Resumen
La activación de una solución concentrada de D-fructosa con ácido carbónico, generada a partir de
dióxido de carbono, induce la formación de dianhídridos de difructosa (DFA) y sus derivados
glicosilados (glicosil-DFA), una familia de oligosacáridos prebióticos. En condiciones optimizadas,
se obtuvo hasta el 70% de las especies activas de DFA a partir de una solución altamente
concentrada de fructosa, evitando el paso de filtración y el riesgo de contaminación asociado con
los procedimientos actuales que emplean catálisis heterogénea con resinas de intercambio iónico
ácido. La preparación optimizada promovida con CO2 del caramelo enriquecido con DFA que se
describe aquí ya se ha ampliado con éxito hasta 150 kg de D-fructosa para estudios nutricionales
que demuestran que la implementación de este proceso es posible a mayor escala.
Introducción
Los prebióticos son ingredientes alimenticios no digeribles que afectan beneficiosamente al
huésped al estimular selectivamente el crecimiento y / o actividad de una o un número limitado de
bacterias en el colon, mejorando la salud del huésped. El mercado mundial de prebióticos era de
500 000 t en 2013 y se espera que alcance 1 100 000 t en 2020. Los oligo y polisacáridos no
digeribles representan el grupo más importante de prebióticos, entre los que se encuentran
representantes a base de fructosa como inulina, fructooligosacáridos (FOS). ) y oligofructosa son
ejemplos típicos. Los dianhídridos de difructosa (DFA) y sus derivados glicosilados (glicosil-DFA)
constituyen una adición relativamente reciente a esta familia (Figura 1). Se han identificado trece
isómeros de DFA con cinco núcleos tricíclicos diferentes en caramelo y se han utilizado como
trazadores para la autenticidad del caramelo y para la detección de la adición fraudulenta de
caramelo a algunos alimentos (Figura 1).
Su estructura cíclica única confiere a los DFA una estabilidad enzimática y química mucho mayor
en comparación con los derivados de fructosilo clásicos como la sacarosa. El creciente interés en
las propiedades prebióticas de los DFA ha llevado a la búsqueda de nuevas metodologías que
permitan la preparación de isómeros individuales o productos enriquecidos con DFA. Los métodos
basados en la degradación catalítica enzimática de fructanos fue uno de los primeros estudiados.
Más recientemente, también se ha informado la síntesis enzimática de un diastereómero DFA a
partir de sacarosa, a saber, alfa-D-fructofuranosa beta-D fructofuranosa 1,2'2,3'-dianhídrido,
mediante el acoplamiento de una sacarosa fructosiltransferasa y una inulina fructotransferasa
inulina. Los principales inconvenientes de estas síntesis son la baja estabilidad térmica, la
dependencia del sustrato de las enzimas y el alto costo de estos procesos. Alternativamente, se
investigó la activación térmica y / o ácida controlada de fructosa. Bajo tales condiciones, se forma
un catión fructosil oxocarbenio, que luego puede glicosilar una segunda molécula de fructosa para
formar fructodisacáridos (fructobiosis). Un segundo proceso de glicosilación intramolecular
proporciona los DFA, que pueden experimentar más reacciones de glicosilación para dar glicosilDFA. Esta vía de reacción compite con los procesos de deshidratación y condensación
intramolecular no especificados en el origen de la formación de derivados de furano (p. Ej., 2hidroximetilfurfural, HMF) y las características de los compuestos de color oligoméricos
(melanoidinas) del caramelo. La inhibición de estas reacciones secundarias representa el obstáculo
principal para lograr altos rendimientos de DFA (Figura 2). Un producto con hasta 26% de DFA ha
sido producido previamente por pirólisis de inulina. También se informó el tratamiento térmico de
inulina o sacarosa, solo o mezclado con un promotor ácido. Las conversiones más altas en DFA y
glicosil-DFA se obtuvieron mediante la activación de inulina, sacarosa, fructosa o glicosilfructosas
con fluoruro de hidrógeno anhidro (HF) y reactivos basados en HF. Sin embargo, los rastros de HF
o sales de flúor en el producto final representan un riesgo para la salud que dificulta el despliegue
de este proceso a nivel industrial.
Más recientemente, se obtuvo un caramelo que contenía aproximadamente el 30% en masa de
DFA (hasta el 70% considerando la suma de DFA y glicosil-DFA) de D-fructosa usando la resina de
ácido sulfónico fuertemente ácido Lewatit S2328 como promotor de la caramelización. La alta
viscosidad del medio de reacción puede representar un problema técnico. Se encontró ventajoso
el uso de irradiación de microondas, dirigido a calentar la mezcla hasta el núcleo, pero el problema
de la separación del catalizador del producto final sigue siendo difícil. Por lo tanto, se necesitan
tecnologías alternativas que permitan la transformación de D-fructosa en caramelos prebióticos
utilizando promotores sin trazas. Es bien sabido que el CO2 forma ácido carbónico con agua, que
puede usarse como catalizador ácido como ya se mencionó en la literatura. Aquí, demostramos
que el DFA y los productos de oligómeros relacionados pueden sintetizarse a partir de una
solución altamente concentrada de fructosa utilizando CO2 barato y seguro como depósito de
ácido. Al final del proceso, el CO2 se puede eliminar fácilmente y se puede obtener caramelo
prebiótico puro sin ningún paso de purificación, lo cual es una ventaja significativa sobre los
métodos existentes.
Materiales y métodos
Materiales
D-fructosa anhidra (para determinaciones analíticas) y 5-hidroximetilfurfural (HMF) de 99% de
pureza, fenil β-D-glucopiranosido (patrón interno, IS), hidrocloruro de hidroxilamina,
hexametildisilazano y trimetilclorosilano se compraron de fuentes comerciales (Sigma Aldrich, Tres
Cantos, España) y se almacenaron a temperatura ambiente. Muestras auténticas de α-Dfructofuranosa β-D-fructofuranose 1,2 ': 2,1'-dianhidruro, 10, di-α-D-fructofuranose 1,2': 2,1'dianhidruro, 7, di- β-D-fructofuranosa 1,2 ': 2,1'-dianhídrido, 12, α-D-fructopiranosa β-Dfructopiranosa 1,2': 2,1'-dianhidruro, 5, di-β-D-fructopiranosa 1,2 ': 2,1'-dianhidruro, 14, α-Dfructofuranosa β-D-fructopiranosa 1,2': 2,1'-dianhidruro, 9 y β-D- La fructofuranosa β-Dfructopiranosa 1,2 ': 2,1'-dianhidruro, 13, utilizada para la calibración del protocolo analítico, se
preparó mediante espiflocloruro de boro o espirociclación promovida por ácido
trifluorometanosulfónico (ácido triflico) de precursores de D-fructosa adecuadamente protegidos ,
cromatografía en columna de los derivados protegidos y desprotección final de los DFA
individuales siguiendo la referencia indicada en cada caso. La α-D-fructofuranosa La β-Dfructofuranosa 1,2 ': 2,3'-dianhidruro, 1, se obtuvo mediante un proceso biotecnológico que
implica el tratamiento de inulina con inulasa II de Arthrobacter sp. y era> 99% puro como se ve por
RMN y GC.
Procedimiento general para la reacción de caramelización.
La reacción de caramelización se llevó a cabo en un reactor discontinuo de acero inoxidable (Parr
Instruments, Francia). El reactivo (fructosa) y el agua se introdujeron en el reactor en una cantidad
apropiada. Se introdujo dióxido de carbono en el reactor en forma gaseosa. La temperatura se
aumentó luego a la temperatura deseada. La agitación continuó durante el tiempo de reacción.
Después de completar la reacción, el reactor se enfrió a temperatura ambiente. El reactor se
despresurizó a presión atmosférica y el caramelo se recuperó y analizó.
Derivación de muestra
Para el análisis GC, las muestras de caramelo, así como las muestras de referencia utilizadas para
fines de calibración, se transformaron en sus correspondientes derivados de per-O-trimetilsililo
(TMS; azúcares no reductores) o de oxima trimetilsililada O (TMS-oximas; azúcares reductores).
Las muestras crudas se diluyeron con agua desionizada (1 ml) y las soluciones acuosas se secaron
por congelación. A 15-20 mg de cada muestra, se añadió agua desionizada (1 ml). A continuación,
se añadieron a 100 µl de la solución resultante 100 µl de patrón interno (IS) que consta de 4 mg /
ml de fenil β-D-glucopiranosido en acetona-agua (1: 9, v / v), y la solución final se evaporó. a
sequedad a 60 ºC (horno de secado). El residuo se trató con 1 ml de una solución de hidroxilamina
en piridina (20 mg / ml) a 60 ºC durante 50 minutos, con mezcla a intervalos. Luego se agregaron
hexametildisilazano puro (200 µL) y trimetilclorosilano (100 µL), y las mezclas de reacción se
mantuvieron a 60 ºC durante un período adicional de 40 minutos. Se observó la formación de un
precipitado blanco durante esta operación, que se separó por centrifugación (13 000 rpm, 5 min)
antes de la inyección en el aparato GC. Cabe señalar que después de la derivatización de la
trimetilsililación de oximación, los compuestos reductores (p. Ej., D-fructosa residual) muestran
dos picos en los cromatogramas GC, correspondientes a las oximas sin y anti-TMS, mientras que
los derivados no reductores (p. Ej., DFA y IS) muestra un solo pico.
Análisis GC-FID
El GC-FID se llevó a cabo utilizando un sistema GC 7820A (Agilent, Las Rozas, España) con un
inyector de EPC dividido / dividido equipado con un inyector automático equipado con una
columna de fenil-dimetilsiloxano al 5% reticulada. La columna utilizada fue una i.d. de 30 mx 320
µm. 0,25 µm, HP-5. Las condiciones de operación fueron: temperatura del puerto de inyección 310
ºC; relación dividida 25: 1; volumen de inyección 1 µL de muestras derivatizadas; temperatura del
horno de columna programada de 180-310 ºC a 5 ºC / min, con una retención de 25 min a 310 ºC;
gas portador helio (flujo constante a 1,2 ml / min); temperatura del puerto del detector 310 ºC. El
tiempo total de adquisición fue de 56 min. La identidad de los DFA en las muestras se confirmó
mediante la comparación de los cromatogramas GC con la de un caramelo industrial de sacarosa y
muestras auténticas de DFA como se informó. Factores de respuesta (RF) para D-fructosa (1.42) y
ocho DFA individuales (1, 0.89; 5, 0.76; 7, 0.68; 9, 0.68; 10, 0.75; 12, 0.86; 13, 0.78; 14, 0.85), a
concentraciones similares a las encontradas en los experimentos, se determinaron en relación con
el estándar interno fenil β-D-glucopiranosido y se usaron para cuantificar su proporción relativa en
caramelos. El promedio de los valores de RF para los ocho DFA disponibles en forma pura (0,78) se
aplicó al resto de componentes de DFA en las mezclas.
Espectrometría de masas por ionización por electropulverización
Los espectros de masas por electroaspersión (ESI-MS) en el modo de iones negativos se
obtuvieron en un instrumento Esquire 6000 (Bruker, Madrid, España). Las muestras de caramelo
se disolvieron en agua Milli-Q (1 mg / ml) y luego se diluyeron con metanol a una concentración
final de 0,1 mg / ml. Las soluciones se introdujeron directamente (0,2 ml / h) a través de una
bomba de jeringa integrada en la fuente de electrospray. La fuente y las temperaturas de
desolvatación fueron de 300 ºC, respectivamente. Se usó nitrógeno como gas de secado y
nebulización a velocidades de flujo de 5 ml / min. Típicamente, el voltaje capilar fue de 4.5 kV y el
voltaje del skimmer de -40 V. El rango de masa fue de 65-3000 Da, y los espectros se registraron
como promedios de 7 escaneos en el modo de perfil, con un Control Ion Change 160 (ICC) de 1000.
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