha línea, es posible experimentar la exposición
simultánea de las células THP-1 a LPS y compuestos alimentarios, junto con el
análisis de expresión génica, permitiendo que sea una herramienta útil in vitro para
seleccionar los compuestos de modulación de inflamación y alimentos.
13
14
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En la actualidad los consumidores demandan productos y alimentos que
brinden beneficios a su salud, en particular para la prevención de enfermedades
crónico-degenerativas como la artritis gotosa, enfermedad que afecta al 3 % de la
población mexicana, para la cual se requiere de alternativas para su prevención y/o
tratamiento.
Los alimentos son fuente de nutrientes, vitaminas, minerales y compuestos
bioactivos que poseen diversas propiedades biológicas como los polifenoles, los
cuales se encuentran en frutos como las cerezas, estás se expenden a nivel
nacional en forma cruda o en conservas.
Existen reportes que indican que las cerezas pueden reducir el riesgo de la
artritis gotosa. Sin embargo, no existen productos elaborados a partir de cereza que
representen una alternativa para los pacientes de gota. Con base en lo anterior el
presente proyecto de tesis se justifica y plantea la elaboración de un puré de cerezas
procesado con microondas con el fin de evaluar el efecto antioxidante in vitro en un
modelo de ataque agudo de gota, permitiendo conocer así, el efecto protector ante
el daño oxidante presente durante la artritis gotosa.
15
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Evaluar la actividad antioxidante y antiinflamatoria in vitro del puré de cereza
procesado con microondas en un modelo de monocitos humanos expuestos a
cristales de urato monosódico mimetizando un ataque agudo de gota.
4.2 Objetivos específicos

Evaluar el contenido de polifenoles totales, antocianinas monoméricas y
actividad antioxidante del extracto de cereza con procesamiento del
microondas y del extracto de puré de cereza sin tratamiento con microondas.


Evaluar el efecto del extracto obtenido del puré de cereza procesado con
microondas y sin tratamiento, durante el daño oxidante inducido por los
cristales de urato monosódico en cultivos celulares.
5. HIPÓTESIS
El procesamiento con microondas del puré de cereza permitirá obtener un
extracto con mayor actividad biológica sobre el estrés oxidante inducido por los
CUM en un modelo in vitro de ataque agudo de gota.
16
6. MATERIAL Y MÉTODOS
6.1 Materia prima.
El fruto de cereza fue adquirido durante los meses de Mayo–Junio del 2017 de
la empresa local Grupo la norteñita ubicada en el Km 98.5 de la carretera
Chihuahua–Cuauhtémoc S/N, C.P. 31552, de Cd. Cuauhtémoc, Chihuahua, en un
estado de maduración comercial. Una vez adquiridos, los frutos se lavaron con una
solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 0.1 % durante 2 min, y fueron
almacenados bajo congelación (-20 °C) para procedimientos posteriores.
6.2 Metodología
6.2.1 Obtención del puré de cereza.
Los frutos fueron molidos con un homogenizador marca Braun por períodos de
5 segundos para después ser procesados por microondas.
6.2.2 Procesamiento con microondas.
Se colocaron 50 g del puré de cereza en una caja Petri y calentaron en un
horno de microondas marca Panasonic operando a una frecuencia de 2450 MHz
con una potencia de salida de 435 W durante periodos de 0 y 60 s (Dorantes-Alvarez
et al., 2017). La potencia nominal del horno de microondas se determinó de acuerdo
al método descrito previamente por Buffler (1992).
Posteriormente, después de salir del microondas se colocaron en un baño de
hielo, para realizar un choque térmico por un período de 2 min, esto con la finalidad
de alargar la vida útil del puré evitando a su vez, la pérdida de nutrientes, aromas y
texturas.
Los tratamientos experimentales se elaboraron por triplicado, y se utilizaron
para cuantificar los componentes fenólicos obtenidos y su capacidad antioxidante.
17
6.2.3 Obtención del extracto.
Se colocaron 40 g del puré previamente sin procesar y procesado con
microondas en tubos de centrifuga, posteriormente se centrifugaron a 1,500 rpm,
durante 30 min a 4 °C, obteniendo el extracto líquido por medio de decantación, y
posteriormente fue almacenado a -20 C en frascos ámbar de 50 mL. Dicho extracto
líquido fue empleado para evaluación antioxidante en un modelo in vitro.
6.2.4 Cuantificación de polifenoles totales.
La técnica empleada para cuantificar los polifenoles totales del extracto fue
mediante el método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu (Singleton & Rossi,
1965) para el cual se utilizó una curva de calibración de ácido gálico, usando una
solución patrón de 12 mg EAG/100 mL (Cuadro 2). La intensidad del color se midió
a una absorbancia de 750 nm.
Concentración
(µg/mL)
Solución
patrón (mL)
Agua
destilada (mL)
120
100
80
60
40
20
0
2.000
1.667
1.333
1.000
0.667
0.333
0.000
0.000
0.333
0.667
1.000
1.333
1.667
2.000
Cuadro 2. Curva de calibración de polifenoles totales.
De cada extracto se tomaron 200 µL, y se adicionaron 200 µL del reactivo FolinCiocalteu 2 N, posteriormente se agitó en un vortex, y se agregaron 2 mL de la
solución de carbonato de sodio 7 %: por último se añadieron 2 mL de agua
destilada. Se agitó nuevamente y se dejó reposar por 1 hora a temperatura
ambiente.
18
La concentración de las muestras se calculó con base en la curva de
calibración (Apéndice 1), y se expresó como mg equivalentes de ácido gálico/100 g
de muestra (mg EAG/100 g).
6.2.5 Cuantificación de antocianinas monoméricas.
Se determinó el contenido de antocianinas monoméricas por el método de pH
diferencial (Giusti y Wrolstad, 2001). Se prepararon las soluciones de pH 1 y pH 4.5.
Para el buffer pH 1 (0.025 M) se pesaron 0.186 g de cloruro de potasio (KCl) y se
disolvieron en 90 mL de agua destilada, posteriormente se ajustó el pH a 1 con
ácido clorhídrico (HCl), una vez ajustado, se aforó a 100 mL. Para el buffer pH 4.5
se pesaron 5.44 g de acetato de sodio y se diluyó en 90 mL de agua destilada, se
ajustó el pH mediante HCl, por último se aforó a 100 mL.
Se diluyeron 2.5 mL de cada extracto en 25 mL de agua destilada.
Posteriormente se tomaron 600 µL por duplicado de cada extracto y se adicionaron
a 2.4 mL de buffer pH 1 y a 2.4 mL del buffer pH 4.5. Se dejó en reposo por 7 min
a temperatura ambiente.
Posteriormente se realizó un barrido en el espectrofotómetro de 420, 505, 510,
515 y 700 nm. La concentración de pigmentos monoméricos se calculó mediante la
fórmula para antocianinas monoméricas como sigue:
La concentración de antocianinas monoméricas se expresó como mg
equivalentes de cianidina-3-glucósido/L (mg EC3G/L).
19
6.2.6 Determinación de actividad antioxidante
La actividad antioxidante del extracto se evaluó mediante la técnica FRAP
descrita por Benzie y colaboradores (1996) donde se cuantificó la capacidad de
captación de radicales libres que tiene el extracto del puré de cereza a través de
una reducción de Fe3+ a Fe2+, formando una coloración azul, la intensidad del color
se midió a una longitud de onda de 593 nm. Se utilizó una curva de calibración
estándar de trolox (Cuadro 3).
Concentración
(µM)
Solución
patrón (mL)
Metanol 80 %
(mL)
0
133
266
400
533
666
800
0.0
0.4
0.6
1.0
1.4
1.6
2.0
2.0
1.6
1.4
1.0
0.6
0.4
0.0
Cuadro 3. Curva estándar de Trolox.
El reactivo FRAP se preparó mediante la siguiente mezcla de a), b) y c), en una
relación de 100:10:10 (v:v:v) al momento de usarla. Todo el procedimiento debe
realizarse protegido de la luz.
a) Buffer de acetato de sodio 300 mM a pH 3.6.
b) FeCl3 – 6H2O 20 nM
c) TPTZ (2,4,6-Tripiridil-s-triazina) 10 mM
La concentración de las muestras se calculó con base en la curva de
calibración (Apéndice 2), y se expresaron como µM ET/100 g de muestra.
20
6.3 Actividad antioxidante del extracto procesado y sin procesar en modelo in
vitro.
6.3.1 Preparación y estandarización de cultivo celular
El cultivo de monocitos humanos, se realizó a partir de una línea celular
comercial THP-1 (ATCC TIB-202), el medio de cultivo utilizado fue RPMI el cual se
complementó
con
10
%
de
suero
fetal
bovino
(SFB)
y
1
%
de
penicilina/estreptomicina (P/S) en una atmósfera controlada de CO2 al 5 % con una
humedad del 95 % a 37 °C, hasta alcanzar una confluencia de 80 %, es decir, se
mantuvieron en la misma caja de cultivo hasta que sobrepasaron el número máximo
de células por mL, tomando 250,000 células por mL, para una caja nueva,
aproximadamente cada 7 días.
La viabilidad celular fue determinada usando la tinción con azul tripano en
cámara de Neubauer.
6.3.2 Preparación de los cristales de urato monosódico monohidratado
Los CUM se prepararon siguiendo el procedimiento de Zamudio et. al., 2016.
Para la identificación de su forma y birrefringencia se empleó microscopía de luz
polarizada. Se pesaron 4 g de ácido úrico (Sigma-Aldrich) y se disolvieron en 800
mL de agua desionizada estéril calentada a 60 °C, ajustada a un de pH 8.9 con
NaOH 0.05 N, y se dejaron cristalizar toda la noche a temperatura ambiente.
Para recuperar los cristales se centrifugaron a 4400 rpm a 4 °C. Posteriormente
los cristales fueron lavados con agua destilada a 4 °C y secados a 60 °C durante
48 h en una estufa con aire en circulación forzada. Por último, los cristales fueron
triturados en un mortero y antes de cada experimento se esterilizaron durante 2 h a
180 °C.
6.3.3 Viabilidad celular
Se realizó viabilidad celular del EC T0 y T60 con las células, esto para verificar
que el extracto por sí solo no actué como un tóxico. Para ello, se hicieron diluciones
del extracto, y se colocaron con células THP-1 y medio RPMI complementado en
21
20
cajas de 12 pozos por duplicado. Las diluciones que se realizaron fueron 1:200,
1:400, 1:800 1:1000 y 1:1600 (Figura 6), tomando como control a las células con
medio RPMI complementado sin el extracto.
Figura 6. Preparación de diluciones.
Posteriormente, se almacenaron por 24 h en una incubadora con una
atmósfera controlada de 5 % CO2, humedad 95 %, temperatura 37 °C. Una vez
almacenadas, se procedió a observar la proliferación mediante un microscopio
EVOS. Posteriormente se realizó conteo de azul de tripano por cada muestra,
tomando en cuenta las diluciones presentes. Una vez obtenidos los resultados del
grupo control, y diluciones 1:200, 1:400, 1:800, 1:1000 y 1:1600 (v:v), se procedió a
realizar los análisis estadísticos. Con base en los resultados obtenidos, se procedió
a utilizar dichas diluciones para los experimentos posteriores. Cada experimento se
realizó por triplicado.
6.3.4 Estimulación de las células con el extracto y con los CUM
Se
realizaron
dos
ensayos
experimentales,
uno
como
tratamiento
coadyuvante, y otro como pre-tratamiento. Para el tratamiento coadyuvante se
realizaron experimentos donde los CUM y los extractos de cereza T0 y T60 fueron
añadidos al mismo momento del cultivo, tras 24 h se procedió a medir ERO. Para
ensayos como pre-tratamiento, se cultivaron las células 24 h antes con los EC T0 y
23
22
T60, posteriormente se añadieron los CUM y se incubaron nuevamente 24 h, por
último se procedió a medir ERO.
6.3.5 Determinación de ERO intracelulares
La producción de ERO intracelulares se medió con el kit CellROX (Molecular
Probes, Life Technologies Cat. C10422), que es una prueba fluorogénica diseñada
para medir ERO en células vivas.
Primero las células fueron recolectadas de una caja de 96 pozos, colocando
cada grupo en tubos eppendorf de 1.5 mL, para ser centrifugadas a 3,600 rpm por
5 min a 4 °C, posteriormente los sobrenadantes fueron colocados en 3 tubos
eppendorf de 0.6 mL y almacenados a -20 °C para realizar determinaciones
extracelulares. Para preparar el reactivo, se colocaron 4 µL del kit CellROX en 2 mL
de medio RPMI al 10 % SFB 1 % PS. Después de tratar las células con el EC, se
adicionaron 200 µL del reactivo CellROX previamente elaborado con una
concentración final 5 µM a las células e incubó durante 30 min a 37 ºC.
Posteriormente se retiró el sobrenadante tras haber centrifugado los tubos a
3,600 rpm por 5 min a 4 °C y se realizaron lavados con una solución buffer de fosfato
(PBS) tres veces, esto para eliminar los sobrantes del reactivo y el medio en las
células. Tras el último lavado, se resuspendieron los botones celulares con 100 µL
de PBS, y se procedió a cuantificarlas por citometría basada en imagen en un equipo
“Tali Image Based Cytometer (TIBC)” Invitrogen de Life Technologies.
Los resultados se muestran cómo % de células con estrés oxidante.
6.3.6 Determinación de interleucina IL-1β
La determinación cuantitativa de IL-1β se realizó por medio un inmunoensayo
enzimático de ELISA para sobrenadantes de cultivo celular, para ello se preparó la
placa de 96 pocillos, y se colocaron 100 µL del anticuerpo de captura por 24 h a
temperatura ambiente, posteriormente al día siguiente se realizaron 4 lavados con
PBS Tween.
23
Enseguida se colocó el buffer de bloqueo (300 µL) y se cubrió la placa con
papel aluminio, dejando reposar la placa por 1 h a temperatura ambiente.
Posteriormente se procedió a realizar 4 lavados con PBS Tween, retirando los
excedentes mediante sanitas, una vez seca la placa se colocaron 100 µL de las
muestras a analizar, recubriendo nuevamente la placa con papel aluminio y dejando
reposar por 2 hrs.
Se realizaron nuevamente 4 lavados con PBS Tween, retirando excedentes,
colocando finalmente 100 µL del anticuerpo de detección en cada pocillo, cubriendo
seguidamente la placa con papel aluminio y dejando a temperatura ambiente por 2
hrs.
Nuevamente se hicieron 4 lavados con el PBS Tween como en pasos previos,
colocando posteriormente 100 µL de Avidina, y cubriendo la placa con papel
aluminio y dejando a temperatura ambiente por 30 min. Finalmente se realizaron los
4 últimos lavados con PBS Tween, retirando los excedentes, y colocando finalmente
el anticuerpo MTB para ELISA, y se procedió a leer en un lector de micro placas al
minuto, seguida de lecturas cada 5 min, por un periodo de 30 min (1, 5, 10, 15, 20,
25 y 30 min).
6.3.7 Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza de una vía para las pruebas de ERO, con los
distintos tratamientos con CUM. Para determinar si existen diferencias
estadísticamente significativas de las variables antes mencionadas entre los cultivos
se realizará la prueba de ANOVA, así como prueba de Tukey para determinar
diferencias significativas entre las medias para valores de P ≤ 0.005.
24
25
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1 Determinaciones del extracto del puré de cereza
7.1.1 Polifenoles totales
Los resultados en cuanto al contenido de polifenoles totales en el extracto de
cereza procesado y sin procesar se muestran en la Figura 7. El extracto del puré de
cereza procesado T60 tuvo una mayor concentración en polifenoles totales con
1116 mg EAG/L en comparación con T0 con 872 mg EAG/L, es decir mostró un
incremento del 28 % en T60 (Figura 7).
Con base a estudios previos, el uso de microondas permitió obtener una mayor
extracción de compuestos bioactivos, esto es debido a una mayor disrupción de la
pared celular (Dorantes-Alvarez et al., 2017)
1200
28%
1000
( m g E A G /1 0 0 g )
P o life n o le s T o ta le s
*
800
600
400
200
0
T0
T 60
Figura 7. Contenido de polifenoles totales. T Estudiante no emparejada. Valores
expresados como media ± SEM de 3 experimentos independientes P <0.0001.
7.1.2 Antocianinas monoméricas
El extracto T60 obtuvo mayor concentración de antocianinas monoméricas con
48 mg EC3G/L, en comparación a T0 con 29 mg EC3G/L, permitiendo un aumento
del 65 % con respecto a T0 (Figura 8).
25
Lo anterior se atribuye a una mayor ruptura en la pared celular (Dorantes-
60
*
( m g E C 3 G /L )
A n to c ia n in a s M o n o m é r ic a s
Alvarez et al., 2017).
65%
40
20
0
T0
T 60
Figura 8. Contenido de antocianinas monoméricas. T Estudiante no emparejada.
Valores expresados como media ± SEM de 3 experimentos independientes P
0.0085.
7.1.3 Actividad antioxidante por el método de FRAP
La actividad antioxidante se midió por método FRAP, el extracto T0 obtuvo
66µM/100g y el T60 112 µM/100g, incrementando hasta un 69 %, lo que sugiere
que el extracto procesado T60 posee mayor actividad antioxidante en comparación
al extracto sin procesar (Figura 9).
Debido al incremento de los compuestos bioactivos, como los polifenoles
totales y antocianinas monoméricas en el extracto del puré procesado con
microondas, es de esperarse un aumento en la capacidad antioxidante.
26
150
( µ M o l/1 0 0 g )
FRAP
*
69%
100
50
0
T0
T 60
Figura 9. Actividad antioxidante por método de FRAP. T Estudiante no emparejada.
Valores expresados como media ± SEM de 3 experimentos independientes P
<0.0001.
7.2 Evaluación de la actividad antioxidante in vitro del extracto de cereza
7.2.1 Viabilidad celular
Con base en la viabilidad celular de los extractos tanto procesado como sin
procesar, T60 y T0 respectivamente, se observó que las diluciones 1:800 y 1:1600
(v:v) fueron las mejores para implementarse en los modelos in vitro, dado que hay
menor presencia de toxicidad por parte de los extractos (Figura 10 y 11).
Al momento de realizar los experimentos de vialidad celular, se encontró que
ambos extractos en las diluciones 1:200 resultaron tóxicos, ya que producían
apoptosis celular, sin embargo, en las diluciones 1:800 y 1:1600 (v:v) se encontró
un incremento en la confluencia de ambos experimentos, es decir, que hubo un
crecimiento celular mayoritario al grupo control. Lo anterior se podría atribuir a un
mayor contenido de carbohidratos en los extractos tanto procesados como sin
procesar.
27
V ia b ilid a d C e lu la r (N o . d e c é lu la s )
200
V iv a s
M u e rta s
150
100
50
0
C o n t r o l 1 :2 0 0
1 :4 0 0
1 :8 0 0
1 :1 0 0 0 1 :1 6 0 0
V ia b ilid a d C e lu la r (N o . d e c é lu la s )
Figura 10. Viabilidad celular de extracto T0. ANDEVA dos vías. Valores expresados
como media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes
P <0.0001 de interacción y de factor de columna (Post hoc de Tukey’s).
200
V iv a s
M u e rta s
150
100
50
0
C o n t r o l 1 :2 0 0
1 :4 0 0
1 :8 0 0
1 :1 0 0 0 1 :1 6 0 0
Figura 11. Viabilidad celular de extracto T60. ANDEVA dos vías. Valores
expresados como media ± desviación estándar de 3 experimentos
independientes P <0.0001 de interacción y de factor de columna (Post hoc de
Tukey’s).
Ambos experimentos fueron observados en un microscopio Evos a 100 µm,
para conocer la morfología celular de los monocitos, ante la presencia de las
diluciones de los extractos sin procesar T0 y procesado T60, respectivamente.
(Figura 12 y 13), lo cual corroboró la toxicidad de las muestras en las diluciones
1:1200.
28
Figura 12. Morfología de THP-1 a 100 µm expuestas a diluciones de extracto T0. A)
Control. B) Dilución 1:200. C) Dilución 1:400. D) Dilución 1:800. E) Dilución 1:1000.
F) Dilución 1:1600.
Figura 13. Morfología de THP-1 a 100 µm expuestas a diluciones de extracto T60.
A) Control. B) Dilución 1:200. C) Dilución 1:400. D) Dilución 1:800. E) Dilución
1:1000. F) Dilución 1:1600.
29
30
7.2.2 Estrés oxidante por CellRox.
Como se puede observar, los CUM incrementaron la producción de ERO en
monocitos a las 24 h en comparación con el control (Figura 14). Se puede observar
que la producción de ERO disminuyó de forma significativa al administrar los
extractos obtenidos del puré sin tratamiento (T0) y con tratamiento con microondas
(T60). Es decir, el estrés oxidante de las células con los extractos de cereza T0 y
T60 en el experimento simultáneo, es menor en comparación al grupo de los CUM.
Es importante mencionar que en tratamiento normal o simultáneo consistió en
40
*
& #
30
20
#
&
10
T 6 0 1 :1 6 0 0 + C U M
T 6 0 1 :8 0 0 + C U M
T 0 1 :1 6 0 0 + C U M
T 0 1 :8 0 0 + C U M
CUM
0
C o n tro l
% C é lu la s c o n e s t r é s o x id a n te
administrar los extractos al mismo tiempo que se provocaba el ataque agudo.
Figura 14. Estrés oxidante de THP-1 a 24 h como tratamiento simultaneo. ANDEVA
de una vía. Valores expresados como media ± desviación estándar de 3
experimentos independientes P 0.0206*, P 0.0271 &, P 0.0137# (Post hoc de
Tukey’s). Control: monocitos sin exposición a los CUM, CUM: monocitos expuestos
a los CUM, T0 1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de
cereza sin procesar a una dilución 1:800, T0 1:1600+ CUM: monocitos expuestos a
los CUM + extracto de puré de cereza sin procesar a una dilución 1:1600, T60
1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza
procesado con microondas 60 s a una dilución 1:800, T60 1:1600+ CUM: monocitos
expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza procesado con microondas 60 s
a una dilución 1:1600.
30
Los resultados obtenidos sugieren la actividad antioxidante del extracto de
cereza en un modelo in vitro de estrés oxidante inducido por CUM. Diversos
estudios sugieren el potencial de aplicación como terapéutico de polifenoles como
el bergamot y la polidatina en el tratamiento de la gota (Lyn y Bochu, 2014; Olivero
et al., 2017).
Por otro lado, el pretratamiento consistió en administrar los extractos 24 h antes
de la inmersión de los CUM, actuando como preventivo antes de un ataque agudo
de gota, en el caso del experimento como pretratamiento, en los monocitos que
fueron expuestos a CUM y recibieron el pretratamiento con extracto obtenido de
cereza sin tratamiento (T0) y con tratamiento con microondas (T60) durante 24
horas, la producción de ERO disminuyó en comparación con los monocitos que
fueron expuestos a los CUM (Figura 15). Estudios realizados por Zhang y
colaboradores (2012) con el consumo de ½ taza de cerezas 2 días ayuda a la
prevención del ataque agudo de gota.
Los presentes resultados sugieren la actividad antioxidante del extracto de
cereza en un modelo in vitro de estrés oxidante inducido por CUM, y su potencial
de aplicación tanto como preventivo y terapéutico en un ataque agudo de gota.
7.2.3 Actividad del extracto de cereza en interleucina IL-1β
Dado que la gota es una patología con un fuerte componente tanto oxidante
como inflamatorio, se evaluó el efecto del extracto de cereza en la interleucina IL1β. Al evaluar el efecto de los extractos obtenidos de cereza sin (T0) y con
tratamiento con microondas (T60) en un tratamiento normal o simultáneo, es decir
su administración ante un ataque agudo de gota (Figura 16) se observó una
disminución de la interleucina IL-1β en los grupos donde se administró el extracto
de cereza en comparación con el grupo correspondiente a los monocitos expuestos
a los CUM, lo cual fue estadísticamente significativo, P<0.0001. Diversos estudios
indican que en la enfermedad de la gota los cristales de urato monosódico activan
el inflamasoma, liberando así interleucina 1β (IL-1β). Lo anterior plantea la
31
32
necesidad del desarrollo de terapias de la gota para ataque agudo que bloqueen la
40
****
***
*
30
20
**
10
**
**
T 6 0 1 :1 6 0 0 + C U M
T 6 0 1 :8 0 0 + C U M
T 0 1 :1 6 0 0 + C U M
CUM
T 0 1 :8 0 0 + C U M
0
C o n tro l
% C é lu la s c o n e s t r é s o x id a n te
interleucina IL-1.
Figura 15. Estrés oxidante de THP-1 a 24 h como pre-tratamiento. ANDEVA una
vía. Valores expresados como media ± desviación estándar de 3 experimentos
independientes P 0.0219*, P 0.0029**, P 0.0001***, P <0.0001**** (Post hoc de
Tukey’s). Control: monocitos sin exposición a los CUM, CUM: monocitos expuestos
a los CUM, T0 1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de
cereza sin procesar a una dilución 1:800, T0 1:1600+ CUM: monocitos expuestos a
los CUM + extracto de puré de cereza sin procesar a una dilución 1:1600, T60
1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza
procesado con microondas 60 s a una dilución 1:800, T60 1:1600+ CUM: monocitos
expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza procesado con microondas 60 s
a una dilución 1:1600.
32
&
IL -1  ( p g /m L )
600
*
**
#
400
**
#
200
T 6 0 1 :1 6 0 0 + C U M
T 6 0 1 :8 0 0 + C U M
T 0 1 :1 6 0 0 + C U M
T 0 1 :8 0 0 + C U M
CUM
C o n tro l
0
Figura 16. Determinación de IL-1β en tratamiento simultáneo de THP-1 a 24 h.
ANDEVA una vía. Valores expresados como media ± desviación estándar de 3
experimentos independientes P 0.0040 *, P 0.0212#, P <0.0001&, P 0.0008 (Post hoc
de Tukey’s). Control: monocitos sin exposición a los CUM, CUM: monocitos
expuestos a los CUM, T0 1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto
de puré de cereza sin procesar a una dilución 1:800, T0 1:1600+ CUM: monocitos
expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza sin procesar a una dilución
1:1600, T60 1:800+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de
cereza procesado con microondas 60 s a una dilución 1:800, T60 1:1600+ CUM:
monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza procesado con
microondas 60 s a una dilución 1:1600.
De igual manera, en el tratamiento preventivo los extractos de puré de cereza
sin procesar (T0) y procesado con microondas (T60) también indujeron una
reducción de la interleucina IL-1β (Figura 17). De acuerdo a Schlesinger (2012) y
Chanput (2010), esto se debe a la inhibición de la producción de la IL-1β durante la
fagocitosis del CUM por parte de los monocitos, de tal manera que el extracto de
cereza interviene en el mecanismo del inflamasoma (Figura 18). Cuando ocurre
dicha inactivación por parte del mecanismo del inflamasoma, este no permite la
liberación de mediadores pro-inflamatorios tras la señalización del endotelio, lo cual
reduce el reclutamiento de neutrófilos, evitando así la liberación de más citosinas
pro-inflamatorias.
33
500
**
*
IL -1  ( p g /m L )
400
300
200
100
T 6 0 1 :1 6 0 0 + C U M
T 6 0 1 :8 0 0 + C U M
T 0 1 :1 6 0 0 + C U M
T 0 1 :8 0 0 + C U M
CUM
C o n tro l
0
Figura 17. Determinación de IL-1β en pre-tratamiento THP-1 a 24 h. ANDEVA una
vía. Valores expresados como media ± desviación estándar de 3 experimentos
independientes P 0.0400*, P 0.0249** (Post hoc de Tukey’s). Control: monocitos sin
exposición a los CUM, CUM: monocitos expuestos a los CUM, T0 1:800+ CUM:
monocitos expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza sin procesar a una
dilución 1:800, T0 1:1600+ CUM: monocitos expuestos a los CUM + extracto de
puré de cereza sin procesar a una dilución 1:1600, T60 1:800+ CUM: monocitos
expuestos a los CUM + extracto de puré de cereza procesado con microondas 60
s a una dilución 1:800, T60 1:1600+ CUM: monocitos expuestos a los CUM +
extracto de puré de cereza procesado con microondas 60 s a una dilución 1:1600.
Figura 18. Mecanismo de producción del inflamasoma a nivel celular.
34
8. CONCLUSIONES
El procesamiento por microondas permitió obtener un extracto con mayor
concentración de compuestos bioactivos, tales como polifenoles totales,
antocianinas monoméricas y su capacidad antioxidante.
Los extractos de puré de cereza mostraron potencial de aplicación como pretratamiento y durante un ataque agudo de gota al reducir la producción de ERO e
interleucina IL-1β, factores que intervienen durante el estrés oxidante y procesos
inflamatorios, sin embargo no se apreció que el extracto procesado sea más efectivo
en comparación al extracto sin procesar.
La aplicación del extracto procesado por microondas como pre-tratamiento,
demostró tener ligeramente una mayor actividad biológica en cuanto a la actividad
antiinflamatoria.
35
9. REFERENCÍAS
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Agricultural and Food Chemistry, 7921-7930.
39
45
10. APÉNDICE
Curva de calibración
0.7
y = 0.0048x - 0.0015
R² = 0.9989
0.6
Absorbancia
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
-0.1
0
20
40
60
80
100
120
140
μg/ml
Apéndice 1. Curva de calibración de ácido gálico.
Curva de calibración
1.4
y = 0.0015x - 0.0036
R² = 0.9985
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
100
200
300
400
500
600
700
-0.2
Apéndice 2. Curva de calibración de trolox.
40
800
900