s41551-021-00760-7.en.es

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Artículo de revisión
https://doi.org/10.1038/s41551-021-00760-7
Diagnóstico basado en CRISPR
Michael M. Kaminski1,2, Omar O. Abudayyeh3,4, Jonathan S. Gootenberg3,4, Feng Zhang3,4,5,6,7,8y
James J. Collins6,8,9,10✉
El diagnóstico preciso y oportuno de la enfermedad es un requisito previo para una intervención terapéutica y una vigilancia epidemiológica eficientes. Los
diagnósticos basados en la detección de ácidos nucleicos se encuentran entre los más sensibles y específicos, aunque la mayoría de estos ensayos requieren
equipos costosos y personal capacitado. Los desarrollos recientes en tecnologías de diagnóstico, en particular aquellos que aprovechan las repeticiones
palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), tienen como objetivo permitir pruebas precisas en el hogar, en el punto de
atención y en el campo. En esta revisión, proporcionamos un resumen de la caja de herramientas en rápida expansión para el diagnóstico basado en CRISPR,
en particular los diversos ensayos, estrategias de preamplificación y lecturas, y destacamos sus principales aplicaciones en la detección de una amplia gama
de objetivos moleculares relevantes para la salud humana.
T
El diagnóstico rápido y preciso de una enfermedad es fundamental para un
en base a su secuencia para posteriormente eliminarlos mediante actividad
tratamiento eficaz y para la prevención de secuelas a largo plazo.1. Los
endonucleasa asociada a la enzima asociada a CRISPR (Cas). Aunque existen
biomarcadores basados en ácidos nucleicos asociados con enfermedades son
diversos sistemas CRISPR-Cas entre las diferentes especies de arqueas y bacterias
, estos sistemas están conectados por su dependencia de CRISPR RNA (crRNA),
esenciales para el diagnóstico porque el ADN y el ARN se pueden amplificar a partir de
13
cantidades mínimas, lo que permite su detección altamente específica mediante el
que guía a las proteínas Cas para que reconozcan y escindan los objetivos de
emparejamiento de nucleótidos complementarios. De hecho, los diagnósticos basados
ácido nucleico. El crRNA se puede programar hacia una región específica de ADN
en ácidos nucleicos se han convertido en el estándar de oro para varias afecciones
o ARN de interés a través de la hibridación con una secuencia complementaria,
agudas y crónicas, especialmente aquellas causadas por enfermedades infecciosas.2.
que en algunos sistemas está restringida a la proximidad de un motivo adyacente
Durante los brotes de enfermedades infecciosas, como se experimentó más
al protoespaciador (PAM) o secuencia flanqueante del protoespaciador.14. Hasta
recientemente con la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), las
ahora, los sistemas CRISPR-Cas se han reutilizado para una variedad de
pruebas rápidas y precisas basadas en ácidos nucleicos son vitales para un control
aplicaciones, incluida la edición específica de genomas.15, epigenomasdieciséisy
efectivo de la enfermedad.3,4. La detección de biomarcadores de ácidos nucleicos
transcriptomas17, la bioimagen de ácidos nucleicos18, la grabación de eventos
también es fundamental para la agricultura y la seguridad alimentaria, para el control
celulares19y la detección de ácidos nucleicos. En general, el área de rápida
ambiental y para la detección de agentes de guerra biológica.
evolución de los diagnósticos basados en CRISPR se basa en la especificidad, la
Los diagnósticos basados en ácidos nucleicos que se basan en la reacción en
programabilidad y la facilidad de uso de la tecnología CRISPR, y tiene como
cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) o en la secuenciación se han
objetivo crear pruebas de diagnóstico en el punto de atención (POC, por sus
adoptado ampliamente y se utilizan con frecuencia en los laboratorios clínicos. La
siglas en inglés) basadas en ácidos nucleicos para su uso en pruebas clínicas de
versatilidad, robustez y sensibilidad de la PCR han convertido a esta tecnología en
rutina. cuidado.
la más utilizada para la detección de biomarcadores de ADN y ARN. De hecho, la
En esta revisión, describimos cómo se han aprovechado las propiedades de
PCR es la técnica estándar de oro para la mayoría de los diagnósticos basados en
diferentes enzimas Cas para ensayos de diagnóstico, discutimos diferentes
ácidos nucleicos. Sin embargo, los costos de los reactivos para PCR son altos y la
estrategias de preamplificación (que hoy forman parte de la mayoría de los
técnica requiere un equipo de laboratorio sofisticado y personal capacitado.5.
ensayos de diagnóstico basados en CRISPR), examinamos enfoques para
Aunque la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos evita la necesidad de
cuantificación y multiplexación, destacamos tecnologías que combinan CRISPR
termocicladores, la amplificación no específica puede resultar en una menor
enriquecimiento de objetivos basado en secuenciación y revisión de la
especificidad de detección.6. La especificidad se puede mejorar mediante lecturas
optimización de diagnósticos basados en CRISPR para aplicaciones POC, con un
adicionales, en particular mediante sondas fluorescentes7, sondas de
enfoque en lecturas de ensayos y preparación de muestras. También
desplazamiento de cadena oligo8o balizas moleculares9. Sin embargo, existe la
proporcionamos una descripción general de las aplicaciones biomédicas
necesidad de tecnologías que combinen la facilidad de uso y la rentabilidad de la
emergentes de la tecnología y discutimos los desafíos y oportunidades abiertos.
amplificación isotérmica con la precisión diagnóstica de la PCR. Idealmente, tales
diagnósticos de próxima generación también deberían tener especificidad de un
Métodos basados en CRISPR para el diagnóstico de enfermedades
solo nucleótido, que es parte integral de la detección de mutaciones que
Desde su descubrimiento inicial, la cantidad de diferentes sistemas CRISPRCas se ha expandido rápidamente.13,20,21. Actualmente, los sistemas CRISPRCas se pueden dividir, según relaciones evolutivas, en dos clases, seis tipos
y varios subtipos20. Las clases del sistema CRISPR-Cas se definen por la
naturaleza del complejo efector de ribonucleoproteína: los sistemas de
clase 1 se caracterizan por un complejo de múltiples proteínas efectoras, y
los sistemas de clase 2 abarcan una sola proteína.
confieren resistencia contra los antibióticos.10o medicamentos antivirales11.
Los diagnósticos basados en repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente
interespaciadas (CRISPR) tienen el potencial de satisfacer estas necesidades insatisfechas. Los
sistemas CRISPR son una parte fundamental de un sistema inmunitario adaptativo microbiano12
que reconoce ácidos nucleicos extraños en el
Instituto de Berlín de Biología de Sistemas Médicos, Centro Max Delbrück de Medicina Molecular, Berlín, Alemania.2Departamento de Nefrología y Cuidados Intensivos Médicos,
1
Charite–́Universitätsmedizin Berlin, Berlín, Alemania.3Instituto McGovern para la Investigación del Cerebro en MIT, Cambridge, MA, EE. UU.4Consorcio de Massachusetts para la
preparación para patógenos, Boston, MA, EE. UU.5Instituto Médico Howard Hughes, Cambridge, MA, EE. UU.6Instituto Broad del MIT y Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.7
Departamento de Ciencias Cerebrales y Cognitivas, MIT, Cambridge, MA, EE. UU.8Departamento de Ingeniería Biológica, MIT, Cambridge, MA, EE. UU.9Instituto de Ingeniería y
Ciencias Médicas, MIT, Cambridge, MA, EE. UU.10Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada, Universidad de Harvard, Boston, MA, EE. UU.✉Email:[email protected]
NATURALEZA INGENIERÍA BIOMÉDICA|VOL 5 | JULIO 2021 | 643–656 |www.nature.com/natbiomedeng
643
Artículo de revisión
NATURALEZA INGENIERÍA BIOMÉDICA
Tabla 1 |principios de diseño para crRNA utilizados en diagnósticos basados
en CRISPR
enzima
o ARN monocatenario (ssRNA; Cas13) en solución, que permite la detección
de ácidos nucleicos a través de la amplificación de la señal y permite varias
lecturas mediante la adición de ácidos nucleicos informadores
Espaciador
repetición directa
repetición directa
longitud (pb)
longitud (pb)
orientación
AsCas12a (ref.22)
20
20
5′
LbCas12a (ref.36)
20
21
5′
LbaCas13a (ref.34)
28
35
5′
LbuCas13a (ref.22)
20
31
5′
LwaCas13a (ref.22)
28
36
5′
CcaCas13b (ref.22)
30
36
3′
PsmCas13b (ref.22)
30
36
3′
funcionalizados, que se escinden por actividad colateral. La familia de
enzimas CRISPR-Cas tipo VI (Cas13) tiene un rango de tamaño de
~900-1,300 aminoácidos, detecta ssRNA encisconformación y muestra
colateraltrans-actividad de escisión contra ssRNA in vitro30,31. En el ensayo
basado en Cas13 SHERLOCK (para el desbloqueo de indicadores enzimáticos
de alta sensibilidad específicos)32, el ADN o el ARN se amplifica primero
isotérmicamente con amplificación de polimerasa de recombinasa (RPA)33o
RPA de transcripción inversa (RT-RPA), respectivamente, utilizando un
cebador directo que agrega un promotor T7 al amplicón (Fig.1, Correcto).
Este promotor permite la transcripción del ARN del objetivo, que luego es
reconocido y unido por un complejo de Cas13a deLeptotrichia wadeii(
LwaCas13a) y un crRNA que incluye una secuencia complementaria a la
pb, par de bases.
Proteína de unión a ARNcr. El diseño de crRNA para las diferentes proteínas
efectoras utilizadas en el diagnóstico CRISPR sigue los mismos principios
que los de otras aplicaciones CRISPR y se resumen en la Tabla1. Entre los
diversos sistemas CRISPR, los sistemas de clase 2 se han aplicado
principalmente para el diagnóstico, ya que estos sistemas son más sencillos
de reconstituir. Incluyen enzimas con actividad colateral, que sirve como la
columna vertebral de muchos ensayos de diagnóstico basados en CRISPR
(Tabla2). Los sistemas de clase 1 (como la nucleasa efectora de tipo III Csm6
o Cas10) también se han diseñado para el diagnóstico, ya sea en
combinación con componentes del sistema de clase 2 o con el complejo
nativo de tipo III.22,23.
diana. El Cas13 activado escindirá tanto el ARN en el objetivo porcisescisión
y, de manera dependiente del objetivo, las moléculas indicadoras de ssRNA
por colateraltransescote. Las moléculas indicadoras de ssRNA consisten en
un fluoróforo y un extintor unidos por un oligómero de ARN corto que, una
vez escindido, permite la separación del fluoróforo del extintor, lo que da
como resultado la fluorescencia. Estos procesos permiten la detección de
ARN viral, ADN bacteriano, polimorfismos de un solo nucleótido humano
(SNP) y mutaciones asociadas al cáncer con atomolar (10–18M) sensibilidad.
La versión dos del ensayo (SHERLOCKv2) permitió la detección multiplexada
cuantitativa de ácidos nucleicos y la detección de objetivos en zeptomolar
(10–21M) e introdujo una lectura de flujo lateral basada en un ensayo
inmunocromatográfico, donde las moléculas indicadoras escindidas se
detectan a través de nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos en
una tira de papel22,34.
Los primeros métodos de diagnóstico basados en CRISPR que se
desarrollaron utilizaron en gran medida variantes Cas9, que reconocen el ADN de
doble cadena (dsDNA). Los principios fundamentales de los muchos enfoques
diferentes basados en Cas9 para detectar el ADN que se han informado incluyen
la reconstitución guiada por guía de proteínas divididas por socios Cas9
catalíticamente inactivos.24, Destrucción basada en Cas9 de sitios que contienen
PAM25,26y el desenrollamiento inducido por Cas9 de la cadena de ADN no dirigida
como un sitio de orientación para la amplificación isotérmica27. El método basado
en Cas9 denominado NASBACC (para amplificación basada en secuencias de
ácidos nucleicos (NASBA)-escisión CRISPR)25combina amplificación basada en
secuencias de ácidos nucleicos28para la preamplificación isotérmica de objetivos,
escisión Cas9 para la detección de objetivos dependiente de PAM y un sensor
toehold para la lectura (Fig.1, izquierda). En resumen, un gatillo toehold se une a
un fragmento de ARN amplificado por NASBA a través de la transcripción inversa.
Si una secuencia PAM está presente en el fragmento de ARN, la escisión mediada
por Cas9 conduce a un ARN truncado sin la secuencia desencadenante. En
ausencia de la secuencia PAM, el activador que contiene ARN de longitud
completa activa el interruptor de punto de apoyo, como lo indica un cambio de
color. Al detectar sitios PAM específicos de la cepa, el método permite la
discriminación del linaje viral, como se muestra para la detección del virus Zika
(ZIKV) en plasma de mono infectado en concentraciones en el rango femtomolar
bajo.25. Informado más recientemente, un método basado en Cas9 denominado
LEOPARD (para aprovechar los tracrRNA diseñados y los ADN en el objetivo para
la detección de ARN paralelo) permite la detección multiplexada de diferentes
Las enzimas Cas12 que se han utilizado en diagnósticos basados en
CRISPR apuntan a dsDNA y ssDNA, requieren un sitio PAM en la región
objetivo para la escisión de dsDNA y colateralmente escinden ssDNA35. Uno
de los primeros métodos de detección basados en Cas12 se informó en
2018 y se denominó DETECTR (para CRISPR dirigido a endonucleasas de
ADN).transreportero; Higo.1, Correcto)36. En este método, Cas12a deLa
bacteria Lachnospiraceae(LbCas12a) u otros organismos es guiado a
objetivos de dsDNA por un crRNA complementario, lo que desencadena la
escisión colateral de reporteros cortos de ssDNA que llevan un fluoróforo y
un extintor. De manera similar a SHERLOCK, el reconocimiento de objetivos
y la escisión del indicador conducen a la separación del extintor del
fluoróforo, lo que genera una señal de fluorescencia. DETECTR alcanzó la
sensibilidad atomolar cuando se combinó con la preamplificación RPA.
Otras técnicas basadas en Cas12 incluyen HOLMES (para un sistema
altamente eficiente multipropósito de bajo costo de una hora)37,38, que
emplea PCR como preamplificación junto con LbCas12a y HOLMESv239, que
utiliza amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP)40combinado con
un Cas12b termoestable de Aliciclobacillus acidoterrestris(AacCas12b) en
una reacción de un solo recipiente. Tanto HOLMES como HOLMESv2
mostraron un límite de detección (LOD) alrededor de las 10 a.m. De manera
similar, Cas12f se dirige a dsDNA y ssDNA, pero permite una mejor
discriminación de SNP en ssDNA que Cas12a41.
secuencias de ARN con especificidad de un solo nucleótido29. El método se basa
en la observación de quetransLos crRNA activadores (tracrRNA), que en los
Diagnóstico sin preamplificación
sistemas de tipo II son necesarios para la formación de complejos Cas9-crRNA, se
Cuando se usan enzimas Cas sin preamplificación ascendente del objetivo, la
hibridan con los ARN celulares, lo que produce crRNA 'no canónicos'. Al
mayoría de los diagnósticos basados en CRISPR tienen un LOD informado en el
reprogramar los tracrRNA para que se unan a las transcripciones celulares de
rango picomolar.32,42. Este LOD permite la detección de objetivos cuando hay una
interés al tiempo que permiten la formación de complejos Cas9-crRNA, los crRNA
concentración relativamente alta de ADN o ARN en la muestra. Por ejemplo, el
no canónicos resultantes permiten guiar a Cas9 hacia un objetivo de ADN.
síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) aparentemente
se elimina en una alta concentración en la fase temprana de la infección (~6.76×
105copias por hisopo)43, lo que permite una detección sin preamplificación44.
La principal diferencia entre los sistemas CRISPR tipo II (Cas9) y los
sistemas tipo V (Cas12) y tipo VI (Cas13) es la capacidad de los dos últimos
sistemas para desencadenar una escisión colateral no específica (trans
escisión) en el reconocimiento de objetivos. La actividad colateral implica la
escisión de ADN monocatenario no dirigido (ssDNA; Cas12)
644
Además de las muestras microbianas altamente concentradas, el ADN genómico
humano (ADNg)45
y ARN mensajeros humanos altamente expresados30y microARN
(miARN)46se ha informado que son susceptibles de detección sin
preamplificación.
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Artículo de revisión
NATURALEZA INGENIERÍA BIOMÉDICA
Tabla 2 |Características de los diagnósticos basados en CRISPR informados
Nombre
enzima
preamplificación
tiempo de ensayoa(min)
Muestra
Leer
Aplicaciones
lOdC(mol l−1)
lOdC
Referencias
(copias
preparación
por ml)3
CRISPR tipo II
NASBACCb
Cas9
NASBA
120–360 (un bote)
Basado en columnas o
Colometría
Discriminación entre
ZIKV africano y americano
1.0×10-15
6.0×105
25
electroquímico
Detección de ADNg de líneas
2.3×10-15
1.4×106
45
2.5×10–19
1.5×102
27
1.9×10–18
1.1×103
71
8.2×10–19
4.9×102
91
1.7×10–19
1.0×102
111
1.0×10–18
6.0×102
36
ns
6.0×103
41
1.0×10–17
6.6×103
37,38
1.0×10–17
6.6×103
79,80
1.0×10–18
6.0×102
112
1.0×10–17
6.0×103
39
extracción de crudo
CRISPR-Chip
Cas9
–
15
basado en columnas
celulares y pacientes con DMD
CRISDA
Cas9
ASD
90
basado en columnas
Fluorescencia
Nickase
Detección de ADNg;
SNP asociados al cáncer de mama
en líneas celulares
DESTELLO
Cas9
PCR
NS
basado en columnas
SNG
Detección de ADNg;
genes de resistencia antimicrobiana
en muestras clínicas
CAS-EXPAR
Cas9
EXPAR
60
Química (fase
Fluorescencia
Cas9nAR
Cas9
Hebra-
Nickase
desplazando el ADN
60
basado en columnas
Detección de ADN metilado;
L. monocytogenesARNm
separación)
Fluorescencia
Detección de bacterias (S.
typhimurium, E. coli,M.
polimerasa
esmegmatis,S. erythraea);
detección deKRASSNP en
líneas celulares
CRISPR tipo V
DETECTAR
Cas14-DETECTR
Cas12a
Cas14
RPA
PCR
(Cas12f)
HOLMES
Cas12a
PCR
10 (RPA) y
60–120 (CRISPR)
Extracción de crudo
NS (PCR) y
120 (CRISPR)
Extracción de crudo
88 (PCR) y 15
(CRISPR)
Fluorescencia
Detección de HPV16 y HPV18
en muestras humanas
Fluorescencia
Detección deHERC2SNP en
muestras humanas
basado en columnas
Fluorescencia
discriminación de SNP en
líneas celulares y muestras
humanas; detección de virus
(PRV, JEV); discriminación
virus-cepa
Materiales CRISPR
Cas12a
RPA
40 (RPA) y 240
(CRISPR)
Blancos sintéticos
10 (RPA) y
60–180 (CRISPR)
Blancos sintéticos
40 (LÁMPARA) y 35
NS
fluorescencia o
Detección de ARN sintético de
μPAD (visual y
EBOV
electrónico)
CDetección
Cas12b
RPA
Fluorescencia
o extracción de crudo
Detección de VPH16; genotipificación
de sangre humana ABO;
BRCA1yTP53SNP
HOLMESv2
Cas12b
LÁMPARA
Fluorescencia
discriminación de SNP en líneas
(CRISPR) o 120
celulares; detección de virus ARN
(una olla)
(JEV); detección de ARNm humano
y ARN circular; metilación del ADN
E-CRISPR
Cas12a
–
30–180
Blancos sintéticos
electroquímico
Detección de virus (HPV16,
PB19) y proteína (TGF-ß1)
5.0×10–11
3.0×1010
77
Fluorescencia
Detección de ARNm humano;
1.0×10–12
6.0×108
30,31
2.0×10–18
1.2×103
32
8.0×10–21
4.8
22,34
Detección de SARS-CoV-2
8.3×10–18
5.0×103
62
Detección de SARS-CoV-2
3.3×10–18
2.0×103
63
Detección de 169 virus; subtipificación de
9×10–19
5.4×102
67
Una colonia-
–
92
(ácidos nucleicos)
CRISPR tipo VI
–
Cas13
–
NS
NS
detección de bacteriófago λRNA
SHERLOCK
Cas13
NASBA o RPA
132 (NASBA) o
120 (RPA) y
60–180 (CRISPR)
Basado en columnas o
Fluorescencia
extracción de crudo
Detección de virus (ZIKV,
DENV) y bacterias(E. coli,
K. pneumoniae,P. aeruginosa,
Tuberculosis M.,S. aureus);
discriminación entre cepas de
virus; detección de SNP
SHERLOCKv2b
Cas13
RPA
60 (RPA) y
60–180 (CRISPR)
o 60–180 (uno
Basado en columnas o
fluorescencia o
Detección de virus (ZIKV,
extracción de crudo
flujo lateral
DENV) y bacterias (P.
aeruginosa,S. aureus);
discriminación entre cepas de
maceta)
virus; detección de SNP
BRILLARb
Cas13
RPA
50 (una olla)
Extracción de crudo
fluorescencia o
flujo lateral
STOPCovidb
Cas12b
LÁMPARA
60 (una olla)
Extracción de crudo
fluorescencia o
flujo lateral
CARMEN
Cas13
PCR o RPA
20 (RPA) y 180
(CRISPR)
basado en columnas
Fluorescencia
cepas de influenza A; detección de
mutaciones resistentes a los medicamentos
del VIH
APC-Cas
Cas13
Alostéricoiniciado por sondeo
110 (APC) y
30 (CRISPR)
Ninguna
Fluorescencia
Detección deS.enteritidis
unidad de formación
amplificación
con ADN
polimerasa
Continuado
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645
Artículo de revisión
NATURALEZA INGENIERÍA BIOMÉDICA
Tabla 2 |Características de los diagnósticos basados en CRISPR informados (continuación)
Nombre
enzima
preamplificación
tiempo de ensayoa(min)
Leer
Muestra
Aplicaciones
lOdC(mol l−1)
lOdC
Referencias
(copias
preparación
por ml)3
Cas13
–
<240
basado en columnas
electroquímico
Detección de microARN
1×10–11
6.0×109
46
6.0×105
78
(miR-19b y miR-20a)
PECL-CRISPR
Cas13
EXPAR
30 (CRISPR), 30
(fosforilación
basado en columnas
electroquimioluminiscencia
Detección de microARN (miR-17, 1.0×10-15
miARN de la familia let‐7)
de predisparo), 30
(EXPARAR)
NS, no especificado; APC-Cas, catálisis iniciada por sonda alostérica y sistema CRISPR-Cas13a;BRCA1, gen del cáncer de mama 1; circARN, ARN circular; Cas9nAR, reacción de amplificación basada en Cas9 nickase; CRISDA, amplificación de
desplazamiento de hebra mediada por endonucleasa de corte activada por Cas9; DENV, virus del dengue; DMD, distrofia muscular de Duchenne; EBOV, virus del Ébola;E. coli,Escherichia coli; HERC2, HECT y dominio RLD que contiene el gen
E3 de la proteína ligasa 2 de la ubiquitina; VPH, virus del papiloma humano; JEV, virus de la encefalitis japonesa;K. pneumoniae,Klebsiella pneumoniae;KRAS, GTPasa del protooncogén KRAS;M. esmegmatis,Mycobacterium smegmatis;
Tuberculosis M.,Tuberculosis micobacteriana; PECL, chip de electroquimioluminiscencia portátil;P. aeruginosa,Pseudomonas aeruginosa; PB19, parvovirus B19; PRV, virus de la pseudorrabia;S. erythraea,Saccharopolyspora erythraea;S.
aureus,estafilococo aureus;S.enteritidis,Salmonella enteritidis;S. typhimurium,Salmonella typhimurium;TP53, proteína tumoralP53gene.
El tiempo de ensayo indica el tiempo de incubación aproximado utilizado con mayor frecuencia en el estudio mencionado (se pueden informar diferentes tiempos de ensayo, según la sensibilidad deseada y la lectura).bLa
a
compatibilidad POC indica si todo el ensayo informado, incluida la preparación de la muestra (es decir, la extracción cruda) y la lectura, se puede realizar en el POC o en el campo con un equipo mínimo.
C
Los límites de detección no siempre se pueden comparar directamente entre estudios, en particular porque algunos estudios no informaron cómo se determinó el LOD o informaron la concentración objetivo en el medio de transporte de
la muestra o en la reacción final. Los LOD que se muestran aquí reflejan los LOD óptimos informados. En general, los LOD dependen del tipo de material de entrada (crudo o sintético), tipo de lectura y tiempo de incubación.
Para aumentar la sensibilidad de los diagnósticos basados en CRISPR
sin preamplificación, LwaCas13a se ha combinado con la nucleasa de ARN
CRISPR tipo III Csm622. La actividad nucleasa de Csm6 es activada por
oligoadenilatos cíclicos (2′,3′-grupos fosfato cíclicos)47,48. Debido a que la
actividad de escisión colateral de LwaCas13a y PsmCas13b (dePrevotellasp.
MA2016) generan productos con 5 hidroxilados′extremos y 2′,3′-extremos
de fosfato cíclico, se planteó la hipótesis de que la actividad colateral de
Cas13 podría generar activadores de Csm6, lo que permitiría la detección de
señal amplificada. En contraste con las preferencias de escisión de
LwaCas13a por los motivos de dos bases UU y AU, se encontró que Csm6 de
Enterococcus itálico(EiCsm6),Lactobacillus salivarius(LsCsm6) yTermo
termófilo(TtCsm6) tenía fuertes preferencias de escisión por los reporteros
ricos en A y C, lo que permitía medir de forma independiente la actividad de
escisión de LwaCas13a y Csm6 en diferentes canales y para el diseño
adicional de activadores de ARN "protegidos". Estos activadores fueron
diseñados para contener un activador poli(A) Csm6 seguido de un
estiramiento poli(U), sobre la base de la lógica de que la escisión colateral
de LwaCas13a solo degradaría las uridinas, generando así hexadenilatos
con 2′,3′-extremos de fosfato cíclico y activación de Csm6. El Csm6 activado
a su vez escindiría moléculas indicadoras adicionales, liberando fluoróforos
apagados y aumentando así la señal. Este diseño condujo a un aumento de
3,5 veces en la sensibilidad de la señal en comparación con Cas13a solo y al
leer la fluorescencia mediada por Csm6 y la fluorescencia mediada por
Cas13a en el mismo canal. De manera similar, la generación de
oligoadenilatos cíclicos a partir de la enzima Cas10 nativa en sistemas de
tipo III se ha utilizado para la detección de genomas de SARS-CoV-223.
Se necesitan más estrategias que aumenten la sensibilidad de los
diagnósticos basados en CRISPR sin preamplificación. Esto podría incluir la
degradación mediada por la enzima Cas de los aptámeros o de los enlazadores de
ácidos nucleicos inhibidores de enzimas (como la fosfatasa alcalina intestinal de
ternera o la luciferasa).49) que luego se pueden detectar mediante métodos
colorimétricos o de luminiscencia.
Estrategias de preamplificación
A diferencia de las aplicaciones que son aptas para diagnósticos basados en CRISPR sin
preamplificación, la mayoría de los entornos clínicos requieren la capacidad de detectar
concentraciones de ácido nucleico por debajo del rango picomolar.50. Un ejemplo es la
detección de la carga del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o del virus de la
RPA, 37–42 °C), pero otros requieren dispositivos de calentamiento (en
particular, NASBA, 40–55 °C; LAMP, 60–65 °C; amplificación por
desplazamiento de cadena53(SDA), 60 °C; amplificación dependiente de
helicasa54(HDA), 65 °C; y reacción de amplificación exponencial55(EXPAR), 55
°C). En los diagnósticos basados en CRISPR, los métodos de amplificación
isotérmica más utilizados son RPA y LAMP. Inicialmente, SHERLOCK32
y DETECTAR36usó RPA para la preamplificación, que exhibió una mayor
sensibilidad que NASBA32. Aunque la amplificación no específica representa
un desafío en la RPA convencional, la detección de objetivos basada en
crRNA aguas abajo mejora la especificidad. El diseño de los cebadores RPA
es menos complejo que el diseño de los cebadores LAMP, pero la obtención
confiable de la mezcla de enzimas patentada de un solo proveedor ha sido
un desafío. Además, la adición de agentes de acumulación
macromoleculares (como poli(etilenglicol)) junto con bajas temperaturas de
reacción reduce la mezcla de los reactivos y requiere un paso de mezcla
para la amplificación de objetivos poco abundantes.56.
La detección de un solo recipiente utilizando HOLMESv2 es posible
combinando AacCas12b con LAMP39. Durante la pandemia de COVID-19, la
transcriptasa inversa LAMP (RT-LAMP) se ha utilizado ampliamente como
técnica de preamplificación isotérmica. Con RT-LAMP, una temperatura de
funcionamiento más alta que la utilizada en RPA permite una mayor
especificidad de amplificación, y la disponibilidad comercial de las enzimas y
reactivos necesarios facilita la planificación y realización de experimentos. El
diseño de cebadores LAMP puede ser complejo, pero las herramientas en
línea (https://primerexplorer.jpyhttps://lamp.neb.com) puede ayudar a
implementar esta técnica de amplificación.
Estrategias de cuantificación
En muchos entornos clínicos, es deseable una cuantificación precisa de la
concentración de biomarcadores, especialmente si los cambios indican la
eficacia del tratamiento, como durante el control de la carga viral bajo
terapia antiviral.57. Para PCR, la cuantificación puede ser absoluta o relativa.
En la cuantificación absoluta, se realizan diluciones en serie de un estándar
externo con concentraciones conocidas para obtener una curva estándar,
que se utiliza para determinar la concentración objetivo en la muestra
desconocida.58. En la cuantificación relativa, que a menudo se usa para
determinar genes expresados diferencialmente, la concentración objetivo
se expresa en relación con una referencia59.
En los diagnósticos basados en CRISPR, la cuantificación absoluta a través de
hepatitis C (VHC) bajo terapia antiviral.51,52. Por lo tanto, los diagnósticos basados en
la comparación con una curva estándar se puede lograr dentro del rango de
CRISPR informados hasta ahora se basan en gran medida en la preamplificación del
picomolar a micromolar (10–12M-10–6M), donde la actividad de escisión colateral
objetivo. Aunque algunos estudios utilizan PCR37,38, las técnicas de amplificación
basada en CRISPR se correlaciona con la concentración objetivo32. Sin embargo,
isotérmicas son más compatibles con el uso de POC, debido a los requisitos de
los ensayos clínicamente útiles generalmente requieren un LOD más bajo y, por
instrumentación más simples (Tabla3). Algunos de estos métodos funcionan a
lo tanto, una preamplificación. En una reacción de dos recipientes, la saturación
temperatura cercana a la ambiente (en particular,
durante la preamplificación puede impedir una lectura cuantitativa32.
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ARN de NASBA
5′
dsADN
3′
ARN
RT + degradación de ARNasa H
Generar
RPA/RT-RPA
Síntesis de la segunda cadena de ADN
Generar
PAM específico de destino
Transcripción T7
Cas9 y ARNg
ARN reportero
T7
ADN reportero
T7
Generar
Sensor
3′
5′
3′
5′
Cas13
Sensor
Sin activación
Cas12a
Escisión colateral
Activación del punto de apoyo
NASBACC
SHERLOCK
DETECTAR
Figura 1 |dos estrategias para el diagnóstico basado en CRISPR.Izquierda: los objetivos de ARN se amplifican a través de NASBA, que comienza con la transcripción inversa (RT) al ADN complementario utilizando un cebador específico de
secuencia que agrega una secuencia desencadenante (magenta) para el sensor de apoyo. El ARN del híbrido ARN/ADN es destruido por la ARNasa H, lo que permite que un cebador que contiene un promotor T7 se una y cree una segunda
cadena de ADN complementaria. La transcripción T7 de la plantilla de dsDNA crea la secuencia de ARN objetivo, que puede usarse como material de partida para un nuevo ciclo NASBA o detectarse mediante el sensor toehold. Si una
secuencia PAM (azul) está presente en el amplicón de dsDNA, la escisión mediada por Cas9 conduce a una plantilla truncada para la transcripción de T7, que genera un ARN diana más corto que no puede activar el sensor toehold. En
ausencia de la secuencia PAM, se transcribe un ARN diana de longitud completa que contiene el desencadenante, que activa el sensor del punto de apoyo y produce un cambio de color visible. Derecha: el ADN o el ARN se amplifican
mediante RPA o RT-RPA, respectivamente. Para las enzimas CRISPR dirigidas al ARN (incluida Cas13a), el producto RPA amplificado se transcribe en T7 en ARN. La unión del crRNA a la secuencia diana complementaria activa la enzima Cas y
desencadena la escisión colateral de los indicadores fluorescentes desactivados. Por lo tanto, Cas13a (usado en SHERLOCK) o Cas12a (usado en DETECTR) indican la presencia de secuencias objetivo de ARN o ADN, respectivamente. La unión
del crRNA a la secuencia diana complementaria activa la enzima Cas y desencadena la escisión colateral de los indicadores fluorescentes desactivados. Por lo tanto, Cas13a (usado en SHERLOCK) o Cas12a (usado en DETECTR) indican la
presencia de secuencias objetivo de ARN o ADN, respectivamente. La unión del crRNA a la secuencia diana complementaria activa la enzima Cas y desencadena la escisión colateral de los indicadores fluorescentes desactivados. Por lo tanto,
Cas13a (usado en SHERLOCK) o Cas12a (usado en DETECTR) indican la presencia de secuencias objetivo de ARN o ADN, respectivamente.
Para las reacciones de un solo recipiente, donde se combinan la preamplificación
proporcionar más información a un mayor rendimiento y a un menor costo por
y la detección basada en CRISPR, la escisión colateral ocurre simultáneamente
objetivo5. Aunque las tecnologías de secuenciación permiten la multiplexación
con la amplificación del objetivo.22,34,39,60–63. Esto permite una lectura en tiempo
mediante la adición de identificadores únicos que se descomponen durante el
real que se puede cuantificar cuando se incorpora una medición continua de la
análisis de datossesenta y cinco, la detección de ácido nucleico basada en PCR se puede
señal. Sin embargo, requiere un equipo de laboratorio más sofisticado (similar a
multiplexar a través de la amplificación simultánea de diferentes objetivos en una
qPCR), que generalmente no está disponible para las pruebas POC. Para facilitar
reacción combinada con la detección específica de cada amplicón66, o a través de
la cuantificación en reacciones de dos recipientes, se pueden usar
la lectura paralela de múltiples reacciones separadas.
concentraciones más bajas de cebador RPA para evitar la saturación de la
reacción de preamplificación.22. En el protocolo SHERLOCKv2, una concentración
de cebador de 240 nM permite la correlación de la concentración de entrada de
ARN y la señal de salida dentro del rango attomolar a picomolar (10–18M-10–12
METRO). Las opciones adicionales para la cuantificación incluyen la posibilidad de
diluciones en serie de la muestra desconocida en comparación con un estándar
conocido. La implementación de estas diferentes soluciones de cuantificación con
dispositivos compatibles con POC probablemente será un foco importante de
investigación en tecnologías de diagnóstico basadas en CRISPR. Además, el
control de la calidad de las preparaciones de ácidos nucleicos y de cualquier
componente inhibidor introducido durante la recolección o el procesamiento de
muestras (como heparina, exceso de sales, urea, hemo, detergentes iónicos,
alcoholes y fenoles) sigue siendo importante para que los diagnósticos basados
en CRISPR lleguen al utilidad clínica de los actuales protocolos de PCR de
diagnóstico64.
Estrategias para la detección de múltiples objetivos
La prueba integral y simultánea de múltiples objetivos (multiplexación)
es deseable en muchos entornos de diagnóstico, ya que puede
Los esfuerzos iniciales en el diseño de diagnósticos multiplexados
basados en CRISPR aprovecharon la especificidad de diferentes enzimas
Cas con respecto a su actividad de escisión colateral hacia diferentes
secuencias indicadoras de ácidos nucleicos. Esto permitió que las enzimas
Cas detectaran múltiples objetivos de ácido nucleico dentro de un ensayo.22.
En particular, SHERLOCKv2 permitió la detección cualitativa de hasta cuatro
objetivos diferentes en una reacción multiplexada mediante la inclusión de
cuatro diseños de moléculas informadoras que eran específicos de las
preferencias ortogonales de base de escisión colateral de PsmCas13b,
LwaCas13a, CcaCas13b (Capnocytophaga canimorsusCc5) y AsCas12a (de
acidaminococosp.). La detección multiplexada de Cas13 podría combinarse
con la preamplificación multiplexada (usando RPA), lo que permite la
detección simultánea de dos objetivos diferentes (Fig.2, izquierda). La
multiplexación adicional más allá de estos niveles en una sola reacción
estaba limitada por las químicas de preamplificación22.
El ensayo multiplexado basado en CRISPR CARMEN (para
reacciones combinatorias en matriz para la evaluación multiplexada de
ácidos nucleicos) permite la detección escalable y paralela de más de
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Tabla 3 |Métodos de amplificación isotérmicos
Método
RPA
lámpara
SdA
NASBA
Temperatura (°C)
37–42
60–65
37-60
65 (cebado); 41
Tiempo (min)
20–60
20–60
30–60
60–120
Objetivo
ADN/ARNa
ADN/ARNa
ADN/ARNa
ARN/ADNb
Proteínas involucradas
Recombinasa, proteína de unión monocatenaria,
Desplazamiento de hebra
ADN con desplazamiento de cadena
Transcriptasa inversa, ARNasa
ADN polimerasa desplazadora de cadenas
ADN polimerasa
polimerasa, muescas
H, ARN polimerasa T7
endonucleasa
liofilización
sí
sí
No
sí
imprimaciones
2
6–8
4
2
El ARN se puede detectar introduciendo una enzima transcriptasa inversa en la reacción.bAunque NASBA se usa principalmente para la amplificación de ARN, las modificaciones del protocolo han permitido la amplificación de ADN.
a
4500 objetivos67. El método se basa en la reacción química de SHERLOCK,
pero utiliza un volumen de reacción miniaturizado (Fig.2, Correcto). En
CARMEN, las muestras diana de ácido nucleico amplificado y las mezclas de
detección de LwaCas13 se combinan cada una con un código de color
distinto basado en la solución. Las soluciones codificadas por colores se
emulsionan en aceite fluorado, creando entradas de gotas de nanolitros.
Las gotitas de todas las muestras y mezclas de detección se agrupan y,
posteriormente, se cargan en un chip microfabricado para crear todas las
combinaciones posibles de muestras y gotitas de detección (un par por
pocillo). Luego, los pares de gotas se fusionan aplicando un campo eléctrico
externo. Un registro inicial de los tintes de dos gotitas en un micropocillo
particular indica qué muestra y qué gotita de detección están presentes, y la
fluorescencia generada a través de la escisión del reportero desencadenada
por Cas13a en la detección del objetivo indica una reacción positiva. Esta
miniaturización, junto con la alta sensibilidad y especificidad de Cas13a,
permitió la detección de 169 virus asociados con humanos, la subtipificación
de coronavirus y cepas de influenza A, y la identificación de mutaciones del
VIH que son resistentes a los medicamentos. En comparación con los
microarreglos de ADN tradicionales, CARMEN no requiere la detección de
sondas que requiere mucho tiempo y ofrece una mayor escalabilidad que
los paneles de PCR. Aunque requiere un paso de preamplificación, análisis
de microscopía y personal de laboratorio capacitado, CARMEN permite una
detección de patógenos rápida, de alto rendimiento y de bajo costo, que es
críticamente necesaria en las rutinas clínicas y para la vigilancia de
amenazas emergentes para la salud pública. Gracias a las reacciones
miniaturizadas para la detección, CARMEN reduce considerablemente los
costes de reactivos y el consumo de muestras. Sin embargo,
fragmentos a gran profundidad manteniendo las marcas epigenéticas68.
Esta tecnología permitió la detección simultánea de metilación de CpG,
variaciones estructurales y variantes de un solo nucleótido resueltas por
haplotipo utilizando 3 μg de ADN genómico, y logró 675×cobertura con una
celda de flujo MinION y 34×cobertura con la celda de flujo Flongle (ambas
celdas son comercializadas por Oxford Nanopore Technologies). En un
esfuerzo similar para eludir la necesidad de enriquecimiento basado en
PCR, se desarrolló STRique (para la identificación, cuantificación y
evaluación de repeticiones cortas en tándem).69para la identificación de
repeticiones cortas en tándem (STR) con secuenciación de nanoporos (Fig.3,
izquierda). Además de Cas9, se utilizó Cas12a para inducir cortes de ADN
junto a una región que contiene repeticiones, seguido de la unión de
adaptadores para la secuenciación de nanoporos. Usando un algoritmo que
identificó las posiciones de las regiones flanqueantes de STR y la cantidad
de STR entre ellas, el método permitió la detección de la expansión de STR
junto con el estado de metilación de CpG en líneas celulares derivadas de
pacientes con síndrome de X frágil y con esclerosis lateral amiotrófica.
Los sistemas CRISPR-Cas también se combinaron con la secuenciación
específica de próxima generación para aumentar el rendimiento de la
secuenciación. Por ejemplo, se desarrolló DASH (para el agotamiento de
secuencias abundantes por hibridación)70para enriquecer secuencias de
patógenos y eliminar especies no deseadas. En este método, una biblioteca
de crRNA dirige a Cas9 a secuencias diana no deseadas para la escisión, y
las regiones no diana retienen los adaptadores intactos necesarios para la
amplificación y la secuenciación (Fig.3, Correcto). Otro método, FLASH (para
encontrar secuencias de baja abundancia por hibridación), incluye el
bloqueo de gDNA por fosfatasa y digestión a través de Cas9 complejado con
un conjunto de crRNA dirigidos a genes de interés, seguido por la ligadura
Combinación de sistemas CRISPR-Cas con secuenciación
Dado que las tecnologías de diagnóstico basadas en la secuenciación
utilizan la alineación de lecturas con bases de datos bioinformáticas para la
identificación de patógenos, toleran la variabilidad en el genoma del
organismo objetivo y no requieren necesariamente un conocimiento previo
de la secuencia objetivo. Estas características son particularmente útiles
cuando se desconoce el patógeno o cuando su genoma evoluciona
rápidamente. Sin embargo, para detectar patógenos de baja abundancia, se
hace necesario el enriquecimiento de las regiones de interés antes de la
secuenciación. La amplificación de regiones de secuenciación basada en
PCR tiene varias limitaciones, incluida la eliminación de marcas
epigenéticas, el sesgo de amplificación y los desafíos asociados con la
amplificación de regiones ricas en GC o de regiones muy grandes. Los
amplicones más grandes son de particular interés para las técnicas de
secuenciación de lectura larga, como la secuenciación de nanoporos,
Para superar estas limitaciones, varios protocolos utilizan nucleasas Cas para
enriquecer las regiones de interés antes de la secuenciación. Por ejemplo, la
de adaptadores y por amplificación y secuenciación.71. Esta técnica detectó,
en fluidos respiratorios y gotas de sangre seca, niveles subattomolares de
bacterias Gram-positivas resistentes a los medicamentos y del parásito de la
malaria.Plasmodium falciparum.
Optimización de ensayos para aplicaciones en el POC y en el
campo
Lecturas.Algunas estrategias para medir y visualizar la activación de las enzimas
Cas en el reconocimiento de objetivos han empleado lecturas rápidas y de bajo
costo aptas para POC o aplicaciones de campo. El uso de moléculas indicadoras
con diferentes propiedades permite una amplia variedad de lecturas, que
incluyen fluorescencia, inmunocromatografía de flujo lateral y electroquímica.
Para los ensayos basados en fluorescencia, la mayoría de los métodos de
diagnóstico basados en CRISPR aprovechan las moléculas indicadoras de ARN o
ADN que llevan un fluoróforo y un extintor. La actividad de escisión colateral en la
detección del objetivo provoca la separación espacial del fluoróforo y el extintor, y
la fluorescencia resultante se puede leer en lectores de placas convencionales
(Fig.4, arriba a la izquierda), en dispositivos portátiles y de bajo costo72e incluso a
secuenciación dirigida a nanoporos Cas9 (nCATS) utiliza Cas9 para escindir el ADN
simple vista bajo la luz azul60(Higo.4, arriba a la izquierda). Estrategias adicionales
cromosómico para la ligadura de adaptadores para la secuenciación de
permiten la visualización colorimétrica mediante el uso de nanopartículas de oro,
nanoporos (Fig.3, izquierda), lo que permite la secuenciación dirigida de largas
que son
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NATURALEZA INGENIERÍA BIOMÉDICA
Multiplexación en matriz
Multiplexación agrupada
A
AA
AA
familia
stra
lia
TEXAS
Chip de micropocillo cargado
codificados por colores y
ARNss
Au
gotitas emulsionadas
Fluorescencia
microscopía
LwaCas13a
ARNss
UA
Cy5
PsmCas13b
CcaCas13b
ARNss
AsCas12a
MALEFICIO
dsADN
Muestra
gotita
Análisis de fluorescencia en
reacción agrupada.
Detección
Cas13 activado al reconocer el
objetivo en la gota fusionada
gotita
Campo eléctrico
Figura 2 |Detección de objetivos multiplexada basada en CRISPR.Izquierda: multiplexación agrupada de hasta cuatro objetivos, tal como se implementa en SHERLOCKv2. Enzimas CRISPR
ortogonales (PsmCas13b, LwaCas13a, CcaCas13b, AsCas12a), cada una de las cuales escinde preferentemente diferentes moléculas indicadoras que portan diferentes fluoróforos (FAM, TEX615 (TEX),
Cy5, hexaclorofluoresceína (HEX)) con distintas longitudes de onda de absorbancia y emisión. Derecha: en CARMEN, se agrega un código de color distinto a cada muestra amplificada por PCR o
mezcla de detección basada en Cas13. La mezcla de detección basada en Cas13 contiene Cas13a, un crRNA específico de secuencia y un indicador de escisión. Las soluciones codificadas por colores
se emulsionan en aceite fluorado, que crea gotas de nanolitros. Las gotas de todas las muestras y mezclas de detección se agrupan y se cargan en un chip de matriz de micropocillos en un solo paso
para crear todas las combinaciones de pares posibles. El par de gotitas en cada pocillo se identifica mediante microscopía de fluorescencia antes de que se fusionen mediante la exposición a un
campo eléctrico. A continuación, se utiliza microscopía de fluorescencia para controlar cada reacción de detección basada en Cas13.
unidos a través de ssRNA o ssDNA oligonucleótidos. Mediado por Cas12 o
La detección de objetivos basada en escisión nativa a colateral combina la
mediado por Cas13transla escisión del enlazador resultó en la dispersión de las
detección de amplicón basada en Cas9 con una lectura de flujo lateral mediante
nanopartículas de oro en el reconocimiento del objetivo y produjo un color rojo
un ensayo de hibridación basado en anclaje crRNA76.
vibrante en la solución73. Alternativamente, la escisión mediada por Cas de los
También son posibles los diagnósticos basados en CRISPR con lecturas
electrónicas. Un método, llamado CRISPR-Chip, involucró Cas9 desactivado
sustratos de ssDNA biotinilados resultó en una disminución en la atracción
magnética de las nanopartículas de oro de ADN.74. Un ensayo basado en la
turbidez basado en la separación de fases líquido-líquido de ácidos nucleicos y
polielectrolitos cargados positivamente también puede proporcionar lecturas
visuales75. En este caso, la escisión colateral conduce a la degradación de los
polímeros de ácido nucleico en el reconocimiento del objetivo. Esto se puede
visualizar después de la complementación con policationes, donde la solución
permanece clara cuando se ha producido la escisión o se vuelve turbia en
ausencia de escisión desencadenada por el objetivo.
Ensayos de flujo lateral (Fig.4, arriba a la derecha) ofrecen una
visualización simple de la actividad de escisión colateral inherente a muchos
diagnósticos basados en CRISPR. Un sistema disponible comercialmente
(Millenia 1T) informado por primera vez en la ref.22ha sido ampliamente
adoptado. En esta técnica, las moléculas indicadoras que contienen biotina
y fluoresceína (amidita de fluoresceína (FAM)) se unen a anticuerpos antiisotiocianato de fluoresceína (FITC) acoplados a nanopartículas de oro en el
área de la almohadilla de muestra de la tira. Estos complejos viajan
posteriormente a una línea de captura de estreptavidina, donde se unen a
través de la biotina de la molécula informadora. En ausencia del objetivo, las
moléculas indicadoras sin cortar se retienen allí y esto se visualiza como una
banda en la tira. En presencia del objetivo, la escisión colateral del reportero
mediada por la enzima Cas separa la biotina de las moléculas FAM unidas a
las nanopartículas de oro anti-FITC, lo que les permite viajar más lejos en la
tira y generar una segunda banda visible en el anticuerpo. -línea de captura,
que lleva anticuerpos secundarios específicos de especie. un alter-
complejado con un crRNA específico del objetivo e inmovilizado en un
transistor de efecto de campo basado en grafeno.45. En la unión del
objetivo, las alteraciones en la conductividad del grafeno hicieron que
cambiaran las propiedades eléctricas del transistor, lo que se puede medir
como un cambio en la corriente. En particular, esta tecnología no requería
moléculas indicadoras marcadas y podía detectar deleciones en el gen de la
distrofina en muestras de gDNA no amplificadas de pacientes con distrofia
muscular de Duchenne. La sensibilidad del sistema alcanzó el rango
femtomolar (~1,7 fM). Otra estrategia para obtener lecturas electrónicas,
llamada E-CRISPR, involucró un indicador de escisión de ssDNA con una
etiqueta electroquímica de azul de metileno y un resto de tiol para la
inmovilización en un electrodo de oro.77. En este método, la escisión
colateral mediada por Cas12a tras la detección del objetivo condujo a una
disminución de la corriente electroquímica a través de la liberación de azul
de metileno, mientras que la ausencia del objetivo resultó en una alta
corriente electroquímica, debido a un reportero portador de azul de
metileno intacto. Este ensayo detectó ADN del virus del papiloma humano y
del parvovirus B19 con un LOD de ~50 pM y se puede adaptar para la
detección de proteínas. Otro método utilizó un biosensor electroquímico
para detectar la escisión colateral mediada por Cas13a de los reporteros de
ARN que transportan FAM y biotina.46(Higo.4, abajo a la izquierda). En este
enfoque, la unión de anticuerpos anti-FAM acoplados a glucosa-oxidasa a
moléculas indicadoras inmovilizadas en el sensor catalizó la oxidación de la
glucosa. El H producido2O2Luego se detectó amperométricamente usando
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nCATS
5′ PAGS
3′
PAM
STRique
ROI
3′
5′
PAGS
ESTRELLARSE
Repetir
PAGS
PAGS
desfosforilación
Cas9
Mediado por Cas9
Biblioteca
construcción
Escisión Cas12
Mediado por Cas9
agotamiento
Además de
PAG
S
PAGS
PAGS
PAG
Fragmento de Klenow
S
d(A)-tiro
d(A)
PAGS
PAGS
d(A)
Adaptador
Proteína motora
ligadura
Amplificación y
secuenciación
nanoporo
secuenciación
Figura 3 |CRISPR: estrategias de enriquecimiento mediadas por Cas para diagnósticos basados en secuenciación.Izquierda: nCATS es una tecnología de enriquecimiento basada en Cas9,
que primero desfosforila los extremos del ADN y luego usa Cas9 para inducir cortes cerca de una región de interés (ROI) que contiene una secuencia PAM. Una ADN polimerasa I con un
truncamiento N-terminal que carece de actividad exonucleasa (fragmento Klenow) permite la adición de dAMP (monofosfato de desoxiadenosina (dA)) a los 3′terminar el fragmento de ADN (d(A)tailing)). A continuación, los adaptadores que contienen una proteína motora se ligan al ADN en los sitios de escisión de Cas9, lo que permite que el ADN pase a través del nanoporo. STRique usa
Cas12a para el enriquecimiento de regiones que contienen repeticiones analizadas por secuenciación de nanoporos y emplea un algoritmo para la identificación de la posición de las regiones que
flanquean la repetición y el número de repeticiones. Derecha: DASH usa Cas9 para agotar las secuencias no deseadas (negro) antes de la secuenciación de próxima generación. Las secuencias no
dirigidas (magenta) conservan los adaptadores intactos para la amplificación y la secuenciación.
una celda electroquímica con un electrodo de trabajo de platino, un
contraelectrodo de platino y un electrodo de referencia de plata/cloruro de
plata. Esta técnica permitió la detección de miARN con un LOD de 10 pM en
4 horas en volúmenes inferiores a 0,6 μl (este LOD se logró utilizando una
escisión 'fuera del chip' separada; el sensor todo en uno tenía un LOD de 2,2
nM ). También se mostró la detección electroquímica de miARN basada en
Cas13a con un chip de electroquimioluminiscencia portátil78(con un límite
de detección informado de 1 fM). En esta técnica, la activación de Cas13a
mediada por miARN condujo a la escisión colateral de un disparador para el
inicio de la amplificación isotérmica exponencial. Los productos
amplificados formaron un complejo con [Ru (phenan throline)2
dipiridofenazina]2+, y la oxidación del complejo en el ánodo de un electrodo
bipolar generó una señal electroquimioluminiscente proporcional a la
concentración del miARN diana.
preamplificación Para crear una lectura electrónica, se colocaron dos
electrodos en la capa inferior del μPAD. Debido a que la conductividad
eléctrica del gel dependía de su grado de entrecruzamiento, los bajos
niveles de entrecruzamiento debido a la escisión mediada por Cas12a
hicieron que fluyera un tampón que contenía electrolitos, mientras que
los altos niveles de entrecruzamiento en ausencia de cualquier objetivo
bloquearon el flujo del tampón. , impidiendo así la grabación de una
señal eléctrica. Además, la incorporación de un módulo de
identificación por radiofrecuencia inalámbrica (RFID) en el μPAD
permitió monitorear la detección de objetivos en diferentes
ubicaciones geográficas en tiempo real. Con este fin, la escisión
colateral mediada por Cas12a en la detección de objetivos resultó en el
cortocircuito de una disposición de electrodos interdigitados en la
etiqueta RFID de bucle,
Los hidrogeles de ADN se han diseñado para permitir lecturas de diagnóstico
basadas en CRISPR a través de cambios en sus propiedades materiales.79,80. Los
Preparación de la muestra.El procesamiento de muestras es una consideración
hidrogeles consisten en polímeros llenos de agua que contienen moléculas de
de importancia crítica para mejorar la usabilidad de los diagnósticos basados en
ADN que sirven como ancla o elemento estructural dentro del gel (Fig.4, abajo a la
CRISPR para aplicaciones de campo y configuraciones de POC. Los diagnósticos
derecha). En el reconocimiento del objetivo, Cas12a desencadena la escisión
basados en CRISPR inicialmente utilizaron objetivos sintéticos o protocolos de
colateral de las moléculas de ADN, lo que cambia las propiedades del gel. Esta
aislamiento de ácido nucleico que requerían mucho tiempo o equipos. Esfuerzos
tecnología se utilizó para detectar ácidos nucleicos derivados de patógenos en un
más recientes tienen como objetivo el aislamiento rápido y sin equipo de ADN o
dispositivo de microfluidos basado en papel de varias capas. (μPAD) con lecturas
ARN. Es importante destacar que los reactivos utilizados en los pasos de
duales visuales y electrónicas. En ausencia del objetivo, el hidrogel que contenía
extracción de muestras no deben interferir con ningún paso de preamplificación
el enlazador de ADN obstruyó el flujo de un tampón a través de los canales
posterior o con la detección de objetivos basada en CRISPR. Como en muchos
porosos del dispositivo basado en papel. El reconocimiento de objetivos condujo
casos, la lectura final se basa en la actividad de escisión colateral y se deben
a la destrucción del enlazador mediada por Cas12a, lo que impidió la reticulación
tomar precauciones especiales para garantizar la ausencia de RNasas y DNasas,
del hidrogel y provocó un flujo observable visualmente a través de los canales
que pueden escindir los reporteros ssRNA o ssDNA.
porosos de μPAD. Esta técnica permitió la detección de dsDNA hasta 400 pM sin
El protocolo original de SHERLOCK mostró que la saliva podía procesarse
directamente usando Triton X-100 al 0,2 % en una mezcla de lisis
650
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NATURALEZA INGENIERÍA BIOMÉDICA
Fluorescencia
Flujo lateral
Lector de fluorescencia
familia
Dirección del flujo
biotina
Bebida refrescante
- Generar
fluoróforo
nanopartícula de oro
y anticuerpos FITC
+ Disparador
estreptavidina
Detección visual
bajo luz LED azul
Anticuerpo anti-especie
Electrónico
estreptavidina-
Anticuerpo-
línea de captura
línea de captura
Materiales
Glucosa
H2O2
2mi–
enlaces cruzados
2H++O2
obstruido
caudal
er
en
-G
GOx
familia
BSA
- Generar
ar
+D
isp
a
+ Disparador
ra
do
r
Flujo de búfer
biotina
Ω
Sin enlaces cruzados
Figura 4 |Lecturas de clivaje colateral.Arriba a la izquierda: las lecturas de fluorescencia se basan en fluoróforos apagados que, al reconocer el objetivo, se liberan como resultado
de la escisión colateral de los oligómeros de ADN o ARN que se unen al fluoróforo y al apagador. La señal puede medirse con un lector de fluorescencia o leerse a simple vista bajo
luz azul. LED, diodo emisor de luz. Arriba a la derecha: las lecturas inmunocromatográficas basadas en flujo lateral se basan en la alta afinidad de la estreptavidina y la biotina, y
utilizan una molécula indicadora que consta de un oligómero de ADN o ARN conjugado con FAM y biotina. El producto de la reacción CRISPR se deposita en el área de aplicación de la
muestra de una tira reactiva, momento en el que FAM se une a los anticuerpos específicos de FITC marcados con nanopartículas de oro. Cuando está intacto, el oligómero
informador permanece unido a la línea de estreptavidina a través de la biotina, creando una banda de color en la tira reactiva. Cuando se escinde el oligómero informador, FAM y los
anticuerpos específicos de FITC marcados con oro unidos fluyen más lejos en la tira y se unen a anticuerpos secundarios anti-especie, lo que conduce a la formación de una segunda
banda de color. Abajo a la izquierda: lectura electroquímica basada en la detección amperométrica de H2O2en una celda electroquimica46. Los anticuerpos anti-fluoresceína (verde)
junto con la glucosa oxidasa (GOx) se unen a las moléculas indicadoras de ARN portadoras de FAM, que se inmovilizan a través de la biotina en una superficie. La concentración de
GOx se reduce en presencia de un activador de ARN, debido al complejo crRNA/Cas13a activado que escinde la molécula informadora de ARN en el reconocimiento del objetivo, lo
que libera los anticuerpos antifluoresceína portadores de GOx de la superficie. Abajo a la derecha: en presencia de un disparador dsDNA, Cas12a escinde colateralmente los
enlazadores ssDNA dentro de un hidrogel. Esto evita la reticulación dentro del hidrogel, modulando así la permeabilidad de un dispositivo de microfluidos a base de papel y
permitiendo el flujo de amortiguación, que se puede medir eléctricamente.79,80.
con solución salina tamponada con fosfato y calentando a 95 °C durante 5
min. Esta mezcla de saliva cruda se usó en una reacción de SHERLOCK para
el genotipado. Para expandirse a tipos de muestras adicionales, el protocolo
HUDSON (para calentar muestras de diagnóstico no extraídas para destruir
nucleasas) permitió la inactivación de nucleasas y virus a través del calor y la
deAliciclobacillus acidiphilus(AapCas12b)63. QuickExtract también
permitió la lisis de muestras a 22 °C o 60 °C durante 10 min, y
cuando un inhibidor bloqueó la proteinasa K en las reacciones
posteriores.
reducción química mediante la adición de clorhidrato de tris (2-carboxietil)
fosfina a una concentración final de 100 mM y ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) a una concentración final de 1 mM81. Se
optimizaron diferentes pasos de calentamiento (que van de 5 min a 20 min
y de 37 °C a 95 °C) para diferentes objetivos y tipos de muestra. HUDSON
permitió la detección de objetivos preamplificados por RPA a través de
CRISPR-Cas13a, incluida la detección de ZIKV y el virus del dengue en
sangre, plasma, suero, saliva y orina. Dado que el protocolo HUDSON no fue
suficiente para inactivar las nucleasas para la detección dePlasmodio(según
lo observado por la fracción de muestras falsas positivas), se ha
desarrollado un tampón de preparación que contiene agentes quelantes
más fuertes (20 % p/v de tampón Chelex100 TE que contiene ditiotreitol
(DTT) a 50 mM)61.
Una solución de extracción rápida de ADN disponible comercialmente
Pruebas y costos a gran escala.Una ventaja de los ensayos de diagnóstico
(QuickExtract, Lucigen) permite una preparación rápida de ARN para la
disponible actualmente a US $ 30,15 por reacción (https://www.idtdna. com/
detección de ARN del SARS-CoV-2 a través de RT-qPCR82. Aquí, los hisopos
pages/landing/coronavirus-research-reactivos/sherlock-kits). No está claro cómo
nasofaríngeos se mezclan con la solución de extracción, se incuban a 95 °C
durante 5 minutos y se usan directamente en la reacción de RT-qPCR
se desarrollarán los precios después de la aprobación de más pruebas, y cómo las
después de enfriarse. Este protocolo de aislamiento es compatible con la
proteínas CRISPR-Cas afectarán la difusión de la tecnología.
basados en CRISPR es su independencia de los equipos de laboratorio complejos
y costosos y de los reactivos comunes, como las mezclas maestras de PCR. Debido
a que las enzimas Cas y los crRNA se pueden producir rápidamente y a escala, los
ensayos basados en CRISPR dependen menos de los problemas de la cadena de
suministro. Sin embargo, aunque los costes de los tampones, los cebadores y los
oligos utilizados como moldes para la síntesis de crRNA son insignificantes, los
ensayos basados en CRISPR incluyen muchas más enzimas que la PCR,
especialmente cuando se incluye un paso de preamplificación isotérmica. El costo
de una reacción individual de diagnóstico basada en CRISPR con preamplificación
es de aproximadamente USD 0,61 por reacción en un entorno experimental.32. De
estos costos, los reactivos RPA constituyeron la fracción más grande. Sin
embargo, el primer ensayo de diagnóstico basado en CRISPR comercialmente
disponible para SARS-CoV-2 que incluye RT-LAMP como preamplificación está
patentes que cubren métodos para la detección de ácidos nucleicos a través de
preamplificación y detección de RT-LAMP aguas abajo a través de Cas12b
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La mayoría de los ensayos de diagnóstico basados en CRISPR utilizan reactivos
líquidos, que brindan flexibilidad experimental. Sin embargo, el almacenamiento de
soluciones de crRNA, el reportero de escisión y la proteína Cas normalmente requiere
congeladores que mantengan temperaturas ultrabajas. La liofilización de estos
componentes y de los reactivos de preamplificación elimina la dependencia de las
cadenas de frío y, al usar volúmenes de muestra de entrada más altos, las sensibilidades
del ensayo pueden ser similares.31o incluso más alto61
que con el uso de reacciones no liofilizadas. Se necesitan pruebas sistemáticas de
estabilidad de los componentes para diagnósticos basados en CRISPR, pero se
necesitan estudios en cohortes clínicas83y la evaluación de la variación
experimental diaria84sugieren que los resultados de los ensayos son altamente
reproducibles.
Aplicaciones biomédicas
Los diagnósticos basados en CRISPR se han utilizado para una amplia
gama de aplicaciones biomédicas y, en particular, para la detección de
biomarcadores basados en ácidos nucleicos de enfermedades infecciosas y
no infecciosas y para la detección de mutaciones y deleciones indicativas de
enfermedades genéticas. Además, la tecnología se ha adaptado para la
detección de proteínas y moléculas pequeñas.
Enfermedades infecciosas.El enfoque principal de los diagnósticos
basados en CRISPR ha sido la detección de patógenos; en particular, el
proteína de membrana) genes del genoma del SARS-CoV-2, así como un gen
de control humano (para la proteína ribonucleasa P), en menos de 40
minutos a partir de extractos de ARN de hisopos respiratorios
preamplificados por RT-LAMP87. SARS-CoV-2 DETECTR arrojó resultados con
una concordancia predictiva positiva del 95 % y una concordancia predictiva
negativa del 100 % en relación con el ensayo RT-qPCR de los Centros para el
Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos. Cas12a
también se utilizó en el ensayo SARS-CoV-2 AIOD-CRISPR (para CRISPRCas12a dual todo en uno)60, que usa Cas12a junto con un par de crRNA no
dependientes de PAM, cada uno de los cuales detecta regiones separadas
del amplicón de ácido nucleico objetivo. Estos complejos Cas12a-crRNA se
introdujeron en un ensayo de un recipiente que contenía los reactivos para
la preamplificación basada en RPA y el indicador de escisión. Este enfoque
permitió la detección de 5 copias de ARN sintético del SARS-CoV-2 por
reacción y se validó en 28 muestras de hisopos clínicos. STOPCovid (para
pruebas de SHERLOCK en un solo recipiente)63, otro ensayo de un solo
recipiente basado en Cas12, preamplificación integrada basada en RT-LAMP
con detección mediada por CRISPR en un flujo de trabajo de un solo paso.
De las diversas proteínas Cas exploradas, Cas12b deAliciclobacillus
acidiphilus(AapCas12b) junto con el ARN de guía única de andamio de
AacCas12b, permitió que la prueba se ejecutara en el rango de temperatura
requerido para LAMP. STOPCovid tiene una sensibilidad comparable a la de
RT-qPCR, con un LOD de 100 copias del genoma viral por reacción.
ADN o ARN de virus, bacterias y parásitos. Los virus de ARN detectados con
Además de los virus de ARN, los virus de ADN como Herpesviridae (incluido el
métodos basados en CRISPR incluyen el parvovirus B19 (ref.77), miembros
citomegalovirus (CMV)84y virus de Epstein-Barr88), Polyomaviridae (virus BK (BKV))
de la familia Flaviviridae (dengue22,25,81, zika25,32y virus de la encefalitis
84
japonesa37), Ébola85y Coronaviridae (que naturalmente se han convertido en
diagnósticos basados en CRISPR. En particular, se utilizó un ensayo basado en
un importante foco de interés durante la pandemia de COVID-19).
La detección de SARS-CoV-2 basada en SHERLOCK consistió inicialmente
en un ensayo de dos pasos que comprendía la preamplificación basada en
RPA, seguida de la transcripción de T7 y el reconocimiento de objetivos
mediado por Cas13a86. Este ensayo se ha probado en una cohorte clínica
validada por qPCR que contiene 154 muestras analizadas mediante lecturas
de flujo lateral y fluorescencia, y con 380 muestras PCR negativas analizadas
solo mediante fluorescencia.83. El ensayo alcanzó un LOD de 42 copias de
ARN por reacción y sensibilidades del 96 % y 88 % cuando se utilizaron
lecturas de fluorescencia y flujo lateral, respectivamente. Ambas lecturas
fueron 100% específicas. En mayo de 2020, un ensayo de dos pasos basado
en SHERLOCK modificado que usa RT-LAMP en lugar de RT-RPA recibió la
autorización de uso de emergencia de la Administración de Drogas y
Alimentos de los Estados Unidos para la detección de SARS-CoV-2 basada en
CRISPR. Las pruebas con este ensayo están destinadas a la detección
cualitativa de SARS-CoV-2 en muestras de las vías respiratorias superiores y
están limitadas a laboratorios autorizados por las reglamentaciones CLIA
(para enmiendas de mejora de laboratorios clínicos). Un ensayo diferente
basado en Cas13a, SHINE (para la integración de SHERLOCK y HUDSON para
SHERLOCK para detectar CMV y BKV en un entorno clínico.84El ensayo se validó
navegar epidemias)62, combinó la reacción de preamplificación y la
detección basada en CRISPR en una reacción de un solo paso que usa
HUDSON para acelerar la extracción viral del SARS-CoV-2 en hisopos nasales
y muestras de saliva. La adición de RNasa H, la optimización de los
tampones, las concentraciones de magnesio y de los cebadores, y el uso de
un indicador poliU junto con una transcriptasa inversa SuperScript-IV,
redujeron el LOD a un rango similar al del ensayo de dos pasos ( 10 copias
por μl con la lectura fluorescente y 100 copias por μl con la lectura de flujo
lateral). La prueba se validó en 50 muestras de pacientes nasofaríngeos y
logró una sensibilidad del 90 % y una especificidad del 100 % frente a la RTPCR. En un enfoque diferente basado en Cas13, la integración de múltiples
crRNA, el uso de un homólogo Cas13a de Leptotrichia buccalis(Lbu) y la
medición de la fluorescencia a lo largo del tiempo permitieron la detección
del ARN del SARS-Cov-2 extraído de hisopos nasales hasta 1,27×108copias
por ml (1,65×103copias por μl en la reacción Cas13). Es importante destacar
que esto se logró sin necesidad de preamplificación, y el ensayo fue
compatible con la lectura utilizando un dispositivo portátil de detección de
fluorescencia.44.
Mediante el uso de Cas12a, el ensayo de dos pasos SARS-CoV-2 DETECTR se
optimizó para detectar la N (nucleoproteína) y la E (envoltura pequeña).
652
y Papillomaviridae (virus del papiloma humano)36también se han detectado con
con qPCR y detectó BKV de 67 muestras de orina y plasma aisladas por HUDSON
con una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 100 %. El procesamiento
basado en HUDSON de muestras de plasma que contenían CMV dio como
resultado una sensibilidad del 80 % y una especificidad del 100 %, mientras que la
purificación del ADN a través de membranas basadas en sílice fue necesaria para
alcanzar una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 100 %. Para evaluar
objetivamente los resultados del ensayo de flujo lateral, se desarrolló una
aplicación de software basada en teléfonos inteligentes para cuantificar las
intensidades de las bandas. La señal de fondo del ensayo de flujo lateral fue
independiente de la variación experimental diaria, el tiempo de incubación y la
temperatura, lo que facilitó la reproducibilidad de la lectura cualitativa.
Las bacterias detectadas con CRISPR incluyenTuberculosis
micobacteriana32,89,estafilococo aureus22,32,90,Listeria monocytogenes91,
Pseudomonas aeruginosa32ySalmonella enteritidis92. CRISPR también ha
sido adaptado para detectar los parásitos delPlasmodiogrupo responsable
de la malaria. Esto incluye la detección de diferentesP falciparumpresiones71
y el desarrollo de un ensayo pan-plasmodium93que detectó todoPlasmodio
especies que se sabe que causan paludismo en humanos, así como la
detección específica de especies deP. vivaxy
P falciparum. Para la detección de
P falciparum,P. vivax,P. ovaleyP. malariae61. La adición de una
transcriptasa inversa para transcribir el ARN objetivo en ADN aumentó
la sensibilidad del ensayo. El protocolo logró un LOD entre 0,36 y 2,4
parásitos por μl, dependiendo de laPlasmodioespecies.
Enfermedades no infecciosas.También se han desarrollado diagnósticos
basados en CRISPR para la detección de especies de ARN relevantes para
enfermedades no infecciosas. Por ejemplo, la detección de humanos basada en
CRISPRCXCL9 El ARNm se utilizó para detectar el rechazo celular agudo del
trasplante de riñón, según lo definido por la biopsia renal, con una sensibilidad
del 93 % y una especificidad del 76 %, en el ARN total aislado de 31 sedimentos de
células urinarias.84. Los diagnósticos basados en CRISPR también se han utilizado
para detectar miARN, como lo demuestra la detección electroquímica basada en
CRISPR/LwaCas13a de miR-19b en muestras de suero de pacientes con
meduloblastoma.46sin preamplificación, y la prueba de ARN aislado
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de líneas celulares de cáncer de mama para miR-17 con CRISPR/LbuCas13a94
factor de crecimiento endotelial vascular humano a 0,81 fM (ref.101). Esto se logró
y para miR-21 con LbCas12a, después de la transcripción en círculo rodante95.
mediante el reemplazo de la enzima de amplificación de la señal de un ensayo
SNP y deleciones.Una de las principales ventajas de los diagnósticos
basados en CRISPR es la especificidad de un solo nucleótido de las enzimas
Cas, que permite la detección de mutaciones puntuales y pequeñas
deleciones. La especificidad de un solo nucleótido ha hecho posible la
detección basada en CRISPR de marcadores de resistencia antimicrobiana,
de deleciones y mutaciones en el gen del receptor del factor de crecimiento
epidérmico22, de mutaciones que confieren distrofia muscular de Duchenne
45y de SNP en el gen de la ubiquitina ligasa E3 que confiere el color de ojos41.
La especificidad de un solo nucleótido del sistema CRISPR-Cas también se
ha aprovechado para la detección de miARN, que son difíciles de detectar
debido a su pequeño tamaño y porque pueden diferir en una sola base. Los
enfoques basados en CRISPR también pueden ser adecuados para la
detección de variantes del SARS-CoV-2 en circulación que pueden diferir en
patogenicidad y transmisibilidad96.
picante) con dsDNA biotinilado que contenía un promotor T7, lo que permitió la
inmunoabsorbente ligado a enzimas tipo sándwich (usando peroxidasa de rábano
transcripción mediada por T7 de un objetivo Cas13a, lo que condujo a su
activación y a la escisión colateral de un reportero.
panorama
En menos de cinco años, los diagnósticos basados en CRISPR han pasado de ser una herramienta experimental de
detección de ácidos nucleicos a una tecnología de diagnóstico clínicamente relevante para la detección rápida,
asequible y ultrasensible de biomarcadores en el POC. Sin embargo, existen varios desafíos que la tecnología debe
superar para poder cumplir la promesa de transformar la forma en que se diagnostican las enfermedades y se
monitorean los patógenos emergentes. Una deficiencia importante de la mayoría de los diagnósticos actuales
basados en CRISPR es su dependencia de la preamplificación para la detección de objetivos por debajo del rango
femtomolar. Aunque los cebadores utilizados para la preamplificación agregan otra capa de especificidad, este
proceso agrega complejidad al ensayo, aumenta sus costos y prolonga el tiempo de reacción. La incorporación de
estrategias de amplificación de señal no basadas en cebadores, o modificaciones de la enzima Cas, crRNA o molécula
informadora, son caminos potenciales para la mejora. Actualmente, la mayoría de los crRNA y los cebadores para la
Dianas distintas de los ácidos nucleicos.Los métodos de diagnóstico
basados en CRISPR se han adaptado para la detección de proteínas y
moléculas pequeñas. En estos casos, el sistema CRISPR se usa
principalmente como informador o amplificador, y la detección real de la
molécula objetivo está mediada por proteínas o aptámeros que
experimentan un cambio conformacional en el reconocimiento del objetivo.
Una estrategia para detectar moléculas pequeñas combinó CRISPR-Cas12a
con factores de transcripción alostéricos bacterianos97(aTF). Conocido como
CaT-SMelor (para detector de moléculas pequeñas mediado por CRISPRCas12a y mediado por aTF), el método se aplicó para detectar ácido úrico y
pags-ácido hidroxibenzoico en concentraciones nanomolares y, por lo tanto,
permitió la detección de ácido úrico en muestras de sangre humana. En
este método, la incubación de complejos aTF-dsDNA inmovilizados que
contenían la secuencia objetivo Cas12a con la pequeña molécula objetivo
aTF condujo a un cambio conformacional en el aTF que liberó el dsDNA del
complejo. Después de eliminar el aTF inmovilizado mediante centrifugación,
se detectó dsDNA libre usando CRISPR-Cas12a y se midió a través de la
escisión colateral de un indicador fluorescente apagado. SPRINT (para
perfiles basados en SHERLOCK de transcripción in vitro)98utilizaron aTF y
riboswitches que son activados por moléculas efectoras específicas para
regular la transcripción de objetivos de ARN. Luego, el ARN transcrito se
detecta mediante un crRNA y Cas13a. Esto permitió la detección de una
amplia gama de moléculas efectoras (incluyendo fluoruro, adenina,
guanina,S-adenosilmetionina, mononucleótido de flavina, serotonina, zinc y
anhidrotetraciclina).
Un enfoque diferente para detectar moléculas pequeñas involucró un
aptámero que contenía un objetivo de ssDNA de Cas12a, que sirvió como
preamplificación deben probarse experimentalmente, y las reglas de diseño para reducir los candidatos potenciales
son toscas. Los algoritmos bioinformáticos y de aprendizaje automático basados en conjuntos de datos
experimentales a gran escala podrían permitir el desarrollo de herramientas de diseño más efectivas para una mejor
predicción del rendimiento del crRNA y para mejorar la especificidad y la actividad del crRNA. De hecho, la viabilidad
de tales enfoques para el diseño de crRNA se ha demostrado en el contexto de la ingeniería genómica. Los algoritmos
bioinformáticos y de aprendizaje automático basados en conjuntos de datos experimentales a gran escala podrían
permitir el desarrollo de herramientas de diseño más efectivas para una mejor predicción del rendimiento del crRNA y
para mejorar la especificidad y la actividad del crRNA. De hecho, la viabilidad de tales enfoques para el diseño de
crRNA se ha demostrado en el contexto de la ingeniería genómica. Los algoritmos bioinformáticos y de aprendizaje
automático basados en conjuntos de datos experimentales a gran escala podrían permitir el desarrollo de
herramientas de diseño más efectivas para una mejor predicción del rendimiento del crRNA y para mejorar la
especificidad y la actividad del crRNA. De hecho, la viabilidad de tales enfoques para el diseño de crRNA se ha
demostrado en el contexto de la ingeniería genómica.102,103y en la caracterización y optimización de interruptores de
pie104,105.
La facilidad de uso de los diagnósticos basados en CRISPR se ha mejorado a
través de reacciones optimizadas de un solo recipiente y la visualización simple de
los resultados de las pruebas. Sin embargo, la preparación de la muestra aún
requiere un paso separado, y las temperaturas de incubación superiores a la
temperatura ambiente requieren dispositivos de calentamiento. Además, las
concentraciones objetivo cercanas al LOD del ensayo dificultan cuantificar la
lectura con certeza, especialmente cuando se utiliza el formato de flujo lateral.
Para uso en el hogar o en el campo, el diseño del ensayo debe combinar
protocolos simples de preparación de muestras con métodos de detección sólidos
para brindar resultados sólidos en contextos variables o desafiantes, como
almacenamiento prolongado, capacitación limitada del usuario y condiciones
ambientales adversas. Para ello, los dispositivos que integran la preparación de
muestras,106. Y la combinación de dichos dispositivos con análisis digital y
sensor para el trifosfato de adenosina.99(ATP; LOD informado del ensayo,
sistemas de intercambio de datos es prometedora para las pruebas centradas en
400 nM de ATP). En este enfoque, la unión de ATP al aptámero dificultó el
el paciente y el acceso remoto a datos. Esto es particularmente importante para
reconocimiento del objetivo y, por lo tanto, redujo la escisión colateral
mitigar la propagación de enfermedades infecciosas al limitar el contacto
desencadenada por Cas12a de un reportero ssDNA. Alternativamente, ATP
personal innecesario en los hospitales. Además, los diagnósticos basados en
o Na+Se han detectado iones a través de aptámeros o ADNzimas (también
CRISPR pueden permitir diagnósticos complementarios basados en ácidos
denominados "ADN funcional") que liberan objetivos Cas12a al unirse a sus
nucleicos centrados en el paciente para monitorear las respuestas al tratamiento
objetivos que no son ácidos nucleicos, lo que resulta en la activación de
de un fármaco y diferenciar a los pacientes que están en riesgo de sufrir efectos
Cas12a detectada por eltransescisión de moléculas reporteras fluorescentes
adversos graves de aquellos que probablemente se beneficiarán del fármaco.107.
100
.
De manera similar, se ha desarrollado un método de detección basado
en aptámeros para la detección basada en CRISPR-Cas12a de la proteína del
factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1).77. En este método, TGF-β1
se une a un aptámero de ssDNA específico que contiene un sitio de destino
Cas12a. En ausencia de TGF-β1, todas las moléculas aptámeras libres y no
unidas son reconocidas por Cas12a, cuya actividad de escisión colateral de
los indicadores ssDNA que llevan azul de metileno da como resultado una
disminución de la señal electroquímica, que es detectada por E-CRISPR. El
ensayo E-CRISPR basado en aptámero permitió la detección de TGF-β1 en
muestras clínicas con un LOD de 0,2 nM. Y CLISA (para el ensayo
inmunoabsorbente ligado a la amplificación de señal basado en CRISPRCas13a) se desarrolló para detectar la interleucina-6 humana a 2,29 fM y
Los diagnósticos basados en CRISPR podrían facilitar el seguimiento de los
marcadores genéticos indicativos de la respuesta al tratamiento, como las
mutaciones en elBRAFgen, que se usa comúnmente para informar el tratamiento
del cáncer de piel tipo melanoma108. Además, los diagnósticos basados en
CRISPR se pueden utilizar para el control en tiempo real de la expresión génica en
diferentes tejidos a través de la detección de ARNm libre de células.109.
Las aplicaciones futuras de los diagnósticos basados en CRISPR probablemente
incluirán tecnologías en la intersección con la ciencia de los materiales.79,80, para la
detección de ácidos nucleicos en superficies sólidas, en dispositivos portátiles y en
dispositivos médicos. Por ejemplo, el trabajo en curso tiene como objetivo incorporar
sensores SARS-CoV-2 en máscaras faciales para la detección en tiempo real.
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continuo y un diagnóstico temprano. Esto podría ampliar las capacidades de las
III proporciona un diagnóstico de SARS-CoV-2 específico de secuencia. Informes celulares Med.2,
Los ensayos CRISPR recientemente desarrollados deben, por supuesto, ser validados83
por ensayos clínicos, y la validez del ensayo monitoreada y mantenida después de
la implementación clínica. Sin embargo, creemos que la rápida innovación en los
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asesores científicos de Sherlock Biosciences y Pine Trees Health. OOA y JSG también
son cofundadores y asesores científicos de Moment Biosciences y Tome Biosciences.
FZ también es cofundador de Editas Medicine, Beam Therapeutics, Pairwise Plants y
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Agradecimientos
Correspondenciadebe dirigirse a JJC
Información de revisión por paresNaturaleza Ingeniería Biomédicaagradece a Kiana
Aran, Charles Chiu y Da Xing por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.
Reimpresiones e información de permisosestá disponible enwww.nature.com/reimpresiones.
MMK recibió el apoyo del Programa Emmy Noether (KA5060/1-1) de la Fundación
Alemana de Investigación (DFG). JJC fue apoyado por Paul G. Allen Frontiers Group y el
Instituto Wyss. Todas las figuras fueron creadas con BioRender.com.
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