Centro Universitario Uteg Manual de Prácticas de Laboratorio de Inmunología Aplicada Dra. Jessay Luna Vásquez Dr. En C. Luis Daniel Hernández Ortega Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Extracto del Reglamento de Laboratorios de Química (D-CL-20) del Centro Universitario UTEG Artículo 1.- El presente reglamento es obligatorio y de observancia general, tanto para el personal como para los alumnos que conforman la comunidad universitaria UTEG, y tiene por objeto regular el uso y conservación de los laboratorios y equipos especializados en química, incluyendo a sus ramas disciplinarias, así como los derechos y obligaciones de los usuarios y encargados de los mismos. Artículo 3.- Para los efectos de este reglamento se entiende por: a. Agente Infeccioso: microorganismo capaz de causar una enfermedad si se reúnen las condiciones para ello y cuya presencia en un residuo lo hace peligroso. b. Laboratorio de Química: lugar habilitado con material e instrumentos especializados para realizar investigaciones y experimentos de tipo científico, en la materia de química incluyendo sus ramas disciplinarias. c. Residuos Peligrosos: son aquellos que posean alguna de las características de corrosividad, reactividad, explosividad, toxicidad, inflamabilidad, o que contengan agentes infecciosos que les confieran peligrosidad, así como envases, recipientes, embalajes y suelos que hayan sido contaminados cuando se transfieran a otro sitio. d. Residuos Peligroso Biológico-Infecciosos: aquellos clasificados como tales en las Normas Oficiales Mexicanas, como la sangre, sus componentes y derivados; cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos; desechos patológicos como tejidos, órganos, cadáveres y partes de animales; muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico, excluyendo orina y excremento; residuos no anatómicos como materiales de curación que contengan algún tipo de líquido corporal y derivados de los laboratorios; y objetos punzocortantes contaminados y no contaminados (lancetas, jeringas, porta y cubreobjetos, navajas de bisturí). e. Usuario: toda persona miembro de la comunidad universitaria UTEG, sea personal académico, alumnos y trabajadores administrativos, que utilice o haga uso de los laboratorios de química. Artículo 6.- Toda persona que haga uso de los laboratorios deberá registrar su ingreso en las bitácoras correspondientes que, para el efecto de registro, posea el centro universitario, anotando su nombre, matricula o número de empleado y firma. Artículo 7.- Todas las prácticas y/o experimentos que se realicen en los laboratorios deberán estar supervisados por el docente de la asignatura correspondiente. Artículo 8.- Los usuarios deberán portar, al ingresar a los laboratorios, el siguiente atuendo: Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg a. b. c. d. e. f. g. h. i. j. k. Bata blanca de manga larga abotonada, con el logo de la institución. Lentes de seguridad. Paño o franela para limpiar su área de trabajo. No usar lentes de contacto, quienes necesiten lentes correctivos deberán portar anteojos. Calzado cerrado, de piso, no de tela y suela antiderrapante (el zapato deberá cubrir completamente el empeine; no se permitirá la entrada con zapato abierto o semicerrado, con o sin calcetines). Pantalón largo de mezclilla o gabardina de algodón. No se permite la entrada con pantalón corto, faldas, blusas escotadas o de tirantes. Cabello recogido (en el laboratorio que se requiera portar cofia). Uñas cortas y limpias, sin esmalte. No accesorios como aretes, anillos, cadenas, pulseras, esclavas y/o relojes. Portar guantes de látex y cubre bocas (bajo indicación del docente, de acuerdo al tipo de práctica y de laboratorio). Mujeres sin maquillaje, de acuerdo al tipo de práctica y de laboratorio, bajo la indicación del docente. Asimismo, es obligatorio llevar a cabo la técnica de lavado de manos indicada por los docentes al iniciar y al terminar la práctica. Artículo 9.- El docente deberá identificar los riesgos específicos de cada práctica e indicar las medidas y procedimientos de seguridad adecuados para su realización, en especial si el alumno pudiera estar expuesto a situaciones de peligro o riesgo, con sustancias peligrosas por el tipo de sus características explosivas, volátiles, corrosivas, reactivas, tóxicas, inflamables o infeccionas. Artículo 11.- Durante el desarrollo de las prácticas en los laboratorios, los docentes a cargo son responsables directos del correcto uso de las instalaciones, material, equipo, reactivos y sustancias, siendo su obligación reportar cualquier irregularidad descubierta en los mismo, notificando por escrito de inmediato al personal a cargo de los laboratorios, así como de los eventuales infractores en su caso. Artículo 12.- El docente que utilice los laboratorios deberá permanecer en los mismos hasta que concluya la práctica, siendo responsable de proporcionar una asesoría adecuada y de calidad a los alumnos durante su desarrollo, así como del comportamiento de los alumnos. Artículo 13.- Los alumnos son responsables del material y equipo de los laboratorios que empleen durante las prácticas. En caso de falla o desperfecto en los equipos, deberán reportarlo de inmediato al docente a cargo de la práctica y/o al Técnico Laboratorista y/o Coordinador de Laboratorios. Para el caso de que algún alumno rompa de manera accidental o intencionada el material o instrumentos del laboratorio, deberá reponerlo en la misma calidad, cantidad y de la misma marca que el que le fue entregado. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Artículo 14.- Son obligaciones de los usuarios de los Laboratorios de Química, las siguientes: a. Asistir con puntualidad a las prácticas. b. Permanecer en orden y guardar silencio. c. Abstenerse de jugar, correr, hacer bromas y emplear lenguaje inadecuado dentro de las instalaciones. d. Realizar el lavado de manos indicado por el docente antes de iniciar la práctica. e. Atender a las indicaciones de vestimenta y atuendo indispensable para asistir a las prácticas. f. Acatar a la brevedad las indicaciones del docente o encargado del laboratorio y/o técnico auxiliar de laboratorio. g. Hacer un uso adecuado de las instalaciones, equipo, materiales, sustancias y/o reactivos. h. Respetar los horarios y condiciones de uso de los laboratorios y sus equipos especializados. i. Revisar con antelación al desarrollo de la práctica, en el manual correspondiente, el material necesario para su realización, solicitado por el docente y/o técnico y/o encargado de laboratorio, ya que sin él no podrán realizarla, ni ingresar al laboratorio, sin excepción. j. Atender a las indicaciones del docente y/o técnico y/o encargado de laboratorio, para la disposición final de las sustancias y reactivos empleados durante las prácticas. k. Localizar el equipo de seguridad para que, en cualquier contingencia, puedan operarlo. l. Usar solamente equipo que se encuentre en buenas condiciones y reportar cualquier desperfecto de inmediato a su docente y/o encargado de laboratorio. m. Guardar su material limpio, seco y completo en la gaveta asignada para tal efecto. n. Una vez concluida la actividad dentro del laboratorio, dejar en perfecto orden el entorno en el cual estuvo trabajando; apagar y entregar equipos y materiales, limpiar las mesas de trabajo, acomodar las bancas o sillas; retirar y limpiar los papeles y elementos utilizados, y reportar cualquier falla del equipo. Artículo 15.- Los alumnos tienen la posibilidad de alquilar en la dirección administrativa del plantel, un lócker al inicio de cada ciclo escolar, para el efecto de que guarden sus objetos personales durante las prácticas de laboratorio; en caso contrario, los alumnos no podrán dejar sus pertenencias en los pasillos, aulas o dentro del laboratorio, y la institución no se hace responsable de los daños que puedan sufrir. Artículo 16.-El alumno deberá leer cuidadosamente las etiquetas de los reactivos; en caso de accidente, deberá actuar con calma y reportar inmediatamente lo sucedido al docente y/o técnico y/o encargado de laboratorio. Artículo 17.- Los alumnos deberán observar los cuidados necesarios para el manejo de los equipos utilizados en la práctica y leer previamente el instructivo de trabajo, el cual se encontrará al lado del equipo. Cualquier duda al respecto deberá consultarla con el encargado y/o técnico del laboratorio y/o docente. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Artículo 25.- Para poder ingresar a los laboratorios, el alumno deberá portar el atuendo establecido en el presente reglamento, en caso contrario, será facultad del Docente y/o encargado y/o técnico de laboratorio, restringirle el acceso al mismo; de igual manera, deberá asistir con puntualidad en las horas programadas para la práctica. Se nombrará lista de asistencia 10 diez minutos después de la hora señalada para la práctica, después de lo cual no se permitirá el acceso o salida a ningún alumno; sin excepción. Artículo 26.- Se dará una tolerancia de sólo 5 cinco minutos para desocupar las instalaciones, una vez concluido el horario designado. La ausencia de un docente o grupo de alumnos en el horario posterior al que le corresponde, no da derecho a seguir ocupando los laboratorios. Ante la omisión reiterada en el cumplimiento de este artículo (dos o más veces), se podrá negar una nueva reservación, a criterio del Director Académico. Artículo 28.- El docente deberá respetar las fechas y número de prácticas establecidas por él mismo en el programa de prácticas del laboratorio. Si el docente planea realizar una práctica diferente a la programada, deberá notificar con preferencia 3 tres días de anticipación para evitar el gasto innecesario de reactivos y/o uso de equipos. Ante la omisión reiterada en el cumplimiento de este artículo (dos o más veces), se podrá negar una nueva reservación, a criterio del Director Académico. Artículo 29.- El usuario conservará y mantendrá el orden y limpieza de las instalaciones y equipos de los laboratorios de química. Si el laboratorio se encuentra sucio antes de empezar la sesión, el usuario deberá reportarlo al encargado y/o técnico en turno; en caso de no recibir respuesta favorable, se deberá reportar a la Dirección Académica. Artículo 30.- Al inicio de cada semestre los alumnos deberán agruparse por equipos o mesas de laboratorio para realizar las prácticas que les corresponda durante todo el ciclo escolar, nombrando un representante. El docente y/o encargado y/o técnico de laboratorio les entregará por equipo o mesa el material que requerirán a lo largo del semestre, firmando el responsable del equipo, mismo que deberán guardar en la gaveta que les corresponda. Al final del semestre, el material deberá ser devuelto íntegro, de lo contrario le será condicionada la reinscripción al equipo completo. Existe material que no debe reusarse por la naturaleza de las muestras que se manejan (como portaobjetos, cubreobjetos), este material deberá desecharse en su contenedor correspondiente y el alumno deberá reponerlo en la práctica inmediata posterior en que fue desechado. Artículo 31.- Al inicio de cada práctica el alumno deberá solicitar al docente y/o encargado y/o técnico de laboratorio la llave de la gaveta donde se encuentra su material, para poder emplear el requerido durante la práctica; al final de la misma el material deberá ser devuelto Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg completamente limpio y seco. En caso de que éste sufra algún desperfecto, deberá reportarlo al docente y/o encargado del laboratorio, de lo contrario, asumirá la responsabilidad correspondiente. Artículo 32.- Por ningún motivo el alumno deberá tratar de abrir o reparar el material o equipo del laboratorio por sí mismo. Cualquier falla en el equipo o material deberá ser reportada al docente o técnico y/o encargado del laboratorio. Artículo 33.- El material y/o equipo utilizado debe ser devuelto en las condiciones que fue prestado. Por tal motivo, en caso de que el usuario dañe el equipo y/o material a su cargo de manera accidental o intencional, deberá reponerlo en la práctica inmediata posterior por uno igual en marca y características. En caso contrario, se le negará el servicio por tiempo indefinido y se levantará el acta correspondiente, ajeno a la sanción que le corresponda de acuerdo al Reglamento de Alumnos. En el caso de docentes y/o técnicos laboratoristas que dañen algún equipo o material, se valorará el por parte de Coordinación de Laboratorios y la Dirección Académica; en caso de que tengan que pagar o reponer el material esto se puede hacer mediante un descuento vía nómina previo Vo. Bo. del departamento de Recursos Humanos. Artículo 34.- Para el caso de que el laboratorio no cuente con las muestras necesarias para el desarrollo de la práctica, el docente deberá solicitarlas a sus alumnos con anticipación. Artículo 38.- Se debe conservar siempre limpia la mesa de trabajo al inicio, durante y al finalizar cada práctica; depositar toda la basura en los cestos correspondientes. Los vertederos deberán estar siempre libres de residuos, no se deberán arrojar cuerpos sólidos ni papeles. Artículo 44.- Queda estrictamente prohibido a los usuarios lo siguiente: a. Mascar chicle, introducir y consumir bebidas, alimentos, cigarrillos o cualquier tipo de golosina dentro del área de laboratorios. b. El uso de lentes oscuros, gorras, audífonos, teléfonos celulares, reproductor de música o video; videojuegos o cualquier equipo electrónico de entretenimiento o comunicación no permitido durante el uso de los laboratorios. c. El uso de sandalias, bermudas, pantalones cortos, cabello largo suelto, accesorios prominentes y corbata. d. Ingresar al laboratorio, tanto alumnos como docentes, sin bata de marga larga o con una bata diferente a la reglamentaria. e. El desorden y ruidos fuera de lo normal, dentro y fuera de los laboratorios; en todo caso los usuarios deberán esperar para su ingreso en el perímetro de acceso a que llegue su docente. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg f. La entrada a personas ajenas a la comunidad Universitaria UTEG. g. Correr, jugar, hacer bromas o acciones que pongan el peligro su seguridad y la de sus compañeros. h. Ingresar a los laboratorios si no está presente el docente o encargado de laboratorio. i. Utilizar computadora durante la clase, excepto si se requiere para exponer algún tema. j. Introducirse objetos en la boca. k. Hacer uso del equipo de seguridad y/o salida de emergencia cuando no sea necesario. l. Mezclar sustancias y reactivos sin la debida autorización del docente o encargado de laboratorio. m. Hacer un uso incorrecto del mobiliario, equipos, instalaciones, sustancias o reactivos de los laboratorios. n. Proferir palabras altisonantes u ofensivas entre los alumnos, docentes, técnicos y/o encargados de laboratorio. o. Las demás que sean establecidas por el docente, encargado y/o técnico o Director Académico, para garantizar el buen funcionamiento y conservación de los equipos y laboratorios de química. Artículo 45.- Ningún alumno podrá permanecer en el recinto de los laboratorios en ausencia de sus docentes o del responsable de laboratorio, ni portando una bata ajena a la reglamentaria. Ningún docente podrá permanecer en los laboratorios fuera de su programa de prácticas sin la autorización del encargado de laboratorio y/o Director Académico de la carrera y/o portando bata ajena a la reglamentaria. Artículo 46.- En caso de incumplimiento a los lineamientos establecidos en el presente reglamento, podrán ser aplicadas por el encargado o personal responsable del laboratorio, el docente, el Director Académico y/o Administrativo, según sea el caso, sin perjuicio de ser exigida la reparación de los daños ocasionados, las siguientes sanciones: a. b. c. d. Amonestación verbal o escrita. Retención de credenciales. Suspensión del servicio. Las sanciones establecidas en el reglamento que por su relación con el Centro Universitario le correspondan. Artículo 47.- El alumno debe comportarse adecuadamente dentro de las instalaciones del laboratorio, hacer uso apropiado del lenguaje oral y escrito, respetar a sus profesores y compañeros de clase técnicos y/o encargados de laboratorio; en caso contrario se le suspenderá el servicio temporalmente o en casos graves indefinidamente, a criterio del docente o del encargado y/o técnico del laboratorio, previo el aval de Dirección Académica. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Artículo 48.- Los alumnos que incumplan con las disposiciones contenidas en el presente reglamento, deberán ser reportados por el docente y/o encargado y/o técnico de laboratorio al Director Académico que corresponda, para que con base en el Procedimiento de Determinación de Responsabilidad y Aplicación de Sanciones establecido en el Reglamento de Alumnos, se determine la sanción que le corresponda de acuerdo a la gravedad de la infracción y se glose copia del acta respectiva al expediente del alumno. Artículo 49.- Los docentes y técnicos y/o encargados de laboratorios que incumplan las obligaciones que este reglamento les confiere, podrán ser sancionados con base en la gravedad de la infracción, de acuerdo al Reglamento de Docentes o Interior de Trabajo, según corresponda. Artículo 50.- Los casos no previstos en este Reglamento serán solucionados por el encargado o técnico del laboratorio, o por el Director Académico en su caso, atendiendo a los intereses de la comunidad y teniendo a la vista el cumplimiento de las finalidades que son propias del servicio de los laboratorios de Química del Centro Universitario. El presente reglamento fue modificado a petición del Director Académico de la Licenciatura en Químico Farmacobiólogo durante revisión oficiosa R03/0114 en el mes de enero de 2014; en virtud de lo anterior se deberá entender que subsiste el contenido en todas sus partes del presente reglamento, en lo que ve a aquellas disposiciones que no fueron modificadas. Estas reformas entrarán en vigor a partir del mes de enero de 2014, previa autorización del Director del Macroproceso correspondiente. TABLA DE MODIFICACIONES REVISIÓN MODIFICACIONES FECHA DE APROBACIÓN R02 Enero de 2013 Artículo 4, 8 inciso e) y f) y 18. R03 Enero de 2014 Art. 13, 21 y 23. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Índice Practica 1. Inflamación Practica 2. Identificación de linfocitos T, determinación de rosetas T Practica 3. Identificación de linfocitos B Practica 4. Hipersensibilidad inmediata, pruebas intradérmicas Practica 5. Degranulación de basófilos Practica 6. Cuantificación de eosinófilos en secreción nasal Practica 7. Determinación de la actividad hemolítica del complemento por IDR Practica 8. Identificación de células LE (lupus eritematoso) Practica 9. Inmunología del cáncer Practica 10. Hipersensibilidad tardía e inmunodeficiencia Practica 11. Inmunología de los trasplantes Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Introducción La inmunología abarca un amplio campo del conocimiento, dentro de los últimos años los ensayos de inmunología celular y molecular han cobrado una importancia significativa ya que nos pueden brindar una gran cantidad de información de un gran número de patologías. A la par de esto se han desarrollado un sin número de técnicas automatizadas con gran exactitud y precisión, este tipo de técnicas son desarrolladas en laboratorios de alta especialización; sin embargo como en todas las técnicas novedosas, existe siempre un fundamento o una técnica que podemos llevar a cabo en laboratorio pequeño o de bajo presupuesto, no por ello el resultado carecerá de validez. Este manual fue diseñado para que el alumno aplique los conocimientos adquiridos en clase, mismos que forman el fundamento de las técnicas empleadas en el laboratorio o sirven a su vez para la interpretación y correlación de los resultados. A lo largo de las prácticas realizadas el alumno desarrollara conocimientos y habilidades manuales que le permitirán desempeñarse de manera adecuada dentro del laboratorio de inmunología y al conocer el fundamento básico de dichas técnicas será capaz de comprender lo que sucede dentro de los equipos automatizados. Los autores Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Práctica 1 INFLAMACIÓN Fundamento La inflamación es una respuesta compleja de nuestro sistema inmune innato, la cual refleja los efectos de las citocinas liberadas sobre los tejidos vascularizados; de manera simple, a una reacción inflamatoria se le puede definir como calor, rubor, tumefacción, dolor y pérdida de la funcionalidad. Las características primordiales de una reacción inflamatoria localizada fueron descritas desde hace casi 2000 años por los romanos y fue en el siglo II DC cuando el médico Galeno añadió la pérdida de la función al concepto. La inflamación puede ser aguda, como ejemplo tenemos al daño tisular, o crónica como consecuencia de una patología ya establecida. El proceso de una reacción inflamatoria es complejo y está dado por una cascada de eventos que finalmente conducen a la migración de células del sistema inmune hacia el lugar de la lesión. Inmediatamente después de la lesión tisular aumenta el diámetro de los vasos sanguíneos (vasodilatación) en dicha zona, lo que ocasiona un aumento del volumen sanguíneo, este aumento de sangre calienta el tejido y lo enrojece. También se aumenta la capilaridad, permitiendo el escape de líquido desde los vasos sanguíneos y la expansión del tejido (edema). Pocas horas después los leucocitos se adhieren a las células endoteliales y atraviesan las paredes de los vasos sanguíneos para migrar a los espacios tisulares, proceso llamado extravasación. Estos leucocitos se encargan de fagocitar a los patógenos invasores y liberan mediadores moleculares que contribuyen a la reacción inflamatoria y al reclutamiento y activación de otras células del sistema inmune, todo esto tiene como consecuencia la sensación de dolor y pérdida de la función en la zona lesionada. Las células del sistema inmune innato desempeñan un papel muy importante en la respuesta hacia microorganismos invasores, en conjunto todas estas células activan una cascada de respuestas cada vez más compleja para permitir la eliminación del agente invasor. Los macrófagos y células NK secretan citocinas que activan a los macrófagos y estimulan la inflamación, también ayudan al reclutamiento y activación de leucocitos. Los neutrófilos y los macrófagos reconocen a los microorganismos por medio de receptores que actúan estimulando la migración de las células al sitio de la lesión, promoviendo la fagocitosis y producción de sustancias que eliminan a las bacterias. Los neutrófilos son las células que migran con mayor rapidez, son las primeras células que aparecen en las zonas de inflamación aguda y predominan durante los primeros días, a partir del primer día comienzan a migrar fagocitos mononucleares y algunos linfocitos, por último llegan las células T CD8+ y algunas células B. Si durante la reacción aguda inflamatoria se logra eliminar el agente invasor el tejido se comienza a recuperar de manera normal, pero si no fue posible Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg eliminar dicho agente, la reacción inflamatoria evolucionará a la cronicidad; en estos casos las células presentes comienzan a cambiar, escasean los neutrófilos y se encuentran grandes cantidades de linfocitos T CD4+ y fagocitos mononucleares, las reacciones frente a las enfermedades parasitarias suelen acompañarse de una acumulación de eosinófilos. El proceso de migración leucocitaria a los sitios de la lesión depende de la estimulación por citocinas y está mediado por los receptores leucocitarios y por los ligandos endoteliales de estos receptores. Las citocinas de mayor importancia son el TNF y las quimiocinas, las cuales son producidas por los macrófagos, las células endoteliales y otras células en respuesta a la lesión; el TNF estimula a las células endoteliales para que secuencialmente expresen distintas moléculas que median la fijación de los leucocitos a la pared del vaso sanguíneo; una o dos horas después de la exposición al TNF, las células endoteliales expresan selectina E, que inicia la unión de los neutrófilos y de otros leucocitos a los vasos sanguíneos en los sitios de inflamación. La molécula de adhesión vascular 1 (V-CAM), el ligando de la integrina (VLA-4), la molécula de adhesión intracelular (ICAM-1) y los ligandos de integrinas LFA-1 y Mac-1 aparecen en el endotelio 6 a 12 horas después de la exposición al TNF. Las integrinas median la fijación estable de los leucocitos al endotelio, para dar lugar a la posterior migración a través de los espacios interendoteliales al tejido extravascular donde se encuentre la lesión. La extravasación de neutrófilos se divide en 4 pasos: A) Rodamiento: en presencia de flujo sanguíneo, los leucocitos son impulsados de tal manera que se desplazan a lo largo de la superficie endotelial. B) Activación por estímulo quimioatrayente: a medida que el neutrófilo se desplaza, encuentra quimiocinas producidas en el sitio de la lesión que lo dirigen. C) Detención y adhesión: al llegar al sitio de la inflamación, gracias a la interacción integrinas-ICAM, el neutrófilo estabiliza su adhesión. D) Migración transendotelial: una vez adherido, el neutrófilo se abre paso a través de las células endoteliales y migra hacia el tejido dañado. Objetivo general Comprender el proceso de una reacción de inflamación. Objetivos particulares Identificar las células del sistema inmune en respuesta a una lesión inflamatoria. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Recursos Material Cubreobjetos Portaobjetos Pipetas Pasteur 1 paquetito de algodón Cinta microporo Reactivos Alcohol 90% Agua desionizada o tampón de fosfatos, pH 6.8–7.2 Colorante WrigthGiemsa Equipo Procedimiento Parte A. Evaluar la respuesta inflamatoria. Inflamación local Seleccionar a una persona por equipo y con un portaobjeto se hará una lesión por raspado en el antebrazo previamente desinfectado con una torunda con alcohol. Colocar un cubreobjetos sobre la lesión y fijar cuidadosamente con una cintra microporo. El cubreobjetos se cambiará a las 2, 6, 12, 24 y 48 hrs, marcando cada uno de ellos y teniendo extremo cuidado de no romperlos. Guardar los cubreobjetos cuidadosamente y marcar la hora que corresponde a cada uno, llevarlos a la siguiente práctica para realizar la segunda parte. Parte B. Observación de las células participantes en la reacción inflamatoria. Esta parte consiste en teñir los cubreobjetos con el colorante Wrigth-Giemsa para poder observar al microscopio las células que se encuentran a las diferentes horas. Tinción de Wrigth-Giemsa Colocar los cubreobjetos completamente secos en una gradilla de tinción. Cubrir el cubreobjetos con colorante de Wright-Giemsa. Tras 1 minuto, añadir un volumen igual de agua desionizada o tampón de fosfatos, pH 6.8–7.2, y mezclar bien soplando con cuidado sobre el cubreobjetos, sin derramar el colorante. Tras 1–3 minutos, lavar con agua desionizada y secar al aire. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Observar al microscopio Identificar las diferentes líneas celulares reclutadas en el sitio de la lesión a los diferentes tiempos en el microscopio con los objetivos de 10X y 40X. Actividades A) Cuestionario 1. ¿Qué es la inflamación? 2. Menciona las características principales de la inflamación 3. Menciona los tipos de inflamación y un ejemplo de cada uno de ellos 4. ¿Cuáles son las primeras células en aparecer en una reacción inflamatoria aguda? 5. ¿Qué son las citocinas y cuál es su función en el proceso de inflamación? 6. ¿Cuáles son las citocinas más importantes en una reacción inflamatoria? Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 7. ¿Cuáles son las moléculas que median la fijación estable de los leucocitos al endotelio vascular? 8. Menciona y explica brevemente los pasos de la extravasación de neutrófilos B) Diagrama de flujo de la reacción de inflamación. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Resultados Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Conclusiones Bibliografía Título Autor Página Editorial 1. 2. 3. Nombre del alumno: Fecha: Grado/grupo/turno: Calificación: Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Práctica 2 IDENTIFICACIÓN DE LINFOCITOS T DETERMINACIÓN DE ROSETAS T Fundamento Los linfocitos son las únicas células del cuerpo capaces de reconocer los diversos antígenos y distinguirlos específicamente, por lo que le dan a la respuesta inmunitaria adaptativa sus dos características principales: la especificidad y la memoria. Los linfocitos constan de distintos subconjuntos que difieren en su función y productos proteínicos, pero son morfológicamente muy parecidos. Las poblaciones y subpoblaciones de linfocitos tienen características morfológicas similares, para identificarlas, hacen falta métodos de laboratorio que detectan, proteínas de membrana denominadas "marcadores". Brain alrededor de 1970 demostró que los linfocitos T humanos poseen la propiedad de unirse espontáneamente a los eritrocitos de carnero in vitro, formando agrupaciones denominadas rosetas E. Esta propiedad ha sido útil para desarrollar una técnica sencilla y de bajo costo para la cuantificación de los linfocitos T. La formación de las rosetas se debe a que los linfocitos T humanos poseen en su superficie un receptor que provoca su unión con los eritrocitos de carnero. Este receptor se conoce como CD2 y forma parte de una familia llamados CD (CD, clusters of differentiation), como tal es una glicoproteína de membrana de 50 kDa, presente en los linfocitos T maduros, su función es interactuar con una glicoproteína de 40-70 kDa, llamada LFA-3 (leukocyte function antigen) o CD58, presente en la superficie de diversos tipos celulares. Por su parte los eritrocitos de carnero poseen una molécula similar al LFA-3 humano en su superficie. El receptor CD2 cumple la función de estabilizar las interacciones celulares durante la adhesión y la activación de los linfocitos T. La presencia del CD2 es útil para identificar a los linfocitos T humanos, a través de la formación de rosetas. Este método ha sido paulatinamente sustituido por métodos de inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales, especialmente con citometría de flujo. Sin embargo, dado su bajo costo en, el método de rosetas E sigue siendo una alternativa válida y útil para los laboratorios pequeños o de bajo presupuesto. Objetivo general Analizar la participación de los linfocitos T en la respuesta inmune y aprender los métodos empleados para la identificación de los mismos. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Objetivos particulares Identificar a los linfocitos B utilizando el método de rosetas “E”. Recursos Material 4 tubos de 13 x 100 4 tubos de 12 x 75 1 tubo con tapón de vaquelita. 1 pipeta de 5 ml. 1 torniquete. 2 pipetas Pasteur. 1 portaobjetos y cubreobjetos. 1 jeringa de 5 ml. Algodón. 1 pipeta de 1 ml. Perlas de vidrio. Reactivos Solución Linfocell o Linfoprep. Eritrocitos de carnero al 2%. Solución de Hanks. Alcohol. Equipo Centrifuga clínica Procedimiento Parte A. Preparación del método Preparación de células indicadoras 1. Obtener 5 ml de sangre periférica de carnero en condiciones asépticas en tubos con anticoagulante. La muestra puede ser almacenada en refrigeración hasta por 4 semanas. 2. Lavar 3 veces los eritrocitos con SSF, centrifugando a 2000 rpm durante 7 minutos cada vez. 3. Resuspender el botón eritrocitario en 1 ml de TBE. 4. Realizar una dilución al 6% de eritrocitos (llevando el ml de eritrocitos a un volumen final de 17.5 ml). Procedimiento de rosetas 1. Tomar de 3 a 5 ml de sangre y desfibrinar. 2. A 2 ml de sangre desfibrinada agregar 2 ml de solución de Hanks. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 3. Tomar 1 ml de esta disolución y agregárselos a 2ml de Linfoprep. Centrifugar a 1000 rpm durante 15 minutos para separación de linfocitos. 4. Con una pipeta Pasteur tomar los linfocitos y pasarlos a un tubo 12x75 y lavar con 2 ml de solución de Hanks. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos. 5. Observar el anillo que se forma al fondo del tubo, son los linfocitos. Eliminar con mucho cuidado la solución de Hanks con una pipeta Pasteur a dejar +/0.25 ml. 6. Agitar suavemente y con una pipeta Pasteur colocar una gota en un portaobjetos para observar al microscopio si hay leucocitos. 7. Aparte preparar una solución de eritrocitos de carnero al 1%. 8. Del paso 6 queda 0.25 ml de linfocitos en Hanks. Añadir 0.25 ml de E. de C. al 1%. Centrifugar a 500 rpm. 9. Incubar a 37°C durante 15 minutos. 10. Con mucho cuidado se suspende el paquete celular. Se toma una gota con una pipeta Pasteur y se coloca en porta y cubreobjetos. Parte B. Examen de rosetas. 1. Se observan al microscopio utilizando el objetivo seco fuerte. 2. Se cuentan 100 linfocitos y se toman como rosetas aquellos que tengan 3 o más eritrocitos adheridos a su superficie. Actividades A) Cuestionario 1. ¿Cuál es la función característica de los linfocitos T? 2. Menciona otros métodos de identificación de linfocitos T Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 3. ¿Qué característica permite la formación de rosetas de linfocitos T? 4. Explica porque razón se utilizan eritrocitos de carnero y no eritrocitos humanos 5. ¿En qué órgano ocurre el proceso de maduración de linfocitos T? B) Diagrama de flujo del método de rosetas EAC. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Resultados Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Conclusiones Bibliografía Título Autor Página Editorial 1. 2. 3. Nombre del alumno: Fecha: Grado/grupo/turno: Calificación: Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Práctica 3 IDENTIFICACIÓN DE LINFOCITOS B Fundamento Los linfocitos B son las células productoras de anticuerpos (inmunidad humoral), sus primeras fases de maduración transcurren en la médula ósea (en inglés, Bone marrow), gracias a la cual adquirieron su nombre. Cuantificación de linfocitos B La mayoría de los linfocitos residen en los órganos linfáticos, razón por la cual es difícil su cuantificación exacta en los tejidos periféricos. Los linfocitos B se distinguen por la síntesis de inmunoglobulinas de superficie, mismas que portan en el exterior, éstas deben ser diferenciadas de las inmunoglobulinas absorbidas; estas células también pueden ser detectadas por la presencia de receptores Fc y un receptor para el tercer componente del complemento (C3). Del 10 al 25% de los linfocitos circulantes portan estos marcadores. Es importante que las células B sean enumeradas tanto en porcentaje como en números absolutos. Se encuentran problemas técnicos con todos los métodos de identificación de marcadores usados; las inmunoglobulinas de superficie membranal (IgS) son las más específicas, pero son las que presentan más problemas, puesto que dan resultados falsos positivos gracias a que los complejos y los agregados en las pruebas de antisueros se unen a receptores Fc. Es posible usar una amplia gama de antisueros específicos para poder identificar las diferentes clases y subclases de inmunoglobulinas. Los Fc y C3 de los linfocitos pueden ser detectados por los métodos de rosetas con células rojas tratadas adecuadamente, sin embargo, los monocitos también presentan esta característica, por lo que es necesario identificar a los monocitos por su capacidad de fagocitar partículas de látex, o removerlos mediante la adherencia con plástico/nylon; ninguno de estos métodos es completamente confiable, ya que no todos los monocitos pueden ser fagocitos y algunas células B pueden ser removidas por dichos métodos de adherencia. Identificación de los linfocitos B El porcentaje de linfocitos B portadores de diferentes clases de IgS en personas normales tiene poca relación con el nivel sérico de la mismas inmunoglobulinas; en algunas inmunodeficiencias estos niveles no guardan relación, como en la agamaglobulinemia de Bruton, que los niveles de IgS están bajos e incluso ausentes, en cambio en la hipogamaglobulinemia, los niveles séricos se encuentran normales. Otro ejemplo se encuentra en los pacientes con deficiencia aislada de IgA, los cuales tienen una población normal de linfocitos circulantes con IgA. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Métodos para determinar la cantidad de células B Uno de los métodos utilizados se basa en que los linfocitos B tienen receptores de membrana para C3, gracias a esto tienen la capacidad de formar rosetas con las células rojas cubiertas de complemento, las células rojas que se utilizan son eritrocitos de carnero (E) tratados con anticuerpos de eritrocito (A) y complemento humano (C). Otro método de identificación consiste en el uso de anticuerpos anti-inmunoglobulina, los cuales pueden ser marcados con cromóforos como la fluoresceína (método directo o método de anticuerpo primario), o pueden no estar marcados y depender del uso de un segundo anticuerpo marcado en contra del primero (método indirecto o método de anticuerpo secundario). Objetivo general Analizar la participación de los linfocitos B en la respuesta inmune y aprender los métodos empleados para la identificación de los mismos. Objetivos particulares Identificar a los linfocitos B utilizando el método de rosetas “EAC”. Rosetas de linfocitos B (EAC) Recursos Material Reactivos Equipo Tubos de ensayo de 10 x Eritrocitos de carnero (en Centrifuga 75 mm solución de Alsever al 50%) clínica Suero con IgM antieritrocito de carnero Suero fresco humano congelado (frío) AB Colorante May-GrunwaldGiemsa Solución Linfocell o Linfoprep. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Procedimiento Parte A. Preparación del método Preparación de células indicadoras Lavar 3 veces 0.5 ml de eritrocitos con solución salina, al final suspenderlos en 5 ml de solución salina. Añadir 0.1 ml de suero de conejo con IgM anti-eritrocito de carnero a dosis de subhematoglutinación e incubar a 37°C por 20 minutos agitando la muestra. Lavar 3 veces en solución salina y resuspenderlo en 10 ml de solución salina. Añadir 0.3 ml de suero fresco humano congelado AB como fuente de complemento e incubar a 37°C por 20 minutos mezclando repetidamente. Lavar 3 veces en solución salina y resuspenderlo en 5 ml de solución salina (solución EAC). Nota: La suspensión debe estar fresca y preparada para el día de la prueba; si ya pasó más de una hora entre la preparación y su uso, lavar una vez más en solución salina. Preparación de linfocitos Se obtienen 5 ml de sangre venosa de un voluntario con la jeringa heparinizada se mezcla bien por inversión. Con la misma jeringa se toman 5ml de SSA y se mezcla bien por inversión. De la sangre diluida se estratifica 4 ml sobre 2.5 ml de la solución Linfoprep contenida en un tubo de ensaye. se centrifuga a 1500 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente (centrifuga clínica). En la interfase entre Linfoprep y el plasma diluido quedan los linfocitos los cuales se recuperan con una pipeta Pasteur. se transfieren las células a un tubo de ensaye y se lavan por centrifugación tres veces con SSA a 1500 rpm durante 4 minutos (centrífuga clínica). las células recuperadas se cuentan y se ajustan a una concentración de 4x10 6 linfocitos/ml utilizando pipetas Thomas para leucocitos. Procedimiento de rosetas Añadir 8 a 10 gotas de suspensión de EAC (radio 8:1) a 0.5 ml de suspensión de linfocitos (aprox. 2x106/ml). Mezclar la suspensión y sedimentar por centrifugación gentil a 25g por 5 minutos. Incubar a 37°C por 40 minutos. Resuspender por aspiración hasta eliminar los grumos. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Con mucho cuidado se suspende el paquete celular. Se toma una gota con una pipeta Pasteur y se coloca en porta y cubreobjetos. Parte B. Examen de rosetas. Se debe tener cuidado al observar, ya que los polimorfismos y los monocitos también pueden formar rosetas EAC, para identificar adecuadamente las rosetas B EAC se toma en cuenta que éstas son más pequeñas y tienen una capa de células rojas adherentes. Para excluir esta formación de rosetas debido a los receptores Fc de otras células, se utiliza una fracción IgM de suero anti-eritrocítico. Actividades A) Cuestionario 1. ¿Cuál es la característica principal de los linfocitos? 2. Menciona la función de los linfocitos B y en dónde transcurren sus primeras fases de maduración 3. ¿A qué tipo de respuesta inmunitaria pertenece la activación de linfocitos B (producción de anticuerpos)? 4. Menciona la razón por la cual es difícil la cuantificación exacta de los linfocitos en los tejidos periféricos Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 5. ¿Qué características presentan los linfocitos B que diferenciación de otras células del sistema inmune? permiten su 6. Menciona los métodos para identificar linfocitos B en el laboratorio 7. ¿Qué característica permiten identificar y diferenciar a los monocitos? 8. Menciona la diferencia entre el método directo y el indirecto para la identificación de linfocitos B B) Diagrama de flujo del método de rosetas EAC. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Resultados Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Conclusiones Bibliografía Título Autor Página Editorial 1. 2. 3. Nombre del alumno: Fecha: Grado/grupo/turno: Calificación: Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Práctica 4 HIPERSENSIBILIDAD INMEDIATA PRUEBAS INTRADÉRMICAS Fundamento La reacción de hipersensibilidad inmediata se conoce de esta forma debido a su rápida aparición, la cual ocurre inmediatamente después del contacto con el antígeno y ocasiona consecuencias patológicas importantes (hipersensibilidad). Las respuestas inmunitarias a los antígenos ambientales dan lugar a la diferenciación de los linfocitos TH2 CD4+ y a la síntesis de anticuerpos de la clase IgE que se unen a los receptores Fc de los mastocitos y basófilos, cuando el anticuerpo se entrecruza con el antígeno, éstas células se activan y liberan rápidamente diversos mediadores como histaminas, leucotrienos, entre otros, que provocan un aumento de la permeabilidad vascular, vasodilatación, contracción del músculo liso bronquial y visceral e inflamación local, lo que comprende una reacción de hipersensibilidad inmediata, si esto ocurre en la piel, se manifiesta a manera de habones o ronchas circunscritas y un área de edema, rodeada de inflamación; en la práctica clínica, estas reacciones se conocen como alergias o atopias. La reproducción de una reacción de hipersensibilidad inmediata se logra mediante la aplicación directa de pequeñas cantidades de extractos alergénicos sospechosos dentro de la piel, esto es de gran ayuda diagnóstica en medicina. Las pruebas intradérmicas se han utilizado con gran éxito para la detección de pacientes alérgicos que presentan signos y síntomas característicos, ya que en manos expertas proporcionan un parámetro de gran confianza diagnóstica y terapéutica, una de sus ventajas es que pueden realizarse en poco tiempo y representan un mínimo riesgo para el paciente. Las técnicas para el diagnóstico de alergias comprenden dos grupos, aquellas que se realizan directamente en las personas (in vivo) y aquellas que se realizan en el laboratorio (in vitro); todas han sido probado y estudiadas ampliamente para saber su especificidad, sensibilidad y positividad predictiva, por lo que son muy confiables. Las pruebas in vivo incluyen las pruebas intradérmicas con alergenos y las pruebas de exposición directa con sustancias alergénicas (método de Prick); de estas dos pruebas, las intradérmicas son las preferidas por su especificidad, predictividad y facilidad para realizarse. Las pruebas intradérmicas tienen varias ventajas, entre las cuales se encuentran la rapidez con la que son realizadas, la simplicidad, el bajo costo y su alta sensibilidad. Gracias a estas pruebas se puede identificar el agente productor de alergia, como polen, hongos, pelos, caspa de animales, etc; se realizan preferentemente en los brazos en sesiones de varios días, en las cuales se utilizan antígenos a diferentes concentraciones en series progresivas. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Dentro de las pruebas cutáneas tenemos 3 alternativas: la estimación directa de niveles séricos de IgE, la eliminación de histamina de leucocitos periféricos y el RAST (radioalergeno-absorbencia); los últimos dos métodos son más exactos pero menos sensibles, debido a esto no se prefieren. Las indicaciones clínicas para realizar estas pruebas se hacen ante cualquier sospecha clínica de que un signo o síntoma sea resultado de una alergia, esta decisión la debe tomar el médico, basándose en la observación y en la historia a la exposición de alergenos conocidos. Objetivo general Conocer las características principales de las reacciones de hipersensibilidad inmediata. Aprender a realizar pruebas intradérmicas de hipersensibilidad inmediata. Objetivos particulares Conocer los elementos participantes en la reacción de hipersensibilidad inmediata. Entender el mecanismo fisiopatológico de las reacciones de hipersensibilidad inmediata. Entender los principios de diagnóstico inmunológico en las enfermedades alérgicas. Pruebas intradérmicas Recursos Material Reactivos Equipo Jeringas hipodérmicas Diferentes alergenos de insulina diluidos en soluciones de Evans a concentraciones Algodón de 1:1000 y 1:10 000. Antígenos de polvo, gato, perro, algodón, tabaco, ganado, ácaro, pólenes y hongos. Alcohol 90% Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Procedimiento Nota: estas pruebas deben realizarse con cuidado debido a las reacciones alérgicas generalizadas que aunque raramente, se pueden presentar y son fatales. En caso de una reacción anafiláctica se debe poner un torniquete arriba del sitio de la prueba e inyectar 0.1cc de adrenalina acuosa 1:1000, la cual debe estar siempre a la mano. 1. Tomar una jeringa estéril desechable de 1ml de tuberculina con aguja de 26x12 (1cm) y llenarla con 0.1 ml de solución a probar, cuidar que la jeringa no tenga burbujas. 2. Limpiar muy bien con alcohol la zona de la piel en donde se aplicará la prueba (preferentemente en el brazo). 3. Los sitios de aplicación se marcan apropiadamente para distinguir cada sustancia, deben estar separados al menos 7.6 cm uno de otro para prevenir solapamiento de las reacciones. 4. Aplicar la solución intradérmicamente; si se usa el brazo la piel debe jalarse por detrás, se pone la jeringa a un ángulo de 45° con el bisel hacia abajo, se introduce la aguja y lentamente se deposita la sustancia. 5. Se utilizará un control con histamina para verificar la calidad de la técnica, con la solución base de histamina al 0.01% con 0.275mg de fosfato de histamina (Eli Lily & Co Indianapolis) por ml de diluyente (11.5 mm de roncha con +- 2.1mm). 6. La lectura se realiza 15 minutos después, se reporta si hay formación de pápula o eritema inmediato o tardío, guiándose con la siguiente tabla: Grado Tamaño del eritema (mm) Tamaño de la roncha (mm) 0 <5 <4 +- 5-10 5-10 1+ 11-20 5-10 2+ 21-30 5-10 3+ 31-40 10-15 (con pseudópodos) 4+ >40 >15 (con pseudópodos) Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Actividades A) Cuestionario 1. ¿Qué otros nombres reciben las reacciones de hipersensibilidad inmediata? 2. ¿Cuál es la inmunoglobulina que se encuentra en las reacciones de hipersensibilidad inmediata? 3. Menciona brevemente la hipersensibilidad inmediata fisiopatología de las reacciones de 4. ¿De qué manera se logra la reproducción de una reacción de hipersensibilidad inmediata en una paciente? 5. ¿En qué consiste el método de Prick? 6. ¿Cuáles son los métodos que se pueden utilizar dentro de las pruebas cutáneas y cual se prefiere? Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 7. Menciona al menos 3 ventajas de las pruebas intradérmicas B) Diagrama de flujo de las pruebas intradérmicas. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Resultados Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Conclusiones Bibliografía Título Autor Página Editorial 1. 2. 3. Nombre del alumno: Fecha: Grado/grupo/turno: Calificación: Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Práctica 5 DEGRANULACIÓN DE BASÓFILOS Fundamento Los mastocitos, los basófilos y los eosinófilos son las células efectoras de las reacciones de hipersensibilidad inmediata o de tipo I y por lo tanto de la enfermedad alérgica. Aunque cada una de estas células tiene sus propias características, las tres tienen gránulos citoplásmicos que contienen mediadores importantes de las reacciones alérgicas y las tres sintetizan mediadores lipídicos y citocinas que desencadenan la inflamación. Los basófilos son granulocitos sanguíneos que derivan de progenitores existentes en la médula ósea, maduran en la misma y circulan en la sangre, estas células representan menos del 1% de los leucocitos y sus gránulos se tiñen con colorantes básicos. Las alergias a los medicamentos representan un problema frecuente, por lo que su prevención, reconocimiento y diagnóstico temprano son muy importantes. Las pruebas cutáneas son de gran ayuda, aunque sólo muestran si la piel del paciente es hipersensible a la droga, pero no indican que ésta sea capaz de provocar una respuesta sistémica; es por esta razón que la prueba confirmatoria es la degranulación de basófilos, la cual valora la hipersensibilidad que se presenta ante dicha droga en un sistema in vitro, mediante la observación de la respuesta biomorfológica del basófilo ante la droga, ya que esta prueba es realizada in vitro, es completamente segura para el paciente. También es útil la degranulación de basófilos para diagnosticar la hipersensibilidad a insectos o a su veneno, como es el caso de las personas sensibles al veneno de abeja; o puede ser solo un criterio de hipersensibilidad inmediata en situaciones no alérgicas. Esta prueba se originó en 1958 gracias a Shilley, que observó un choque anafiláctico en un paciente alérgico a la penicilina, Shilley encontró que los basófilos son un índice citológico útil para medir la anafilaxia y realizó estudios en diferentes especies de animales, finalmente concluyó que al colocar los basófilos de conejo (similares a los de humano) en el suero de pacientes sensibles a la penicilina y añadir la misma, los basófilos presentaban degranulación, lo cual no ocurría con el suero de personas no sensibles a la penicilina. Otros estudios han demostrado que la degranulación de basófilos también es útil como indicador de la reacción antígeno anticuerpo y que ésta varía en proporción a las cantidades del antígeno, por esta razón se cree que el sistema de células cebadas-basófilo tienen respuestas paralelas y ambas células liberan el complejo histamina-heparina en una reacción alérgica, esto explica que los esteroides y los antihistamínicos puedan inhibir el fenómeno de la degranulación. La degranulación de basófilos es tiempo-dependiente, esto es que puede ser negativa una o dos semanas después del choque anafiláctico debido a la depleción de anticuerpos; puede ser alterada por varios factores como la lipemia (la ingesta de 4mg/kg de margarina y niveles séricos de 8mEq/L de triglicéridos), Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg la cual puede causar la degranulación en el 75% de las veces, sin embargo, no hay correlación entre el nivel de lipemia y el porcentaje de degranulación. Objetivo general Conocer la participación de los basófilos en la respuesta inmune tipo I. Aprender la técnica de degranulación de basófilos. Objetivos particulares Revisar el proceso fisiopatológico de la respuesta inmune tipo I. Realizar la técnica de degranulación de basófilos. Recursos Material 15 tubos de ensayo de 10x75 ml. 3 pipetas Pasteur con bulbo. 2 pipetas graduadas de 1ml. 1 pipeta graduada de 5ml. Portaobjetos Reactivos y muestras Equipo 2ml de sangre heparinizada de Centrífuga una persona alérgica a un Estufa a medicamente (especificar a cuál). 37°C El medicamento al cual es Microscopio alérgica. 2ml de sangre heparinizada de una persona sana como control negativo. 2ml de sangre heparinizada de una persona alérgica al veneno de abeja como control positivo. linfoprep. Solución salina 0.95%. Colorante rojo neutro. Colorante azul de Toluidina. Procedimiento 1. Una vez tomadas las muestras entre los 120 días posteriores a la ingesta de la droga reactante, se realiza el método de aislamiento de células mononucleares de la misma manera que en la técnica de determinación de rosetas de linfocitos B 2. Se obtiene un paquete de células blancas (basófilos) mediante la centrifugación y purificación con linfoprep. de los 2ml de sangre heparinizada de cada paciente. 3. Preparar diluciones de la droga reactante a concentraciones de 1:100, 1:1000 y 1:2000, diluirlas con solución salina fisiológica al 0.95%. 4. Poner en contacto las células rojas con las diferentes diluciones. 5. Añadir 2 gotas de rojo neutro e incubar a 37°C por 20 minutos. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 6. Realizar un frotis de células y dejar secar, posteriormente teñir con azul de Toluidina. 7. Usar las células blancas del individuo sano y las del individuo alérgico al veneno de abeja como controles. 8. Se observa al microscopio y se cuentan 1000 células y los basófilos que se encuentren entre ellas, para comparar el número de basófilos de las muestras control con la muestra problema. 9. La muestra será positiva si presenta 2 o más degranulaciones mayores al 20% respecto de la muestra control. Actividades A) Cuestionario 1. ¿Cuáles son las células efectoras de las reacciones de hipersensibilidad inmediata o de tipo I? 2. Describe a los basófilos 3. Describe brevemente la fisiopatología de la degranulación de basófilos 4. ¿Por qué no es suficiente una prueba cutánea para diagnosticar alergia a los medicamentos? Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 5. ¿Cuál es la prueba confirmatoria de alergia a algún medicamento? 6. ¿Qué medicamentos se pueden utilizar para inhibir el fenómeno de la degranulación? 7. ¿Qué factores pueden alterar la degranulación de basófilos? B) Diagrama de flujo de la degranulación de basófilos Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Resultados Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Conclusiones Bibliografía Título Autor Página Editorial 1. 2. 3. Nombre del alumno: Fecha: Grado/grupo/turno: Calificación: Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Práctica 6 CUANTIFICACIÓN DE EOSINÓFILOS EN SECRECIÓN NASAL Fundamento Los eosinófilos son granulocitos procedentes de la médula ósea, ahí maduran y posteriormente circulan en la sangre, sus gránulos contienen proteínas básicas que se unen a los colorantes básicos como la eosina; estas células se presentan abundantemente en los infiltrados inflamatorios de las reacciones tardías y contribuyen a muchos de los procesos patológicos de las enfermedades alérgicas. Las citocinas producidas por los linfocitos T H2 activan a los eosinófilos y los atraen hacia los focos de inflamación en fase tardía, la IL-5 es una citocina que estimula la maduración de los eosinófilos, también es activadora de los mismos y mejora su capacidad para liberar el contenido de los gránulos, el cual contiene proteínas tóxicas para los parásitos y que pueden dañar a los tejidos normales. En los procesos inflamatorios que tienen como factor desencadenante a un parásito o a procesos alérgicos, se encuentra infiltración de eosinófilos, se sugiere que estos cumplen un papel de fagocitosis de complejos inmunes y desactivación de la histamina liberada de los tejidos por los mastocitos. Los eosinófilos tienen dos tipos de gránulos, unos pequeños de tipo lisosomas dotados de fosfatasa alcalina y otros de mayor tamaño dotados de arginina y cristales de Charcot-lydn. La eosinofilia es característica de los procesos autópicos, y puede aumentar si aumenta el contacto con el alérgeno, la eosinofilia es favorecida por la liberación del factor quimiotáctico eosinofílico (FQE) de las células cebadas degranuladas; debido a esto una persona atópica puede presentar eosinofilia en sangre periférica y en moco nasal, o puede que la presente en uno y en el otro esté normal. Objetivo general Identificar a los eosinófilos en la secreción nasal. Objetivos particulares Valorar la respuesta celular en la secreción nasal. Realizar la técnica de tinción de eosinófilos. Recursos Material Portaobjetos Hipos estériles Lic. en Químico Farmacobiólogo Reactivos y muestras Colorante de Wrigth Mucosa nasal Equipo Microscopio Centro Universitario Uteg Procedimiento 1. Se tomará una muestra de secreción de la mucosa nasal con un hisopo estéril, se debe hacer de forma giratoria. 2. Correr suavemente la muestra sobre el portaobjetos. 3. Dejar secar a temperatura ambiente. 4. Teñir con la técnica de Wrigth 5. Observar al microscopio la presencia de eosinófilos y sus características, usar aceite de inmersión. 6. Los resultados se interpretan de la siguiente manera: a. Más del 10% de eosinófilos en personas atópicas. b. 0% de eosinófilos en personas no atópicas. Actividades A) Cuestionario 1. Describe a los eosinófilos 2. ¿En dónde podemos encontrar infiltrados de esosinófilos? 3. ¿Cuál es la citocina que estimula la maduración de los eosinófilos y los activa para liberen el contenido de sus gránulos? 4. ¿Cuáles son los tipos de gránulos que encontramos en los eosinófilos y qué contienen? Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 5. Mencione los valores normales de eosinófilos en la secreción nasal en personas atópicas y no atópicas B) Diagrama de flujo de la cuantificación de eosinófilos en la secreción nasal Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Resultados Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Conclusiones Bibliografía Título Autor Página Editorial 1. 2. 3. Nombre del alumno: Fecha: Grado/grupo/turno: Calificación: Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Práctica 7 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD HEMOLITICA DEL COMPLEMENTO POR IDR Fundamento El sistema del complemento está constituido por un conjunto de glicoproteínas plasmáticas presentes en el organismo a manera de zimógenos, las cuales tienen la capacidad de ser activadas frente a estímulos de diferente naturaleza. La activación de este sistema se realiza de forma secuencial también denominado sistema en cascada y forma parte importante de los mecanismos inespecíficos de la inmunidad en vertebrados, participando principalmente en actividades como la promoción de la inflamación y de la fagocitosis, el ataque lítico hacia membranas y la facilitación de la remoción de complejos inmunes. Dependiendo que estímulo es el responsable de activar la cascada puede ser clasificado dentro de alguna de las siguientes vías: Vía clásica: Iniciada por el reconocimiento de los complejos antígeno-anticuerpo, principalmente los de origen IgM, IgG1 e IgG3, para su activación es indispensable la presencia de iones Ca++ y Mg++. El orden de activación de los componentes en esta vía es el siguiente Ag-Ac → C1→C4→C2→C3→C5→C6→C7→C8→C9, las consecuencias biológicas de su activación incluyen el aumento de: la permeabilidad vascular, la quimiotaxis de polimorfomucleares, la adherencia celular etc. Vía alterna: Es la vía filogenéticamente más antigua iniciada por la detección de polímeros de superficie de origen bacteriano o vírico (ej. Polisacáridos), en esta vía no participan los factores C1, C4 y C2 en su lugar encontramos a los factores D, C3, B C3b y P. El orden de activación es el siguiente Polisacárido→ C3→C3b→D→B→P→C3→C5→C6→C7→C8→C9. Vía de las Lectinas: Se inicia por lectinas que reconocen residuos de manosa en las superficies microbianas, como la MBL (mannose-binding lectin). Todas estas vías de activación conducen a una fase efectora común, que culmina con el ataque lítico a membranas. La medición y monitoreo del complemento es realizado con el objeto de detectar y cuantificar el grado de producción y consumo del complemento y con ello diagnosticar las deficiencias del mismo, ya sean deficiencias de tipo genético o provocadas por algún factor secundario. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Algunas de las alteraciones de importancia clínica del complemento son: En inmunodeficiencias, existen defectos en este sistema, los cuales por lo general consisten en la ausencia o la falta de funcionalidad de alguno de los factores de la cascada, generalmente por causas genéticas. En las enfermedades autoinmunes, las proteínas del complemento juegan un papel importante en la lesión a los tejidos, determinación puede orientar el diagnóstico, evaluar el curso y actividad de la enfermedad y dar una idea de la severidad del daño. Algunas patologías donde podemos encontrar de cambios en los niveles del complemento son: Patologías que aumentan los niveles de complemento: Síndrome de Reiter, Ictericia obstructiva, Gota, diabetes, tiroiditis, artritis reumatoide, Fiebre reumática aguda, Fiebre tifoidea, Periarteritis nodosa, Colitis ulcerativa, Dermatomiositis e Infarto agudo al miocardio. Patologías que disminuyen los niveles de complemento: Lupus eritematoso sistémico, Enfermedad del suero, Cirrosis hepática avanzada, Hepatitis infecciosa con artritis, Edema angioneurótico hereditario, Deficiencia hereditaria de C2, Hemoglobinuria paroxística nocturna, Coagulación intravascular diseminada, Inmunodeficiencia combinada grave, Glomerulonefritis membranoproliferativa, Glomerulonefritis aguda, Enfermedades por complejos inmunes, Linfoma, Rechazo de aloinjertos, Crioglobulinemia mixta (IgG-IgM), Endocarditis infecciosa con glomerulonefritis, Miastenia gravis y Derivaciones ventriculoarteriales infectadas. Metodología para la determinación de complemento. La determinación del sistema del complemento presenta algunas dificultades dada la complejidad propia de la cascada, la labilidad de sus componentes y su inhibición por factores reguladores. Estos factores limitantes dificultan la reproducibilidad de muchas de las técnicas. Las principales técnicas empleadas para determinar el complemento pueden dividirse en dos conjuntos generales: las pruebas funcionales y las pruebas inmunoquímicas, cada conjunto posee diversas virtudes y limitaciones, por lo que generalmente se emplean en combinación para obtener mejores resultados. La cuantificación de los componentes mayoritarios (C3, C4 y Cq), puede realizarse mediante técnicas como inmunodifusión radial o inmunonefelometría. La principal limitante de esta técnica es su capacidad de detectar tanto componentes funcionales normales, como aquellos sin función (mutados, inactivados etc.). Por ejemplo, algunos antisueros empleados en placas de inmunodifusión radial pueden reaccionar con fragmentos de degradación de los componentes nativos, lo cual puede originar valores falsos positivos. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg De la misma manera han desarrollado métodos para la cuantificación funcional de cada uno de los componentes del sistema del complemento. Sin embargo, estos métodos son metodológicamente muy complejos y relativamente caros, por lo que su uso se restringe a laboratorios especializados en este campo. Determinación del complemento hemolítico total por medio de placa de IDR. El kit del complemento hemolítico total se encuentra diseñado para detectar deficiencias en la vía clásica del complemento y los componentes de la vía común. Esta prueba puede ser empleada en el monitoreo de la actividad total del complemento, por lo que su utilidad clínica se encuentra como prueba de tamizaje para personas con defectos del sistema del complemento. Objetivo general Comprender el proceso de una reacción de inflamación. Objetivos particulares Identificar las células del sistema inmune en respuesta a una lesión inflamatoria. Recursos Material 1 placa de I.D.R. complemento 1 jeringa de 3ml 2 tubos de ensayo de 10 x 75 ml 1 pipeta Pasteur con bulbo Reactivos Equipo Centrifuga clínica Procedimiento 1. Extraer 3ml de sangre y colocarla en un tubo de ensayo de 10 x 75 ml 2. Centrifugar a 2000 rpm para separar el suero 3. Colocar 0.5 µl de suero en una de las horadaciones de la placa Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 4. Colocar los controles necesarios 5. Incubar de 24 a 48 horas 6. Medir el halo de hemólisis formado y realizar una curva con los datos obtenidos 7. Calcular concentración y reportar Actividades A) Cuestionario 1. ¿Cuál es la función del sistema del complemento? 2. ¿Cuáles son los factores que participan en la vía común del complemento? 3. ¿A qué tipo de inmunidad corresponde el sistema del complemento? 4. ¿Cuáles son las principales moléculas de origen microbiano responsables de activar el complemento? Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 5. Mencione 3 patologías que alteran las concentraciones de los niveles del complemento y describa si aumentan o disminuyen sus valores B) Diagrama de la determinación del complemento por IDR. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Resultados Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Conclusiones Bibliografía Título Autor Página Editorial 1. 2. 3. Nombre del alumno: Fecha: Grado/grupo/turno: Calificación: Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Práctica 8 IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS LE (LUPUS ERITEMATOSO) Fundamento Una de las principales características del sistema inmune es que en condiciones normales no reacciona contra sus propios constituyentes, hay diversos mecanismos que permiten al sistema inmune tolerar lo propio e identificar y destruir lo extraño, pero en ocasiones estos mecanismos se pierden y el sistema inmune genera autoanticuerpos, lo cual puede que no genere problemas, o de lo contrario, que se desarrolle una enfermedad autoinmunitaria. Según la teoría de eliminación clonal de Burnet, todos los individuos deben nacer carentes de las clonas celulares capaces de reconocer a los antígenos propios y por lo tanto, incapaces de desarrollar respuestas autoinmunes; sin embargo se presentan las enfermedades autoinmunes, para lo cual existen varias explicaciones: tolerancia inmunológica y supresión activa, liberación de antígenos secuestrados, reactividad cruzada (mimetismo molecular), activación policlonal, factores genéticos, antígenos HLA y autoinmunidad. Existen muchas enfermedades autoinmunes, y se pueden clasificar principalmente en las enfermedades de órganos específicos y en las enfermedades sin órgano específico (sistémicas). En las enfermedades de órganos específicos los anticuerpos se dirigen contra componentes del órgano afectado; un ejemplo son las enfermedades tiroideas autoinmunitarias, que comprenden 3 tipos: enfermedad de Graves o hipertiroidismo, enfermedad de Hashimoto o hipotiroidismo y Mixedema con ausencia total de función tiroidea. En las enfermedades sin órgano específico los anticuerpos no están dirigidos contra un componente en especial, sino que atacan a varios componentes de varios órganos, un ejemplo de esto es el Lupus Eritematoso Sistémico. Debido a la gran variedad de enfermedades autoinmunes, no solo se clasifican dependiendo la extensión en órgano específicas y órgano inespecíficas, sino que también se clasifican de acuerdo a su relación con los antígenos de clase I o II del CMH. El Lupus eritematoso sistémico (LES) se caracteriza por afección cutánea en la cara en forma de alas de mariposa (eritema) y afección a varios órganos; es una enfermedad multisistémica crónica con remisiones y reactivaciones, afecta principalmente a las mujeres entre 20 y 60 años de edad, con una relación mujer:hombre de 10:1. En esta enfermedad se encuentran autoanticuerpos contra ADN y autoanticuerpos contra diversos constituyentes celulares, los complejos inmunitarios que se forman, se depositan en varios sitios, estimulando la inflamación generalizada, la citotoxicidad dependiente de anticuerpos y la activación de fagocitos. Los anticuerpos que se encuentran más frecuentemente en estos pacientes son los anticuerpos antinucleares anti-ADN, anticuerpos contra Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg las ribonucleoproteínas, contra histonas y antígenos nucleorales, contra eritrocitos y plaquetas, entre otros. Las principales manifestaciones clínicas son: erupciones cutáneas, artritis, glomerulonefritis, vasculitis de pequeñas arterias en todo el cuerpo, anemia hemolítica, trombocitopenia y afectación del SNC. La prueba fundamental para el diagnóstico de la enfermedad es la presencia de anticuerpos antinucleares (anticuerpos contra el ADN nativo de doble cadena). Prueba para el Lupus Eritematoso Sistémico Es una prueba que tiene como objetivo determinar la presencia de un tipo especial de células que indican dicho padecimiento, por lo tanto se utiliza como prueba diagnóstica de LES. La forma en que se realiza el examen es la siguiente: se extrae sangre venosa en un frasco hermético o jeringa, en bebés o niños pequeños se punza con una aguja o lanceta y se recoge la sangre en un tubo pequeño de vidrio, en una lámina de vidrio o en una tira de examen; posteriormente se prepara la muestra y se buscan al microscopio las células LE. El valor normal de esta prueba es la ausencia de dichas células, en presencia de valores anormales se deben descartar artritis reumatoide con esclerodermia y sensibilidad a los medicamentos, pues en ocasiones estos pacientes muestran un examen de células LE positivo, los pacientes con LES que presentan un examen positivo varían de un 50 a un 75%. Objetivo general Conocer los principios básicos de la autoinmunidad. Identificar qué enfermedades se consideran autoinmunes. Objetivos particulares Conocer las características del Lupus Eritematoso Sistémico. Identificar a las células LE (Lupus Eritematoso). Recursos Material Capsula de porcelana Tubo de Wintrobe Portaobjetos Lic. en Químico Farmacobiólogo Reactivos y muestras Equipo Muestra de sangre en Incubadora tubo seco Microscopio Colorante de Wrigth óptico Centro Universitario Uteg Procedimiento 1. Se obtiene la muestra de sangre y se deja coagular. 2. Con la ayuda de aplicadores se intenta eliminar la mayor cantidad de fibrina de la muestra. 3. Incubar la muestra a 37°C durante 2 horas. 4. Decantar el suero liberado y comprimir el paquete en una malla para que el coágulo se quede en ella y las células y el suero pasen a la cápsula de porcelana. 5. La muestra traumatizada se pone en tubos de Wintrobe y se centrifuga durante 10 minutos. 6. Se hace un frotis y se tiñe con la técnica de Wrigth. 7. Se observa el frotis con el microscopio con el objetivo 40X buscando posibles células LE y se verifican con el objetivo 100X. 8. Para dar un resultado observar por lo menos 500 PMN. Actividades A) Cuestionario 1. ¿Qué es una enfermedad autoinmune? 2. Menciona las posibles explicaciones para una enfermedad autoinmune 3. ¿Cómo se clasifican las enfermedades autoinmunes? 4. Menciona por lo menos 3 ejemplos de enfermedades autoinmunes órgano específicas Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 5. Definición de Lupus Eritematoso Sistémico 6. ¿Cuáles son los autoanticuerpos que más frecuentemente se encuentran en LES? 7. Menciona las principales manifestaciones clínicas del LES 8. ¿Cuál es la prueba diagnóstica del LES y en qué se basa? B) Diagrama de flujo Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Resultados Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Conclusiones Bibliografía Título Autor Página Editorial 1. 2. 3. Nombre del alumno: Fecha: Grado/grupo/turno: Calificación: Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Práctica 9 INMUNOLOGÍA DEL CÁNCER Fundamento Según la OMS, se proyecta que para el 2020 habrá 15 millones de casos nuevos de cáncer por año. En nuestro país el cáncer ocupa la segunda causa de muerte. La inmunología del cáncer estudia el reconocimiento y la respuesta del sistema inmune contra las células cancerosas, su estudio abarca desde la transformación maligna de las células, el entendimiento de los tumores y la evasión del sistema inmune hasta la aplicación en oncología con fines preventivos, diagnósticos y de tratamiento (inmunoterapia). En la mayor parte de los órganos y tejidos se conserva un equilibrio entre la renovación y muerte celular, en circunstancias normales, la producción de nuevas células es regulada por diversos mecanismos para que el número de cualquier tipo particular de éstas se conserve constante, sin embargo, en ocasiones aparecen células que no están reguladas por los mecanismos normales de crecimiento, y pueden dar lugar a clonas que producen un tumor o neoplasia. El cáncer es, en realidad, un grupo de enfermedades caracterizadas por una serie de cambios en el genoma de las células. La oncogénesis es un proceso representado por la activación de oncogenes y la pérdida de la función de los genes supresores, en general, las características distintivas del cáncer comprenden la autosuficiencia en señales de crecimiento, insensibilidad a las señales de regulación del crecimiento, escape de los mecanismos de apoptosis, replicación sin límite, fomento de la angiogénesis, evasión del sistema inmune, invasión y metástasis. Se han podido identificar algunos de los mecanismos que utilizan los tumores para evadir la respuesta inmunológica, entre ellos se encuentran la escasa inmunogenicidad de los antígenos tumorales, el acelerado crecimiento tumoral que llega a rebasar la velocidad de la respuesta inmune, la ausencia o enmascaramiento de las moléculas del CMH I, la secreción de factores que inhiben la activación de la respuesta inmune, entre otros. La capacidad del sistema inmune de discriminar entre células normales y células tumorales es crítica para permitir la destrucción del tumor efectivamente, si las células tumorales expresan moléculas que actúan como antígenos no propios para el hospedero, antígenos nuevos que surgen durante el proceso de transformación maligna celular, es posible que el sistema inmune sea capaz de reconocer y destruir a estas células anormales mediante diversos mecanismos como la respuesta específica por linfocitos T y anticuerpos o por medio de componentes de la inmunidad innata como las células dendríticas, macrófagos y células NK; gracias a esto, podemos clasificar a los antígenos tumorales según la respuesta que ocasionen: respuesta humoral (anticuerpos), generación de células CD4+ y generación de células CD8+ (citotóxicas). Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Algunos de los antígenos presentes en el cáncer se usan para monitorear el curso del tumor, en el caso de los antígenos reconocidos por linfocitos T, es más relevante para evaluar el rechazo a los tumores. Los antígenos reconocidos por los linfocitos T se pueden agrupar en 4 categorías: en el primer grupo se encuentran las mutaciones somáticas, son los antígenos presentes en un tumor específico de un individuo; en el segundo grupo encontramos a los antígenos específicos de un tumor pero que se encuentran en diferentes individuos, un ejemplo son los antígenos virales; en el tercer grupo entran los antígenos producto de genes normales con una distribución restringida en los tejidos; por último, en el cuarto grupo se incluyen los antígenos compartidos en los tejidos, lo cual implica un reconocimiento autoreactivo. Uno de los tantos retos de la inmunoterapia es el contrarrestar los mecanismos de evasión al mismo tiempo que se estimulan formas eficientes de respuesta inmune contra las células cancerosas; es por esto que la inmunoterapia se basa en varios métodos que incluyen el uso de antígenos (lisado de tumor, proteínas tumorales, péptidos sintéticos y ADN), células activadas (células dendríticas, células T citotóxicas y células NK), anticuerpos específicos, citocinas conjugadas o modificadas y terapia génica. Objetivo general Conocer los principios básicos del cáncer. Objetivos particulares Conocer los mecanismos que utilizan las células tumorales para evadir al sistema inmune. Principio básico del método El modelo de ratones con linfoma murino L-5178-Y representa un buen ejemplo de supresión de la respuesta inmune celular, a través de los diferentes mecanismos de evasión inmunológica, en este caso la inmunosupresión se logra gracias a la acción supresora de una glucoproteína presente en el líquido ascítico y plasma de estos ratones. La inmunosupresión se verifica mediante la prueba del dinitro-fluorobenceno (DNFB), este agente ocasiona una reacción de hipersensibilidad tardía que refleja lo que sucede en la respuesta inmune celular contra microorganismos. Mediante esta prueba se puede apreciar la reacción de hipersensibilidad tardía en el grupo control, mientras que el grupo experimental, inmunosuprimido por el linfoma, no se logra conseguir dicha reacción. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Recursos Material Ratones cepa Balb/c Torundas con alcohol Jeringas de 1ml (para insulina) Navajas para rasurar Guantes de látex Gasas Reactivos Equipo Linfoma L-5178-Y Solución salina fisiológica 0.9% PBS (solución salina de fosfatos) Procedimiento Parte A. Inoculación del tumor 1. Rasurar la región cervical derecha de 4 ratones. 2. Marcar a dos de los ratones como control y a los otros dos como experimentales. 3. Inocular en un ratón experimental 10 millones de células tumorales en 200ul de solución de Hanks. 4. Administrar a los ratones controles 200ul de solución de Hanks. 5. Transcurridos 8 días se realizará la prueba de hipersensibilidad retardada con el DNFB para evaluar la respuesta inmune celular. 6. Obtener células tumorales de los ratones inoculados previamente. 7. Realizar un frotis de células tumorales y teñirlo con la técnica de Wright. 8. Observar al microscopio y describir las células encontradas. Parte B. Prueba de hipersensibilidad tardía al DNFB (Siguiente práctica) Actividades A) Cuestionario 1. ¿Qué estudia la inmunología del cáncer? 2. ¿Qué es la oncogénesis? Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 3. Menciona los mecanismos que utilizan los tumores para evadir la respuesta inmunológica 4. ¿Qué es lo que le permite al sistema inmune discriminar entre células normales y células tumorales? 5. ¿Cómo se clasifican a los antígenos tumorales según la respuesta que producen? 6. ¿Cómo se agrupan los antígenos reconocidos por linfocitos T? 7. Menciona el objetivo de inocular a los ratones con el linfoma y cómo se demuestra el mismo. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg B) Diagrama de flujo Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Resultados Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Conclusiones Bibliografía Título Autor Página Editorial 1. 2. 3. Nombre del alumno: Fecha: Grado/grupo/turno: Calificación: Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Práctica 10 HIPERSENSIBILIDAD TARDÍA E INMUNODEFICIENCIA Fundamento La hipersensibilidad tardía también es llamada hipersensibilidad de tipo IV, o mediada por células T, este tipo de reacción desempeña un importante papel en la defensa del huésped contra agentes ambientales o químicos y microorganismos intracelulares. Cuando algunas poblaciones de células T H activadas se encuentran con ciertos tipos de antígenos, comienzan a secretar citocinas que inducen una reacción inflamatoria localizada (reacción de hipersensibilidad tardía), este reconocimiento y eliminación del agente infeccioso o antígeno extraño son el resultado del sistema inmune adaptativo, por medio de sus mecanismos humorales y celulares. Cuando un individuo se expone a un antígeno, se dice que se sensibiliza, las células presentadoras de antígeno ayudan a que los linfocitos TH reconozcan al antígeno procesado y se activen, diferenciándose en linfocitos T H1; si el individuo se vuelve a exponer al mismo antígeno, las células T H1 lo reconocen y secretan citocinas y quimiocinas que atraen y activan a macrófagos y otras células inflamatorias inespecíficas, lo cual establece la reacción de hipersensibilidad tardía. La reacción de hipersensibilidad tardía se puede inducir de forma experimental en un laboratorio en modelos animales. El proceso incluye desde la fase de sensibilización, donde el animal entra en contacto por primera vez al agente sensibilizante o antígeno mediante la aplicación por contacto o cutánea; el agente aplicado es reconocido y procesado por las células presentadoras de antígenos, quienes lo presentan a los linfocitos T; cuando los linfocitos T reconocen al antígeno como algo extraño se activan y desencadenan una respuesta específica contra ese antígeno; al final de esa respuesta, algunos de los linfocitos se diferenciarán en células de memoria. Si posteriormente el animal es expuesto a ese mismo agente, se desencadenará la reacción de hipersensibilidad tardía en las próximas 24 a 48 hrs, caracterizándose por enrojecimiento e induración del tejido expuesto. Objetivo general Identificar y comprender las reacciones de hipersensibilidad tardía o de tipo IV. Objetivos particulares Identificar las diferentes fases de una reacción de hipersensibilidad tardía mediante la prueba del DNFB. Comprender la relación entre la inmunosupresión y la eliminación de la respuesta de hipersensibilidad tardía. Evaluar el estado de la respuesta inmune celular en el modelo animal. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Principio básico del método La inmunosupresión en el modelo de ratones con linfoma murino L-5178-Y se hace patente mediante la prueba del DNFB, que causará una reacción de hipersensibilidad retardada en los ratones control, mientras que en los ratones experimentales esta reacción se verá suprimida. Se sensibiliza a los ratones con el DNFB, el cual funciona como un hapteno en unión a proteínas de la dermis, este complejo es reconocido por las células de Langerhans, las cuales lo procesan y presentan a los linfocitos T en los ganglios más cercanos, esto activa a los linfocitos TH1, ahora capaces de reconocer al complejo en la dermis. Cuando se aplica una dosis de DNFB, se forma el complejo en la dermis y al ser reconocido por los linfocitos TH1, se producen IFN-g e IL-17, los cuales a su vez estimulan la producción de IL-1, IL-6, GM-CSF, TNF-a y diferentes quimiocinas por parte de los queratinocitos y células inflamatorias; las citocinas y quimiocinas promueven la respuesta inflamatoria, la llegada de monocitos que se convierten en macrófagos y la llegada de más linfocitos, lo que instaura la reacción de hipersensibilidad retardada. Recursos Material Ratones cepa Balb/c (se usarán los ratones experimentales y controles de la práctica anterior) Hoja de rasurar Aplicador de plástico Jeringas de insulina Guantes de látex Gasas Reactivos Dinitrofluorobenceno (DNFB) Acetona Aceite de oliva Equipo Micrómetro de precisión Procedimiento Prueba de hipersensibilidad tardía al DNF. 1. Se rasurarán los ratones de la región abdominal. 2. Se tomará un ratón control y otro experimental de los dos ratones previamente inoculados con el linfoma, y de la misma manera se tomará un ratón control y uno experimental de los ratones sanos. 3. Los dos ratones experimentales se sensibilizarán con una dosis de 20ul de DNFB al 0.5% en una mezcla de acetona y aceite de oliva en proporción 4:1 (v/v) en la región del abdomen previamente rasurada. 4. Los dos ratones controles se sensibilizarán con 20ul de solución salina fisiológica al 0.9% en la región del abdomen previamente rasurada. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 5. 24 horas después se aplicará un segundo reto de 20ul de DNFB a los ratones experimentales y 20ul de solución salina al 0.9% a los ratones control. 6. A los 5 días se aplicará un tercer reto con 20ul de DNFB a los ratones experimentales y 20ul de solución salina al 0.9% a los ratones control. Además de la aplicación en la región abdominal se aplicará en el pabellón auricular derecho 10ul de DNFB a todos los ratones (experimentales y control). Antes de la aplicación en el pabellón auricular, medir el grosor del mismo con el micrómetro. 7. Esperar 48 horas y medir nuevamente con el micrómetro el pabellón auricular derecho de cada ratón verificar la reacción de hipersensibilidad. Calcular la diferencia existente entre ambas mediciones y anotar la conclusión. Actividades A) Cuestionario 1. Explica el proceso de una reacción de hipersensibilidad tardía. 2. ¿Cuáles son las células mediadoras de las reacciones de sensibilidad tardía y qué otras células participan? 3. ¿De qué manera se puede inducir de forma experimental una reacción de hipersensibilidad tardía? Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 4. ¿Cuál es la aplicación clínica de las reacciones de hipersensibilidad tardía? 5. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de reacción de hipersensibilidad tardía al DNFB? 6. ¿Qué cuidados se deben tener al manejar el DNFB y cuáles son los riesgos? 7. Menciona la clasificación de Coombs y Gell para las reacciones de hipersensibilidad y da un ejemplo de cada una. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg B) Diagrama de flujo Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Resultados Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Conclusiones Bibliografía Título Autor Página Editorial 1. 2. 3. Nombre del alumno: Fecha: Grado/grupo/turno: Calificación: Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Práctica 11 INMUNOLOGÍA DE LOS TRASPLANTES Fundamento En inmunología, el término trasplante se refiere a la acción de transferir células, tejidos u órganos de un individuo a otro, esto se realiza con la justificación de la posibilidad de curar muchas enfermedades al reemplazar un tejido dañado por uno sano; el objetivo es mantener la integridad funcional del tejido trasplantado en el receptor y así suplir la falla orgánica preexistente, en ocasiones es crucial realizar un trasplante para evitar la muerte. El mayor problema que se presenta en esta situación es la disponibilidad de los tejidos y el rechazo que se puede presentar por parte del receptor. Al hacer un trasplante, el sistema inmune tiene una participación muy importante, pues de esto depende la supervivencia o el rechazo de los mismos, para ayudar a la supervivencia de los injertos, se utilizan diferentes agentes inmunosupresores como fármacos y anticuerpos específicos desarrollados para disminuir el ataque del sistema inmune hacia el injerto, la desventaja que tiene esto es que los agentes inmunosupresores actúan a nivel global y ponen al individuo en riesgo, haciéndolo susceptible a infecciones y otras enfermedades. Debido a que la inmunorreacción a los antígenos tisulares del CMH es la principal razón para el rechazo, la compatibilidad entre el receptor y el donante se evalúa mediante la tipificación de los antígenos tisulares de CMH cases I y II. El grado de inmunorreacción que causa el injerto en el receptor depende de la naturaleza del mismo, se pueden clasificar los injertos en 4 tipos: Autoinjerto.- es el tejido del mismo individuo transferido de una a otra parte del cuerpo. Isoinjerto.- es el tejido que se transfiere entre individuos genéticamente idénticos. Aloinjerto.- es el tejido que se transfiere entre individuos de la misma especie pero genéticamente diferentes. Xenoinjerto.- es el tejido transferido entre individuos de diferentes especies. Los autoinjertos y los isoinjertos generalmente son bien aceptados en el individuo; el aloinjerto tiene cierto grado de rechazo debido a que el sistema inmune lo reconoce como algo extraño; el xenoinjerto es el que presenta rechazo con mayor intensidad debido a la gran diferencia genética entre los individuos. El rechazo de un injerto es la inmunorreacción que presenta reconocimiento de lo propio y o extraño, especificidad y memoria; estas reacciones de rechazo se clasifican en tres: Rechazo hiperagudo.- esta mediado por anticuerpos preexistentes en el receptor contra los antígenos del injerto. Rechazo agudo.- esta mediado por linfocitos TH y células citotóxicas. Rechazo crónico.- está mediado por componentes humorales y celulares. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Cuando se presenta un rechazo, se pueden describir dos etapas, la primera es la etapa de sensibilización, en la que se estimulan y activan los linfocitos T; la segunda es la etapa efectora, durante la cual se produce el ataque al injerto. Trasplante de piel La piel es el órgano más grande, está encargada de proporcionar una barrera protectora contra el medio ambiente al organismo, por esto es esencial en la homeostasis, control de la temperatura, intercambio de fluidos con el exterior y por supuesto, es el principal mecanismo de defensa contra microorganismos invasores. Su alta especialización hace que el trasplante de piel sea una prueba de histocompatibilidad muy rigurosa, ya que prácticamente todos los antígenos se encuentran ahí. Los injertos de piel son de primera intención, esto es que su vasculatura se establece por anastomosis directa termino-terminal entre los vasos del injerto y los vasos del receptor. La evolución en los injertos de piel es rápida, en los primeros días no se observan grandes diferencias en los tejidos, dentro de las primeras 24 horas todos los injertos se encuentran pálidos y es hasta el segundo día que aparecen manchas de color rosado, en el tercer y cuarto día todo el injerto se ve de un color rosa uniforme, para el quinto día comienza a desaparecer el edema y eritema y hay regeneración epidérmica y fusión gradual del injerto con la piel del huésped, para el vigésimo día ya se observa un patrón de vasculatura similar al de la piel circundante. En caso de que se presente un rechazo al injerto, dentro de la primer semana se observa un halo de edema y eritema que incrementa durante los siguientes días, para el octavo y noveno día el color del injerto cambia a rojo cereza, progresando a cianosis franca, después de esto se presenta punteado trombótico, escarificación y hemorragia en los siguientes días, al final del proceso de rechazo, se pierde por completo el flujo sanguíneo y el injerto se convierte en una escara negra que se esfacela. Los criterios de diagnóstico para el rechazo de autoinjerto de piel son los siguientes: Intensidad del eritema y edema circundantes. Color y consistencia del injerto. Valoración microscópica de la vasculatura superficial. Presencia o ausencia de trombosis o hemorragia. Basándose en estas observaciones, se determina un criterio específico para diagnosticar el rechazo basándose en lo siguiente: Desarrollo de edema y eritema intensos alrededor del injerto. Color rojo oscuro o cianosis del injerto. Edema y opacificación de la superficie del injerto. Interrupción del flujo sanguíneo en todos los vasos del injerto. Presencia de trombosis intravascular y hemorragia. Escarificación y esfacelación del injerto. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Objetivo general Comprender la participación del sistema inmune en los trasplantes. Objetivos particulares Identificar los efectos de un trasplante de piel en un modelo murino. Evaluar la evolución en un trasplante de piel. Recursos Material Reactivos Equipo Ratones de la cepa Anestesia pentobarbital Balb/C, DBA. sódico o Zoletil® Cajas de Petri Solución fisiológica Pipetas pasteur Bulbos de succión Estuche de disección Navajas de rasurar Sutura de seda 3-0 Gasas Guantes Cubre bocas Procedimiento 1. Se anestesia a los ratones con 2ml de pentobarbital sódico vía intraperitoneal. 2. Rasurar el dorso de los ratones y delinear la piel a trasplantar, cuidando que sean las mismas dimensiones en el donador y en el receptor. 3. Cortar con bisturí la zona delineada y disecar el tejido con mucho cuidado con tijeras curvas. 4. La piel separada del dorso de los ratones se colocará en las cajas de Petri con solución salina fisiológica al 0.9% a temperatura ambiente, cuidando que los injertos no se sequen. Cuidar también que no se seque en ningún momento la zona descubierta de los ratones. 5. Implantar el tejido en la zona destinada como receptora, es importante que los bordes queden bien alineados para garantizar el contacto y la irrigación del injerto. El injerto se fija con puntos simples, utilizando la sutura de seda 3-0. 6. Dejar a los ratones en su jaula y ponerle al agua un antihistamínico. 7. Evaluar la evolución del trasplante y registrar los cambios en los injertos durante los próximos 15 días. Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Actividades A) Cuestionario 1. ¿Qué es el trasplante y con qué objetivo se realiza? 2. ¿Cómo participa el sistema inmune en la evolución de los trasplantes? 3. Menciona la importancia del CMH en la inmunología de los trasplantes 4. Menciona los tipos de injertos y sus características 5. Describe los tipos de rechazo que se pueden presentar Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg 6. Describe brevemente el proceso del rechazo, sus etapas y las células del sistema inmune que participan 7. ¿Qué cambios se observan en la primera semana después de un trasplante de piel? 8. ¿Cuáles son los criterios finales para diagnosticar rechazo en un trasplante de piel? 9. ¿Cómo se puede evitar el rechazo de los trasplantes y qué riesgos conlleva? 10. En caso de presentarse el rechazo, ¿cuáles son las medidas a llevar a cabo? Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg B) Diagrama de flujo Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Resultados Observaciones Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Conclusiones Bibliografía Título Autor Página Editorial 1. 2. 3. Nombre del alumno: Fecha: Grado/grupo/turno: Calificación: Lic. en Químico Farmacobiólogo Centro Universitario Uteg Bibliografía Abbas A. Inmunología celular y molecular, 6ª edición, editorial Elsevier (2008), Madrid, España. Kindt T. Inmunología de Kuby, 6ª edición, editorial McGraw-Hill (2007), México. Ponce S. Inmunología I curso teórico practico, editorial Amate (2008), México. Ponce S. Inmunología aplicada curso teórico práctico, Amate (2009), México. Daneri-Navarro A. lymphoma associated immunosuppression in Balb/c mice. Biomed Pharmacother. 1995; 49(1):39-44. L-5178-Y Lomonte, B. Técnicas de Laboratorio en Inmunología Clínica, 122 pp. Universidad de Costa Rica (2009). Acceso libre en: http://www.icp.ucr.ac.cr/~blomonte/ Calderón R. Manual del Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México (2007). Acceso libre en: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf Rosales M. Manual del laboratorio de Inmunología, Universidad Autónoma de Baja California (2007). Acceso libre en: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf Lic. en Químico Farmacobiólogo