13/03/2020
Biotecnología
Maestra: Blanca Rosa
Aguilar Uscanga
CURVA DE CRECIMIENTO
MICROBIANO
Práctica 1
Equipo:
Laura Vargas Obieta
Jesús Matías Ruiz Rangel
Erick Alejandro Rodríguez Ibarra
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS
PRÁCTICA 1
CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO
OBJETIVO.
Determinar los parámetros cinéticos, a partir de los datos obtenidos de una cinética
de crecimiento microbiano.
INTRODUCCIÓN.
Una curva de crecimiento microbiano es una representación gráfica que nos
describe la manera en la que se incrementan el número de células, la biomasa o la
turbidez en un sistema a lo largo del tiempo por unidad de volumen. Dicha curva
nos permite procesar la información como base para la determinación de algunos
parámetros cinéticos de una fermentación.
El crecimiento de un microorganismo (MO) varía principalmente con el medio de
cultivo (contenido en nutrientes), la temperatura, el pH y la aireación durante la
incubación. Es necesario que la agitación sea vigorosa para mantener la suficiente
cantidad de oxígeno disuelto en el medio que permita el crecimiento (en el caso de
microorganismos aerobios) y que los nutrientes se mantengan en todo momento
uniformemente distribuidos en el medio. Incluso así, el crecimiento en un medio
mínimo comparado con el conseguido en un medio rico manifiesta un alargamiento
del periodo de duplicación en una bacteria; esta diferencia se debe al tiempo y la
energía que el MO debe emplear en un medio mínimo para sintetizar los metabolitos
que serían proporcionados directamente por un medio rico (complejo). Así, el
comienzo y la duración de la fase logarítmica es variable, y debe establecerse para
cada medio de cultivo y cada cepa microbiana empleada. La construcción de la
curva de crecimiento microbiano que incluye las fases de lag (fase de adaptación),
logarítmica/exponencial, estacionaria y de muerte, se utiliza como base para el
cálculo de parámetros que son de interés biotecnológico.
BIOTECNOLOGÍA
Página 1
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS
MATERIAL Y REACTIVOS.
Material:
Algodón
Cinta adhesiva Masking
Celdas para espectrofotómetro
Desecador
Gasa
Marcador de tinta indeleble
Mecheros
Pipetas graduadas de 5 a 10 mL
Pipitas volumétricas de 1mL
Puntas de micropipeta (1000 y 200 L)
Tubos de eppendorf de 1 mL
Equipo:
Biorreactor
Balanza analítica
Baño María
Centrífuga
Estufa de secado
Espectrofotómetro
Incubadora
Micropipetas de diferentes volúmenes (1000 y 200 L)
Reactivos:
Agua bidestilada
Medio de cultivo, ya sea para bacterias o levaduras
Reactivo DNS (ácido dinitro 3,5 salicílico)
Soluciones de glucosa para la construcción de una curva de calibración a
concentración de 2 a 0 g/L.
Microorganismo:
Levadura
BIOTECNOLOGÍA
Página 2
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS
PROCEDIMIENTO.
1. Preparación del medio de cultivo y propagación del inóculo.
El laboratorio tendrá listo y esterilizado un matraz que contendrá 300 mL de medio
estéril, así, como 50 mL de un cultivo primario (inoculo) de la cepa de bacteria o
levadura que se vaya a usar durante la cinética.
2. Inicio de la fermentación y cinética fermentativa.
La cinética de fermentación, iniciará en el momento que se inocule el 1% del
microrganismo en el medio de cultivo, donde se llevará a cabo la cinética, el inóculo
se encontrará a temperatura optima del microorganismo con el fin de disminuir la
fase de adaptación.
Una vez iniciada la fermentación, se llevará a cabo la medición del crecimiento
microbiano a diferentes tiempos (Tabla 1), mediante la medición de turbidez (DO),
la determinación de peso seco y el consumo de sustrato.
2.1 Medición de turbidez.
Tomar una muestra de 1 mL del medio de cultivo con el MO, y colocar en una celda
para la lectura de la densidad óptica (OD), en un espectrofotómetro a una longitud
de onda () de 600 nm para bacterias y 660 nm para levaduras. Realizar diluciones
cuando sea necesario o cuando la lectura del espectrofotómetro se sature.
2.2 Determinación de peso seco.
Tomar una muestra de 1 mL de medio con el MO y vaciar a un tubo eppendorf
previamente puesta a peso constante, posteriormente centrifugar durante 5 min a
3000 rpm. Posteriormente, separar cuidadosamente el sobrenadante con una
pipeta, evitando que se mezcle el precipitado. El sobrenadante se guardará en
congelación a -20C para posteriormente analizar el consumo de sustrato. El
precipitado o botón celular que se encuentra en el tubo eppendorf, se llevará
nuevamente a peso constante, sometiéndolo a secado en una estufa durante 24 h
a 80°C; con el objetivo de determinar la biomasa (g/L). Los tubos no deben tocarse
con las manos, deberá usar pinzas o guantes, para evitar variación en los pesos.
2.3 Consumo de sustrato.
Se realizará la cuantificación del consumo de glucosa en el medio de cultivo, usando
el método del DNS, según el protocolo descrito por Sumner y Howell (1935). Deberá
construir una tabla con la información generada de la fermentación realizada. Los
BIOTECNOLOGÍA
Página 3
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS
datos obtenidos serán registrados en base logarítmica para llevar el control de las
diferentes fases de crecimiento.
3. Cuantificación de azúcares reductores por el método DNS (ácido 3,5dinitrosalicílico)
a. Agregar 200 μL del reactivo de DNS a 200 μL una muestra problema.
b. Llevar la mezcla de reacción a la temperatura de 100°C en un baño María
durante 5 minutos.
c. Detener la reacción en un baño de hielo.
d. Diluir la muestra con 2.5 mL de agua destilada.
e. Cuando la muestra se encuentre a temperatura ambiente medir la
absorbancia a 540 nm.
f. Realizar una curva de calibración a partir de soluciones equimoleculares de
D-glucosa con concentraciones comprendidas de 0.1 a 2 g/L en agua.
4. DIAGRAMA DE FLUJO
BIOTECNOLOGÍA
Página 4
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS
5. RESULTADOS
1. Complete la siguientes tablas
Sustrato
Curva de calibración
Curva calibración glucosa DNS
1
0,8
glucosa
(g/L)
0
DO
2
1.8
1.5
1
0.5
0.855
0.726
0.613
0.385
0.228
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
R² = 0,9953 y = 0,4134x - 0,0007
Mediciones
Tiempo (h)
DO DNS
DO DNS
0
0.599
0.671
0.635
1.54
1
0.579
0.606
0.5925
1.43
2
0.539
0.595
0.567
1.37
3
0.535
0.536
0.5355
1.30
4
0.537
0.587
0.562
1.36
5
0.496
0.534
0.515
1.25
6
0.378
0.432
0.405
0.98
7
0.337
0.359
0.348
0.84
8
0.255
0.29
0.2725
0.66
9
0.121
0.155
0.138
0.34
10
0.546
0.558
0.552
1.34
20
0.09
0.118
0.104
0.25
BIOTECNOLOGÍA
DO promedio
Sustrato (g/L)
Página 5
0
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS
Sustrato
(g/L)
Biomasa
(g/L)
LN
Biomasa
µesp
4.8083
1.54
1.046587
0.04553439
0.00678762
5.1716
5.1752
1.43
1.053715
0.05232202
0.00268687
0.275
5.1316
5.1356
1.37
1.05655
0.05500888
0.01446121
0.365
0.37
4.6016
4.6087
1.30
1.07194
0.06947009
0.03416894
0.613
0.587
0.6
4.9042
4.9077
1.17
1.36
1.1092
0.10363903
0.10394408
5
1.31
1.39
1.35
5.1096
5.1131
1.17
1.25
1.2307
0.20758311
0.08451918
6
1.92
2.12
2.02
5.058
5.062
1.33
0.98
1.33924
0.29210229
0.12865201
7
3.28
3.03
3.155
5.0239
5.0269
0.84
1.52311
0.4207543
0.08508693
8
4
3.98
3.99
5.0088
5.013
0.66
1.65838
0.50584122
0.11171997
9
4.86
5.54
5.2
4.9767
4.9823
0.34
1.8544
0.61756119
0.06510121
10
6.36
5.58
5.97
4.8522
4.857
1.34
1.97914
0.68266241
0.10333739
11
7.4
7.2
7.3
4.8835
4.8888
2.1946
0.7859998
0.10268538
12
8.94
8.59
8.765
4.6958
4.7003
2.43193
0.88868518
-0.0133905
20
6.84
7.64
7.24
2.18488
0.78156091
0.03907805
Tiempo
(h)
DO 1
DO2
DO
promedio
Tubo
vacio
Tubo+biomasa
0
0.219
0.208
0.2135
4.8046
1
0.259
0.256
0.2575
2
0.268
0.282
3
0.375
4
Biomasa
(g/L)
1.87
0.25
Correlación de D.O con Biomasa
3
y = 0,162x + 1,0119
R² = 0,977
2,5
D.O
2
1,5
1
0,5
0
0
2
4
6
8
10
Biomasa (g/L)
BIOTECNOLOGÍA
Página 6
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS
2. Grafique la información generada del crecimiento del microorganismo
utilizado los datos de la biomasa (g/L) y consumo de sustrato (g/L) contra el
tiempo.
T vs biomasa y sustrato
3,00
2,50
D:O.
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
0
5
10
15
Concentración (g/L)
BIOTECNOLOGÍA
20
Sustrato (g/L)
25
Biomasa (g/L)
Página 7
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS
3. Calcule el tiempo de duplicación (tiempo de generación), la μmax,
rendimiento de biomasa y la velocidad de consumo de sustrato(Qs).
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 µ = 0.09813 h-1
0.693
𝑇𝑔 =
= 7.062 ℎ
0.09812
Yx/s=
2.43193−1.0456
1.54−0.25
𝑸𝑺 =
𝟎.𝟗𝟖𝟏𝟑
𝟏.𝟎𝟕𝟒
= 1.074
= 𝟎. 𝟎𝟗𝟏𝟒
µmax = 0.1286
5. CONCLUSIONES.
Describa sus comentarios y conclusiones en relación al trabajo de esta práctica y la
importancia de conocer el crecimiento microbiano para la formación de biomasa.
Laura Vargas Obieta: Es importante conocer la cinética microbiana para predecir la
cantidad de producto o biomasa que obtendremos, esto es muy útil a la industria ya
que se puede predecir lo que ocurrirá con cantidades más grandes y otros tiempos.
En algunos puntos la toma de muestra no fue correcta debido a que no mostraban
mucha relación entre ellos.
Erick Alejandro Rodríguez Ibarra: La cinética de crecimiento de la cepa
utilizada muestra que tiene un tiempo de generación de 7h y que su formación
de biomasa es inversamente proporcional al consumo de sustrato des pues
de unas horas, teniendo su pico máximo de producción de biomasa dentro de
la primera generación (entre 7 y 8 horas).
De manera personal considero que se tuvieron algunos contra tiempo y fallos,
no en toma de muestra si no en la forma de rotular y preparar las muestras
con diluciones, sin embargo se pudo solucionar. Por otra parte la curva se
muestra incompleta ya que requiere más tiempo de evaluación para
determinar el tiempo que se mantienen nuestras levaduras en fase
estacionaria y cuando llegan a su fase de declive.
BIOTECNOLOGÍA
Página 8
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIA EXACTAS E INGENIERÍAS
6. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA.
BIOTECNOLOGÍA
Página 9
0
