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XII CONGRESO NACIONAL DE CIENCIA
Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
Jueves 27 y Viernes 28 de Mayo de 2010
Guanajuato, Gto.
DETERMINACIÓN DE SULFONAMIDAS EN MÚSCULO DE BOVINOS
SACRIFICADOS EN RASTROS TIPO INSPECCIÓN FEDERAL (TIF) EN NUEVO
LEÓN, MÉXICO, POR MEDIO DE LA TÉCNICA DE CROMATOGRAFÍA
LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC).
Lazcano Villarreal J.L. a*, Wong González A. b*, Roig Sagués A. X. b, Pérez
Fernández B. b, Moreno Degollado G. c, Cantú Martínez M. A. c , Zarate Ramos
J.J. c , Avalos Ramírez R c , Aguirre Ramos Ac. , Dávalos Aranda G. c.
a*, b*c
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UAN.L Ave Francisco Villa
s/n Ex - Hacienda el Canadá C.P. 66050 General Escobedo N.L, México.
b
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Universidad Autónoma de
Barcelona, Bellaterra 8193 (Cerdanyola del valle) Campus de la UAB edificio B,
Barcelona España.
[email protected]
RESUMEN:
Los residuos de Sulfonamidas en la carne de animales tratados representan un
riesgo para la salud de los consumidores. El objetivo fue determinar la presencia
de Sulfapiridina, Sulfatiazol, Sulfametazina y Sulfadimetoxina, en músculo de
bovino por la técnica de HPLC. El análisis se realizó a partir de 28 muestras de
músculo de bovinos de 28 lotes de 100 animales cada uno, sacrificados en dos
rastros Tipo Inspección Federal, provenientes de 15 municipios del Estado de
Nuevo León México; las Sulfonamidas después de la adición del estándar interno
fueron extraídas con acetato de etilo, y separadas dentro de un buffer de glicina.
Después de una limpieza con hexano, la fase acuosa fue extraída evaporada y
recuperada, posteriormente se le adicionó fluorescamina. Las condiciones del
equipo fueron: volumen de inyección 50µl, temperatura de la columna 30ºC, λ
Excitación del detector 405 nm, λ Emisión del detector 495 nm, columna de
cromatografía, Luna ODSLC-18. La fase móvil estuvo constituida en forma de
gradiente por ácido acético 62%, 15%, 62% acetonitrilo 38%, 85%, 38% hasta los
17 min., a un flujo constante de 2 ml/min.El resultado obtenido fue que el 100% de
las muestras analizadas resultaron negativas a los estándares de las cuatro
Sulfonamidas por el método de HPLC. Las concentraciones detectadas variaron
de 0.005-0.01ppm. 0.1ppm
ABSTRACT:
Sulfonamides residues in meat from treated animals have a health risk to consumers. The objective
was to determine the presence of sulfapyridine, sulfathiazole, sulfamethazine and sulfadimethoxine
in bovine muscle by HPLC. The analysis was performed by HPLC, from 28 samples of muscle from
cattle of 28 batches of 100 animal each, two abattoirs Federal Inspection Type, from 15
municipalities in the State of Nuevo Leon, Mexico; the Sulfonamides after addition internal
standard were extracted with ethyl acetate, and separated in a glycine buffer. After cleaning with
hexane, the aqueous phase was extracted evaporated and recovered, then was added
fluorescamina. The conditions of the equipment team were: injection volume 50µl, column
temperature 30 º C, λ excitation detector 405 nm, λ emission detector 495 nm, column
chromatography, Luna ODSLC-18. The mobile phase was set up as a gradient of acid Acetic 62%,
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15%, 62% acetonitrile 38%, 85%, 38% to 17 min., a constant flow of 2 ml / min.The result was that
100% of the samples were negative to the standards of the four Sulfonamides by the HPLC
method.The detected concentrations ranged from 0.005-0.01ppm. Official Mexican Standard
establishes the Maximum Residue Limit (MRL) is 0.1ppm.
Palabras clave:
Detección, Sulfonamidas, HPLC.
INTRODUCCIÓN
Las Sulfonamidas se han usado en animales productores de alimentos, para
promover su crecimiento y/o con fines terapéuticos y profilácticos (Bordier, et al.,
2007). Tras la administración parenteral u oral de Sulfonamidas se producen
residuos en carne, leche de mamíferos y en huevos de aves (Cancho Grande, et
al., 2000; Repetto y Camean, 2005).
Sin embargo se ha limitado su empleo debido a que los residuos de Sulfonamidas
encontrados en algunos animales, son cancerígenos (Pérez, 2004; Yarén et al.,
2007).
En México desde 1984 se estableció un Programa Nacional de Control de
Residuos Tóxicos, Biológicos y Contaminantes en tejidos animales para consumo
humano, cuyo responsable es la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Pesca,
éste sólo ha tenido un avance importante en el análisis y control de estos residuos
en carne. En México la normatividad sobre la presencia de residuos tóxicos en
alimentos aún está incompleta, lo que impide garantizar plenamente la calidad
sanitaria de los alimentos (Pérez, et al., 2004).
En lo que respecta a México, se emitió la Norma Oficial Mexicana (NOM) NOM004-Z00-1994. Modificada en el 2001 de residuos tóxicos en la que se especifican
límites máximos permisibles y procedimientos de muestreo de grasa, hígado,
músculo y riñón en aves, bovino, caprino, cérvido, equino, ovino y porcino. Así
también en la NOM-0011-ZOO-1994. Titulada determinación de Sulfonamidas en
hígado y músculo de bovinos, ovinos, equinos, porcinos y aves por cromatografía
capa fina densitometría para la determinación de Sulfadimetoxina (SDM),
Sulfapiridina (SPY), Sulfametazina (SMZ) y Sulfatiazol (STZ). La técnica también
es aplicable a las siguientes Sulfonamidas: Sulfadiazina, Sulfametoxipiridazina,
Sulfamerazina,
Sulfacloropiridazina,
Sulfaquinoxaleína,
Sulfafenazol,
Sulfaetoxipiridazina, Sulfatroxazol, Sulfisoxazol y Sulfadoxina, con límites
máximos de residuos de Sulfonamidas en hígado y músculo de 0.100 ppm
(Anónimo, 1994).
El Programa de Control de Residuos en Productos Pecuarios de Chile realizo en el
2004 un estudio sobre residuos de sustancias Grupo B Sulfonamidas (Sulfatiazol,
Sulfadiazina, Sulfamerazina, Sulfametazina, Sulfadimetoxina, Sulfaquinoxalina) en
bovinos en matriz de músculo donde se utilizo el método de cromatografía liquida
de alta resolución Fluor (HPLC) (Anónimo, 2004).
El objetivo del presente trabajo es determinar la presencia de Sulfapiridina,
Sulfatiazol, Sulfametazina y Sulfadimetoxina, en músculo de bovino por le técnica
de HPLC.
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METODOLOGÍA
Toma de muestras
El muestreo se realizó al azar, de acuerdo al sistema de número aleatorios
indicado en el apéndice C de la NOM-004-1994, modificada en 25 de abril 2001.
Se recolectaron 28 muestras de músculo de 28 lotes con un promedio de 100
bovinos cada uno, de 2 rastros TIF, procedentes de 15 municipios del Estado de
Nuevo León, México. Para la preparación de los tejidos posteriormente se tomaron
200g de músculo, se molieron y homogenizaron individualmente. Los tejidos se
identificaron y se almacenaron en recipientes adecuados y se refrigeraron a una
temperatura de -10 ºC para su posterior análisis por HPLC.
Descripción de los procedimientos analíticos
De las muestras almacenadas se pesaron 2.5g +/- 0.05 de tejido. Por cada serie
de muestras, se preparo un blanco de cristalería, un blanco de reactivos, un tejido
blanco y las recuperaciones.
Así mismo se utilizaron estándares de cuatro Sulfonamidas SPY, STZ, SMZ, SDM,
de pureza certificada (U.S. Pharmacopea, Rockville, MD, EEUU) seguidamente
se preparo la solución stock, se peso por separado en matraces volumétricos
aproximadamente 100 ml de 0.1 mg de cada sulfonamida y se llevo a volumen con
acetona, posteriormente se pipetearon 2 ml de la solución stock de STZ de 1000
µg/ml y 1 ml de solución stock de 1000 µg/ml de SMZ y SDZ en un matraz
volumétrico de 100 ml y se llevo a volumen con la solución de buffer de fosfatos
0.2M. Para obtener una concentración de 20 µg/ml de STZ y 10 µg/ml de SMZ y
SDZ (concentración 1), posteriormente se realizaron las diluciones
correspondientes para obtener las siguientes concentraciones 10 µg/ml de STZ y
5.0 µg/ml de SMZ y SDZ (concentración 2), 5µg/ml de STZ y 2.5 µg/ml de SMZ y
SDZ, (concentración 3), 2.5 µg/ml de STZ y 1.25 µg/ml de SMZ y SDZ
(concentración 4).
En el caso de SPY por ser el estándar interno (SI) se peso 1ml de la solución de
SPY de la solución de 1000 µg/ml en un matraz volumétrico de 100 ml se llevo a
volumen con la solución de buffer de fosfatos 0.2M para tener una concentración
de 10µg/ml. Posteriormente se preparo la dilución correspondiente para obtener
una concentración de 5.0 µg/ml.
Se fortificaron las muestras con 100 µl de estándar interno SPY para tener una
concentración en matriz de 0.020 ppm. Se preparo una curva de estándares
fortificando las muestras de tejido blanco con 100 µl de cada una para tener una
concentración en matiz de:
Concentración 1, 0 .08, ppm de STZ - 0.04 ppm de SMZ, SDM
Concentración 2, 0.04 ppm de STZ - 0.02 ppm de SMZ, SDM.
Concentración 3, 0.02 ppm de STZ - 0.01 ppm de SMZ, SDM
Concentración 4, 0.01 ppm de STZ - 0.005 ppm de SMZ, SDM
Esto calculado en base a 2.5 g de tejido.
Las recuperaciones se fortificaron de acuerdo a los diferentes niveles cada
estándar excepto sulfapiridina.
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El análisis de residuos de Sulfonamidas se realizo por HPLC, a partir de músculo;
las Sulfonamidas después de la adición del estándar interno fueron extraídas con
acetato de etilo, y fueron separadas dentro de un buffer de glicina. Después de un
ajuste de pH y una limpieza con hexano, la fase acuosa fue extraída con
diclorometano, evaporada y recuperada con un buffer de acido acético.
Posteriormente se le adicionó fluorescamina para ser cuantificada por el detector
de fluorescencia.
En el presente estudio se utilizó un cromatógrafo de líquidos de alta resolución
modelo 9012 marca Varian™, a una temperatura de 30 ºC, con una columna
econosférica de octadecilsiliano (ODSL C18) de 5 µm de tamaño de partícula, con
una longitud de 25 cm y 4.6 mm de diámetro interno (Cía Phenomenex, Torrance,
CA, EEUU), así como un detector de fluorescencia marca Pro Star a una λ
Excitación del detector 405nm y una λ Emisión del detector de 495 a un volumen
de inyección de 50 µl/min. Este sistema se conectó a una computadora equipada
con un Software Star Cromatography y Worksation System Control Versión 552.
Calibración del sistema
Para la calibración del sistema se utilizaron diferentes condiciones cromatográficas
en cuanto a variaciones en el flujo que fluctuaron 0.2 a 2 ml/min., volumen de
inyección de 20 a 50 µl, y las proporciones de la fase móvil (Acido acético 15 a
77%, Acetonitrilo 23 a 85 %, temperatura de 22 a 55º C y el tiempo de corrida de
20 a 60 minutos.
Curvas de calibración del sistema (sin matriz)
Para la curva de calibración del sistema se inyectaron 50 µl de la soluciones de las
estándares de las Sulfonamidas reconstituidos a las concentraciones de: 2, 1, 0.5,
0.25, 0.125, 0.0624 ppm para SMZ y SDM, y para el caso de STZ las
concentraciones fueron al doble y de 1 ppm para SPY por ser el estándar interno.
La fase móvil estuvo constituida por Acido Acético (AC) al 2%, Acetonitrilo (AN) en
forma de gradiente iniciando con un 62% AC y un 38% AN, manteniéndose hasta
los 10 minutos, seguidamente a los 11 minutos se cambió a 15% de AC y un 85%
de AN, manteniéndose hasta los 16 minutos. Finalmente a los 17 minutos se
cambió a 62% AC y un 38% de AN hasta los 20 minutos, a un flujo constante de
2.0 ml/minutos.
Curva de calibración con matriz
Se corrieron las curvas de calibración con matriz fortificando las muestras de tejido
blanco con las concentraciones de: 0.04, 0.02, 0.01, 0.005 ppm para SMZ y SDM
y al doble de concentración para STZ. Como también SPY a una concentración de
0.020 ppm por se el estándar interno. Estas concentraciones se calcularon en
matriz tomando en cuenta 2.5 g de músculo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Como resumen del proceso de optimización del método propuesto en la Tabla 1
se muestran los valores y parámetros óptimos del método
Condiciones del Equipo
Velocidad de flujo
2.00 ml/min.
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Volumen
de
inyección
Temperatura de la
columna
λ Excitación del
detector
λ
Emisión
del
detector
Columna
de
cromatografía
Fase Móvil
50µl.
30ºC
405 nm
495 nm
Phenomenex Luna ODSLC18 (25cm, 4.6mm, 5µm)
Acido
acético
al
2%,
Acetronilo (15: 85)
Programa de Gradiente de la fase móvil
Tiempo (min.) Acido
Acetonitrilo
acético (%)
%
Flujo
Constante
Inicio
62
38
2 ml/min.
10
62
38
11
15
85
16
15
85
17
62
38
Tabla 1.- Valores y parámetros óptimos del método
Los valores y parámetros obtenidos en la optimización del método de este estudio
son similares a los utilizados por (Posyniak et al., 2002) en el análisis de residuos
de Sulfonamidas por HPLC en miel.
Además se determinaron los tiempos de retención para las cuatro Sulfonamidas
estudiadas los cuales se pueden observar en la Tabla 2
Sulfonamida
Sigla
Tiempo de retención
(Minutos)
Sulfapiridina
SPY
7.418
Sulfatiazol
STZ
7.876
Sulfametazina
SMZ
8.656
Sulfadimetoxina SDZ
13.330
Tabla 2.-Tiempo de retención para cada Sulfonamida en la columna HPLC
En el perfil cromatográfico (Figura 2) se puede observar la separación de las
cuatro Sulfonamidas analizadas con una buena resolución, bajo las condiciones
experimentales descritas anteriormente.
Figura 2.- Perfil cromatográfico de los estándares de las cuatro Sulfonamidas
Curvas de calibración con matriz
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La linealidad de la respuesta se comprobó a partir de cuatro concentraciones
fortificadas y la curva de calibrado se estableció considerando la altura de los
picos. (Relación de la altura del pico del analito entre la altura del pico del SI. En
función a la concentración del analito).
Se calcularon los coeficientes de
y = 8.9268x
determinación de (R2 ) y la ecuación de las curva obteniéndose valores 0.9903,1.0,
R² = 0.9903
0.9978 (Figura
3) los resultados anteriores
indican que la curva tiene un
Sulfametazina
y
=
1.464x
0.0456
comportamiento
lineal y directamente proporcional, con una baja dispersión de
10
5
R2 = 1
valores.
Estos parámetros son satisfactorios
ya que debe ser mayor o igual que
0.995 aunque
pueden
encontrarse
entre
0.980
y 0.990 según el analito (FAO
Sulfadimetoxina
5
2005).
y = 1.1737x + 0.1609
a)50
Sulfametazina
Sulfatiazol
b)
0
0
2
R² = 0.9978
Lineal…
Sulfadimet…
4
0
c) 0
2
4
Figura 3.- Curva de calibración de: a) Sulfatiazol, b) Sulfametazina, c)
Sulfadimetoxina.
Reproducibilidad del método
La reproducibilidad por este método fue aceptable ya que el coeficiente de
variación fue inferior al 20 % y los porcentajes de recuperación en los tejidos
analizados en las diferentes concentraciones se presentaron dentro de los rangos
de recuperación aceptables, entre el 70 y 120 %. Así mismo los resultados
obtenidos en las recuperación se encuentran entre del 67 al 114 %, en el caso de
Sulfatiazol 67.80 %, la homogeneidad es menor por factores no determinados.
Los resultados obtenidos en las recuperaciones en este estudio son mayores a los
reportados por (Pérez, 1999). Quien reporto un 71% para Sulfatiazol y 74.2% para
Sulfadimetoxina aunque posiblemente esto es debido a que estos autores
utilizaron un método diferente de HPLC con arreglo de diodos.
Exactitud
Los porcentajes de desviación estándar y los porcentajes de recuperación,
observados en este método fueron aceptables. Esto es interesante ya que
cualquier concentración detectada y/o cuantificada por este método advierte la
presencia de residuos de sulfonamidas en músculo de bovino.
Para demostrar la aplicabilidad del método desarrollado en muestras reales se
preparo una curva con cuatro concentraciones para realizar el análisis de 28
muestras de músculo de bovinos de 28 lotes de 100 animales en promedio cada
uno, sacrificados en 2 rastros TIF. Las muestras provenían de 15 municipios del
Estado de Nuevo León, México.
Los resultados fueron negativos para la detección de residuos de Sulfapiridina,
Sulfatiazol, Sulfametazina, Sulfadimetoxina en las 28 muestras analizadas. Los
resultados obtenidos en este estudio son similares a los reportados por Pérez,
1999, en el cual analizo 48 muestras con resultados negativos por el método
HPLC arreglo de diodos
CONCLUSIONES
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De acuerdo a la metodología seguida y las condiciones de trabajo para la técnica
de HPLC que se empleo en el presente trabajo es posible la detección de
Sulfonamidas con límites de detección de 0.01ppm en el caso de Sulfatiazol y de
0.005ppm para Sulfametazina , Sulfadimetoxina y Sulfapiridina.
En el estudio realizado no se encontraron residuos inferiores ni superiores del
LMR de las cuatro Sulfonamidas en las muestras analizadas de músculo de
bovino en el Estado de Nuevo León, México
Por otra parte, en un estudio anterior de control de residuos tóxicos y
contaminantes en alimentos de origen animal por el método HPLC realizado en
México, se encontraron 2 muestras positivas en 262 muestras de músculo de
bovino y 4 muestras positivas en 300 muestras de músculo de porcino por encima
del límite de tolerancia de 0.100 mg/Kg a Sulfametazina (Anónimo, 2007a). En
forma similar, en Chile, de 112 muestras analizadas, 111 resultaron negativas y
solo una positiva con un limite de detección de 0.05 ppm (Anónimo, 2004). De
acuerdo a los resultados obtenidos, se sugiere ampliar el número de muestras, así
como el cambiar el tipo de rastros para la obtención de las muestras, ya que en los
rastros TIF se llevan a cabo un estricto control sanitario.
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