manual de practicas de laboratorio de bioquimica booksmedicos.org

SERGI SÁNCHEZ ENRÍQUEZ
SERGIO
LUIS JAVIER FLORES ALVARADO
CARMEN MAGDALENA GURROLA DÍAZ
PATRICIA HEREDIA CHÁVEZ
PATRICI
Manual de
prácticas de laboratorio de
TERCERA EDICIÓN
TERCERA EDICIÓN
Sergio Sánchez Enríquez, MD, PhD
Médico Cirujano y Partero
Especialidad en Ortopedia y Traumatología
Maestría en Farmacología
Doctorado en Biología Molecular en Medicina
Miembro del Sistema Nacional de Investigadores (SNI-I)
Perfil PROMEP
Presidente de la Asociación Mexicana de Egresados
de Ciencias de la Salud (AMECIS, A. C.)
Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Molecular y Genómica
Profesor Docente Titular, CUCS, Universidad de Guadalajara
ERRNVPHGLFRVRUJ
MÉXICO • BOGOTÁ • BUENOS AIRES • CARACAS • GUATEMALA
MADRID • NUEVA YORK • SAN JUAN • SANTIAGO • SAO PAULO
AUCKLAND • LONDRES • MILÁN • MONTREAL • NUEVA DELHI
SAN FRANCISCO • SIDNEY • SINGAPUR • ST. LOUIS • TORONTO
Director editorial: Javier de León Fraga
Editor de desarrollo: Héctor F. Guerrero Aguilar
Supervisora de producción: Ángela Salas Cañada
NOTA
La medicina es una ciencia en constante desarrollo. Conforme surjan nuevos conocimientos, se
requerirán cambios de la terapéutica. El(los) autor(es) y los editores se han esforzado para que los
cuadros de dosificación medicamentosa sean precisos y acordes con lo establecido en la fecha
de publicación. Sin embargo, ante los posibles errores humanos y cambios en la medicina, ni los
editores ni cualquier otra persona que haya participado en la preparación de la obra garantizan
que la información contenida en ella sea precisa o completa, tampoco son responsables de errores
u omisiones, ni de los resultados que con dicha información se obtengan. Convendría recurrir a
otras fuentes de datos, por ejemplo, y de manera particular, habrá que consultar la hoja informativa
que se adjunta con cada medicamento, para tener certeza de que la información de esta obra es
precisa y no se han introducido cambios en la dosis recomendada o en las contraindicaciones
para su administración. Esto es de particular importancia con respecto a fármacos nuevos o de
uso no frecuente. También deberá consultarse a los laboratorios para recabar información sobre
los valores normales.
TERCERA EDICIÓN
Prohibida la reproducción total o parcial de esta obra,
por cualquier medio, sin autorización escrita del editor.
DERECHOS RESERVADOS © 2014, respecto a la tercera edición, por
McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, S. A. de C. V.
Prolongación Paseo de la Reforma 1015, Torre A, Piso 17, Col. Desarrollo Santa Fe,
Delegación Álvaro Obregón
C. P. 01376, México, D. F.
Miembro de la Cámara Nacional de la Industria Editorial Mexicana, Reg. No. 736
ISBN: 978-1-4562-2012-9
ACH 04/14
1234567890
2356789014
Impreso en México
Printed in Mexico
Colaboradores
PEDRO GARZÓN DE LA MORA
LUIS HUACUJA RUIZ
Médico Cirujano y Partero, Universidad
de Guadalajara (U de G)
Doctorado en Ciencias Biomédicas, U de G
Profesor Investigador Titular, CUCS, U de G
Licenciatura en Biología, Maestría en
Biología Molecular, UNAM
Doctor en Ciencias, U de G
Profesor Investigador Titular A,
Instituto de Enfermedades
Crónico-Degenerativas. CUCS, U de G
MERCEDES GONZÁLEZ HITA
Químico Farmacobiólogo, Universidad Nacional
Autónoma de México (UNAM)
Maestría en Nutrición y Metabolismo,
Massachusetts Institute of Technology
Doctorado en Bioquímica, Massachusetts
Institute of Technology
Profesora perfil PROMEP
Cuerpo Académico de Estudio
Multidisciplinario de Enfermedades
Crónico Degenerativas, UDG-CA-533
Profesora Investigadora Titular C de
Bioquímica, CUCS, U de G
Perfil PROMEP
MARÍA DE LOURDES ISAAC VIRGEN
Doctora en Ciencias. Maestría en Nutrición
Química Farmacobióloga, Médica en
Veterinaria y Zootecnista, U de G
Profesora Investigadora Titular C, Departamento
de Biología Molecular y Genómica,
División de Ciencias Básicas. CUCS, U de G
Perfil PROMEP
Miembro del Sistema Nacional de
Investigadores (SNI-1)
IRMA NOEMÍ LÚA RAMÍREZ
Química Farmacobióloga, Universidad
de Guadalajara (U de G)
Académica del Departamento de Biología
Molecular y Genómica, Laboratorio
de Bioquímica. CUCS, U de G
Maestría en Metodología de la Enseñanza, U de G
CARMEN MAGDALENA GURROLA DÍAZ
Química Farmacobióloga, Maestría en Ciencias
Biomédicas, Especialidad en Genética Humana,
Universidad de Guadalajara (U de G)
Doctora en Ciencias, Universidad Ruprecht-Karls
de Heidelberg, Alemania
Profesora Investigadora Titular B,
Instituto de Enfermedades
Crónico-Degenerativas, CUCS, U de G
BEATRIZ TERESITA MARTÍN MÁRQUEZ
Química Farmacobióloga, Universidad
de Guadalajara (U de G)
Profesora Investigadora Asociada B.
CUCS, U de G
Maestría en Ciencias Biomédicas con
Orientación en Inmunología, U de G
PATRICIA HEREDIA CHÁVEZ
Química Farmacobióloga, Universidad
de Guadalajara (U de G)
Especialidad de Docencia en el Área de Bioquímica,
Universidad Autónoma de Aguascalientes
Especialidad en Docencia Universitaria,
Universidad del Valle de Atemajac
Maestría en Investigación en Ciencias
de la Educación, U de G
Académica del Departamento de Biología
Molecular y Genómica, Laboratorio
de Bioquímica. CUCS, U de G
MARTHA LETICIA ORNELAS ARANA
Médica Cirujana y Partera, Universidad
de Guadalajara (U de G)
Doctorado en Genética Humana
Miembro del Cuerpo Académico
de Enfermedades Metabólicas
CA-27, U de G
Profesor Docente Asociado B
Perfil PROMEP
v
vi
Colaboradores
GUILLERMO PÉREZ GARCÍA
Médico Cirujano y Partero, Universidad
de Guadalajara (U de G)
Doctorado en Genética Humana
Jefe del Laboratorio de Bioquímica.
CUCS, U de G
Miembro del Cuerpo Académico
de Enfermedades Metabólicas
CA-27, U de G
Profesor docente titular C
Perfil PROMEP
IRMA RAMOS RODRÍGUEZ
Química Farmacobióloga, Universidad
de Guadalajara (U de G)
Licenciada en Nutrición, U de G
Doctora en Ciencias de la Salud
en el Trabajo, U de G
Académica del Departamento de Biología
Molecular y Genómica. Laboratorio
de Bioquímica, CUCS, U de G
MERCEDES ROMERO GÓMEZ
Química Farmacobióloga, Universidad
de Guadalajara (U de G)
Académica del Departamento de Biología
Molecular y Genómica. Laboratorio
de Bioquímica. CUCS, U de G
Miembro del Cuerpo Académico
de Enfermedades Metabólicas
CA-27, U de G
MARÍA ROSALBA RUIZ MEJÍA
Cirujana Dentista, Universidad
de Guadalajara (U de G)
Maestría en Salud Pública, U de G
Profesora perfil PROMEP
Coordinadora de Docencia del Departamento
de Biología Molecular y Genómica
Profesora Docente Titular. CUCS, U de G
SONIA URIBE LUNA
Profesora Investigadora. Departamento
de Clínicas Quirúrgicas, Instituto de
Oftalmología y Ciencias
Visuales. CUCS, U de G
Doctora en Ciencias con especialidad
en Microbiología, Escuela Nacional
de Ciencias Biológicas del Instituto
Politécnico Nacional (IPN)
Perfil PROMEP
Acerca de los autores
El doctor Sergio Sánchez Enríquez es médico cirujano y
partero. Cuenta con una especialidad en ortopedia y traumatología, una maestría en farmacología y un doctorado
en biología molecular en medicina, todos ellos por la Universidad de Guadalajara (U de G). Entre los cursos que
ha impartido se cuentan los de fisiología humana, farmacología humana, terapéutica farmacológica, bioquímica
y bioquímica clínica. Actualmente es Profesor Investigador Titular “C”, en el Centro Universitario de Ciencias
de la Salud (CUCS), U de G. Tiene Perfil PROMEP y es
miembro del Sistema Nacional de Investigadores (SNI-I).
Responsable del Cuerpo Académico consolidado UDGCA-533 de Estudio multidisciplinario de las Enfermedades Crónico-Degenerativas.
El doctor Luis Javier Flores Alvarado es médico, cirujano y partero, por la Facultad de Medicina de la U de
G. Tiene una maestría en Ciencias, con especialidad en
biología celular, por el Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados. Es Profesor Investigador Titular “C”, en
el CUCS, U de G. Posee perfil PROMEP y es miembro
del Sistema Nacional de Investigadores (SNI-I). Ha tomado cursos de farmacología molecular, errores innatos
del metabolismo y métodos diagnósticos de las enfermedades por atesoramiento de glucógeno. Entre los cursos
que ha impartido se cuentan los de bioquímica avanzada
y fisiopatología molecular para estudiantes del doctorado
en Farmacología. Es profesor del curso de Estructura y
función celular.
La doctora Carmen Magdalena Gurrola Díaz es Química Farmacobióloga y tiene maestría en Ciencias Biomédicas, con especialidad en Genética Humana, por la
U de G. Tiene doctorado en Ciencias, por la Universidad
Ruprecht-Karls de Heidelberg, Alemania. Actualmente es Profesora Investigadora Titular “C”, en el CUCS,
U de G. Tiene perfil PROMEP y es miembro del Sistema
Nacional de Investigadores (SNI-I), así como del Instituto de Enfermedades Crónico-Degenerativas.
La doctora Patricia Heredia Chávez es Química
Farmacobióloga por la U de G. Tiene especialidad de
Docencia en el área de Bioquímica, por la Universidad
Autónoma de Aguascalientes, y especialidad en Docencia
Universitaria por la Universidad del Valle de Atemajac.
Tiene también Maestría en Investigación en Ciencias de
la Educación, por la U de G.
vii
Contenido
Colaboradores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
v
Práctica 5. Regulación no específica
de la actividad enzimática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Acerca de los autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
Prólogo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
x
Presentación del manual. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
Guía del estudiante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
Diagrama de flujo para la elaboración
del caso integrador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
Normas de seguridad en el laboratorio. . . . . . . . . . . . .
4
Acciones que se deben tomar en caso
de accidente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Recomendaciones para tener éxito
en las prácticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5
Práctica 1. Normas de bioseguridad y manejo
de muestras biológicas, material, equipo
y procedimientos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
7
• Irma Noemí Lúa Ramírez
• Carmen Magdalena Gurrola Díaz
• Patricia Heredia Chávez
• Sergio Sánchez Enríquez
Práctica 6. Metabolismo de carbohidratos. . . . . . . . . . 47
• Sergio Sánchez Enríquez
• Mercedes Elvira González Hita
• Luis Javier Flores Alvarado
Práctica 7. Metabolismo de lípidos . . . . . . . . . . . . . . . 57
• Patricia Heredia Chávez
• Irma Ramos Rodríguez
• Mercedes Elvira González Hita
• Sergio Sánchez Enríquez
4
Práctica 8. Metabolismo de compuestos
nitrogenados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
• Irma Noemí Lúa Ramírez
• María Rosalba Ruiz Mejía
• Beatriz Teresita Martín Márquez
• Luis Javier Flores Alvarado
• Sergio Sánchez Enríquez
• Mercedes Romero Gómez
• María de Lourdes Isaac
• Virgen Luis Huacuja Ruiz
• Irma Ramos Rodríguez
• Martha Leticia Ornelas Arana
• Guillermo Pérez García
Práctica 9. Extracción de DNA de células
vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
• Sonia Uribe Luna
• Irma Noemí Lúa Ramírez
• María Rosalba Ruiz Mejía
• Mercedes Romero Gómez
• Sergio Sánchez Enríquez
Práctica 2. Agua y soluciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
• Mercedes Romero Gómez
• María de Lourdes Isaac Virgen
• Luis Huacuja Ruiz
• Irma Ramos Rodríguez
• Sergio Sánchez Enríquez
Apéndices
1. Definición de prefijos, unidades
y constantes físicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
Práctica 3. pH y amortiguadores . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
• Sonia Uribe Luna
• Sonia Uribe Luna
• Patricia Heredia Chávez
• Sergio Sánchez Enríquez
• Pedro Garzón de la Mora
2. Constantes biológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
• Mercedes Romero Gómez
3. Determinación del gasto energético diario (GED). . . 81
• Sergio Sánchez Enríquez
• Patricia Heredia Chávez
Práctica 4. Aminoácidos y proteínas . . . . . . . . . . . . . . 29
• Carmen Magdalena Gurrola Díaz
• María de Lourdes Isaac Virgen
• Sergio Sánchez Enríquez
4. Historia clínica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
• Sergio Sánchez Enríquez
ix
Prólogo
La Universidad de Guadalajara, y en particular el Centro Universitario de Ciencias de la Salud, han hecho un
enorme esfuerzo para que los alumnos involucrados en
el proceso de enseñanza-aprendizaje relacionado con
las ciencias básicas impartidas, tengan en sus manos las
herramientas necesarias para entender y comprender
una de las materias más importantes en su formación:
la Bioquímica. Este Manual de prácticas de Laboratorio
de bioquímica conducirá a nuestros alumnos al interior
de la mayor parte de conceptos de bioquímica en sus aspectos fundamentales. Así, es evidente que este manual
complementará los conocimientos que serán impartidos
en el aula de manera teórica, fundamentados en la experiencia de maestros de bioquímica que han impartido
dicha asignatura por muchos años.
La metodología utilizada y fundamentada en este
Manual de prácticas permite de manera sencilla, pero al
mismo tiempo científica y validable, que el alumno navegue por experimentos y reacciones que sin duda alguna
lo llevarán a preguntarse de qué manera podrá aplicar
estos conocimientos, obtenidos en un salón de laboratorio, más tarde en su carrera profesional. De tal manera,
estudiantes de las carreras de medicina, odontología, nutrición, enfermería, cultura física y del deporte, y técnicos
superiores en radiología e imagen, encontrarán en este
Manual de prácticas un recurso didáctico y aplicativo importante para el desarrollo de un ejercicio intelectual que
encontrará su nicho de aplicabilidad no sólo durante su
estancia en nuestro Centro Universitario de Ciencias de
la Salud, sino tal vez más allá de su entorno.
Los autores de este manual de prácticas, pertenecientes a la Academia de Bioquímica, han hecho un esfuerzo honesto y auténtico para que nuestros alumnos de
Bioquímica “aprendan a no temerle” más al proceso de
aprendizaje de la Bioquímica. Que aprendan a entender
que los procesos metabólicos, y que las reacciones interiorizadas en cada célula de nuestro cuerpo, son más luminosas y fáciles de entender de lo que aparentan.
Dr. en C. Juan Armendáriz Borunda
x
Presentación del manual
El presente Manual de prácticas de bioquímica se ha diseñado para realizar actividades en el laboratorio y extra-aula con el fin de que cada uno de los estudiantes de
Ciencias de la Salud fortalezca o adquiera nuevas habilidades y conocimientos de Bioquímica con experiencias
propias o cercanas a ellos.
En el Manual de prácticas se contemplan tres aspectos a desarrollar:
res o diabetes. A lo largo del curso práctico se evalúan parámetros antropométricos y bioquímicos que presentan
una correlación integral. El análisis y la interpretación
de estos datos en su conjunto representan el Caso integrador del Programa por Competencias de Bioquímica.
Por ello, los esfuerzos de profesores y estudiantes deben
encaminarse a la recolección, el análisis de los datos y
la interpretación de los resultados, para concluir con el
Seminario de Integración Metabólica.
Teniendo como meta la elaboración del Caso integrador que refleje el aprendizaje obtenido, se invita a los
estudiantes a participar y cooperar en el desarrollo de
cada una de las prácticas. En la Guía del estudiante de este
manual se encuentran la programación y las condiciones
en que el alumno debe asistir a su toma de muestra. Esta
experiencia permite al participante y a sus compañeros
contar con el material biológico apropiado para la realización de las prácticas.
El estudiante tiene la vivencia de ser un paciente, lo
que le permite identificar y valorar los obstáculos que podrían afectar el éxito de un diagnóstico. Esta actividad
también permite sensibilizar al estudiante para que desarrolle habilidades, al solicitar que un paciente se incorpore a un régimen nutricional y modifique su actividad
física, sus actitudes o sus hábitos nocivos.
Al concluir la asignatura de Bioquímica, el estudiante tendrá las bases para continuar con su programa
formativo y habrá adquirido nuevas actitudes y valores
requeridos en un profesional de Ciencias de la Salud.
Los profesores, los técnicos, los instructores y el personal administrativo de la Academia de Bioquímica dan
la bienvenida a los estudiantes y les ofrecen su mejor disposición para que tengan una productiva estancia en el
laboratorio de Bioquímica.
• Empleo de equipo e introducción a los conceptos
básicos del laboratorio de Bioquímica.
• Ejecución de experimentos que manifiestan las
propiedades estructurales y químicas del agua y
diferentes biomoléculas.
• Fundamentos del análisis bioquímico, su aplicación en la clínica e integración metabólica.
Las prácticas se desarrollan en concordancia con el
programa de estudios por competencias, teniendo como
eje conceptual la relación del hombre con su medio nutricio.
Por ello, en la programación de las prácticas se ha
considerado que cada una debe representar la actividad
integradora de cada unidad. Con el fin de reforzar los
conocimientos adquiridos, en cada práctica se incluyen
actividades de aprendizaje, en las que el estudiante debe
realizar una investigación bibliográfica que sustente la
respuesta dada a la actividad correspondiente.
Con el fin de evitar un aprendizaje fragmentado de
la bioquímica y facilitar la integración del metabolismo de los nutrientes, las muestras biológicas deben obtenerse de los alumnos, bajo condiciones específicas. Para
ello, se requiere la participación de estudiantes que presenten sobrepeso, presión arterial elevada, antecedentes
familiares relacionados con enfermedades cardiovascula-
1
Guía del estudiante
3. En la Práctica núm. 6 se tomará sangre en ayuno de
A continuación se describe el proceso para desarrollar el
ejercicio de la integración metabólica. Asimismo, para
una mejor comprensión, se acompaña de un diagrama
de flujo.
12 horas, así como a los 30 y 90 min después de un
desayuno habitual, a los tres estudiantes con predisposición de desarrollar diabetes mellitus. La sangre se
centrifugará para la obtención de plasmasuero.
La determinación de la glucosa deberá realizarse
dentro de los 90 min de haberse tomado la muestra,
por lo que se recomienda que se extraiga la muestra
de sangre y tome su desayuno antes de iniciar con
la explicación de la práctica. En caso de que no se
hubiese logrado determinar la glucosa posprandial
en la sesión de la Práctica núm. 6, determinarla en la
Práctica núm. 7.
Si la glucemia posprandial está por arriba de
160 mgdl, se recomendará al estudiante repetir su
análisis en un laboratorio particular y solicitar una
consulta médica.
A partir de esta fecha, los estudiantes en estudio
iniciarán una dieta, indicada por un nutriólogo de la
Unidad de Síndrome Metabólico del Laboratorio de
Bioquímica (Departamento de Bioquímica y Genómica del CUCS), y 30 min de actividad física diaria
(caminata).
En otra ciudad:
1. El estudiante realizará como actividades prelimina-
res lo siguiente:
a) El llenado de las actividades extra-aula, que se
encuentra en la Práctica núm. 6 (Metabolismo de
carbohidratos) y deberá completarse dos semanas
antes de su realización.
El registro tendrá la siguiente información:
•
•
•
•
•
•
•
•
Edad
Peso
Estatura
Índice de masa corporal (IMC)
Diámetro de cintura
Porcentaje de grasa por bioimpedancia
Presión arterial
Factores de riesgo para diabetes
mellitus tipo 2
Con excepción de la presión arterial y el porcentaje de grasa, los cuales se determinarán durante la Práctica núm. 6, todos los demás datos
serán obtenidos por el estudiante.
Nota: la forma apropiada para obtener
cada uno de los datos se indica en la Práctica
núm. 6.
4. En la Práctica núm. 7 se tomarán muestras de sangre
(ayuno de 12 horas) a los estudiantes sometidos a
dieta y actividad física para la obtención de plasma
suero. Se determinarán colesterol, triacilgliceroles y
c-HDL de las muestras. Se integrarán los resultados
de esta práctica con los de la glucemia determinada
en la Práctica núm. 6, para determinar si el estudiante presenta síndrome metabólico o está en riesgo de
padecerlo.
b) El estudiante también llenará la información so-
bre sus antecedentes familiares de padecer diabetes mellitus. Los datos provendrán de al menos
tres familiares directos entre 18 y 55 años de edad,
en el siguiente orden de prioridad: padre, madre,
hermanos, abuelos y tíos.
La información será recabada para completar el registro localizado en la Actividad extra-aula de la Práctica núm. 6.
5. En la Práctica núm. 8 se determinarán los compues-
tos nitrogenados de las muestras. Se compararán los
resultados para conocer si existe una relación entre
los valores encontrados en las prácticas previas.
2. El profesor revisará la información solicitada en el
punto anterior dos semanas antes de realizar la Práctica núm. 6 y seleccionará a tres estudiantes, entre 18
y 35 años, que presenten factores de riesgo de diabetes mellitus.
6. Se recopilarán todos los datos para llevar a cabo un
análisis de los mismos y presentarlos en el Seminario
de Integración Metabólica.
2
Diagrama de flujo para la elaboración del caso integrador
Actividad extra-aula
1
a. Llenar la información clínica y antropométrica del estudiante, siguiendo las
instrucciones de la Práctica núm. 6.
b. Incluir la información de los antecedentes familiares.
Actividad preliminar para la Práctica núm. 6
2
a. Determinar el porcentaje de grasa empleando la báscula de
bioimpedancia.
b. Determinar el IMC.
c. Determinar el riesgo de desarrollar diabetes mellitus tipo 2.
d. Determinar la predisposición al desarrollo del síndrome
metabólico.
e. El profesor seleccionará con dos semanas de anticipación a
tres estudiantes con predisposición a desarrollar síndrome
metabólico y les dará indicaciones para la toma de muestras.
Actividad de la Práctica núm. 6
3
a. Obtener suero o plasma en ayuno de 12 horas.
b. Inmediatamente después de la toma de muestra el estudiante
ingerirá su desayuno habitual.
c. Determinar glucosa basal y posprandial a los 30 y 90 min.
Si los valores a los 90 min se encuentran por arriba de 160
mgdl, realizar recomendaciones al estudiante.
d. Iniciar una dieta adecuada recomendada por un nutriólogo y
30 min de caminata diaria. Mantener dieta y ejercicio por 15
días.
Actividad de la Práctica núm. 7
4
a. Obtener muestra de sangre en ayuno de 12 horas de los estudiantes que se
encuentren bajo una dieta balanceada y ejercicio.
b. Determinar glucosa, lípidos y triacilgliceroles.
Actividad de la Práctica núm. 8
5
a. Determinar la concentración de los compuestos nitrogenados de las muestras
basales, posprandiales y después de dieta y ejercicio.
b. Recabar la información de todos los datos obtenidos.
Seminario de Integración Metabólica
Presentación del CASO INTEGRADOR.
6
Normas de seguridad
en el laboratorio
El funcionamiento correcto del laboratorio está sujeto al
cumplimiento de las siguientes normas:
11. Evitar agregar agua sobre ácidos para prevenir que-
maduras por proyección. Para diluir cualquier ácido,
se vierte el ácido sobre el agua y nunca agua sobre
ácido. Emplear baño de hielo o baño de agua fría
para preparar soluciones diluidas de ácidos.
1. El alumno ingresará al laboratorio con bata, la cual
debe ser blanca y de manga larga. Es indispensable
portar la bata abotonada y guardar el comportamiento apropiado durante la estancia en el laboratorio.
12. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar
2. El alumno se familiarizará con los sitios en donde se
13. Depositar en los recipientes apropiados las puntillas
derrames.
encuentran localizadas las regaderas, extinguidores,
botes de basura, caja para material punzocortante,
bolsa roja para desecho de material biológico, etc. El
material punzocortante y desechos biológicos deberán depositarse en los contenedores correspondientes.
y lavar las pipetas inmediatamente.
14. Utilizar guantes desechables cuando se manejen
muestras biológicas. Considerar que cualquier material biológico es potencialmente infeccioso aun cuando proceda de personas aparentemente sanas.
3. En ningún momento se permitirá la aplicación de
15. Lavarse las manos con agua y jabón antes de salir del
cosméticos, fumar yo ingerir alimentos dentro del
laboratorio.
laboratorio.
16. Reportar inmediatamente al profesor del laboratorio
4. Tomar la postura más cómoda para trabajar correc-
cualquier accidente o lesión que suceda para que se
tomen las medidas apropiadas.
tamente con el fin de tener el control y precisión de
los movimientos durante el uso de materiales, equipos y reactivos.
Acciones a tomar
en caso de accidente
5. Limpiar las mesas de trabajo antes y después de cada
práctica, así también durante la práctica si se ha derramado algún reactivo o muestra biológica.
1. En caso de que exista contacto de ácidos o bases con
6. Para evitar quemaduras, se deberán apagar mecheros
la piel, ojos o boca. Se recomienda enjuagar el área
con abundante agua con el propósito de disminuir su
acción por dilución; para ello en el laboratorio existen las tarjas, regaderas especiales y lavaojos.
yo planchas calientes cuando éstos no se utilicen.
Así también, se deberán emplear gradillas o pinzas
para sostener o transportar tubos calientes.
7. Mantener las sustancias químicas inflamables aleja-
2. En caso necesario llamar inmediatamente a los telé-
das de fuego, planchas calientes, o ambos.
fonos de urgencias en Guadalajara: 066; Cruz Roja
(3613-1550, 3614-2707 y 3614-5600); Cruz Verde
(3614-5252, 3613-1572, 3812-5143 y 3643-7190).
8. No se deberá olfatear yo probar reactivos o solu-
ciones. No se debe mirar nunca el interior de un tubo
de ensayo que se esté calentando, ni apuntar hacia
alguna persona porque el contenido podría proyectarse en cualquier momento. La misma precaución
debe tomarse cuando se mezclen reactivos o se agiten
vigorosamente los tubos.
En otra ciudad:
9. Utilizar guantes de látex y gafas de seguridad cuando
se manejen ácidos, hielo seco o sustancias desconocidas.
3. En caso de ingestión de corrosivos NUNCA provo-
car vómito. Si existe ingestión de ácidos hacer beber
inmediatamente una solución de bicarbonato de sodio (2 cucharadas soperas en 2 vasos de agua); en
10. Utilizar pipetores o perilla de goma para la medición
de los líquidos corrosivos, ácidos, bases, sustancias
volátiles, venenos, entre otros. No aspirar con la boca.
4
caso de ingestión de soluciones cáusticas (hidróxido
de sodio o de potasio) ingerir una cucharada de vinagre o 25 ml de jugo de limón en agua.
4. Al ingerir otras sustancias químicas hacer vomitar a
la persona accidentada. Vigilar que exista una ventilación adecuada y mantener las vías aéreas permeables mientras se traslada al hospital.
5. Si hay derramamiento de un ácido, neutralizar agre-
gando bicarbonato de sodio y en caso de bases agregar
ácido acético (vinagre). NUNCA tratar de adicionar
agua. Emplear bata, guantes y gafas durante la limpieza.
2. Los útiles y objetos personales deberán ser colocados
en la parte inferior de las mesas de trabajo.
3. El material con el que se trabajará deberá estar per-
fectamente limpio antes y después de la práctica.
4. Antes de preparar las mezclas de reacción etiquetará
apropiadamente cada uno de los tubos con marcador
indeleble.
5. Por ningún motivo alterar el orden de adición de
reactivos en la práctica.
6. Utilizar agua destilada en todos los experimentos en
los que se solicite agregar agua.
7. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar
Recomendaciones para
tener éxito en las prácticas
1. El alumno leerá la práctica completa y la discutirá
con el profesor antes de la realización de la misma.
contaminación yo vaporización de los mismos.
8. Utilizar sólo la cantidad requerida de reactivos para
evitar el desperdicio de los mismos.
9. Procurar no regresar excedentes de reactivo al frasco
de donde se extrajo el mismo.
Práctica
Normas de bioseguridad y manejo
de muestras biológicas, material,
equipo y procedimientos
• Mercedes Romero Gómez
• María de Lourdes Isaac Virgen
• Luis Huacuja Ruiz
Normas de bioseguridad general
a) Mantener el lugar de trabajo en condiciones higiéni-
cas y aseadas.
b) Evitar maquillarse, fumar, comer o beber en el sitio
de trabajo.
c) No guardar alimentos en los equipos donde se refri-
geran sustancias contaminantes o químicas.
• Irma Ramos Rodríguez
• Martha Leticia Ornelas Arana
• Guillermo Pérez García
n) Evitar el cambio de los elementos punzocortantes de
un recipiente a otro.
o) Evitar el reciclaje de material contaminado, como
agujas, jeringas u hojas de bisturí.
p) Desinfectar y limpiar las superficies y los equipos de
trabajo, en caso de contaminación.
q) En caso de que se rompa material de vidrio contami-
d) Manejar a todo paciente como si pudiera estar in-
fectado.
e) Lavarse con cuidado las manos antes y después de
f)
g)
h)
i)
j)
k)
l)
m)
cada procedimiento.
Utilizar de forma sistemática guantes plásticos o de
látex en procedimientos en que se manipulan sustancias biológicas, se maneja instrumental o equipo contaminado en la atención de los pacientes, o en ambas
situaciones.
Abstenerse de tocar con las manos enguantadas alguna parte del cuerpo y de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento.
Emplear mascarilla y protectores oculares durante
procedimientos que puedan generar salpicaduras,
gotitas aerosoles de sangre u otros líquidos corporales.
Usar bata durante la estancia en el laboratorio.
Mantener los elementos de protección personal en
condiciones óptimas de aseo, en un lugar seguro y
de fácil acceso.
Si se tienen lesiones exudativas o dermatitis serosas,
evitar la atención directa de pacientes hasta que éstas
hayan desaparecido.
Utilizar las técnicas correctas en la realización de
todo procedimiento.
Manejar con estricta precaución los elementos punzocortantes y desecharlos en los recipientes indicados, a prueba de perforaciones.
1
r)
s)
t)
u)
v)
w)
nado con sangre u otro líquido corporal, recoger los
trozos con escoba y recogedor (nunca con las manos)
y depositarlos en el contenedor para punzocortantes.
Los recipientes para transporte de muestras deben
ser de material irrompible y contar con cierre hermético (tapón de rosca).
Manipular, transportar y enviar las muestras en recipientes seguros, con tapa y rotulación adecuada.
A su vez, transportar las gradillas en recipientes herméticos, de plástico o acrílico, que retengan fugas o
derrames accidentales. Además, deben ofrecer facilidad de lavado.
Restringir el ingreso a las áreas de alto riesgo biológico a personal no autorizado, a quien no utilice los
elementos de protección personal y a los niños.
Disponer el material patógeno en bolsas resistentes,
de color rojo, que se identifiquen con el símbolo de
riesgo biológico.
Las personas sometidas a tratamiento con inmunodepresores no deben trabajar en áreas de riesgo biológico.
Medidas generales de protección
a) Lavarse las manos con frecuencia y al quitarse los
guantes.
b) Usar guantes cuando se manejen líquidos biológicos.
c) Establecer y respetar áreas sucias y áreas limpias.
8
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
d) No tocar las áreas sin contaminación con guantes
e)
f)
g)
h)
i)
j)
contaminados.
Utilizar el pipetor para aspirar sustancias corrosivas
a través de la pipeta.
Ingresar sin maquillaje al laboratorio.
Es riesgoso consumir alimentos o masticar chicle en
las áreas de trabajo.
No fumar en las áreas de trabajo.
No tapar de nuevo las agujas.
Depositar los objetos punzocortantes en los contenedores adecuados.
Lavado de manos
El lavado de manos es el método más eficaz para prevenir
y evitar infecciones. Debe realizarse:
a) Cuando exista contaminación de sangre o líquidos
corporales.
b) Después de completar la práctica y antes de abando-
nar el área de trabajo.
c) Cuando se hayan quitado los guantes.
d) Antes de comer, beber, aplicarse maquillaje, cambiar-
se lentes de contacto.
e) Antes y después de ir al baño.
Método del lavado de manos
a) Abrir la llave del agua.
b) Usar una cantidad generosa de jabón no abrasivo.
c) Tallar bien todas las superficies de las manos, cuando
d)
e)
f)
g)
h)
i)
j)
menos durante 10 segundos.
Limpiar bien abajo y alrededor de las uñas.
Enjuagar con las manos hacia abajo.
Evitar las salpicaduras.
Secarse bien con toallas de papel.
Cerrar la llave utilizando una toalla de papel.
Tirar la toalla en un cesto con bolsa negra.
Utilizar una crema para evitar resequedad o irritación.
Medidas de seguridad para
el manejo de muestras biológicas
Introducción
Las medidas de seguridad son muy importantes para la
persona que toma muestras biológicas, porque su manejo
conlleva el riesgo de transmisión de una gran cantidad de
infecciones, como hepatitis y VIH, por mencionar algunas. Por este motivo, se debe considerar que todo paciente
al que se le tome una muestra biológica puede estar infectado. Las normas deben aplicarse para todos los pacientes, sin importar el diagnóstico.
Las medidas que se tomen deben permitir que el
personal trabaje en un entorno físico seguro, y que éste
conozca los riesgos y las medidas de protección adecua-
das, según las normas oficiales mexicanas NOM-017STPS-2008 (equipo de protección personal) y NOM087-ECOL-SSA1-2002 [manejo de residuos peligrosos
biológico-infecciosos (RPBI]).
Equipo de protección
a) Bata. Que sea de manga larga y algodón; mantenerla
cerrada para protegerse de salpicaduras.
b) Guantes. Usarlos durante la práctica; deben ajustarse
bien. En caso de que se rompan, reemplazarlos con
unos nuevos.
c) Cubrebocas. Utilizarlo en áreas donde se produzcan
salpicaduras o aerosoles.
d) Lentes de seguridad. Usarlos en áreas donde se produzcan salpicaduras o aerosoles.
Limpieza del área
y el material de trabajo
a) El área y el material de trabajo deben mantenerse
limpios y libres de contaminantes.
b) El material de desecho debe colocarse en los conte-
nedores especiales.
c) En caso de derrames de líquidos biológicos, debe ab-
sorberse el derrame con toallas de papel y desecharse
en el contenedor adecuado.
d) Desinfectar el sitio del derrame con una solución de
hipoclorito de sodio a 5% en dilución 1:10; dejar 30
minutos, absorber con toallas de papel y lavar con
agua para quitar el olor.
Obtención y manejo
de muestras biológicas
Introducción
En las prácticas del laboratorio de bioquímica se realizan
algunas pruebas analíticas en muestras de sangre, orina, o
ambas. Estas pruebas se realizan con el fin de desarrollar
habilidades formativas y aplicar los conocimientos teóricos en el laboratorio.
Es importante saber cómo obtener y manejar las
muestras biológicas para llegar a resultados confiables,
además de conocer las medidas de seguridad que deben
poner en práctica las personas que obtienen las muestras
y de las que se obtienen éstas.
También es importante conocer el aspecto ético en la
toma de una muestra biológica.
Aspectos éticos
Debe informarse a la persona que se planea obtener una
muestra, el tipo de ésta, las pruebas que se realizan con
ellas, y los resultados esperados y obtenidos.
Práctica 1. Normas de bioseguridad y manejo de muestras biológicas, material, equipo y procedimientos
Es importante obtener el consentimiento de esta
persona. El tipo de consentimiento puede ser verbal o
escrito, de acuerdo con los objetivos. En caso de que se
pretenda conocer el estado de salud, puede ser verbal.
Si es con fines de investigación, el consentimiento debe
exponerse por escrito, indicando el procedimiento y las
repercusiones que puede tener para su persona (sobre
todo si es una muestra para análisis del DNA o identificación de VIH), y la hoja de aceptación debe tener firma
de consentimiento.
A
B
C
D
E
F
9
Toma de sangre
Composición de la sangre
El corazón y los vasos sanguíneos de un adulto contienen
casi 5 litros de sangre. Ésta se compone de células suspendidas en un líquido llamado plasma. El color de la sangre
se debe a los eritrocitos (glóbulos rojos), que contienen el
pigmento hemo; también hay leucocitos (glóbulos blancos) y trombocitos (plaquetas).
Suero y plasma
Cuando se extrae sangre y se deja reposar en un recipiente
de vidrio por algunos minutos, ésta se coagula, debido
a la precipitación de una proteína plasmática a la que
se le denomina fibrinógeno, que forma hebras de fibrina
insoluble. Las células sanguíneas quedan atrapadas en
una red de fibrina que poco a poco se contrae y libera
un líquido llamado suero. Éste no contiene fibrinógeno
ni algunos factores de la coagulación, porque se han consumido durante la formación del coágulo. El plasma, a
diferencia del suero, sí contiene factores de coagulación;
es posible obtener plasma, si el tubo donde se recolecta la
sangre tiene un anticoagulante.
Obtención de sangre
Cuando se requiere una cantidad pequeña de sangre, puede obtenerse puncionando la piel del dedo o el lóbulo de
la oreja con un instrumento cortante (lanceta). En lactantes, se puede obtener del talón. En primer lugar, se limpia
la piel con alcohol (etanol a 95% v/v) y se deja secar. Se
inserta una lanceta o aguja estéril en la piel, a 1 o 2 mm
de profundidad. La primera gota de sangre que sale de
la herida se limpia con torunda de algodón. Las gotas
siguientes se recogen con un portaobjetos para frotis,
con una pipeta o con algún otro recipiente para pruebas.
Debe obtenerse una cantidad de sangre mayor de 0.5 ml
por venopunción. Por lo general, se prefiere sangre venosa para la mayor parte de exámenes, y es recomendable
obtener una mayor cantidad, en caso de que se necesite
repetir la prueba. Es común que se emplee una vena del
brazo: se aplica un torniquete para bloquear la circulación venosa, se selecciona alguna vena adecuada por su
calibre y prominencia y se limpia la piel con alcohol. Una
Figura 1-1. Técnica para la extracción de sangre de vena
periférica. A, colocación del torniquete. B, antisepsia previa
a la venopunción. C, venopunción y adaptador vacutainer. D,
extracción de la sangre con tubo vacutainer. E, retiro de la
aguja. F, depósito de la muestra de sangre en tubos con anticoagulantes.
vez que el alcohol se ha evaporado, se introduce una aguja
afilada, adaptada a una jeringa de tamaño adecuado y
estéril; enseguida se tira del émbolo de la jeringa para que
la sangre penetre en ésta. En cuanto se ha obtenido una
cantidad suficiente, se libera la presión ejercida sobre el
brazo y se extrae la aguja.
Se aplica una torunda de algodón estéril en el sitio
de la punción y se ejerce presión firme durante medio minuto para evitar escurrimiento de la sangre en los tejidos
circunvecinos. Debe quitarse la aguja de la jeringa antes
de distribuir la sangre en los tubos de ensayo (figura 1-1).
Anticoagulantes
Si se necesita suero, puede verterse la sangre en el interior
de un tubo de ensayo esterilizado. Si se necesita sangre
total o plasma, debe emplearse algún anticoagulante; el
más común para la mayor parte de exámenes es el EDTA
(ácido etilen-diamino-tetra-acético). El citrato de sodio a
3.8% también es un anticoagulante.
La heparina es un anticoagulante antitrombocítico
que se usa en pruebas en que no se desea la eliminación
de iones calcio.
10
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Toma de muestra de orina
para cultivos deben obtenerse por sondeo o aspiración
suprapúbica con aguja.
Varones
Casi siempre, resulta sencillo obtener una muestra de orina limpia a mitad de la micción. De manera sistemática,
pueden proporcionarse instrucciones por escrito o colocarse en la pared del laboratorio. El procedimiento debe
ser el siguiente:
1. Retracción del prepucio (fuente usual de contamina-
ción de la muestra) y aseo del meato con cloruro de
benzalconio o hexaclorofeno.
2. Eliminar la primera parte del chorro (15 a 30 ml).
3. Reunir la siguiente porción (de 50 a 100 ml) en un
recipiente estéril para muestras, que se debe tapar de
inmediato.
4. Vaciar por completo la vejiga en el sanitario. Enseguida se preparará una parte de la muestra para
exámenes macroscópico y microscópico; el resto se
guarda en un recipiente estéril para cultivos posteriores, si son necesarios.
Mujeres
Es casi imposible obtener, sin ayuda, una muestra limpia, satisfactoria, a mitad de la micción. Si la paciente
no está preparada, su orina no resulta útil, a menos que
sea por completo normal. El mejor método para reunir
una muestra limpia a mitad de la micción en mujeres es
el siguiente:
1. Colocar a la paciente en la mesa de exploración, en
posición de litotomía.
2. Asear la vulva y el meato uretral con cloruro de ben-
zalconio o hexaclorofeno.
3. Separar los labios y pedir a la paciente que inicie la
micción en un recipiente que se conserva cerca de la
vulva; una vez que se han eliminado los primeros 10
a 20 ml de orina, reunir los siguientes 50 a 100 ml en
un recipiente estéril, que se tapa de inmediato.
4. A continuación, permitir que la paciente vacíe por
completo la vejiga.
Como esta técnica exige gran esfuerzo, es aceptable
pedir a la paciente que obtenga en el sanitario una muestra inicial en un recipiente no estéril. Si los resultados del
análisis general son normales, no está indicado hacer más
estudios; en caso contrario, hay que obtener una muestra
de orina con una técnica más exacta.
Medidas a seguir en caso
de exposición a líquidos biológicos
Cuando haya exposición a líquidos biológicos (punciones
con aguja contaminada, salpicadura de mucosas, etc.) se
debe avisar al profesor, al técnico responsable del grupo,
o a ambos.
a) Lavar el área afectada con agua abundante.
b) Realizar los siguientes exámenes, tanto a la muestra
contaminada como a la persona afectada:
• Antígenos de superficie contra virus de la hepatitis
B.
• Anticuerpos contra VIH.
• Anticuerpos contra virus de la hepatitis C.
Material, equipo
y procedimientos
Introducción
La aplicación de algunos de los conocimientos teóricos
obtenidos en el salón de clases se logra mediante prácticas de laboratorio en que se requiere familiaridad con la
utilidad y el manejo apropiados del equipo de laboratorio, como espectrofotómetro, centrífuga, potenciómetro,
baños de temperatura constante, placa caliente, agitador
magnético, material de vidrio, etc. Asimismo, el estudiante debe emplear el vocabulario apropiado y los conceptos
de uso común en el laboratorio.
En la figura 1-2 se muestran algunos de los materiales
y equipos más utilizados en el laboratorio.
Objetivo general
Manejar adecuadamente el material y equipo de laboratorio.
Objetivos específicos
Identificar los materiales y equipos de uso común en el
laboratorio.
Utilizar de manera apropiada algunos de los equipos
de laboratorio.
Materiales y equipo
Niños
Obtener muestras satisfactorias de orina en niños pequeños puede representar un desafío. La orina para otros
análisis, como cultivos bacterianos, puede obtenerse de
niños y niñas al cubrir el meato uretral aseado con una
bolsa de plástico; por lo general, las muestras de orina
•
•
•
•
•
Vasos de precipitado
Matraz Erlenmeyer
Matraces aforados de diferentes capacidades
Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml
Micropipetas con puntas
Práctica 1. Normas de bioseguridad y manejo de muestras biológicas, material, equipo y procedimientos
Figura 1-2. Materiales y equipo de
uso frecuente en el laboratorio de bioquímica. A, tubos de ensayo de diferentes capacidades y gradilla. B, matraz aforado. C, matraz Erlenmeyer. D,
probetas de diferente volumen. E, placa caliente. F, agitador eléctrico (vórtex).
A
D
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Probetas
Buretas
Embudos
Tubos de ensayo 13 × 100
Gradillas
Pinzas para tubos
Balanza granataria
Plato caliente
Agitador magnético
Vórtex
Espectrofotómetro
Báscula de bioimpedancia
Centrífuga
Centrifugación
La centrifugación es un método empleado para separar
partículas con base en la velocidad de sedimentación de
cada una de ellas, como resultado de la fuerza centrífuga
a la que se les somete.
Fundamento
Una esfera de masa m y de volumen específico V, que
cae a través de un medio viscoso de densidad ρ, bajo la
influencia de un campo gravitacional, alcanza una velocidad terminal νt. En analogía a la caída libre de una esfera en un campo gravitacional, una molécula (de masa
m y volumen específico parcial V) que sedimenta a través
de un medio viscoso en un campo sometido a la fuerza
centrífuga, alcanza también una velocidad νt. De aquí se
deduce que la aceleración centrífuga ω2x reemplaza la
aceleración gravitacional g. Al cociente de νtω2x, que re-
B
11
C
E
F
presenta la velocidad por unidad de aceleración angular,
se le denomina coeficiente de sedimentación y se le simboliza con s. Su dimensión es (cm · s−2)(cm · s−2) ≡ s.
Una unidad conveniente para s es el Svedberg, llamada así en honor de T. Svedberg, quien fue el precursor en
las investigaciones sobre sedimentación de partículas por
ultracentrifugación. Un Svedberg se define como 10–13 s.
La velocidad y el tiempo con el que se somete una
muestra a centrifugación para separar sus componentes
depende de la distancia que recorren las partículas, además de la viscosidad del medio. Esta distancia se relaciona con la forma y el tamaño del rotor; por ello, en las centrífugas suelen seleccionarse las revoluciones por minuto
(rpm). Debido a que la aceleración angular es diferente a
la lineal, se debe realizar la conversión de una forma a la
otra de acuerdo con la siguiente ecuación:
Vs = ω2 · ref · s
Vs = velocidad de sedimentación (cm · s−1)
ω = velocidad angular (radianes · s−1)
r = radio efectivo (cm)
s = coeficiente de sedimentación S (Svedberg = 10−13 s)
S=
Mr (1 − V · ρ)
f
Mr = masa molecular relativa
V = volumen específico parcial de la partícula
(cm3 × g–1)
ρ = densidad de la solución (g × cm–3)
f = coeficiente friccional
12
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Centrífuga
El equipo empleado para realizar la centrifugación es la
centrífuga. Está compuesta por un motor eléctrico unido
a un dispositivo que gira a gran velocidad alrededor de
un eje vertical, el rotor o corona; provoca el aumento de
atracción gravitacional en el fondo del tubo que contiene
la muestra. El resultado de toda centrifugación es la separación de dos fases: una insoluble, el residuo o precipitado,
y una líquida, el sobrenadante.
El uso adecuado de la centrífuga requiere el seguimiento de estas acciones:
Cuadro 1-1. Características del espectro
UV y la luz visible.
Nombre de
la longitud
de onda
Muestra
absorbida
Región
espectral
absorbida
en nm
Verde azuloso
Rojo
Visible
620 a 700
Azul verdoso
Anaranjado
Visible
600 a 620
Azul
Amarillo
Visible
575 a 600
Violeta
Verde
amarillento
Visible
555 a 575
Púrpura
Verde
Visible
505 a 555
Rojo
Verde
azuloso
Visible
495 a 505
Anaranjado
Azul
verdoso
Visible
475 a 495
Amarillo
Azul
Visible
430 a 475
Verde
amarillento
Violeta
Visible
380 a 430
—
No visible
UV
220 a 380
—
No visible
UV lejana
180 a 220
Color
de la luz
1. En la centrífuga, los tubos deben colocarse por pares,
uno frente al otro, de acuerdo con su peso.
2. Aumentar la velocidad poco a poco, hasta que se al-
cance la velocidad requerida, para no forzar el motor.
3. Permitir que el rotor de la centrífuga se detenga por
su propia inercia, sin tratar de detenerlo con las manos.
4. Levantar la tapa de la centrífuga hasta que el rotor
quede inmóvil por completo.
5. En caso de ruptura de un tubo dentro de la centrífuga, debe hacerse un aseo completo de inmediato,
empleando desinfectantes como cloro y benzal. Debido a la enorme fuerza que puede alcanzar el rotor,
el mal uso de la centrífuga representa un peligro, si
no se utiliza de manera apropiada. En la figura 1-3 se
muestra una centrífuga clínica.
Espectrofotometría
La base de la colorimetría y la espectrofotometría es que
muchas sustancias tienen color propio, o pueden dar lugar a productos finales de color en ciertas reacciones químicas. Hay una relación entre la intensidad del color y la
concentración del producto. Es preciso conocer las leyes
físicas en que se basan los instrumentos de medición.
Espectrofotómetro
A
B
Figura 1-3. A, centrífuga analítica desde su aspecto externo. B, rotor y sitios de inserción de los tubos (la flecha indica
la forma correcta de colocar los pares de tubos).
Se trata de un aparato que sirve para medir la intensidad
de la luz absorbida por una solución en un estrecho intervalo de longitudes de onda del espectro UV visible. Cuanta mayor intensidad de color de una solución, mayor es
la absorción de la luz; por tanto, esa absorción puede
utilizarse como medida directa de la intensidad de color.
La relación entre la concentración de una sustancia y la
absorción se basa en la ley de Beer-Lambert, que enuncia
que la concentración de una sustancia es directamente
proporcional a la cantidad de luz absorbida e inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida
(cuadro 1-1).
Un espectrofotómetro es un dispositivo que posee
una fuente de radiación que se puede dirigir hacia una
muestra. Se espera que ésta absorba parte de la radiación,
que se detecta enseguida mediante un circuito que produce una señal reproducible.
Práctica 1. Normas de bioseguridad y manejo de muestras biológicas, material, equipo y procedimientos
13
Los componentes de un espectrofotómetro son los
siguientes:
1.
2.
3.
4.
5.
Fuente de luz.
Filtro.
Cubeta con la muestra.
Célula fotoeléctrica.
Amplificador y medidor.
La fuente de luz aplica una gran intensidad sobre
una superficie limitada. Algunas muestras deben manejarse con luz ultravioleta o infrarroja; para ello, se utilizan
lámparas con características especiales.
El filtro es un dispositivo que tiene la función de permitir el paso de luz de una longitud de onda específica.
No debe absorber cantidades apreciables de la luz en una
longitud de onda determinada, que debe ser de un color
complementario al de la muestra.
Las cubetas o celdas analíticas suelen ser tubos redondos o rectangulares de espesor constante, de diversos
materiales, como vidrio, cuarzo o plástico.
Una muestra puede presentar una absorbancia de
cero: no absorbe la radiación incidente y, por tanto, transmite 100% de esa radiación. La situación opuesta se tiene con un cuerpo opaco a un intervalo determinado del
espectro electromagnético; en este caso, la transmisión es
nula y la absorción es completa.
La determinación cuantitativa de una sustancia depende de la relación entre la cantidad de radiación absorbida por la muestra problema y la absorbancia de una
sustancia de referencia, con una concentración conocida.
Los espectrofotómetros permiten efectuar la comparación entre la señal obtenida por una mezcla que no
contiene la sustancia en estudio y otra que sí la tiene,
para obtener la señal de esa diferencia. En la figura 1-4 se
muestra un espectrofotómetro de luz visible.
Bioimpedanciometría
Fundamento
Sin entrar en los detalles físicos y matemáticos, que están
más allá del alcance de esta obra, la ley fundamental de
la electricidad que relaciona la impedancia con la intensidad y el voltaje es la ley de Ohm: impedancia = voltaje/
intensidad. Cuando la corriente eléctrica alterna circula
por un medio, la impedancia depende en parte de la facilidad de éste para conducir la corriente, y es proporcional a la resistividad o mala conductividad del medio. Si,
además, el circuito eléctrico contiene condensadores (sistemas de placas separadas por un medio aislante, donde se
acumula una carga eléctrica que se libera cuando el sistema se satura), la impedancia también depende del número de condensadores que tenga que atravesar la corriente
y de la facilidad de carga y descarga de éstos (capacidad).
Al componente de la impedancia (Z) que se debe a la
A
B
Figura 1-4. A, espectrofotómetro de luz visible. B, botón
selector de longitud de onda del espectrofotómetro.
mala conductividad del medio se le denomina resistencia
(R); el componente que se debe a la acción de los condensadores recibe el nombre de reactancia capacitiva (Xc); en
adelante aquí se le denomina tan sólo reactancia.
La ecuación que las relaciona es:
(Z)2 = (R)2 + (Xc)2
La bioimpedancia representa la oposición de un medio biológico al paso de una corriente alterna, y también
cuenta con los componentes de resistencia y reactancia
ya expuestos. La resistencia está condicionada por la
resistividad de los diferentes tejidos a la conducción de
la corriente eléctrica: los tejidos graso y óseo son malos
conductores y la corriente circula mejor por los fluidos
intra y extracelulares, que son soluciones electrolíticas. La
reactancia se debe al efecto aislante de las membranas
celulares, que se comportan como condensadores que se
cargan y descargan al paso de la corriente. En la figura 1-5
se muestra una báscula de bioimpedancia.
Actividades de aprendizaje
1. Leer completas las NOM-017-STPS-2008 y NOM-
087-ECOL-SSA1-2002.
2. Investigar cuál es el símbolo de RPBI.
3. Investigar cuáles son las partes de una centrífuga.
4. Investigar la clasificación de los materiales de vidrio
utilizados en el laboratorio de bioquímica.
14
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Conclusiones
Figura 1-5. Báscula de bioimpedancia. Se utiliza para obtener el porcentaje de grasa corporal.
5. Investigar qué otros métodos se utilizan para cuanti-
ficar el porcentaje y la distribución de grasa corporal.
6. Investigar el espectro completo de la luz (ultravioleta,
visible e infrarroja).
7. Investigar los daños que genera la exposición a luz
ultravioleta.
8. Investigar si la luz ultravioleta se utiliza para el trata-
miento de algunas enfermedades.
Discusión
Bibliografía
William RD. Exámenes urológicos de laboratorio. En: Tanagho
EA, McAninch JW. Urología general de Smith, 10a ed. Editorial El Manual Moderno, 1993:51-63.
WoodLiff HJ, Herrmann RP. Hematología clínica, 1a ed. Editorial El Manual Moderno, 1981.
Práctica
2
Agua y soluciones
• Irma Ramos Rodríguez
• Sergio Sánchez Enríquez
• Mercedes Romero Gómez
• María de Lourdes Isaac Virgen
• Luis Huacuja Ruiz
Introducción
Agua
Las propiedades fisicoquímicas del agua dependen de su
carácter bipolar y de su capacidad para formar puentes
de hidrógeno, lo que le confiere propiedades únicas.
Soluciones homogéneas
Una solución es una mezcla con aspecto homogéneo, formada por uno o más solutos y un solvente; cualesquiera
de ellos puede estar en alguno de los tres estados de la
materia.
El soluto es la sustancia que se disuelve o dispersa
por vía molecular en otra, y el solvente es el compuesto
más abundante.
En una solución, el soluto y el solvente pueden encontrarse como moléculas o como iones. Por ejemplo,
cuando la sacarosa (azúcar común) se disuelve en agua,
la molécula se incorpora por completo en la solución (no
H
O
disociada); por el contrario, cuando el cloruro de sodio
(sal de mesa) se disuelve en agua, se disocia en iones sodio y cloro. En cualquier caso, las moléculas o iones están rodeadas por moléculas de agua (hidratadas), que las
mantienen separadas entre sí, como se representa en la
figura 2-1.
Las propiedades del soluto y el solvente, como la polaridad y el carácter iónico, afectan la solubilidad.
Los factores que afectan la velocidad de disolución
son:
1.
2.
3.
4.
5.
Tamaño de la partícula.
Cantidad de soluto.
Agitación.
Temperatura.
pH.
A la relación entre las cantidades de soluto y solvente
se le denomina concentración. Una solución puede ser no
saturada, saturada o supersaturada, de acuerdo con la
capacidad del solvente para solvatar al soluto.
H
H
O
H
Na
+
H
H
H
O
H
O
H
H
O
H
H
H
O
C1 –
H
O
H
O
O
H
O
H
H
H
H
H
B
O
H
H
C12 H22 O11
H
H
H
A
O
O
O
H
H
H
O
H
Figura 2-1. Representación de la capacidad de solvatación del agua (hidratación). A, molécula de cloruro de sodio disociada
en iones sodio y cloro hidratados. B, hidratación de una molécula de carbohidratos.
16
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Existen varias formas de expresar la concentración
de una solución; las de uso más frecuente son porcentual,
molar y normal. A continuación se describe la forma de
calcular cada una de ellas:
1. Porcentual (%). Representa la proporción del soluto
que se encuentra en una solución utilizando la base
100 expresada en gramos o en mililitros. Existen cuatro diferentes formas para referirse a la concentración porcentual:
• Porcentaje en peso (% pp). Cantidad de g de soluto en 100 g de solución.
• Porcentaje en volumen (% vv). Número de mililitros de soluto en 100 ml de solución.
• Porcentaje en peso-volumen (% pv). Cantidad de
gramos de soluto en 100 ml de solución.
• Porcentaje en moles (% mol). Número de moles de
soluto disueltos en 100 ml de solución.
En ciencias de la salud, las más utilizadas son las
soluciones porcentuales pv (p. ej., ¿cuántos gramos
de NaCl se requieren para preparar 250 ml de solución salina a 1%?).
La resolución de este problema es sencilla, si se
parte de la base de que por cada 100 ml de solución
se requiere 1 g de NaCl (1%), de acuerdo con el planteamiento de la siguiente regla de tres:
1g
100 ml
=
x
250 ml
x = 2.5 g
2. Molar (M). Cantidad de moles de soluto en un litro
de solución.
M=
Moles de soluto
Litro de solución
Mol se define como el peso molecular de una
sustancia expresado en gramos. En el ámbito experimental, este número es igual a 6.022 × 1023 moléculas (número de Avogadro). La masa molecular o
peso molecular (PM) de una sustancia es la suma de
los pesos atómicos de cada uno de sus componentes;
por ejemplo, el PM del ácido sulfúrico (H2SO4) es de
98 gmol, como se describe en el cuadro 2-1.
Para preparar soluciones molares se tiene que hacer el cálculo matemático, que es diferente si el soluto
es un sólido o un líquido. En el primer caso, como
cuando se usa NaOH o NaCl, la pureza es casi de
100% y no se tiene que convertir de gramos a mililitros
con la fórmula de la densidad (ρ = mv). Por tanto,
para saber, por ejemplo, cuántos gramos de NaOH
se requieren para preparar 300 ml de una solución
de esta sustancia a 0.2 M, si el peso molecular del
NaOH es 40 g, se utiliza, en primer lugar, una regla
de tres, para corregir la molaridad (de 1 M a 0.2 M):
Cuadro 2-1. Procedimiento
para calcular el peso molecular.
Átomo
Hidrógeno (H)
Peso
Número de
atómico
átomos en la
(PA)
molécula (NAM)
PA × NAM
1
2
2
Azufre (S)
32
1
32
Oxígeno (O)
16
4
64
Peso molecular (PM)
98
40 g
1M
x
0.2 M
=
x=8g
Por tanto, se necesitan 8 g de NaOH para preparar 1 litro de solución; sin embargo, el volumen que
se desea obtener es de 300 ml, de modo que se aplica
una segunda regla de tres para corregir el volumen:
8g
1L
=
x
0.3 L
x = 2.4 g
Con esto se sabe la cantidad de gramos necesarios para preparar la solución solicitada.
Otra opción consiste en utilizar el análisis bidimensional modificado, utilizando la siguiente ecuación:
g = PM × M × V
g
PM
M
V
= gramos de soluto
= peso molecular del soluto, en gramos
= molaridad
= volumen, en litros.
Al sustituir los valores conocidos, se obtiene:
g = 40 × 0.2 × 0.3
g=8
Con esto se obtiene un resultado igual que con el
procedimiento anterior.
Un caso diferente resulta si el soluto que se va a
utilizar es líquido y, en especial, un ácido que nunca
tiene 100% de pureza. Para esto, puede utilizarse cualesquiera de los procedimiento realizados, pero debe
agregarse la fórmula de densidad para corregir de
gramos a mililitros y una regla de tres adicional para
corregir la pureza. Otra opción consiste en utilizar el
análisis bidimensional, modificando la ecuación de la
siguiente manera:
Práctica 2. Agua y soluciones
ml =
PM × M × V
ml =
m
v=ρ
Al sustituir por sus valores, se debe considerar
que la densidad del H2SO4 es de 1.88 gml.
V=
98 × 0.3 × 0.4
Nota: cuando se prepara una solución de ácido,
nunca se debe poner primero el ácido y luego el agua,
porque se produce una reacción exotérmica que puede proyectar el ácido y quemar. Vale la pena recordar
el aforismo “Nunca le des de beber a un ácido”.
Para preparar de manera correcta esta solución
se coloca primero un poco de agua, después se deposita el ácido, que debe descender por las paredes del
matraz, y luego se vierte agua, una vez más, hasta
alcanzar el volumen deseado.
3. Normal (N). Cantidad de equivalentes químicos de
soluto en un litro de solución:
El equivalente químico (eq) se define como la
capacidad de reacción de un átomo, ion o molécula.
Por ejemplo, al colocar H2SO4 en solución acuosa, la
molécula se disocia en dos hidrogeniones (H+) y un
ion sulfato (SO42−) como se muestra en la siguiente
reacción:
H2SO4 g H+ + H+ + SO42−
En este ejemplo, el equivalente químico en gramos se obtiene al dividir el peso molecular del ácido entre el número de hidrogeniones sustituibles (2),
como se muestra en la siguiente ecuación:
Eq gramo =
PM (98 g ∙ mol)
Hidrogeniones sustituibles (2)
Eq gramo = 49 g de H2SO4
Debido a que el H2SO4 se encuentra en estado
líquido, es necesario convertir los gramos del mismo
a unidades de volumen (ml). Para este fin se usa la
fórmula de la densidad:
ρ=
ρ = densidad
m = masa en gramos
m
v
1.88 gml
Este volumen sería el correcto si el ácido estuviera a 100% de pureza, pero como se encuentra a
98%, se debe hacer la corrección utilizando una regla
de tres:
26.06 ml
x
=
98%
100%
x = 26.6 ml
Este volumen sería adecuado para preparar una
solución a 1 N; si se solicitara una a 0.1 N, habría que
corregir con una regla de tres, de la siguiente manera:
26.6 ml
x
=
1N
0.1 N
x = 2.66 ml
Equivalente químico del soluto
Litro de solución
49 g
Volumen = 26.06 ml
1.71 × 0.85
ml = 8.11
N=
que se despeja de la siguiente manera:
ρ × Proporción de pureza
Por ejemplo, si se quiere saber cuántos mililitros
de la solución stock de H3PO4, con densidad de 1.71
gml y pureza del 85%, hay que extraer para preparar
400 ml de solución de H3PO4 al 0.3 M, se sigue este
procedimiento:
17
Estos 2.66 ml serían correctos si se necesita un
litro; sin embargo, si se solicitan 500 ml, habría que
realizar una última regla de tres:
2.66 ml
x
=
1L
0.5 L
x = 1.33 ml
Otra opción consiste en realizar un análisis bidimensional modificado, que integre todas estas variables en una sola ecuación. Si se continúa con el
mismo caso (preparar 0.5 l de una solución de H2SO4
a 0.1 N, para una pureza de 98%, con densidad de
1.88 gml, y considerando el equivalente químico de
H2SO4 = 49 g), se utiliza la siguiente ecuación:
v=
Eq × N × V
ρ × Proporción de pureza
donde V es el volumen en litros. Al sustituir las variables por su valor, se obtiene:
v=
49 g × 0.1 N × 0.5 L
1.88 gml × 0.98
v = 1.33 ml
Como puede observarse, se obtiene el mismo
resultado con cualquiera de los dos procedimientos.
Por ello, el estudiante tiene la libertad de utilizar el
que más domine.
18
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Propiedades de las soluciones
Las propiedades físicas de las soluciones se dividen en tres
categorías: constitutivas, aditivas y coligativas.
Propiedades constitutivas. Son las que dependen de
manera exclusiva de la naturaleza de las moléculas que la
forman. Son propiedades constitutivas los caracteres ácido, básico, oxidante, reductor, radiactivo, dulce, insípido,
colorido, etcétera.
Propiedades aditivas. Son las que dependen de la
suma de las propiedades correspondientes a los constituyentes de la solución. La única propiedad rigurosamente
aditiva es el peso molecular.
Propiedades coligativas. Son las que dependen del número de moléculas por unidad de volumen (la concentración del soluto). Algunos ejemplos son: punto de fusión,
punto de ebullición, presión de vapor, presión osmótica y
presión oncótica. Estas propiedades tienen un papel relevante en las soluciones biológicas.
traer del stock para preparar la nueva solución, más diluida?
Al sustituir las variables de la ecuación anterior con
sus valores, se tiene:
V1 =
V1 = 0.125 L = 125 ml
Por tanto, se deben medir 125 ml de la solución 2 N
de H2SO4, depositarla en un matraz volumétrico de 500
ml y completar en volumen a la marca de aforo.
Objetivo general
Realizar cálculos para la preparación de soluciones porcentuales, molares y normales. Realizar una curva de
una solución de fenolftaleína utilizando el espectrofotómetro.
Diluciones
Materiales y equipo
En el laboratorio, a menudo es necesario preparar soluciones de trabajo diluidas a partir de reactivos u otras
concentradas. A una misma cantidad de soluto y diferentes cantidades de solvente, la concentración de la solución
es diferente.
Cuando la concentración se expresa sobre una escala
volumétrica, la cantidad de soluto presente en un volumen de solución es igual al producto de la concentración
por el volumen:
Cantidad de soluto = Volumen × Concentración
Al diluir una solución, aumenta el volumen y se reduce la concentración, si se tiene la misma cantidad de
soluto. La relación que existe cuando se preparan dos soluciones con diferente concentración, utilizando la misma
cantidad de soluto, es:
V1 × C 1 = V 2 × C 2
V1
V2
C1
C2
0.5 L × 0.5 N
2N
= volumen inicial
= volumen final
= concentración inicial
= concentración final
Matraz aforado de 100 ml
Tubos de ensayo de 13 × 100
Gradilla para tubos
Pipetas serológicas de 1, 5 y 10 ml
Probeta de 100 ml
Vasos de precipitado de 250 ml
Espectrofotómetro
Soluciones y reactivos
• Agua destilada
• Solución de fenolftaleína a 0.5%
• Solución de etanol a 50%
Desarrollo experimental
Experimento 1
Manejo de concentraciones
por espectrofotometría
Fundamento
Si se conocen tres valores entre la solución conocida y la que se desea preparar se puede calcular el cuarto
parámetro, respetando las mismas unidades para el volumen (ml, L, etc.) y para la concentración (molar, normal).
Al sustituir en la ecuación anterior, se tiene:
V1 =
•
•
•
•
•
•
•
V2 × C2
C1
Por ejemplo, si se desea preparar 500 ml de una solución de H2SO4 a 0.5 N, a partir de una solución stock
que se encuentra a 2 N, ¿qué volumen se necesita ex-
La fenolftaleína con PM de 318.33, en solución alcohólica a 50% y pH de 11.5, se ioniza y produce color violeta
(véase la figura 2-2).
Procedimiento
A partir de una solución almacenada (A) de fenolftaleína
a 0.5%, hacer las siguientes diluciones:
1. Tomar una alícuota de 1 ml y aforar a 100 ml, con la
solución de alcohol a 50% y pH de 11.5 (B), etiquetar
seis tubos de ensayo de 13 × 100 (cuadro 2-2).
2. Leer el espectrofotómetro a una longitud de onda de
530 nm, ajustando a cero con el blanco. Al graficar
19
Práctica 2. Agua y soluciones
O
OH
OH
O
OH
OH
H2O
+
C
C
C
H 3O +
O
C
C
OH
O-
C
O
I
Forma
seudo o normal
(incolora)
O
O
II
Forma
ionogénica
(roja)
III
Ion
(rojo)
Figura 2-2. Fórmula. Reacciones químicas de la fenolftaleína.
los valores de densidad óptica (DO), se obtiene una
línea recta, lo que indica que la DO es directamente
proporcional a la concentración (DO ∝ C).
3. Graficar los valores obtenidos en la práctica (DO
versus concentraciones) en papel milimétrico (cuadro 2-3).
Actividades de aprendizaje
Realizar los cálculos para la preparación de las siguientes
soluciones:
1. Preparar 250 ml de una solución de cloruro de sodio
a 0.9% (pv). Describir los cálculos para conocer la
cantidad de cloruro de sodio que debe pesarse, para
aforarla al volumen deseado.
2. Preparar 500 ml de una solución de ácido fosfórico
(H3PO4) a 0.1 M, tomando como base los siguientes
datos:
Fenolftaleína
1
0.5
4.5
2
1
3
Describir los cálculos hechos para conocer el volumen del ácido fosfórico concentrado que se utilizó
para preparar 500 ml de esa solución.
3. Preparar 500 ml de una solución de NaOH a 0.1 M,
con peso molecular de 40. Describir los cálculos para
saber cuántos gramos se deben tener de NaOH.
4. Preparar dos soluciones: una de HCl y otra de NaOH
a 0.01 N. Se necesitan 1 000 ml de cada una. El PM
del HCl es de 36.5 y su densidad a 20°C es de 1.060
gml. El PM del NaOH es de 40. Describir los cálculos para conocer las cantidades de solutos (HCl y
NaOH) que hay que utilizar.
5. Investigar en el libro de texto de qué manera se puede convertir una solución porcentual a solución osmolar.
Cuadro 2-3. DO esperada para una concentración
determinada de fenolftaleína.
Cuadro 2-2. Diluciones de fenolftaleína
y su concentración.
Núm.
de tubo
a) Peso molecular (PM) del ácido fosfórico: 98 gmol.
b) Pureza de 85%.
c) Densidad de 1.71 gcm3.
Etanol a 50%, Concentración
pH 11.5 (ml)
(mg/tubo)
DO (530 nm)
Núm. de
tubo
Esperado
2.5
1
0.160
2.5
4.0
5
2
0.296
5
1.5
3.5
7.5
3
0.377
7.5
4
2
3
10
4
0.527
10
5
2.5
2.5
12.5
5
0.655
12.5
6
3
2
blanco
6
0.0
Blanco
Experimental
Concentración
(mg)
20
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
6. Investigar la composición en miliequivalentes de la
solución salina a 0.9%, glucosada a 5%, Hartman,
Ringer, solución mixta (NaClglucosa) y registrarla
en un cuadro.
7. Calcular la osmolaridad de las anteriores soluciones.
Discusión
Preparación de reactivos
1. Solución de etanol a 50%:
Mezclar partes iguales de alcohol y agua destilada,
tomando en cuenta la pureza del alcohol. Ajustar a
pH de 11.5 con tres gotas de NaOH a 40%.
2. Solución de fenolftaleína a 0.5%:
En un matraz volumétrico de 100 ml, colocar 0.5 g
de fenolftaleína, mezclar y aforar con alcohol a 50%.
Bibliografía
Conclusiones
Bigelow P. How to make standard solutions for Chemistry. http:
www.scn.org [Revisado 16092013].
Chang R. Química, 7a ed. McGraw-Hill, 2003.
Kotz JC, Treichel PM. Química y reactividad química, 5a ed.
Editorial Thomson, 2003.
Práctica
pH y amortiguadores
• Sonia Uribe Luna
• Patricia Heredia Chávez
• Sergio Sánchez Enríquez
• Pedro Garzón de la Mora
Introducción
el logaritmo negativo de la concentración de iones hidrógeno.
pH = –log10 [H+]
Agua
La molécula de agua tiene una capacidad limitada para
disociarse en un ion hidrógeno (H+), al que también se le
llama protón, y un ion hidroxilo (OH−).
H2O (l)
H+
Agua
Protón
OH−
+
Ion hidroxilo
En solución acuosa, un protón se combina de inmediato con una molécula de agua para formar el ion hidronio o hidrogenión (H3O+).
H+ +
Protón
3
H2O (l)
Agua
H3O+
Hidronio
Sin embargo, por convención, en las reacciones de
ionización del agua se utiliza la representación del protón
en lugar del ion hidronio.
Las concentraciones de protones y iones hidroxilo, en
agua pura, son de 10−7 M para cada uno, como muestra
la siguiente expresión:
[H+] = [OH−] = 10−7 M
Las concentraciones de ambos iones exponen una relación recíproca: cuando H+ aumenta, OH− disminuye,
y viceversa. El producto de sus concentraciones es una
constante conocida como producto iónico del agua (Kw),
que tiene un valor de 1 × 10−14 M.
Kw = [H+] × [OH−] = 1 × 10−14 M
Con el fin de facilitar los cálculos para determinar
H+, además de su interpretación, en 1909 el químico danés Sørensen definió el potencial hidrógeno (pH) como
Más adelante, en 1923 Johannes Brønsted y Thomas
Lowry propusieron, en forma independiente, los conceptos de ácido, como la capacidad de las sustancias para
ceder protones en una solución acuosa, y de base, como
la de aceptar protones. En la práctica, las disoluciones
acuosas se clasifican en ácidas, si presentan un pH menor
a 7.0; básicas, si el pH es mayor a 7.0, y neutras, si el pH
es igual a 7.0.
Por otra parte, no todos los ácidos se disocian con la
misma facilidad. A los que lo hacen por completo en una
solución acuosa, se les considera ácidos fuertes; los que
se disocian en parte, son ácidos débiles. Algunos ácidos o
bases débiles tienen importancia biológica porque evitan
cambios bruscos de pH cuando se les agrega pequeñas
cantidades de ácidos o bases. A esta propiedad se le denomina capacidad amortiguadora. El fin de los amortiguadores es mantener el pH estable en un intervalo muy
estrecho (p. ej., en la sangre va de 7.35 a 7.45).
El pK es el pH necesario para que un ácido esté 50%
no disociado y 50% disociado (es decir, la razón o proporción de ácido disociado y no disociado es 1). Cuando la
solución presenta un pH cercano a su pK (± 1.0) posee
su mayor capacidad amortiguadora.
Los ácidos o las bases producidas por el catabolismo de carbohidratos, lípidos y aminoácidos dan lugar
a una gran cantidad de compuestos con potencial para
modificar el pH fisiológico. Sin embargo, existen sistemas
amortiguadores que evitan cambios bruscos del pH. Un
ejemplo es el sistema bicarbonatoácido carbónico, que
mantiene el pH de los líquidos intercelulares en valores
cercanos a 7.4. En éste, la combustión completa de carbohidratos y lípidos genera bióxido de carbono y agua, que
22
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
+
CO2
Bióxido
de carbono
H2O
Agua
AC
H2CO3
Ácido
carbónico
pKa = 6.1
HCO3− +
H+
Bicarbonato
Protón
AC = anhidrasa carbónica
Figura 3-1. Reacción de disociación del ácido carbónico. A la izquierda del ácido carbónico se muestra la disociación mediada por la anhidrasa carbónica y a la derecha la disociación espontánea (sin enzima).
se combinan para producir ácido carbónico en el nivel
tisular. El ácido carbónico en solución acuosa se disocia
para formar su base conjugada (el bicarbonato), lo que
genera un sistema amortiguador (figura 3-1).
Si aumenta la concentración de protones en el medio, debido a cualquier proceso químico, el equilibrio
se desplaza a la izquierda y el exceso de CO2 producido
se elimina a través de los pulmones. Por el contrario, si
disminuye la concentración de protones, el equilibrio se
desplaza a la derecha.
Las proteínas (en forma específica, las enzimas) son
sensibles a los cambios bruscos de pH. Por tanto, el pH
sanguíneo debe conservarse en un intervalo de 7.35 a
7.45, con el fin de mantener la homeostasis.
Además de los sistemas amortiguadores de pH, el
sistema nervioso (centro respiratorio), el aparato respiratorio y los riñones contribuyen a mantener en nuestros
órganos y tejidos el pH en los rangos apropiados.
Objetivo general
• Analizar las propiedades de soluciones ácidas y básicas.
Objetivos específicos
• Medir el pH de diferentes sustancias.
• Evaluar la capacidad amortiguadora de líquidos biológicos.
• Determinar los valores de pK de un ácido poliprótico.
Materiales y equipo
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Materiales y equipo
Bureta
Matraz Erlenmeyer de 250 ml
Probeta de 100 ml
Pipetas de 1, 5 y 10 ml
Vasos de precipitado de 100 y 250 ml
Tubos de ensayo 13 × 100
Soporte universal
Pinzas en mariposa para bureta
Gradilla
Potenciómetro
Tiras reactivas para pH
Agitador magnético
Pipetores
Soluciones y reactivos
Soluciones
Muestras*
H3PO4 a 0.1 M
Saliva
NaOH a 0.1 M
Orina
NaOH a 0.01 N
Sudor
HCl a 0.01 N (3.8%)
Leche
NaHCO3 con pH 7.4
Refresco oscuro
Reactivo de Yamada
Refresco claro
Solución amortiguadora
de referencia a pH 4.0
Jugo de naranja
Solución amortiguadora
de referencia a pH 7.0
Yogurt
Agua
* El alumno debe proporcionar las muestras.
Desarrollo experimental
Experimento 1
Medición del pH con tiras reactivas
Una forma rápida de medir el pH consiste en utilizar tiras
reactivas diseñadas para ese fin.
Fundamento
Las tiras reactivas contienen diferentes compuestos, a los
que se les denomina indicadores de pH, que cambian de
color de acuerdo con el pH en que se encuentran. A estas
mediciones se les considera semicuantitativas, porque no
indican el valor exacto del pH. La coloración que presenta la tira se compara con la gama de colores de referencia
incluida en el recipiente de las tiras.
Procedimiento
1. Sumergir la tira reactiva en el líquido problema y
mantenerla por 10 segundos.
2. Retirar la tira y quitar el exceso de líquido.
3. Comparar los cambios de color obtenidos con la
gama de colores existentes en el contenedor de las
tiras.
4. Registrar los valores de pH obtenidos de las soluciones incluidas en el cuadro 3-1.
Práctica 3. pH y amortiguadores
Cuadro 3-1. Resultados de la medición
de pH de distintas soluciones.
Solución
23
Cuadro 3-2. Resultados obtenidos para el pH
de diferentes soluciones, antes y después de la
exposición a un ácido y a una base.
pH obtenido
NaOH
0.01N
HCl
0.01N
Orina
0.5 ml
—
2
Orina
—
0.5 ml
Leche
3
Suero
0.5 ml
—
Refresco oscuro
4
Suero
—
0.5 ml
Refresco claro
5
NaHCO3 a
0.1 N y pH
7.0
0.5 ml
—
6
NaHCO3 a
0.1 N y pH
7.0
—
0.5 ml
7
Agua
destilada
0.5 ml
—
8
Agua
destilada
—
0.5 ml
Saliva
Tubos
Orina
1
Sudor
Jugo
Yogurt
Solución de jabón
Solución de sosa cáustica
Agua
Experimento 2
Sistemas amortiguadores
Fundamento
El objetivo de este experimento es comparar diferentes
líquidos que contienen amortiguadores y ver cuál es más
eficaz para evitar cambios importantes de pH ante la exposición a un ácido o una base. Se tiene un control que
no es amortiguador (agua).
Desarrollo
a) Preparar una serie de tubos numerados de acuerdo
con el cuadro 3-2.
b) Medir el pH de cada solución, empleando tiras reac-
tivas.
c) Registrar el pH final.
d) Analizar los cambios observados.
Experimento 3
Capacidad antiácida del hidróxido de
aluminio y magnesio
y del subsalicilato de bismuto
Fundamento
El propósito de este experimento es observar el comportamiento de dos fármacos utilizados como antiácidos,
cuando se exponen a soluciones básicas y ácidas. Como
control, se tiene agua destilada.
Muestra
(2.5 ml)
pH
inicial
pH
final
Procedimiento
a) Preparar una serie de tubos numerados de acuer-
do con el cuadro 3-3. Realizar las diluciones del hidróxido de aluminio y magnesio (Melox) y el subsalicilato de bismuto (Peptobismol). El volumen total
debe ser 2.5 ml; de ellos, 0.5 ml corresponden a
Melox o Peptobismol, mezclados con 2 ml de agua
destilada.
b) Agregar la base (NaOH) a la dilución de los tubos
nones y el ácido (HCl) a la de los tubos pares.
c) Mezclar bien.
d) Medir el pH de cada solución, empleando tiras reactivas.
Experimento 4
Curva de titulación
del ácido fosfórico (H3PO4)
Fundamento
El ácido fosfórico, H3PO4, es un ácido poliprótico (tiene
tres protones, que pueden disociarse). Mediante titulación, es posible determinar los tres valores de pKa de este
compuesto.
Para titular un ácido débil se agregan cantidades pequeñas de una base fuerte que permite desplazar el equilibrio hacia la formación de su base conjugada. Después
de cada adición de la base, se determina el pH, mediante
24
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Cuadro 3-3. Resultados obtenidos para el pH
de hidróxido de aluminio y magnesio (Melox),
subsalicilato de bismuto (Peptobismol) y agua,
antes y después de exponerlos a una base y a un ácido.
Tubos
Muestra
(2.5 ml)
pH
inicial
NaOH
a 0.01
N
HCl a
0.01
N
1
Hidróxido
de aluminio
y magnesio
(1:5)
0.5 ml
—
2
Hidróxido
de aluminio
y magnesio
(1:5)
—
0.5 ml
3
Subsalicilato de
bismuto (1:5)
0.5 ml
—
4
Subsalicilato de
bismuto (1:5)
—
0.5 ml
5
Agua
destilada
0.5 ml
—
6
Agua
destilada
—
0.5 ml
pH
final
Figura 3-2. Potenciómetro portátil con electrodo de vidrio.
potenciometría, y su valor se registra en una gráfica para
determinar el comportamiento del ácido débil. De la misma forma, se puede titular una base débil empleando un
ácido fuerte.
En el proceso de titulación se modifica el pH (en este
caso, de valores ácidos a otros cada vez más básicos).
Esto se puede determinar a partir de cambios de color, si
se agrega a la reacción una mezcla de indicadores de pH,
como el reactivo de Yamada.
Potenciómetro
Se trata de un aparato que mide el pH y que funciona por
medio de electrodos. El electrodo es un dispositivo que
contiene una solución amortiguadora; al ponerse en contacto con la solución problema, mide la concentración de
los hidrogeniones.
El uso del potenciómetro depende del modelo. Sin
embargo, en forma general se deben tener los siguientes
cuidados:
• Antes de medir el pH, debe mezclarse la solución que
se desea analizar empleando el agitador magnético.
Se recomienda evitar el uso de varillas de vidrio como
agitadores, porque se corre el riesgo de romper los
electrodos, que son frágiles.
• Los electrodos deben enjuagarse con agua destilada
antes y después de utilizarse, y no se deben tocar con
la mano.
• Antes de utilizar el potenciómetro, debe calibrarse
con una solución de referencia (pH 4, pH 7 o pH 10).
• Los electrodos deben mantenerse en agua destilada
cuando no estén en uso, evitando que se sequen. Si
esto ocurre, deben sumergirse en agua y calibrarse
varias veces antes de hacer las mediciones.
En la figura 3-2 se muestra una fotografía de un
modelo de potenciómetro portátil, junto con sus aditamentos.
Procedimiento
1. En un vaso de precipitado de 250 ml, depositar 25 ml
de una solución de H3PO4 a 0.1 M.
2. Agregar 4 gotas del reactivo de Yamada (mezcla de
indicadores de pH).
3. Medir el pH con un potenciómetro. El potencióme-
4.
5.
6.
7.
tro debe calibrarse de antemano con amortiguadores
de referencia, a pH 4.0 y pH 7.0.
Preparar una bureta con 50 ml de una solución de
NaOH a 0.1 M.
Agregar al H3PO4 alícuotas de 3.0 ml de NaOH a 0.1
M. Mezclar con el agitador magnético y medir el pH
después de cada adición, hasta completar 75 ml de la
base NaOH.
Graficar en papel milimétrico el volumen de NaOH
gastado contra el pH.
Determinar los valores de pKa1, pKa2 y pKa3 para el
H3PO4.
Actividades de aprendizaje
1. Investigar la composición promedio de las siguientes
soluciones y cuál de esos compuestos contribuye más
al pH de la solución.
Práctica 3. pH y amortiguadores
25
26
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Solución
9. Investigar la utilidad práctica de los siguientes com-
Compuesto
puestos y marcarlos en el siguiente cuadro:
Saliva
Orina
Antiácido
Amortiguador
Efecto
sistémico
Sudor
Bicarbonato
de sodio
Leche
Refresco oscuro
Hidróxido
de magnesio
Refresco claro
Jugo
Hidróxido
de aluminio
Yogurt
Subsalicilato de
bismuto
Solución de jabón
Agua
2. ¿Qué pH tiene la mayor parte de las sustancias estu-
diadas en este experimento?
3. De acuerdo con los resultados obtenidos en el experimento 2, investigar qué sistema o sistemas de amortiguadores se encuentran en cada una de las soluciones
utilizadas.
10. Explicar la diferencia entre un sistema amortiguador
y el de una sustancia con propiedad antiácida.
Discusión
Descripción del sistema
amortiguador
Muestra
Orina
Suero
NaHCO3 a 0.1 N y pH 7.0
Agua destilada
4. ¿Cuál de estos amortiguadores es el mejor?
5. ¿Cuál de los antiácidos utilizados en el experimento
3 es mejor?
6. ¿Cuál de los pKa del ácido fosfórico es mejor amor-
tiguador a pH fisiológico?
7. Investigar cuáles enfermedades tienen relación con
el pH
8. Completar la información del siguiente cuadro:
Indicadores del
reactivo de Yamada
Intervalos de pH
Azul de timol
Rojo de metilo
Azul de bromotimol
Fenolftaleína
Color
Conclusiones
Práctica 3. pH y amortiguadores
27
Preparación de reactivos
H3PO4
0.1 M
NaOH
0.1 M
HCl
0.01 N
NaOH
0.01 N
Solución NaHCO3 a 0.1N: ajustar el pH a 7.0
Reactivo de Yamada:
Azul de timol
5.0 mg
Rojo de metilo
12.5 mg
Azul de bromotimol
50.0 mg
Fenolftaleína
100.0 mg
Disolver en 200 ml de alcohol etílico a 50%
Bibliografía
Garzón de la Mora P. Manual de prácticas de bioquímica. Proyecto IV de pH y Buffers, 2002:85-93.
McKee T. Bioquímica, 3a ed. Cap 3. El agua: el medio de la vida.
McGraw-Hill, 2003:65-91.
Roskoski R Jr. Bioquímica. Cap 3. Aminoácidos y proteínas.
McGraw-Hill, 1998:65-91.
http:www.uclm.es. Equilibrio ácido-base. [Revisado el 16 de
septiembre de 2013.]
Práctica
Aminoácidos y proteínas
4
• Carmen Magdalena Gurrola Díaz
• María de Lourdes Isaac Virgen
• Sergio Sánchez Enríquez
Introducción
Las proteínas constituyen el grupo de compuestos más
abundante en los seres vivos; en algunos casos representan hasta 50% del peso total seco. Esta abundancia se
debe a que desempeñan diversas funciones:
Catálisis, en el caso de las enzimas.
Transporte, en el de la hemoglobina.
Almacenamiento, como sucede con la ferritina.
Movimiento (p. ej., actina y miosina).
Soporte mecánico (colágeno).
Protección inmunológica, a través de los anticuerpos.
7. Regulación de procesos biológicos y comunicación
celular, como algunas hormonas y sus receptores.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Las proteínas son macromoléculas de elevado peso
molecular, porque su estructura consta de cadenas de
aminoácidos unidos por enlaces peptídicos entre el grupo alfa carboxilo de un aminoácido y el grupo alfa amino
de otro.
Aunque en la naturaleza existen más de 300 aminoácidos, las proteínas sólo utilizan 20, de diferente tamaño,
forma, carga, capacidad de formar puentes de hidrógeno
o enlaces disulfuro y reactividad química.
Los aminoácidos tienen la capacidad de formar dos
tipos de isómeros, D y L, que indican si el grupo amino se
encuentra a la derecha o a la izquierda del carbono quiral.
En las proteínas, sólo se encuentran los isómeros L-alfa.
Las cuantiosas combinaciones que se pueden lograr
con los 20 aminoácidos en las cadenas polipeptídicas,
otorgan gran diversidad a las funciones proteínicas.
La presencia de grupos químicos ionizados en los
aminoácidos permite que las proteínas presenten características fisicoquímicas específicas en el microambiente
biológico; de allí la importancia de su estudio.
A varios aminoácidos se les denomina esenciales,
porque el organismo carece de la capacidad de sintetizarlos y, por tanto, es necesario ingerirlos en la dieta. Los
aminoácidos no esenciales son los que el cuerpo humano
sí puede sintetizar.
El catabolismo deficiente de los aminoácidos lleva a
su acumulación en el plasma y su excreción excesiva en la
orina; a esto se le conoce como aminoaciduria. En el adulto normal, la excreción urinaria de aminoácidos es constante; en un periodo de 24 horas se excreta un promedio
de 200 mg de nitrógeno alfa aminado. Existen diversos
trastornos en que aumenta la cantidad de aminoácidos
en la orina.
Métodos de separación
de aminoácidos y proteínas
Los métodos de cromatografía en capa fina y de electroforesis son adecuados para determinar la cantidad absoluta
y relativa de los diferentes aminoácidos en una muestra
(análisis cualitativo); sin embargo, para los análisis cuantitativos es necesaria la cromatografía de líquidos de alta
presión (HPLC).
• Electroforesis. Se trata de un proceso en que algunas
biomoléculas con carga (como proteínas, polinucleótidos, biopolímeros) se separan a partir de su distinta
velocidad de migración en un campo eléctrico. Por lo
general, los aminoácidos no se presentan en forma
aislada; de modo que es necesario separarlos antes
de poder cuantificarlos. Entre las técnicas de separación, se mencionan a continuación las de uso más
frecuente en el laboratorio.
• Cromatografía en capa fina. Se fundamenta en la separación de las moléculas adsorbidas en una placa
(fase estacionaria), con una capa muy delgada de
30
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
gel de sílice; se coloca en posición vertical en una cámara con un sistema de solventes (fase móvil), que
ascienden debido al fenómeno de capilaridad. La separación se realiza con base en la polaridad de las
moléculas.
• Analizador automático de aminoácidos (HPLC). Existen dos técnicas para la determinación de aminoácidos mediante cromatografía líquida: en columnas de
intercambio iónico y de alta resolución en columnas
de fase reversa:
∘ Cromatografía líquida en columnas de intercambio
iónico. La cromatografía iónica está relacionada
con los métodos modernos y eficaces para la determinación de iones, que se basan en el uso de
resinas de intercambio iónico. Se hacen pasar los
aminoácidos a través de una columna de resina con
grupos catiónicos o aniónicos; dependiendo de la
carga de los aminoácidos, éstos se unen a la columna y, más adelante, mediante un cambio gradual en
el pH del solvente, se eluye cada aminoácido a un
pH distinto (de acuerdo con el punto isoeléctrico
del aminoácido).
∘ Cromatografía líquida de alta resolución en columnas de fase reversa. Este método consiste en aplicar
aminoácidos disueltos en una fase acuosa acidificada (fase móvil) a una columna de sílice unida a
una cadena hidrocarbonada (fase estacionaria). La
selectividad se basa en las interacciones específicas
entre el soluto y la fase móvil, que puede ser de
tipo polar, de formación de puentes de hidrógeno
o mediante equilibrios secundarios provocados al
variar la composición de la fase móvil (ácido-base,
formación de complejos o pares iónicos, adición de
complejos metal-ligando o reactivos quirales para
separar los isómeros ópticos, etcétera).
Objetivo general
O
R
H
C
C
N
N
H
H
O
C
C
O
R
O
C
H
C
N
+
N
Cu
Cu
N
N
C
C
O
O
Aminoácidos + Biuret
Color violeta
Figura 4-1. Reacción de la ninhidrina. La ninhidrina reacciona con los grupos alfa amino de los aminoácidos.
Desarrollo experimental
Experimento 1
Prueba de la ninhidrina
Fundamento
La ninhidrina reacciona de manera específica con el grupo alfa amino de los aminoácidos, sean libres o estén unidos mediante enlaces peptídicos.
La ninhidrina a pH de 4 a 8 es un oxidante muy fuerte
y siempre reacciona con los grupos alfa amino, liberando
amonio; éste se condensa con la ninhidrina reducida y
con otra molécula de ninhidrina, formando un compuesto coloreado que va del azul violeta al púrpura. En la
figura 4-1 se muestra la reacción química de la ninhidrina
con los aminoácidos.
Reacción:
Figura 4-1.
Procedimiento
1. Numerar tres tubos de ensayo de acuerdo con el cua-
dro 4-1.
2. En el tubo 1, colocar 1 ml de agua (blanco).
3. En el tubo 2, colocar 1 ml de solución de glicina (o
cualquier otro aminoácido) a 1%.
Seleccionar pruebas de laboratorio que permitan el estudio de las propiedades fisicoquímicas de aminoácidos y
proteínas, además de su identificación.
Objetivo específico
4. En el tubo 3, colocar 1 ml de solución de albúmina
de huevo.
Cuadro 4-1. Organización de los tubos de reacción
y su contenido.
Utilizar técnicas analíticas que permitan la identificación
de aminoácidos en general, aminoácidos específicos y
proteínas, en cualquier espécimen biológico.
Material
Biológico:
Químicos:
• Solución de albúmina de
huevo (clara de huevo diluida 1:50)
• Solución de glicina a 1%
• Solución de ninhidrina a
0.2%
• Agua destilada
Agua
destilada
Glicina
1%
Albúmina
de huevo
Reactivo
(ninhidrina
a 0.2%)
1
Blanco
1 ml
—
—
10 gotas
2
Patrón
—
1 ml
—
10 gotas
3
Problema
—
—
1 ml
10 gotas
Tubo
31
Práctica 4. Aminoácidos y proteínas
5. Agregar a cada tubo 10 gotas de solución de ninhi-
Material
drina a 0.2%.
6. Mezclar y colocar en baño María durante 5 minutos.
Resultados esperados
Los tubos 2 y 3 deben presentar el color azul violeta que
revela la presencia de aminoácidos.
Biológico:
Químicos:
• Solución de albúmina de
huevo (clara de huevo diluida 1:50)
• Solución de fenilalanina
a 1%
• Reactivo de Biuret
• Agua destilada
Resultados obtenidos
Procedimiento
1. Enumerar tres tubos de ensayo, de acuerdo con el
cuadro 4-2.
2. En el tubo 1, colocar 2 ml de agua destilada (blanco).
3. En el tubo 2, colocar 2 ml de solución de fenilalanina
(u otro aminoácido) a 1%.
4. En el tubo 3, colocar 2 ml de albúmina de huevo
a 1%.
5. Añadir a cada tubo 2 ml del reactivo de Biuret.
6. Mezclar y observar.
Resultados esperados
Experimento 2
Prueba de Biuret
Existen varias pruebas para la cuantificación de proteínas
en muestras biológicas. La elección del método depende de
varios factores; uno de ellos es la cantidad de proteínas en
la muestra. Por ejemplo, si la cantidad se encuentra en el orden de los microgramos, es recomendable utilizar la prueba de Lowry. Por el contrario, en muestras en que la cantidad es mayor; la prueba de elección es la de Biuret.
El tubo que contiene la proteína albúmina es el único que
debe presentar coloración violeta, porque contiene enlaces peptídicos.
Resultados obtenidos
Fundamento
La prueba de Biuret sirve para investigar la presencia
de enlaces peptídicos, que representan uniones específicas entre los aminoácidos. Se basa en la formación de
sales complejas de color violeta cuando se añade sulfato
cúprico en solución alcalina. El complejo está formado
por enlaces de coordinación, en que los pares electrónicos
proceden de los grupos amino de los aminoácidos de la
cadena polipeptídica (figura 4-2).
Reacción
Cuadro 4-2. Organización de los tubos de reacción
y su contenido.
Agua
destilada
Fenilalanina a 1%
Albúmina
de huevo
a 1%
Reactivo
(Biuret)
1
Blanco
2 ml
—
—
2 ml
2
Patrón
—
2 ml
—
2 ml
3
Problema
—
—
2 ml
2 ml
Figura 4-2.
Tubo
O
O
R C H+CO 2
H
OH
O
+ R C COOH
OH
NH 2
Ninhidrina + alfa aminoácido
O
2H 2O
O
O
OH
+ NH3
H
O
N=
O
-
O
Complejo coloreado + aldehído
Figura 4-2. Reacción de Biuret. El reactivo de Biuret detecta la presencia de enlaces peptídicos.
32
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Cuadro 4-4. Resultados obtenidos para absorbancia
y concentración de proteínas totales.
Experimento 3
Determinación de las proteínas
totales del suero y la relación entre
albúmina y globulina (A:G)
Absorbancia
Fundamento
Blanco
La prueba de Biuret permite determinar las proteínas totales del suero.
La albúmina reacciona de manera específica con el
colorante verde de bromocresol, por el método llamado “error proteínico de los indicadores”, formando una
coloración verde proporcional a la concentración de la
fracción de albúmina, que puede medirse con un espectrofotómetro. Las globulinas se calculan a partir de la
diferencia entre la cantidad de las proteínas totales y la
fracción de albúmina.
Patrón
Materiales
Biológicos:
Químicos:
• Suero o plasma del
voluntario
• Suero humano, control
multiparamétrico (labtrol,
ortho, etc.)
Concentración
de proteínas
totales g/dl
Problema 1
Problema 2
Problema 3
Cálculos
Absorbancia del
problema
Proteínas totales
=
× [patrón]*
(g100 ml)
Absorbancia del
patrón
*[ ] = Concentración
• Solución de verde de
bromocresol
• Reactivo de Biuret
• Agua destilada
Determinación de albúmina
1. Disponer de tres tubos: blanco, patrón y problema,
de acuerdo con el cuadro 4-5.
2. Mezclar y dejar que repose durante 15 minutos, a
temperatura ambiente.
Procedimientos
3. Medir la absorbancia del patrón y de la muestra a
Determinación de proteínas totales
4. Ajustar a cero de absorbancia con el blanco.
5. Registrar los resultados de absorbancia y concentra-
630 nm.
1. Disponer de tres tubos: blanco, patrón y problema,
de acuerdo con el cuadro 4-3.
2. Mezclar y dejar que repose durante 15 minutos a
temperatura ambiente.
3. Ajustar a cero de absorbancia con el blanco (545 nm).
4. Medir la absorbancia del patrón y de la muestra y
registrarlas en el cuadro 4-4.
Cuadro 4-3. Organización de los tubos de reacción
y su contenido.
Blanco
Patrón
Problema
Agua
destilada
100 μl
—
—
Suero
problema
—
—
100 μl
Suero
control
—
100 μl
—
5 ml
5 ml
5 ml
Reactivo de
Biuret
ción de albúmina en el cuadro 4-6.
Cálculos
Absorbancia del
problema
Albúmina
(g100 ml) = Absorbancia del × [patrón]
patrón
Cuadro 4-5. Organización de los tubos de reacción
y su contenido.
Blanco
Muestra
Patrón
5 ml
5 ml
5 ml
Suero
problema
—
20 μl
—
Suero
control
—
—
20 μl
20 μl
—
—
Solución
de verde
bromocresol
Agua
destilada
Práctica 4. Aminoácidos y proteínas
Cuadro 4-6. Resultados de absorbancia
y concentración de albúmina.
Absorbancia
Concentración
de albúmina
g/dl
Blanco
4. Dejar que seque.
5. Revelar las placas mediante la aplicación, sobre su
superficie, de ninhidrina contenida en un atomizador.
6. Calcular la RF (relación de frentes) de cada mancha
mediante la siguiente fórmula:
RF =
Patrón
Problema 1
Distancia recorrida por el problema
Distancia recorrida por el solvente
Discusión
Problema 2
Problema 3
Valores normales de referencia
Proteínas totales:
6.0 a 8.0 g por 100 ml
Albúmina:
3.5 a 5.5 g por 100 ml
Globulinas:
1.5 a 2.5 g por 100 ml
Experimento 4
Separación de aminoácidos
por cromatografía en capa fina
Fundamento
Conclusiones
Se extrae de una fase líquida móvil la sustancia que se
quiere separar y se le retiene en una fase sólida. El fenómeno depende de adsorción por fuerzas de van der Waalls, puentes de hidrógeno o intercambio de iones.
El método de la cromatografía consiste en extender
el adsorbente deseado sobre una placa de vidrio o algún
soporte. La gota de solución problema se aplica en un
punto inicial conocido. La placa se coloca en una cámara
cromatográfica cerrada, junto con un sistema de solventes adecuado. Por capilaridad, el solvente recorre la capa
estacionaria y separa los componentes de la muestra.
Después de la separación, se sacan las placas y, mediante
la adición de ciertos reactivos, se revelan las manchas correspondientes a los aminoácidos y estándares.
Procedimiento
1. En la cromatoplaca, colocar (con un tubo capilar)
una gota de la mezcla de aminoácidos, de aminoácidos individuales, o ambos, a una distancia de 1
cm del borde.
2. Introducir la placa, con la línea de muestra hacia
abajo, en la cámara de cromatografía que contiene
el sistema de solventes:ácido acético:butanol:agua
VV:30:50:10. Nota: verificar que la altura del solvente no exceda de 0.5 cm.
3. Cerrar la cámara y dejar en reposo, sin moverla. Sacar la placa cuando el solvente llegue a 1.5 cm del
borde superior de ésta. Marcar con un lápiz la altura
del solvente.
33
Actividades de aprendizaje
1. Nombrar los 10 aminoácidos esenciales.
34
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
2. Investigar algunos alimentos, en especial de origen
5. Investigar por lo menos tres patologías ocasionadas
vegetal, que no aporten alguno de los aminoácidos
esenciales.
por deficiencias en las enzimas metabolizadoras de
los aminoácidos.
3. Investigar las causas de la hipoalbuminemia (dismi-
nución de albúmina sérica).
Preparación de reactivos
a) Reactivo de Biuret
1. Pesar 3 g de sulfato de cobre, 12 g de tartrato de
sodio y potasio tetrahidratado y 2 g de yoduro de
potasio.
2. Añadir 100 ml de agua destilada y agitar hasta su
dilución.
3. Añadir, con movimientos rotatorios constantes,
600 ml de hidróxido de sodio (NaOH) a 10%.
4. Diluir hasta 2 litros con agua destilada y mezclar.
b) Solución de verde de bromocresol
4. Investigar qué otras pruebas de identificación de ami-
1. Verde de bromocresol 500 mg y NaOH al 10%.
noácidos existen.
Bibliografía
Garzón de la Mora P. Manual de prácticas de bioquímica. Proyecto V, aminoácidos y su identificación en las proteínas,
2002:94-110.
Pérez García G. Bioquímica: temas selectos y prácticas. Práctica
6 aminoácidos y proteínas. 1996:47-53.
http:depa.fquim.unam.mx. Estructura de aminoácidos. [Revisado el 16 de septiembre de 2013]
Práctica
5
Regulación no específica
de la actividad enzimática
• Irma Noemí Lúa Ramírez
• Carmen Magdalena Gurrola Díaz
Introducción
Las enzimas son proteínas con capacidad de catalizar
reacciones biológicas. Al igual que los catalizadores inorgánicos, las enzimas aumentan la velocidad con que se
alcanza el equilibrio de la reacción. El mecanismo que
permite que las enzimas incrementen la velocidad de la
reacción es la reducción de la energía libre de activación
requerida para transformar un sustrato al producto correspondiente, sin afectar la constante de equilibrio.
v1
A+B
C+D
v2
Keq =
La actividad de una enzima se evalúa de acuerdo
con la velocidad de la reacción. La cinética enzimática
estudia la velocidad de la reacción enzimática, los factores que la modifican y el mecanismo de la reacción. Los
factores fisicoquímicos que modifican la actividad de la
enzima son los siguientes:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Concentración del sustrato.
Concentración de la enzima.
pH.
Temperatura.
Fuerza iónica.
Inhibidores.
[C][D]
[A][B]
A y B = Sustratos
C y D = Productos
v1 = Velocidad de la reacción para formar los productos
v2 = Velocidad de la reacción para formar los sustratos
Keq = Constante de equilibrio
[ ] = Concentración molar.
A continuación se presenta un resumen de las características que distinguen a una enzima:
Es una proteína.
Resulta muy específica para el sustrato.
Incrementa la velocidad de la reacción.
No modifica la constante de equilibrio (Keq).
Se modifica de manera temporal, pero esta modificación no persiste al final de la reacción, ni forma parte
de los productos.
6. Requiere condiciones óptimas para la catálisis.
1.
2.
3.
4.
5.
• Patricia Heredia Chávez
• Sergio Sánchez Enríquez
Catalasa
En esta práctica se utilizará la enzima catalasa como
modelo para analizar algunos aspectos de la regulación
no específica de la enzima (pH, temperatura, tiempo de
reacción, concentración del sustrato y concentración de
enzima).
La catalasa es una hemoproteína que contiene cuatro grupos hemo. Además, posee actividad de peroxidasa, utiliza una molécula de peróxido de hidrógeno (H2O2)
como sustrato donador de electrones y otra molécula de
H2O2 como oxidante o aceptor de electrones.
2H2O2 g
catalasa
2H2O + O2
La catalasa se encuentra en la sangre, la médula ósea,
las mucosas, el riñón y el hígado. Su función es la destrucción del H2O2 formado por la acción de las oxidasas.
Los microcuerpos, o peroxisomas, se encuentran en cuantiosos tejidos, incluido el hígado. En ellos abundan las
oxidasas y la catalasa, lo que sugiere que tal vez haya una
ventaja biológica en el agrupamiento de las enzimas que
36
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
producen H2O2 con la enzima que lo destruye. Además
de las enzimas peroxisómicas, se debe considerar que los
sistemas mitocondriales y microsómicos de transporte de
electrones, además de la xantina oxidasa, son fuentes de
H2O2.
Objetivo general
• Evaluar la actividad de la catalasa en presencia de
reguladores no específicos.
Objetivos específicos
• Determinar el efecto del pH sobre la velocidad de
reacción.
• Identificar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción.
• Determinar el efecto de la concentración de sustrato y enzima sobre la velocidad de reacción.
• Determinar el efecto del tiempo sobre la velocidad
de reacción
Materiales y equipo
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
8 matraces volumétricos de 25 ml
Gradilla
Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml
Micropipeta de 20 μl
Matraz Erlenmeyer de 125 ml
Probeta de 25 ml
Jeringa de 3 ml
Torniquete
Torundas de algodón con alcohol etílico
Tiras reactivas para medir pH
Termómetro
Vaso de precipitado de 250 ml
Pipetor
Recipiente con hielo
Soluciones y reactivos
• Ácido sulfúrico (H2SO4) a 2 N, que contiene 1 mg por ml
de sulfato de manganeso (MnSO4)
• Permanganato de potasio (KMnO4) a 0.05 N
• Soluciones de sustrato: H2O2 a 0.24 % acidulada a pH 3,
pH 7 y pH 9
Desarrollo experimental
Preparación de la solución de catalasa
1. Obtener una muestra de sangre, con la técnica y los
cuidados descritos en la práctica 1. Al mismo tiempo, otro estudiante debe colocar 25 ml de agua destilada (fría) en un matraz pequeño. Depositar 20 μl de
sangre total en el matraz con agua fría y mantener la
mezcla en baño de hielo. Esta etapa debe realizarse
de prisa, porque la sangre se coagula en la pipeta si
se deja más de medio minuto.
Fundamento
En cada experimento, la concentración de H2O2 se determina mediante titulación con estándar de KMnO4.
La titulación de un tubo control por cada experimento
sirve como medida de la concentración de peróxido al
comienzo del experimento. La titulación del tubo experimental es una medida del peróxido remanente al final
del experimento. La diferencia entre las dos titulaciones
representa la cantidad de peróxido descompuesto. En este
experimento, se considera que los miliequivalentes (meq)
de peróxido descompuesto por unidad de tiempo son la
medida de la actividad de la catalasa.
Reacciones
2 H2O2
5 H2O2 + 2 KMnO4 + 6H
2 H2O + O2
5O2 + 2Mn++ + 8H2O
Desarrollo
Se evalúan el efecto de la concentración de sustrato, la
concentración de la enzima, el pH, la temperatura y el
tiempo en la actividad de la catalasa.
Experimento 1
Efecto de la concentración de la enzima
1. Preparar una serie de matraces de acuerdo con el cua-
dro 5-1. Los matraces tienen concentración fija de
sustrato (H2O2) y concentración variable de catalasa.
El matraz 1 es el control sin enzima. Después de colocar la enzima, todos los matraces deben dejarse en
reposo por 5 minutos y en cuanto se detenga la reacción con el H2SO4 2 N (desnaturalizante).
2. Titular KMnO4 a 0.05 N, gota a gota, agitando después de la aplicación de cada gota hasta la aparición
de un color rosa permanente.
3. Contar la cantidad de gotas necesarias para adquirir
el color permanente.
4. Calcular, de la siguiente manera, los meq de H2O2 destruidos por la catalasa, por mililitro de sangre total:
Se calcula la cantidad de meq de H2O2 (x) en
las mezclas de reacción. Se considera H2O2 total
en las mezclas de reacción con ausencia de catalasa
y H2O2 remanente en las mezclas con presencia de
catalasa.
Para calcular los miliequivalentes (meq) de H2O2
en la titulación, se debe considerar que 1000 ml de
KMnO4 a 0.05N contienen 0.05 eq o 50 meq (ver ejercicio de equivalencias en la Práctica 2).
Práctica 5. Regulación no específica de la actividad enzimática
37
Cuadro 5-1. Organización y contenido de cada uno de los matraces para el experimento 1.
Tubo
H2O2
a pH 7
Catalasa
1
5 ml
0.0 ml
2
5 ml
0.10 ml
3
5 ml
0.20 ml
4
5 ml
5
5 ml
H2SO4
a2N
5 ml
0.40 ml
R
E
P
O
S
O
0.80 ml
5 min
5 ml
Titular
(ml de KMnO4 a 0.05 N)
meq de H2O2
no destruido
meq de H2O2
destruido
5 ml
5 ml
5 ml
De aquí se aplica la siguiente fórmula:
Experimento 2
A (50 meq)
x=
1 000 ml
Efecto de la concentración de sustrato
1. Preparar una serie de matraces de acuerdo al cua-
x = miliequivalentes de H2O2
A = ml de KMnO4 gastados en la titulación
dro 5-2.
2. Calcular los meq de H2O2 destruidos, de acuerdo con
5. Calcular el H2O2 descompuesto:
Y = H2O2 total − H2O2 remanente
Y = H2O2 descompuesto
6. En los experimentos siguientes, realizar los mismos
cálculos para obtener los meq de H2O2 no destruidos.
7. Graficar en papel milimétrico la cantidad de meq de
H2O2 destruido contra la concentración de enzima.
8. Interpretar los resultados, explicando el comporta-
lo ya descrito. Es necesario observar que en este caso
se comparan el matraz 2 con el 1, el 4 con el 3 y el 6
con el 5.
3. Graficar en papel milimétrico la cantidad de meq de
H2O2 destruidos en comparación con la concentración del sustrato.
4. Interpretar los resultados, explicando el comportamiento de la actividad de la enzima en función de la
concentración del sustrato.
miento de la actividad de la enzima en función de su
concentración.
Cuadro 5-2. Organización y contenido de cada uno de los matraces para el experimento 2.
Tubo
H2O2
pH 7
H2O
Catalasa
1
5 ml
—
—
2
5 ml
—
0.5 ml
3
2.5 ml
2.5 ml
—
4
2.5 ml
2.5 ml
0.5 ml
5
1.25 ml
3.75 ml
—
6
1.25 ml
3.75 ml
0.5 ml
H2SO4
a2N
R
E
P
O
S
O
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 min
5 ml
Titular
(ml de KMnO4 a 0.05 N)
meq de H2O2
no destruido
meq de H2O2
destruido
38
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Cuadro 5-3. Organización y contenido de cada uno de los matraces para el experimento 3.
Tubo
H2O2
a pH 7
Catalasa
Reposo
H2SO4
a2N
1
5 ml
—
—
5 ml
2
5 ml
0.5 ml
1 min
5 ml
3
5 ml
0.5 ml
3 min
5 ml
4
5 ml
0.5 ml
5 min
5 ml
5
5 ml
0.5 ml
7 min
5 ml
6
5 ml
0.5 ml
10 min
5 ml
Titular
(ml de KMnO4 a 0.05N)
meq de H2O2
no destruido
Experimento 3
Experimento 4
Efecto del tiempo sobre la reacción
Efecto de la temperatura sobre
la velocidad de la reacción
1. Preparar una serie de matraces de acuerdo con el cua-
dro 5-3.
2. Calcular los meq de H2O2 destruidos, restando los
meq de H2O2 no destruidos de los tubos 2, 3, 4 y 5 a
los meq de H2O2 no destruidos del tubo 1.
3. Graficar en papel milimétrico los meq de H2O2 destruidos por minuto en comparación con el tiempo.
4. Interpretar los resultados explicando el comportamiento de la actividad de la enzima en función del
tiempo de reacción.
meq de H2O2
destruido
1. Preparar una serie de matraces, de acuerdo con el
cuadro 5-4.
2. Calcular los meq de H2O2 destruidos restando los meq
de H2O2 no destruidos del tubo 2 a los meq de H2O2
no destruidos del 1; hacer lo mismo restando los del 4
a los del 3; los del 6 a los del 5 y los del 8 a los del 7.
3. Graficar en papel milimétrico los meq de H2O2 destruidos en comparación con la temperatura.
4. Interpretar los resultados explicando el comportamiento de la actividad de la enzima en función de la
temperatura de reacción.
Cuadro 5-4. Organización y contenido de cada uno de los matraces para el experimento 4.
Tubo
H 2O 2 a
pH 7
Temp
Catalasa
H2SO4
a2N
1
5 ml
15°C
0.5 ml
5 ml
2
5 ml
15°C
—
3
5 ml
25°C
0.5 ml
4
5 ml
25°C
—
5
5 ml
40°C
0.5 ml
6
5 ml
40°C
—
7
5 ml
60°C
0.5 ml
8
5 ml
60°C
—
R
E
P
O
S
O
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 min
5 ml
5 ml
Titular
(ml de KMnO4 a 0.05 N)
meq de H2O2
no destruido
meq de H2O2
destruido
Práctica 5. Regulación no específica de la actividad enzimática
Experimento 5
39
Discusión
Efecto del pH sobre
la velocidad de la reacción
1. Preparar una serie de matraces, de acuerdo con el
cuadro 5-5.
2. Calcular los meq de H2O2 destruidos restando los
meq de H2O2 no destruidos resultantes del tubo 2 a
los del tubo 1; hacer lo mismo con los del 4 a los del
3; los del 6 al 5 y los del 8 al 7.
3. Graficar en papel milimétrico los meq de H2O2 destruido en comparación con el pH.
4. Interpretar los resultados explicando el comportamiento de la actividad de la enzima de acuerdo con
el pH.
Conclusiones
Cuadro 5-5. Organización y contenido de cada uno de los matraces para el experimento 5.
Tubo
H2O2
5 ml
Catalasa
H2SO4
a2N
1
pH 3
0.5 ml
5 ml
2
pH 3
—
3
pH 5
0.5 ml
4
pH 5
—
5
pH 7
0.5 ml
6
pH 7
—
7
pH 9
0.5 ml
8
pH 9
—
R
E
P
O
S
O
Titular
(ml de KMnO4 a 0.05 N)
meq de H2O2
no destruido
meq de H2O2
destruido
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 ml
5 min
5 ml
5 ml
Actividades de aprendizaje
1. Definir enzima, coenzima, cofactor y grupo prosté-
tico.
2. Elaborar una lista de los radicales libres que se gene-
ran en las células.
40
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
3. Investigar el pH óptimo de la pepsina, la amilasa sali-
Preparación de reactivos
val, la fosfatasa alcalina y las hidrolasas lisosómicas.
1. Solución de H2SO4 a 2 N.
Ácido sulfúrico (H2SO4; PM = 98; ρ = 1.89).
En un matraz volumétrico de 1 L, depositar 600 ml
de agua destilada y agregar poco a poco, por las paredes del matraz, 51.8 ml de H2SO4 mezclando en cada
adición. Aforar a 1 L con agua destilada.
2. Solución de KMnO4 a 0.05 N.
4. Escribir 4 reacciones en que se genere H2O2 en la
célula.
a)
Permanganato de potasio (KMnO4; PM = 158).
En un matraz volumétrico de un litro, depositar 7 g
de KMnO4, disolver en casi 400 ml de agua destilada.
Una vez disuelta la sal, aforar a un litro con agua
destilada.
b)
3. Solución de H2O2 a 0.24% y pH de 3, 5, 7 y 9.
c)
Peróxido de hidrógeno (H2O2; PM 34).
d)
En un matraz volumétrico, verter 8 ml de H2O2 a 30%
y aforar a un litro. Ajustar al pH requerido, utilizando NaOH o HCl, según sea el caso.
5. Explicar la utilidad de determinar la actividad enzi-
mática en la clínica. Dar tres ejemplos:
a)
b)
c)
Bibliografía
Garzón de la Mora P. Manual de prácticas de bioquímica. Proyecto VI: condiciones óptimas para medir una actividad enzimática, 2002:111-125.
McKee T. Bioquímica, 3ª ed. Cap 6. Enzimas. McGraw-Hill,
2003:161-199.
Práctica 5. Regulación no específica de la actividad enzimática
41
42
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Práctica 5. Regulación no específica de la actividad enzimática
43
44
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Práctica 5. Regulación no específica de la actividad enzimática
45
Práctica
Metabolismo de carbohidratos
6
• Sergio Sánchez Enríquez
• Mercedes Elvira González Hita
• Luis Javier Flores Alvarado
Introducción
Los carbohidratos son las biomoléculas más abundantes
de la naturaleza. Representan más de la mitad de todo el
carbono orgánico y 0.3% del peso corporal en el ser humano. Además, proporcionan de 50 a 60% de la energía
consumida por un individuo.
Definición de carbohidrato
Los carbohidratos son un grupo de biomoléculas orgánicas, entre las que se incluyen los azúcares, como la sacarosa, y los polisacáridos, como el almidón, el glucógeno y
la celulosa, entre otros. En esencia, están compuestos por
carbono, hidrógeno y oxígeno, en una proporción 1:2:1;
por tanto, su fórmula general es Cn(H2O)n.
Clasificación de los carbohidratos
Los carbohidratos se clasifican de acuerdo con el número
de monómeros que contiene en monosacáridos (un monómero), oligosacáridos (de 2 a 10 monómeros unidos
por enlace glucosídico) y polisacáridos (más de 10 monosacáridos unidos). Los monosacáridos, de acuerdo con su
grupo funcional, se dividen en aldosas (polihidroxialdehídos) y cetosas (polihidroxicetonas). A su vez, de acuerdo
con la cantidad de carbonos que contienen, se subdividen
en triosas, tetrosas, pentosas, hexosas y heptosas (de 2 a 7
carbonos, respectivamente).
Funciones de los carbohidratos
1. Fuente energética principal (p. ej., la glucosa).
2. Estructura (como la celulosa en las plantas y la qui-
tina en el exoesqueleto de los insectos).
3. Precursores de biomoléculas complejas, como los
ribonucleótidos del ácido ribonucleico (como la
ribosa) y los desoxirribonucleótidos (la desoxirribosa).
4. Almacén de energía, en forma de almidón en los vegetales y de glucógeno en los animales.
Carbohidratos de la dieta
El individuo puede ingerir los carbohidratos en forma
de monosacáridos y disacáridos, también denominados
azúcares simples, o de polisacáridos, denominados azúcares complejos. Los azúcares simples aumentan la glucosa
sanguínea (glucemia) en mayor proporción y más rápido
que los complejos. Por lo anterior, se recomiendan carbohidratos complejos en los pacientes con diabetes mellitus
para “suavizar” los picos de hiperglucemia posprandial
(después de la ingesta de alimentos). Por lo contrario, en
pacientes con hipoglucemia, se recomienda la ingesta o
administración intravenosa de azúcares simples, para aumentar la glucemia.
Regulación de la glucemia
e importancia biológica
La concentración normal de glucosa en sangre (normoglucemia) es de 60 a 100 mg100 ml, aun durante los estados posprandial, de ayuno o de inanición. La insulina se
encarga de disminuir la glucemia, al promover el ingreso
de glucosa en las células, su utilización (glucólisis), su almacenamiento en hígado y músculo en forma de glucógeno (glucogénesis), y su transformación en triacilgliceroles
en el tejido adiposo, entre otras acciones. Por otra parte,
las hormonas contrarreguladoras de la insulina, como el
glucagon, la adrenalina y los glucocorticoides, elevan la
glucemia al activar la destrucción de glucógeno (glucogenólisis), la formación de glucosa a partir de lactato,
aminoácidos y glicerol (gluconeogénesis), la degradación
de triglicéridos (lipólisis) y la degradación de proteínas
48
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
(proteólisis), al mismo tiempo que reducen el empleo periférico de la glucosa.
La homeostasis de la glucosa es fundamental, porque
las neuronas, los eritrocitos y otras células del organismo
utilizan glucosa como combustible principal, y las consecuencias del déficit o ausencia de glucosa en estos tejidos
son catastróficas.
Cuando el organismo pierde la capacidad de regular
la glucemia, la glucosa plasmática se eleva. A este trastorno se le denomina diabetes mellitus. De acuerdo con
la Norma Oficial Mexicana, “La diabetes mellitus es la
enfermedad sistémica, crónico-degenerativa, de carácter
heterogéneo, con grados variables de predisposición hereditaria, con participación de factores ambientales, que
se caracteriza por hiperglucemia crónica, debido a la deficiencia en la acción o producción de insulina, lo que
afecta el metabolismo intermedio de los carbohidratos,
proteínas y grasas”.
Categorías de la glucemia en ayuno
1. Glucosa plasmática en ayuno <100 mgdl (<5.6
mmolL) = glucosa normal.
2. Glucosa plasmática en ayuno ≥100 mgdl y ≤125
mgdl (5.6 a 6.9 mmolL) = glucemia anormal de
ayuno (prediabetes).
3. Glucosa plasmática en ayuno ≥126 mgdl (≥7.0
mmolL) = diagnóstico provisional de diabetes.
También se puede diagnosticar diabetes en hemoglobina glicada o glucosilada ≥6.5%, glucemia ≥200
mgdl durante una curva de tolerancia oral a la glucosa y glucemia casual ≥200 mgdl más signos y síntomas clásicos de diabetes.
hiperinsulinemia) induce al desarrollo de un conjunto de
alteraciones que evolucionan a otras enfermedades crónicas, como la diabetes mellitus y las enfermedades cardiovasculares. Por tanto, es importante detectar la RI de
manera oportuna para evitar, en lo posible, el desarrollo
de esas enfermedades.
Existen varios métodos para el diagnóstico de resistencia. En esta práctica, se utiliza la medición de la concentración de insulina sanguínea en ayunas, como una
expresión de la sensibilidad a la hormona (opcional).
También se han propuesto diversas fórmulas para la
estimación de RI; una de las más utilizadas es el análisis del modelo homeostático, más conocido como índice
HOMA:
HOMA-RI =
[Concentración de insulina en ayuno (μUml) ×
Concentración de glucosa en ayuno mmolL]
22.5
La fórmula para el cálculo del HOMA, cuando se
utilizan mgdl de glucosa, queda de la siguiente manera:
[Concentración de insulina en ayuno (μUml) ×
Concentración de glucosa en ayuno mgdl]
HOMA-RI =
405
En la práctica clínica cotidiana, los métodos más
simples y económicos para estimar la RI son la concentración sanguínea de triglicéridos (TG) y el valor de la
relación TGHDL − colesterol. Los puntos de corte son:
• Nivel circulante de triglicéridos ≥ 130 mgdl.
• Relación TGHDL-c ≥ 3.0
Evaluación antropométrica
Hemoglobina glucosilada
La elevación continua y prolongada de la glucemia, que
es una característica de la diabetes, origina la glucosilación de las proteínas del organismo. Esta modificación
química causa alteraciones en su función y su estructura, lo que tiene relevancia en las complicaciones crónicas de la diabetes. La hemoglobina glucosilada (HbA1c)
y la albúmina glucosilada son las proteínas circulantes
en sangre, con aplicación en el diagnóstico y pronóstico
de la diabetes. La concentración de HbA1c se utiliza en la
práctica clínica como un criterio de la calidad del control
del paciente diabético en las 6 a 8 semanas previas a la
prueba.
Resistencia a la insulina
La resistencia a la insulina (RI) se define como la disminución de la capacidad de la insulina para ejercer sus
acciones biológicas en tejidos típicos de destino, como el
músculo estriado, el hígado o el tejido adiposo. Como
respuesta compensatoria, el páncreas produce hiperinsulinemia. La combinación de estas dos condiciones (RI e
La antropometría es la técnica que se ocupa de medir las
dimensiones físicas y la composición global del cuerpo
humano en diferentes edades y estados fisiológicos. Como
ventajas principales, se encuentran su sencillez y bajo costo. Las mediciones antropométricas permiten evaluar la
composición corporal y hacer inferencias acerca del crecimiento y desarrollo físico, y del estado de nutrición del
individuo. Cuando se evalúa la composición corporal, el
peso normal se divide entre masa magra (80%) y masa
grasa (20%).
Los depósitos de grasa visceral están relacionados
con el desarrollo de enfermedades crónicas, como resistencia a la insulina, diabetes mellitus y enfermedades
cardiovasculares que representan las primeras causas de
morbilidad y mortalidad en México y el mundo. En épocas recientes, se ha identificado que el diámetro de cintura
tiene más valor, porque, al parecer, está relacionado con
los depósitos de grasa visceral y las morbilidades debidas
a la obesidad.
En el cuadro 6-1 se muestran las mediciones antropométricas más utilizadas en la práctica clínica.
49
Práctica 6. Metabolismo de carbohidratos
Cuadro 6-1. Medidas antropométricas
y su aplicación en la práctica clínica.
Medida
Cuadro 6-2. Categorías de la presión
arterial normal y de la hipertensión.
Evalúa
Peso
Masa corporal total
Estatura
Longitud total
del cuerpo
Circunferencia de muñeca
Índice cintura-cadera (ICC)
Complexión
Depósitos de grasa en la
región abdominal
Sistólica
(mmHg)
Diastólica
(mmHg)
Óptima
<120
<80
Normal
120 a 129
80 a 84
Normal alta
130 a 139
85 a 89
Grado I (leve)
140 a 159
90 a 99
160 a 179
100 a 109
Categoría
Hipertensión
Índice de masa corporal
(IMC)
Desnutrición, sobrepeso y
normalidad
Grado II (moderada)
Grado III (intensa)
>180
>110
Panículo adiposo
Espesor de la grasa debajo
de la piel
Sistólica aislada
>140
<90
Sumatoria de panículos
adiposos
% de grasa corporal
% del peso ideal (PI)
Desnutrición, sobrepeso y
normalidad
% del peso habitual (PH)
Desnutrición, sobrepeso y
normalidad
% de cambio reciente de
peso (CRP)
Riesgo de morbilidad y
mortalidad
Tomado de Journal of Hypertension (2003;21:1011-1053; Eur
Heart J, 1998;19:1434-1503;1998)
Objetivos específicos
• Desarrollar las habilidades básicas de la antropometría.
• Desarrollar habilidades para la toma de presión
arterial.
• Demostrar habilidades para la obtención y manejo
de muestras sanguíneas.
• Diferenciar los cambios de la glucemia en el estado
pre y posprandial.
• Determinar la glucemia utilizando tiras reactivas.
Modificado de Trejo B. Evaluación del estado de nutrición.
En: Pérez Lizaur AB, Marvan Laborde L. Manual de Dietas
normales y terapéuticas, 5a ed. Prensa Médica Mexicana,
2005:57.
Materiales y equipo
Evaluación de la presión arterial
La toma de la presión se utiliza para medir la fuerza o
presión que ejerce la sangre en las paredes de las arterias.
La sangre no fluye de forma continua, lo hace a borbotones y en oleadas que corresponden a cada latido del
corazón. La presión tiene dos medidas: la presión sistólica es la máxima y la diastólica es la mínima; ambas se
representan con cifras: 12080.
La presión arterial puede presentar variaciones entre
una persona y otra, además de variaciones durante el día.
Por lo general, cuando una persona duerme, la presión
tiende a disminuir; cuando tiene actividad física, a elevarse.
La presión alta (hipertensión arterial) desencadena
problemas cardíacos, renales, vasculares, etc. En el cuadro
6-2 se muestran los valores de la presión arterial normal
y los diferentes grados de hipertensión.
Objetivo general
• Analizar la relación entre las mediciones antropométricas y la glucemia.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Cinta métrica flexible
Báscula de pedestal con estadímetro
Marcador de tinta indeleble (permanente)
Jeringas desechables de 5 y 10 ml, o aguja y
adaptador para vacutainer
Tubo vacutainer rojo
Torniquete
Lancetas
Torundas de algodón secas y con alcohol
Tiras reactivas para glucosa
Pipetas Pasteur
Bulbos de látex para pipetas Pasteur
Micropipetas de 20, 25, 50 y 200 μl
Microtubos de 1.5 ml para centrífuga
Gradillas para tubos de ensayo
Gradillas para microtubos
Pipetas de 5 ml
Celdillas de 1 cm para espectrofotómetro
Centrífuga clínica
Espectrofotómetro de luz visible
Soluciones y reactivos
• Equipo (kit) para determinación enzimática de glucosa
con patrón
50
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Flujograma de las actividades de la práctica
de metabolismo de carbohidratos
gramos entre la estatura en metros elevada al cuadrado, como se muestra en la siguiente fórmula:
IMC =
Evaluación
de laboratorio
Evaluación
clínica
(para todos los
alumnos)
1. Medir peso,
talla y diámetro
de cintura
2. Realizar tomas
de presión
arterial
Extraer sangre
venosa a tres
voluntarios
en estado de
ayuno
Cuantificar
glucemia en
ayuno utilizando
tiras reactivas
(el resto de los
estudiantes)
Cuantificar glucemia basal, 30 y
90 minutos pospandriales
Figura 6-1. Flujograma de la práctica del metabolismo de carbohidratos.
p
t2
p = peso en kilogramos
t = talla en metros
Resultado _________
4. Medir la circunferencia de cintura.
La circunferencia de cintura (CC) se debe medir
en centímetros, utilizando una cinta métrica (figura
6-2), mientras el individuo está parado en posición
de firmes, con los brazos colgando del cuerpo y el
abdomen descubierto. La cinta debe estar paralela al
piso. Tomar como referencia la mitad de la distancia
entre el borde costal inferior y el borde superior de
la cresta ilíaca. Registrar la medida en centímetros y
con una precisión de 0.1 cm.
Resultado _________
Desarrollo experimental
Procedimiento general (figura 6-1)
A) Mediciones antropométricas
Las mediciones antropométricas se realizarán de acuerdo
con las normas antropométricas internacionales aplicadas por la International Society for the Advancement of
Kinanthropometry (ISAK, 2001). Debe tomarse en cuenta
que algunas de estas medidas se utilizan de nuevo en la
Práctica 7.
Todos los alumnos deben realizar las siguientes actividades, trabajando en binas o pares:
1. Medir el peso.
El peso corporal se puede medir en báscula de
pedestal o con la báscula de bioimpedancia con precisión de ±100 g. El sujeto debe quitarse los zapatos,
quedarse con una cantidad mínima de ropa y colocar
su cabeza en el plano de Frankfurt.
5. Medición de la circunferencia de cadera.
La circunferencia de cadera (CCa) se puede medir en la misma posición que la CC. Realizar la medición, con la cinta métrica paralela al piso, en el nivel
de ambos trocánteres mayores y pasando por la parte
más prominente de los glúteos.
Resultado _________
6. Calcular el índice de cinturacadera (ICC).
El ICC se obtiene al dividir la circunferencia de
cintura entre la de cadera, de acuerdo con la siguiente
fórmula:
ICC =
Circunferencia de la cintura
Circunferencia de la cadera
El ICC es útil para determinar si la grasa corporal está distribuida en el nivel central (abdominal,
visceral o androide) o periférica (localizada en brazos y cadera o ginecoide). Es importante conocer esta
Resultado _________
2. Medir la talla.
La estatura se puede medir con el estadímetro de
la báscula de pedestal o de pared, con una precisión
de ±0.5 cm. Medir con los sujetos descalzos y durante una inspiración profunda, mientras mantiene
la cabeza en el plano de Frankfurt.
Resultado _________
3. Calcular el índice de masa corporal (IMC).
El IMC (índice de Quetelet) es el parámetro más
útil y práctico para determinar la condición nutricia
de un individuo. Se obtiene al dividir el peso en kilo-
Figura 6-2. Cinta métrica flexible para medición de circunferencias corporales.
Práctica 6. Metabolismo de carbohidratos
51
distribución porque la grasa visceral se relaciona con
mayor riesgo de alteraciones metabólicas y de enfermedades cardiovasculares.
Resultado _______
B) Medición de la presión arterial
Técnica práctica para la toma de presión arterial
La persona que se va a evaluar debe estar sentada en posición cómoda, por lo menos durante 5 minutos, tranquila
y sin hablar, con brazos y piernas relajados.
• Colocar el brazo sobre el nivel del corazón, de manera que descanse sobre una mesa; si la persona
está acostada, extender tan sólo el brazo.
• Colocar el brazalete del baumanómetro alrededor
del brazo sin ropa, por encima del codo. El brazalete no debe quedar muy apretado; se recomienda
que quede suelto donde quepan dos dedos entre el
brazo y el mango (figura 6-3).
• Colocar el diafragma del estetoscopio en el lado
interior de la hendidura del codo (figura 6-4). Insuflar con rapidez el brazalete del baumanómetro con
la perilla (bombilla de hule), a una presión de 200
a 220 mmHg (si se insufla la banda con lentitud,
se puede alterar la presión). Comenzar la libera-
Figura 6-4. Técnica para tomar la presión arterial. Colocar
el diafragma del estetoscopio en el lado interno de la hendidura del codo. Insuflar con rapidez el brazalete del baumanómetro con la perilla (bombilla de hule) a una presión de 200
a 220 mmHg; si se insufla el brazalete con lentitud se podría
alterar la presión.
Resultado de presión arterial (primera toma) ________
Presión arterial (segunda toma) _________
ción del aire poco a poco; es recomendable poner
atención para escuchar el pulso del corazón, memorizar o anotar el número indicado en el marcador con el primer latido. Este número es la presión
sistólica (máxima). Cuando el pulso se detenga al
seguir desinflando la banda, anotar o memorizar
una vez más el número indicado, que representa
la presión diastólica (baja). Es recomendable dejar
pasar por lo menos 3 minutos antes de tomar de
nuevo la presión.
Este procedimiento requiere cierta práctica.
La arteria braquial es un vaso sanguíneo que va
del hombro a debajo del codo. Esta arteria es la
más utilizada para medir la presión.
Figura 6-3. Localización del pulso antebraquial y colocación del brazalete del baumanómetro. Localizar con los dedos
índice y medio el pulso de la arteria antebraquial. Colocar el
brazalete del baumanómetro alrededor del brazo sin ropa,
por encima del codo. La banda no debe quedar muy apretada; es recomendable dejarla tan suelta como para que quepan dos dedos entre el brazo y el mango.
C) Extracción y procesamiento
de muestras biológicas
1. Extraer, a tres voluntarios, una muestra de 5 ml de
sangre venosa. Utilizar tubos vacutainer sin anticoagulante (de tapa roja). El estudiante que extraiga la
muestra debe utilizar guantes de látex para su protección.
52
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
2. Los estudiantes seleccionados deben ingerir un de-
sayuno habitual en cuanto se les tomen las muestras
basales; deben tomárseles nuevas muestras a los 30 y
90 minutos.
3. Centrifugar las muestras a 2 500 revoluciones por minuto (rpm) durante 5 minutos.
4. Con una pipeta Pasteur, aspirar el suero (líquido de
color amarillo en la parte superior del tubo), teniendo cuidado de no aspirar el paquete celular (en el
fondo del tubo y de color rojo).
D) Determinación de la glucemia
en ayuno y posprandial
Cuadro 6-4. Resultados de glucemia en ayuno y
posprandial.
Voluntario
1
Tiempo
Voluntario
2
Voluntario
3
Basal
30 minutos
90 minutos
120 minutos
(condicionada)
Fundamento
En solución acuosa, la enzima glucosa oxidasa oxida a
la glucosa para dar ácido glucónico y peróxido de hidrógeno.
1. En presencia de la enzima peroxidasa, el peróxido de
hidrógeno reacciona con el fenol y la 4-aminofenazona, para formar un complejo de color rojo.
2. La intensidad de color desarrollada se relaciona de
forma directamente proporcional a la concentración
de la glucosa.
3. Se determina mediante espectrofotometría a una
longitud de onda entre 460 y 560 nm, empleando un
patrón de 100 mgdl de glucosa.
Procedimiento
A partir de las muestras obtenidas y procesadas de los
tres estudiantes seleccionados, realizar el siguiente procedimiento:
1. Con el marcador indeleble, etiquetar tres tubos de
5. Después de 10 minutos, leer en el espectrofotómetro
la absorbancia de cada tubo contra el reactivo de destino, a una longitud de onda de 520 nm.
6. Calcular la glucemia mediante la siguiente fórmula:
Glucosa Absorbancia del problema Concentración
×
=
del patrón
(mgdl)
Absorbancia del patrón
7. Valores esperados: 70 a 105 mgdl o 3.8 a 5.8 mmolL.
8. Realizar el mismo procedimiento después de desayu-
nar y tomar muestras a los 30 y 90 minutos. Tomar
una nueva muestra, a los 120 minutos, a los estudiantes que después de 90 minutos sigan con valores de
glucemia entre 140 y 200 mgdl. Registrar en el cuadro 6-4 los resultados de glucemia de cada uno de los
voluntarios:
Con los datos obtenidos, realizar un cuadro
comparativo de los valores de glucosa en ayuno y
posprandial.
ensayo, de acuerdo con el esquema del cuadro 6-3.
2. Añadir a cada tubo 2.5 ml de reactivo para glucosa.
3. Preincubar las muestras a 37ºC (con el calor de la
Ayuno
Pospandrial
mano).
4. Agregar 20 μl (0.020 ml) de agua, suero o estándar a
los tubos correspondientes y mezclar con suavidad.
Cuadro 6-3. Organización y contenido
de los tubos para medición de glucosa.
Agua
destilada
Solución
patrón
Suero o
plasma
Reactivo
No. 1
Blanco
20 μl
—
—
2.5 ml
No. 2
Patrón
—
20 μl
—
2.5 ml
No. 3
Problema
—
—
20 μl
2.5 ml
Tubo
E) Determinación de la glucosa sanguínea
capilar utilizando tiras reactivas
Fundamento
Las tiras reactivas para glucosa son tiras plásticas con un
cojinete impregnado con reactivos en un extremo. Contienen:
• Glucosa oxidasa 0.6 U.I.
• Peroxidasa 6.0 U.I.
Práctica 6. Metabolismo de carbohidratos
• Dihidrocloruro de orto-toluidina 0.0750 mg.
• Ingredientes no reactivos 91 mg.
Actividades de aprendizaje
1. Realizar una encuesta en que se registre edad, género,
Procedimiento
1. Con una torunda impregnada en alcohol, limpiar el
dedo que se va a puncionar.
2. Con una lanceta, puncionar el pulpejo o la yema del
2.
dedo.
3. Obtener una gota de sangre al ejercer presión en el
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
dedo puncionado.
Colocar la gota de sangre en el cojinete reactivo de
la tira.
Dispersar la gota de sangre sobre el área reactiva.
Secar el excedente de sangre a los 30 segundos exactos, ejerciendo presión con papel facial en dos ocasiones (no frotar).
Colocar la tira reactiva sobre el papel facial, con el
cojinete hacia arriba.
Esperar 90 segundos exactos.
Realizar la lectura comparando con la carta de colores que está adherida al frasco.
Anotar los resultados.
NOTA: estas indicaciones pueden variar de
acuerdo a la marca de la tira reactiva, por lo cual
se sugiere siempre leer las indicaciones del frasco a
utilizar.
53
3.
4.
5.
peso, talla, IMC, circunferencia de cintura, circunferencia de cadera, ICC y glucemia de cada uno de los
integrantes del grupo.
Registrar en una base de datos de Excel los datos de
la variables anteriores y sacar el promedio y la desviación estándar.
Identificar la cantidad y el porcentaje de compañeros
que tengan peso bajo, peso normal, sobrepeso, obesidad tipo I, tipo II y tipo III.
Analizar qué porcentaje de compañeros tiene glucemia normal, hiperglucemia de ayuno o diabetes, de
acuerdo con los criterios descritos en esta práctica.
Dividir la base de datos por género y repetir de la
acción 1 a la 4.
a) ¿La frecuencia de alteraciones de peso (bajo, so-
brepeso y obesidad) es mayor en hombres o en
mujeres?
b) ¿La frecuencia de alteraciones de la glucemia es
mayor en hombres o en mujeres?
Resultado de la glucemia capilar _________
Discusión
Conclusiones
3. Realizar una evaluación propia y de la familia, incluyen-
do cada uno de los datos solicitados en el cuadro 6-5.
Contestar la encuesta del cuadro 6-6 y determinar cuál es el riesgo propio y de los familiares de desarrollar diabetes mellitus tipo 2.
En caso de que el alumno o sus familiares tengan
un puntaje mayor de 9, se sugieren cambios en los
hábitos de alimentación (especificados por un nutriólogo de la unidad de síndrome metabólico del laboratorio de bioquímica) y un programa de ejercicio (caminata diaria de 30 minutos) para disminuir el riesgo
de desarrollar diabetes y para mantenerse sanos.
4. En el cuadro 6-7 se muestran algunas pruebas clínicas y de laboratorio que orientan al grado de control
metabólico de un paciente diabético. En caso de que
se tenga un familiar con esta enfermedad, evaluar su
grado de control metabólico.
5. De acuerdo con este cuadro, indicar cómo se considera el control metabólico del familiar o los familiares
diabéticos:
Adecuado _________________
Aceptable _________________
Deficiente _________________
Si el familiar tiene un control metabólico deficiente, se sugiere explicar la importancia de lograr un
control adecuado.
54
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Cuadro 6-5. Evaluación de factores de riesgo para diabetes en el entorno familiar del estudiante.
Familiares
Evaluación
Estudiante
Padre
Madre
Otros
Presión arterial (mmHg)
IMC (kgm2)
Diámetro de cintura
(cm)
Uso de medicamentos
antihipertensivos (síno)
Último valor de glucosa
(mgdl)
Actividad física por semana (horas)
Consumo de frutas y
verduras a diario (síno)
Cuadro 6-6. Calificación de riesgo para el desarrollo de diabetes mellitus tipo 2.
Variable
Puntaje
Edad (años)
45 a 54
55 a 64
2
3
IMC (kgm2)
Mayor de 25 y menor de 30
Mayor de 30
1
3
Circunferencia de cintura (cm)
Hombres: 94 a <102
Mujeres: 80 a <88
Hombres: ≥102; mujeres: ≥88
3
3
4
Uso de medicamentos antihipertensivos (para presión alta)
2
Antecedentes de glucosa sanguínea alta
5
Actividad física menor a 4 horas por semana (individuos que
trabajan sentados, no caminan mucho, que en su tiempo
libre leen, ven televisión o no realizan labores físicas en el
hogar)
2
Falta de consumo diario de frutas y vegetales
1
Total
Estudiante
Familiares
Otros
0 a 20
Una calificación ≥9 significa riesgo alto de desarrollar diabetes mellitus (con 81% de sensibilidad y 76% de especificidad). La
sensibilidad es la probabilidad de que la prueba sea positiva para sujetos que, en el futuro, pueden requerir tratamiento farmacológico por diabetes. (En este caso, 81% de las personas con calificación igual o mayor de 9 pueden requerir tratamiento
farmacológico por diabetes en el futuro.) La especificidad es la probabilidad de que la prueba sea negativa en personas que no
requieran tratamiento farmacológico en el futuro. (En este caso, es probable que 76% de las personas que tengan calificación
menor de 9 no desarrollen diabetes tratada con fármacos.)
Modificado de: Lindström J, et al. Diabetes Care, 2003;26:725-731.
55
Práctica 6. Metabolismo de carbohidratos
Cuadro 6-7. Indicadores de control metabólico.
Grado de control
Indicador
Adecuado
Aceptable
Deficiente
Glucemia en ayunas (mgdl)
80 a 120
121 a 140
>140
Glucemia posprandial 2 h (mgdl)
80 a 160
160 a 180
>180
HbA1c % (hemoglobina glucosilada)
3a6
<7
>8
Colesterol (mgdl)
<200
200 a 240
>240
Colesterol de LDL (mgdl)
<100
100 a 129
>130
Colesterol de HDL (mgdl)
>45
35 a 45
<35
Triglicéridos (mgdl)
<130
150 a 250
>250
Relación TGHDL
≥3
<130
>130
Presión arterial (mmHg)
<13085
>14090
Índice de masa corporal (kgm2)
20 a 25
>25
Colesterol no HDL (mgdl)
Circunferencia de cintura (cm)
Mujeres: <88
Hombres: <100
Modificado de American Diabetes Association 1998.
Actividad complementaria
Resolver el siguiente cuestionario:
3. ¿Cómo se espera que se encuentre la glucemia, la
insulina y el glucagón en el estado de ayuno y posprandial?
1. Definir estado posprandial.
4. ¿Qué tipo de carbohidratos elevan menos la glucemia
2. ¿Cuál es la diferencia entre suero y plasma?
del paciente diabético? Fundamentar la respuesta.
56
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
5. ¿Cómo están los niveles de insulina sérica si la perso-
na ingiere una dieta abundante en fructosa y por qué?
Preparación de reactivos
Reactivo para glucosa.
Se prepara a temperatura ambiente con agua destilada o desionizada, libre de contaminantes. Al contenido
de cada frasco, añadir la cantidad de agua indicada en
la etiqueta. Una vez diluido, se tiene la composición del
cuadro 6-8.
Cuadro 6-8. Composición de reactivos.
Ingrediente activo
Concentración mínima
aproximada
Glucosa oxidasa
(Aspergillus)
2 000 UL
Peroxidasa (rábano
picante)
1 250 UL
4-aminofenazona
2 mM
Fenolato de sodio
10 mM
Amortiguador de fosfatos
Excipientes y
estabilizadores
100 mM
pH 7 ±0.2
Bibliografía
2003 European Society of Hypertension. European Society of
Cardiology guidelines for the management of arterial hypertension. Journal of Hypertension, 2003;21:1011-1053.
American Diabetes Association. Standards of Medical Care in
Diabetes-2013. Diabetes Care, 2013;36:suppl 1:S11-S66.
Garzón de la Mora P. Manual de prácticas de bioquímica.
Anexo A del proyecto II. 2002:64-66.
Islas Andrade SA, Revilla Monsalve C. Diabetes Mellitus, 3a
ed. McGraw-Hill, 2005.
Lindström J, Tuomilehto J. The diabetes Risk Score. A practical tool to predict type 2 diabetes risk. Diabetes Care,
2003;26:725-731.
McLaughlin T, et al. Use of metabolic markers to identify
overweight individuals who are insulin resistant. Ann Intern
Med, 2003;139:802-809.
Recommendations of the Second Joint Task Force of European
and other Societies on Coronary Prevention. Prevention of
coronary heart disease in clinical practice. European Heart
Journal, 1998;19:1434–1503.
SSA. Modificaciones a la Norma Oficial Mexicana NOM-015SSA2-1994. Diario Oficial de la Federación. México, 2000.
Trejo B. Evaluación del estado de nutrición. En: Pérez Lizaur
AB, Marvan Laborde L. Manual de dietas normales y terapéuticas, 5a ed. Prensa Medica Mexicana, 2005:5
Práctica
Metabolismo de lípidos
• Patricia Heredia Chávez
• Irma Ramos Rodríguez
Introducción
Definición
Los lípidos son uno de los principales grupos de biomoléculas de los seres vivos. Se definen como un conjunto
de compuestos con heterogeneidad química que tienen en
común su poca o nula solubilidad en agua y, por el contrario, su solubilidad en solventes orgánicos como éter y
cloroformo, entre otros.
Funciones
Esa gran heterogeneidad estructural conlleva diversas
funciones biológicas. Entre ellas se encuentran, por citar
algunas: fuente y almacenamiento de energía (triacilgliceroles), reguladores metabólicos y fisiológicos (hormonas
esteroideas y prostaglandinas), vitaminas liposolubles (A,
D, E y K), emulsificantes (sales biliares) y estructura de
las membranas celulares (fosfolípidos y colesterol).
Importancia de la interacción
de los lípidos con el agua
El modo y el grado de interacción de estas biomoléculas
con el agua también determinan aspectos importantes en
los procesos biológicos; por ejemplo, el carácter anfipático de los fosfolípidos favorece la formación eficiente de
micelas y bicapas. Por otra parte, el carácter apolar de los
ácidos grasos y los triacilgliceroles requiere mecanismos
específicos de transporte en la sangre, mediante la albúmina y las lipoproteínas plasmáticas.
Metabolismo de los lípidos
El organismo humano cuenta con la capacidad de sintetizar casi todas las moléculas lipídicas. Sin embargo,
7
• Mercedes Elvira González Hita
• Sergio Sánchez Enríquez
éste debe obtener de los alimentos algunas vitaminas
liposolubles, además los ácidos grasos esenciales, como
el linoleico (C18:9,12), de la familia omega 3, y el linolénico (C18:9,12,15), de la familia omega 6. El organismo
humano tiene vías metabólicas, tanto anabólicas (síntesis
de ácidos grasos, síntesis de triacilgliceroles, síntesis del
colesterol, etc.) como catabólicas (lipólisis, oxidación de
ácidos, oxidación de cuerpos cetónicos, etc.); la activación de las enzimas de estas vías reguladoras depende de
la presencia de múltiples factores bioquímicos y fisiológicos, con el único fin de mantener la homeostasis (para
conocer de manera detallada esta regulación, revísese el
libro de texto).
Consecuencias del exceso
de grasa corporal
La obesidad es el incremento del peso corporal debido al
aumento en la grasa. De manera particular, la grasa localizada en la región visceral propicia diversas alteraciones metabólicas, sobre todo dislipidemias, hiperglucemia
e hipertensión. Estas alteraciones se agravan con el envejecimiento y la continua elevación del peso corporal; además, la presencia de factores hereditarios, puede originar
el síndrome metabólico (SM), que confiere riesgo para
patologías crónico-degenerativas, como diabetes mellitus
tipo 2 y enfermedades cardiovasculares, que en la actualidad son las primeras causas de morbilidad y mortalidad
en México.
El factor fisiopatológico central que vincula la obesidad con las patologías crónicas es la resistencia a la insulina, que se evalúa mediante distintos métodos. El clamp
insulina-glucosa es el método más exacto; sin embargo,
es costoso, complejo y requiere experiencia en la técnica.
Métodos más prácticos y con buena correlación con el
clamp son el modelo homeostático (índice HOMA-RI)
58
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
y el índice triacilglicerolescolesterol en lipoproteínas de
alta densidad (TGHDL).
Diversos organismos internacionales han establecido
los criterios para el diagnóstico del SM, con base en la
presencia de entidades clínicas en los sujetos afectados.
En el caso de México, se ha reportado que los criterios del
ATP III para el diagnóstico del SM resultan adecuados
(cuadro 7-1).
Esta práctica está dirigida a revisar la relevancia clínica de la concentración de lípidos en la sangre, como
indicador bioquímico del estado de salud de un individuo
y de la aplicación de los parámetros clínicos para la detección del síndrome metabólico.
Objetivo general
Analizar la relación entre las mediciones antropométricas
y el perfil de lípidos.
Cuadro 7-1. Definición del síndrome metabólico,
de acuerdo con los criterios del ATP III.*
Presencia de tres o más de los siguientes criterios:
1. Circunferencia de cintura: >102 cm en hombres y
>88 cm en mujeres
2. Triglicéridos (TG) séricos: ≥1.7 mmolL (150 mgdl)
3. Presión sanguínea: ≥13085 mmHg
4. HDL-colesterol: <1.05 mmolL (40 mgdl) en hombres
y <1.3 mmoldl (50 mgdl) en mujeres
5. Glucosa sanguínea: ≥6.1 molesL (110 mgdl)
*NCEP-ATP III: the National Cholesterol Education Program’s
Adult Treatment Panel IIl, mejor conocido como ATP III.
Tomado de: Kahn R, Buse J. Diabetologia. ATPIII: adult treatment panel III, 2005;48:1684-1699.
Desarrollo experimental
Procedimiento general
Objetivos específicos
1. Obtener el porcentaje de grasa mediante bioimpe-
dancia.
2. Determinar la categoría de peso de acuerdo con el
IMC.
3. Determinar el riesgo cardiovascular de acuerdo con
el ICC.
4. Determinar la concentración sanguínea de colesterol
total, HDL-colesterol y TG.
5. Calcular el valor del índice TGHDL.
6. Relacionar los cambios de concentración de colesterol y TG con la dieta.
Materiales y equipo
Para antropometría
• Báscula de bioimpedancia
Para las pruebas de laboratorio
• Espectrofotómetro
• 8 tubos de ensayo de 13 × 100
• Gradilla para tubos de ensayo
• 10 tubos de ensayo de 18 × 150 con tapón
• Pinzas para tubo de ensayo
• Microtubos cónicos
• Parafilm
• 10 pipetas serológicas de 5 ml
• Micropipetas de 20 μl
• Puntas para micropipeta
• Vaso de precipitado de 200 ml
• Estufa
• Termómetro
• Agujas para vacutainer verdes y negras
• Adaptador vacutainer
• Tubos vacutainer de tapa roja y morada
• Torniquete
• Torundas de algodón con alcohol
Los alumnos deben trabajar en binas para realizar las
mediciones antropométricas uno al otro. Después deben
tomar muestras de sangre, centrifugarlas y obtener el suero o plasma para cuantificar los lípidos.
Experimento 1
MEDIDAS ANTROPOMÉTRICAS
A) Clasificación del peso corporal
de acuerdo con el IMC.
A partir del valor de IMC calculado en la Práctica 6,
identificar y resaltar o subrayar en qué categoría de peso
se encuentra el alumno, de acuerdo con los puntos de corte del cuadro 7-2.
Para la interpretación adecuada del IMC se debe
considerar si el individuo es de talla baja, si cursa algún
estado fisiológico como el embarazo, si presenta aumento
de peso a expensas de masa muscular (fisicoculturistas o
Cuadro 7-2. Clasificación del peso de acuerdo
al IMC.*
Criterio
Bajo peso
Punto de corte
18.50
Peso normal
18.50 a 24.99
Sobrepeso
25.00 a 29.99
Obesidad I
30 a 34.99
Obesidad II
35 a 39.99
Obesidad III (mórbida)
*OMS.
40
Práctica 7. Metabolismo de lípidos
Cuadro 7-3. Clasificación del riesgo
cardiovascular de acuerdo con el ICC.
Grado de riesgo
Bajo
Medio
Alto
Mujeres: ≥0.80
Hombres: ≥0.90
B) Clasificación del riesgo cardiovascular,
de acuerdo con el ICC.
A partir del ICC calculado en la práctica 6, identificar
y resaltar o subrayar en qué categoría de riesgo se encuentra el alumno, de acuerdo con los puntos de corte
del cuadro 7-3.
C) Medición del porcentaje de grasa corporal
mediante bioimpedancia eléctrica.
El fundamento de la bioimpedancia se describe en la
Práctica 1.
Procedimiento
1. Oprimir el botón naranja y enseguida el verde. Al
3.
4.
5.
6.
7.
Género
Porcentaje de grasa
normal
Masculino
15 a 18
Femenino
20 a 25
<0.73
fisicoconstructivistas) y si se trata de niños o personas de
edad avanzada (en ambos casos, existen tablas más apropiadas para su evaluación).
2.
Cuadro 7-4. Porcentaje de grasa corporal
normal de acuerdo con el género.
Punto de corte del ICC
Mujeres: 0.73 a 0.79
Hombres: 0.73 a 0.89
presentar la opción 1, elegirla oprimiendo de nuevo
el botón naranja.
Aparecen dos opciones de manera intermitente:
adulto y niño. Elegir la adecuada con el botón verde
y aceptar con el botón naranja.
Cuando aparezcan las siluetas de una mujer y un
hombre, elegir la opción adecuada, con el mismo
procedimiento del paso anterior.
Una vez programada la báscula con la edad y sexo
del paciente, sólo falta registrar la estatura en centímetros. Para ello, oprimir el botón verde hasta
completar la medida deseada y aceptar con el botón
naranja.
Queda una señal intermitente en los números de la
pantalla. Cuando se borren, oprimir el botón que se
encuentra al pie de la báscula y que tiene el número 1.
Cuando la báscula marque 0.0 kg, es el momento indicado para pesar al paciente. Éste debe encontrarse
descalzo; además, deben hacerse las plantas de los
pies con una torunda impregnada en alcohol, para
retirar cualquier resto de polvo, sudor o grasa.
La primera lectura indica el peso en kilogramos del
paciente, seguida por el porcentaje de grasa corporal.
59
La báscula se apaga de manera automática después de que el paciente descienda de ella.
Resultado % de grasa _________ .
D) Clasificación del porcentaje
de grasa de acuerdo con el género.
Una vez hecha la medición de grasa mediante impedancia, se debe identificar si el porcentaje obtenido es normal, bajo o alto, de acuerdo con el género (cuadro 7-4).
Actividades de aprendizaje
1. Registrar el porcentaje de grasa de cada uno de los in-
tegrantes del grupo.
2. Identificar el número y el porcentaje de compañe-
ros que tienen obesidad visceral, de acuerdo con el
ICC.
3. Identificar el número y el porcentaje de compañeros que tienen alto riesgo cardiovascular, de acuerdo
con el ICC.
4. Dividir la base de datos por género.
a) ¿Quiénes tienen más grasa corporal, los hombres
o las mujeres?
b) ¿Quiénes tienen más frecuencia de riesgo cardio-
vascular, los hombres o las mujeres?
3. Escribir las conclusiones de acuerdo con los resul-
tados.
60
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
4. ¿Qué acciones se podrían establecer para normalizar
principio, a colest-4-en-3-ona y peróxido de hidrógeno.
3. El peróxido de hidrógeno se combina con fenol y
4-aminoantipirina para formar un cromóforo, en
cantidades directamente proporcionales a la concentración de colesterol en la muestra. El aumento en la
concentración de quinoneimina provoca uno correspondiente en la absorbancia a 500 nm, lo que permite
el cálculo de la concentración del colesterol.
las variables alteradas?
Procedimiento
1. Obtener la muestra de sangre, de casi 5 ml, de volun-
Experimento 2
INDICADORES BIOQUÍMICOS
A) Determinación cuantitativa
del colesterol sérico.
2.
Significado clínico
La cuantificación del colesterol en suero sirve como indicador de las funciones hepática y biliar, la absorción
intestinal, el riesgo de enfermedades cardiovasculares,
las funciones tiroideas y las enfermedades arteriales. Las
concentraciones de colesterol son importantes en el diagnóstico y la clasificación de hiperlipoproteinemias. De la
misma manera, la concentración del colesterol varía de
acuerdo con la dieta, el estrés, la edad, el género, el peso
corporal, el equilibrio hormonal, la actividad física y el
embarazo.
6.
Metodología
7.
Método enzimático colorimétrico de punto final, que se
basa en la formulación de Allain y colaboradores, además
de la modificación hecha por Roeschlau.
8.
3.
4.
5.
tarios en ayuno de 12 horas. Utilizar el sistema vacutainer o jeringa y colocar la muestra en tubos secos, sin anticoagulante (tapa roja). Es importante que
quien tome la muestra se proteja con guantes de látex
y siga la norma para toma de muestras (práctica 1,
Obtención y manejo de muestras biológicas).
Centrifugar las muestras a 3 500 rpm durante 5 minutos, teniendo los cuidados referidos en el apartado
de centrifugación de la Práctica 1. Para esto, se necesitan muestras de suero o plasma de un voluntario en
ayuno de 12 horas.
Organizar los tubos, marcarlos con tinta indeleble, de
acuerdo con lo indicado en el cuadro 7-5.
Una vez colocados los reactivos, mezclar y dejar en
reposo por 10 minutos a 37°C o 15 minutos a temperatura ambiente.
Ajustar el espectrofotómetro a 500 nm de longitud
de onda y calibrar con el blanco hasta obtener absorbancia cero.
Leer la absorbancia de cada muestra, lavando la celdilla con agua destilada entre cada medición.
Registrar en el cuadro 7-6 los resultados de la absorbancia de cada muestra.
Realizar los cálculos de la concentración de colesterol, de acuerdo con la siguiente fórmula:
Absorbancia del
Concentración
Concentración
problema
de patrón
×
del colesterol =
Absorbancia
del
(mgdl)
(mgdl)
patrón)
Fundamento
1. La colesterol esterasa (CE) hidroliza los ésteres de co-
lesterol, mediante enzimas, a colesterol y ácidos grasos libres.
2. La acción de la enzima colesterol oxidasa (CO) oxida
al colesterol libre, incluido el que se encontraba al
9. Registrar en el cuadro 7-6 los resultados de concen-
tración de colesterol para cada muestra.
Cuadro 7-5. Organización de los tubos y su contenido para determinación de colesterol.
Tubo
Agua destilada
Solución patrón
Suero o plasma
Reactivo
1 Blanco
20 μl
—
—
2.0 ml
2 Patrón
—
20 μl
—
2.0 ml
3, 4, 5,…
Problema 1, 2, 3, …
—
—
20 μl
2.0 ml
Práctica 7. Metabolismo de lípidos
Cuadro 7-6. Resultados de absorbancia
y concentración de colesterol para cada muestra.
Tubo
Valor de
absorbancia
61
4. Investigar las causas de hipercolesterolemia.
Concentración
de colesterol
total (mg/dl)
1 Blanco
2 Patrón
3 Problema 1
4 Problema 2
5. Investigar las opciones de tratamiento para la hiper-
5 Problema 3
colesterolemia.
Actividades de aprendizaje
1. De acuerdo con el fundamento, escribir en el cuadro
las estructuras químicas correspondientes:
Ésteres de colesterol —— (CE)
Colesterol + O2 —
+
Colesterol-4-en-3-ona + H2O2
H2O2 + 4-aminoantipirina + Fenol-Peroxidasa
cromógeno quinoneimina + H2O
6. Investigar cuál es la enzima reguladora de la síntesis
de colesterol.
2. Comparar los resultados propios y de los compañe-
ros contra los valores de referencia (140 a 200 mgdl)
y describir si alguno tuvo el colesterol alto o bajo.
7. Investigar cuál es la enzima a la que inhiben los medi-
camentos utilizados para reducir el colesterol.
8. ¿Cuál es la reacción normal propiciada por la enzima
a la que inhiben los medicamentos que disminuyen la
concentración del colesterol sérico?
3. Investigar cuáles enfermedades se relacionan con la
concentración elevada de colesterol (hipercolesterolemia).
B) Determinación de la concentración
sérica de triacilgliceroles (TG).
Significado clínico
Los triacilgliceroles son una familia de lípidos compuestos por una molécula de glicerol y por tres ácidos grasos.
Sus fuentes son la dieta y la síntesis endógena a partir
62
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
3. Organizar los tubos, marcarlos con tinta indeleble
de carbohidratos. Su cuantificación es importante para
el diagnóstico y tratamiento de las hiperlipidemias. Estas
enfermedades suelen ser de origen genético o secundarias
a otros trastornos como nefrosis, diabetes mellitus y padecimientos endocrinos. Se ha identificado que el aumento de los TG es un factor de riesgo para ateroesclerosis y
enfermedades cardiovasculares.
4.
5.
Metodología
6.
Método enzimático colorimétrico de punto final (Trinder). Este procedimiento se basa en el método de Wako y
en las modificaciones de McGowan y colaboradores y de
Fossati y colaboradores.
7.
8.
Fundamento
según corresponda a blanco, patrón o problema 1, 2,
3, etcétera (cuadro 7-7).
Una vez colocados los reactivos, mezclar y dejar en
reposo por 10 minutos a 37°C o durante 15 minutos
a temperatura ambiente.
Ajustar el espectrofotómetro a una longitud de onda
de 500 nm y calibrar con el blanco hasta obtener absorbancia cero.
Leer la absorbancia de cada muestra, lavando la celdilla con agua destilada entre cada medición.
Registrar en el cuadro 7-8 los resultados de la absorbancia para cada muestra.
Realizar los cálculos de la concentración de TG de
acuerdo con la siguiente fórmula:
Absorbancia del
Concentración
problema
Concentración de
del colesterol =
× patrón (mgdl)
Absorbancia del
(mgdl)
patrón)
1. La lipasa hidroliza los TG mediante enzimas a ácidos
grasos libres y glicerol.
2. La adenosina trifosfato (ATP) fosforila al glicerol, en
presencia de glicerol cinasa, para dar glicerol-3-fosfato y adenosina difosfato (ADP).
3. La enzima glicerol fosfato oxidasa oxida al glicerol-3fosfato para dar dihidroxiacetona fosfato y peróxido
de hidrógeno.
4. En una reacción colorimétrica tipo Trinder catalizada
por la peroxidasa, el peróxido reacciona con 4-aminoantipirina y 3,5-dicloro-2-hidroxibencen-sulfonato para producir un color rojo. La absorbancia de
este cromógeno, es proporcional a la concentración
de TG presentes en la muestra.
9. Registrar los resultados de concentración de TG para
cada muestra en el cuadro 7-8.
Actividades de aprendizaje
1. De acuerdo con el fundamento de esta determina-
ción, escribir en el cuadro las estructuras químicas
correspondientes:
Triacilgliceroles + H2O — lipasa
Glicerol + — GK
Procedimiento
1. Obtener la muestra de sangre, de casi 5 ml, de los
+
+
2. ¿Cuál es la función principal de los TG?
voluntarios que estén en ayuno de 12 horas. Utilizar
el sistema vacutainer o jeringa y colocar la muestra
en tubos secos, sin anticoagulante (tapa roja). Los
alumnos que tomen la muestra deben protegerse
con guantes de látex y seguir la norma para toma de
muestras referidas en la Práctica 1.
2. Centrifugar las muestras a 3 500 rpm durante 5 minutos, aplicando los cuidados referidos en la práctica
1, apartado de la centrifugación. Para esta determinación, se requiere de muestras de suero o plasma de
un voluntario en ayuno de 12 horas.
Cuadro 7-7. Organización de los tubos y su contenido para determinación de TG.
Tubo
Agua destilada
Solución patrón
Suero o plasma
Reactivo
1 Blanco
20 μl
—
—
2.0 ml
2 Patrón
—
20 μl
—
2.0 ml
3, 4, 5,…
Problema 1, 2, 3, …
—
—
20 μl
1.0 ml
Práctica 7. Metabolismo de lípidos
6. Investigar cuáles son las opciones de tratamiento
Cuadro 7-8. Resultados de absorbancia
para cada muestra.
Tubo
Valor de
absorbancia
63
para la hipertrigliceridemia.
Concentración
de TG (mg/dl)
1 Blanco
2 Patrón
3 Problema 1
4 Problema 2
5 Problema 3
7. Investigar cuál es la enzima reguladora de la síntesis
de TG.
3. Comparar los resultados de los compañeros contra
los valores de referencia (≤150 mgdl) y describir si
alguno tuvo TG altos o bajos.
8. Investiga el mecanismo que utilizan los fibratos para
disminuir los TG.
4. Investigar cuáles enfermedades se relacionan con la
concentración elevada de TG (hipertrigliceridemia).
C) Determinación cuantitativa
del HDL-c sérico.
Significado clínico
5. Investigar las causas de la hipertrigliceridemia.
Las HDL participan en la captación de colesterol de los
tejidos y en su transporte hacia el hígado, donde se eliminan en forma de ácidos biliares. Por esta razón, al colesterol HDL se le ha denominado colesterol “bueno”: cuando
su concentración es mayor de 40 mgdl en el hombre o de
50 mgdl en la mujer tiene efecto cardioprotector (disminuye el riesgo de infarto cardiaco).
Por el contrario, existe una correlación positiva entre concentraciones bajas de colesterol HDL en plasma
e incidencia de ateroesclerosis, base fisiopatológica del
infarto del miocardio y de accidentes cerebrovasculares.
Existen diversos estados patológicos o factores ambientales relacionados con concentraciones reducidas de HDL:
enfermedades hepatocelulares agudas o crónicas, hiperalimentación intravenosa, malnutrición intensa, diabetes,
anemia crónica, alteraciones mieloproliferativas, enfermedad de Tangier, analfalipoproteinemia, estrés agudo,
algunos medicamentos y tabaquismo.
64
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Cuadro 7-9. Organización de los tubos y su contenido para determinación de HDL-c.
Agua destilada
Patrón HDL-c (S)
Sobrenadante
muestra
Reactivo A (kit de
colesterol)
1 Blanco
100 μl
—
—
1.0 ml
2 Patrón
—
100 μl
—
1.0 ml
3 Problema
—
—
100 μl
1.0 ml
Tubo
La concentración del colesterol HDL se puede aumentar si se realiza actividad física de manera regular, se
aumenta la ingesta de ácidos grasos insaturados o se usan
algunos fármacos.
Metodología
Método enzimático colorimétrico de punto final. Este
procedimiento se basa en el método de Burstein y colaboradores, y en las modificaciones de Grove y colaboradores
de aislamiento de lipoproteínas por precipitación.
Precipitación
1. En un tubo, pipetear 200 μl de la muestra y 500 μl del
2.
3.
4.
Fundamento
Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y las
lipoproteínas de baja densidad (LDL) presentes en la
muestra (suero o plasma), se precipitan en presencia de
fosfotungstato y iones de magnesio. El sobrenadante contiene las lipoproteínas de alta densidad (HDL); de éste, el
colesterol se cuantifica con espectrofotometría mediante
las siguientes reacciones acopladas;
5.
6.
7.
colesterol
colesterol
+ H2O esterasa
esterificado
colesterol +
ácido
graso
8.
colesterol
colesterol + ½ O2 + H2O oxidasa
colestona + H2O2
2 H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol
quinonaimina + 4H2O
peroxidasa
Reactivos
• El frasco A es el reactivo compuesto por fosfotungstato (0.4 mmolL) y cloruro de magnesio (20
mmolL).
• El frasco S es el patrón de colesterol HDL (15
mgdl).
• Reactivos adicionales: reactivo de colesterol.
• Los reactivos y el patrón están listos para su uso.
9.
10.
reactivo A del kit de colesterol HDL. Nota: se pueden modificar los volúmenes de la muestra y el reactivo, siempre y cuando se conserven las proporciones.
Agitar bien y dejar en reposo durante 10 minutos a
temperatura ambiente.
Centrifugar durante 10 minutos a un mínimo de
4 000 rpm en la microcentrífuga refrigerada a 20ºC.
El sobrenadante debe ser claro por completo. En el
caso de persistir la turbidez o de no obtener una buena sedimentación del precipitado, agregar otros 500
μl del reactivo A, mezclar bien y centrifugar de nuevo. Multiplicar el resultado por 1.7 para corregir la
dilución efectuada.
Atemperar el reactivo (kit de colesterol) a temperatura ambiente.
Pipetear en tubos de ensayo de acuerdo con lo descrito en el cuadro 7-9.
Agitar bien e incubar los tubos durante 30 minutos a
temperatura ambiente (16 a 25ºC) o durante 10 minutos a 37ºC.
Ajustar el espectrofotómetro a 500 nm de longitud
de onda y calibrar con el blanco hasta obtener absorbancia cero.
Leer la absorbancia de cada muestra, lavando la celdilla con agua destilada entre cada medición.
Registrar en el cuadro 7-10 los resultados de la absorbancia para cada muestra.
Cuadro 7-10. Resultados de absorbancia
para cada muestra y concentración de HDL.
Tubo
1 Blanco
2 Patrón
3 Problema 1
Procedimiento
4 Problema 2
Obtener suero o plasma con el procedimiento estándar,
ya descrito.
5 Problema 3
Valor de
absorbancia
Concentración
de HDL (mg/dl)
Práctica 7. Metabolismo de lípidos
11. Realizar los cálculos de la concentración de HDL de
acuerdo con la siguiente fórmula:
65
3. Investigar los mecanismos que hacen que la actividad
física aumente la concentración de HDL-c.
Absorbancia del
Concentración
problema
Concentración de
× patrón (mgdl)
del colesterol =
Absorbancia
del
(mgdl)
patrón)
12. Registrar en el cuadro 7-10 los resultados de concen-
tración de HDL para cada muestra.
Valores de referencia
Las concentraciones de colesterol HDL varían de manera
considerable con la edad y el sexo. Se han recomendado
los siguientes valores discriminantes para identificar a individuos con elevado riesgo de enfermedad de las arterias
coronarias:
Hombres: <40 mgdl
Mujeres: <50 mgdl
Riesgo alto de enfermedad
coronaria
>60 mgdl
Riesgo bajo de enfermedad coronaria
4. Investigar por qué los ácidos grasos insaturados au-
mentan la concentración de HDL-c.
Actividades de aprendizaje
1. Comparar los resultados de los compañeros contra
los valores de referencia.
5. Investigar cuáles fármacos o medicamentos aumen-
tan la concentración de HDL.
2. ¿Qué riesgo cardiovascular tienen estos compañeros,
de acuerdo con la concentración de HDL?
D) Cálculo del índice TGHDL.
Emplear la siguiente fórmula:
Valor del índice =
Concentración de TG (mgdl)
Concentración de HDL-c (mgdl)
Valores de referencia
Punto de corte para establecer la posibilidad de resistencia a la insulina: ≥3.0.
66
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Actividades de aprendizaje
Discusión
1. Analizar los resultados a partir de los valores de re-
ferencia proporcionados.
Conclusiones
2. De acuerdo con los resultados del índice TGHDL,
identificar si los compañeros tienen o no resistencia
a la insulina.
Bibliografía
3. Hacer recomendaciones a los compañeros que pudie-
ran tener un valor elevado del índice de TGHDL.
Khan R, Buse J, Ferranini E, Stern M. The Metabolic Syndrome: Time for a Critical Appraisal. Diabetes Care,
2005:28(9):2289-2304.
Product data sheet, Triglyceride-G code No 997-69801. Dallas
Tx: Wako Pure Chemical Industries Ltd.
Roeschlau P, Bernat E, Gruber WA. Clin, chem Clin: biochem,
1974;12(226).
Sánchez-Iglesias A, Fernández-Lucas M, Teruel JL. Fundamentos eléctricos de la bioimpedancia. Nefrologia,
2012;32(2):133-135.
The International Society for the Advancement of Kinanthropometry (ISAK). 2001. http:www.isakonline.comint
[Consultado el 1 de diciembre de 2013.]
Third Report of the National Cholesterol Education Program
(NCEP) Expert Panel on Evaluation, and Treatment of High
Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III Report). Actualización 2004.
World Health Organization. Obesity and overweight. http:
www.who.int [Consultado el 1 de diciembre de 2013.]
Práctica
Metabolismo de compuestos
nitrogenados
• Irma Noemí Lúa Ramírez
• María Rosalba Ruiz Mejía
• Beatriz Teresita Martín Márquez
Introducción
Se denomina sustancias o compuestos nitrogenados a las
biomoléculas que contienen nitrógeno, ya sea macromoléculas o productos de desecho. Las macromoléculas
nitrogenadas con mayor importancia biológica son los
ácidos nucleicos y las proteínas; sus precursores son las
bases nitrogenadas y los aminoácidos. Otros compuestos
nitrogenados son las porfirinas, que se encuentran en la
hemoglobina, la mioglobina, los citocromos y la catalasa,
entre otras moléculas. Los productos del catabolismo de
los ácidos nucleicos, las proteínas y el grupo hemo son
el ácido úrico, la urea y la bilirrubina, respectivamente.
La creatinina proviene del catabolismo de la fosfocreatina, que se forma a partir de tres aminoácidos (arginina,
metionina y glicina) y, por tanto, se le puede considerar
como producto del catabolismo de las proteínas.
No es posible eliminar del organismo el amoníaco
producido por el catabolismo de los aminoácidos; por
tanto, es necesario transformarlo en urea en el hígado.
Hay varios compuestos nitrogenados más que se obtienen
de la incorporación de grupos amino en los carbohidratos
y en lípidos (galactosamina, glucosamina, esfingomielina y lecitina), pero no se estudian en esta práctica. Al ácido úrico, la creatinina y la urea se les elimina en la orina
y constituyen casi 93% de los compuestos nitrogenados
presentes en ésta. El resto lo conforman el amoníaco y
otras sustancias.
La mayor parte del nitrógeno se excreta como urea.
Dentro de los tejidos, es necesaria la desaminación de
los aminoácidos destinados al metabolismo energético
para proporcionar el esqueleto carbonado. Existen tres
mecanismos para la eliminación del grupo amino de los
aminoácidos: transaminación, desaminación oxidativa y
eliminación de una molécula de agua por una deshidratasa (serina o treonina deshidratasa).
8
• Luis Javier Flores Alvarado
• Sergio Sánchez Enríquez
La histidina pierde el grupo amino mediante una
histidasa. Por último, el glutamato libera amoníaco por
desaminación oxidativa. Al amoníaco se le transporta al
hígado, donde se combina con CO2 y ATP para formar
carbamoil fosfato, que se transforma en urea mediante el
ciclo de la urea. Cuando el hígado carece de la capacidad
de formar urea debido a una disfunción hepática provocada, por ejemplo, por cirrosis hepática, el amoníaco
pasa a la circulación general y provoca daños al sistema
nervioso central, que desembocan en coma hepático y, en
última instancia, la muerte.
Balance nitrogenado
En un adulto, se llega a un balance nitrogenado, cuando
la cantidad de nitrógeno ingerido es igual a la del eliminado. El balance nitrogenado debe ser positivo durante el
crecimiento del individuo o cuando se desea aumentar la
masa muscular, y negativo cuando se tiene una alimentación con un contenido proteínico deficiente o cuando se
ingiere una cantidad suficiente de proteína y calorías pero
con deficiencia en un aminoácido esencial. También se
presenta balance negativo por enfermedad debilitante en
la que se presenta un aumento del catabolismo proteínico,
como se observa en el cáncer, la tuberculosis pulmonar o
durante el periodo posoperatorio. Para medir el balance
nitrogenado, se debe tomar en cuenta la cantidad de nitrógeno consumida por las proteínas y eliminada por la
orina, sobre todo en forma de urea. Sin embargo, también
se debe tomar en cuenta el nitrógeno en heces, que representa el nitrógeno no absorbido, y la urea eliminada por el
sudor, sobre todo durante el ejercicio intenso. A partir de
estudios preliminares en que no se tomó en cuenta que los
sujetos que realizaban ejercicio intenso eliminaban urea
en el sudor, se llegó a la conclusión errónea de que no se
utilizaban proteínas durante el ejercicio.
68
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Urea
Una fracción importante de las proteínas se transforma
en urea, como producto de la desaminación de los aminoácidos en el hígado, mediante un proceso denominado
ciclo de la urea. La urea se elimina en la orina a través
de un proceso complejo que tiene lugar en el riñón y que
incluye filtración, secreción, reabsorción y, por último,
excreción. La cuarta parte de la urea se metaboliza en los
intestinos para formar amoníaco y dióxido de carbono
mediante la actividad de la flora bacteriana normal. Más
adelante, este amoníaco se reabsorbe del sistema portal y
se convierte de nuevo en urea en el hígado. Las concentraciones sanguíneas de urea varían de manera proporcional
al contenido de la dieta, al catabolismo de las proteínas
durante la degradación tisular y a la función hepática. En
personas sanas y que ingieren una dieta promedio, la concentración de urea en sangre es un indicador muy sensible
de la función renal. Las concentraciones sanguíneas de
urea se elevan antes que se produzca cualquier alteración
en las concentraciones de creatinina.
Se encuentran concentraciones elevadas de urea en
plasma como consecuencia de una dieta rica en proteínas, aumento en el catabolismo de las proteínas, hemorragia gastrointestinal, ligera deshidratación, choque,
insuficiencia cardíaca o tratamiento con glucocorticoides
(uremia prerrenal). La uremia posrenal se debe a trastornos que obstruyen el flujo urinario: nefrolitiasis, tumor o
hipertrofia prostática. La utilidad de la urea como indicador de la función renal está limitada por la variabilidad
de su concentración plasmática, como consecuencia de
factores no renales.
Ácido úrico
El ácido úrico es el producto final del catabolismo de las
bases púricas (adenina y guanina). Casi todo el ácido
úrico se forma en el hígado y en la mucosa intestinal.
Se excreta sobre todo a través del riñón; se le filtra en el
glomérulo y 98% de él se reabsorbe en el túbulo contorneado proximal. La cantidad eliminada cada día en la
orina suele ir de de 250 a 750 mgdl. La excreción varía
en función de la ingesta de purinas, el catabolismo endógeno, la insuficiencia renal, la cetoacidosis y el uso de diuréticos. Cuando se eleva la concentración de ácido úrico
en plasma, casi siempre se relaciona con una patología,
como insuficiencia renal, con procesos de regeneración
acelerada y amplia destrucción celular, como en las leucemias y otras neoplasias, con el uso de diuréticos y, sobre
todo, con gota primaria o secundaria.
Existen cuantiosos alimentos que son fuentes exógenas de purinas (hígado, levadura, alcachofas, riñones,
sardinas, etc.) y que, por tanto, llevan a la producción
de ácido úrico. Su ingestión tiende a aumentar la cantidad diaria excretada de ácido úrico (uricosuria), más
que la uricemia, siempre y cuando la función renal sea
normal.
Aunque la síntesis de los nucleótidos de purinas y su
catabolismo o degradación tienen lugar en todos los tejidos, el urato sólo se sintetiza en los tejidos que contienen
xantina oxidasa, sobre todo el hígado y el intestino delgado. La síntesis de urato varía en función del contenido
de purinas en la dieta y de la velocidad de biosíntesis,
degradación y ahorro de purinas. En condiciones normales, entre dos terceras y tres cuartas partes del urato
sintetizado se eliminan a través del intestino. De 8 a 12%
del urato filtrado por el glomérulo se excreta en la orina,
en forma de ácido úrico. La concentración plasmática de
urato varía de acuerdo con la edad y el sexo.
La patología genética más frecuente relacionada con
elevación de ácido úrico en plasma es la deficiencia adquirida de hipoxantina guanina fosforribosil transferasa. La
deficiencia congénita de esta enzima da lugar al síndrome
de Lesch Nyhan, que consiste en hiperuricemia con daño
neurológico importante. Para el diagnóstico clínico, no
debe considerarse el resultado de un ensayo único, sino
que debe integrar datos clínicos y de laboratorio.
Bilirrubina
Los dos principales pigmentos biliares son la bilirrubina y
la biliverdina. Se originan en el sistema reticuloendotelial,
incluidas las células de Kupffer del hígado y otras células reticuloendoteliales que retiran a los eritrocitos de la
circulación. Durante la destrucción de los eritrocitos, se
libera hemoglobina; una vez degradada ésta, es posible
utilizar de nuevo la globina (parte proteínica) de manera
íntegra o aprovechando los aminoácidos que la constituyen. A la fracción porfirínica (grupo hemo) se le desintegra en las células reticuloendoteliales del hígado, el bazo
y la médula ósea. Durante la degradación del hemo, se
libera hierro y se abre el anillo porfirínico de cuatro grupos pirrólicos, para formar el primer pigmento biliar, la
biliverdina.
A su vez, la biliverdina se convierte, por reducción,
en bilirrubina. La bilirrubina formada en los tejidos se
asocia con la albúmina sérica, constituyendo la bilirrubina indirecta, no conjugada, insoluble en agua. En esta
forma, la sangre la transporta hacia el hígado, donde las
células hepáticas, mediante la acción de la enzima glucuronil transferasa, conjugan la bilirrubina con ácido
glucurónico, formando diglucurónido de bilirrubina: bilirrubina directa, conjugada, hidrosoluble.
Más adelante, los hepatocitos la segregan en el conducto hepático, que se une con el conducto cístico procedente de la vesícula biliar para formar el colédoco;
por ello, se le excreta con la bilis en el intestino delgado,
donde el colédoco descarga su contenido. Al llegar al intestino, la bilirrubina se libera del glucurónido y, en un
paso posterior, las bacterias intestinales lo reducen hasta
69
Práctica 8. Metabolismo de compuestos nitrogenados
urobilinógeno y estercobilinógeno (grupo de urobilinógenos). Enseguida, el intestino absorbe parte del urobilinógeno, que pasa a la sangre y regresa al hígado; allí, las
células hepáticas lo absorben y secretan, sin modificar,
con la bilis, lo que constituye el ciclo enterohepático del
urobilinógeno. Al resto se le excreta, sobre todo en las
heces, como urobilinógeno fecal, estercobilinógeno (de 40
a 280 mg diarios), y en la orina (de 0 a 4 mg en 24 horas).
Cuando se le expone al aire, el urobilinógeno se oxida y
pasa a urobilina.
Creatinina
La síntesis de la creatina tiene lugar en el hígado a partir
de tres aminoácidos: glicina, arginina y metionina. La enzima hepática aminotransferasa forma el radical amidina
de la arginina para fijarlo al nitrógeno de la glicina (guanidinoacético). Una transmetilasa que utiliza el metilo de
la 5-adenosil-metionina, metila la glucociamina sobre el
nitrógeno central, formando la creatina (figura 8-1).
La sangre transporta la creatina hasta los músculos,
donde mantiene un equilibrio con la fosfocreatina (fosfágeno), y representa una fuente de energía inmediata para
volver a formar el ATP, cuando a éste se le transforma en
ADP con la contracción muscular. Cada día, casi 2% de
la creatina corporal se convierte en creatinina; los músculos no pueden utilizar ésta y se le elimina en la orina.
1
H
N
NH 3
2
O
O
2
NH 3
O
NH 2
L-arginina
1
O
NH 2
1
Objetivo general
• Identificar algunos productos nitrogenados que se
encuentran en la sangre y se excretan en la orina.
Objetivos específicos
• Medir la concentración de urea en suero de sujetos
normales mediante un método colorimétrico.
• Cuantificar la concentración de ácido úrico en
plasma mediante un método espectrofotométrico.
• Identificar por medio de un método semicuantitativo la presencia de bilirrubina en la orina.
Materiales y equipo
• Kit para la determinación de urea
• Kit para la determinación de ácido úrico
• Tiras reactivas para identificación
de metabolitos en orina
• Centrífuga clínica
• Pipeta graduada de 5 ml
• Tubos de ensayo
• Gradilla
• Espectrofotómetro
• Jeringas desechables
• Torniquete
• Torundas con alcohol
• Vasos de precipitado
• Palillos de madera o pipetas Pasteur
• Plato caliente
• Etiquetas
• Micropipeta de 0.02 ml
Glicina
Aminotransferasa
2
O
Desarrollo experimental
O H
N
1
NH 2
Acetato de guanidino
NH 3
2
1
1
NH 3
O
NH 2
O L-ornitina
O
O
Creatincinasa
Determinación de urea por color
Fundamento
Transmetilasa
2
Experimento 1
La urea presente en el suero origina, de acuerdo con las
reacciones descritas a continuación, un indofenol coloreado que se cuantifica mediante espectrofotometría.
CH 3
N NH 2
NH
2
1
ATP
O
2
CH3
N
O ADP
H
2
N P O
O
NH 2 O
2
Creatina
Urea + H2O
O
H3C
NH
NH Creatinina
ureasa
NH4+ + Salicilato + NaCIO
2NH4+ + CO2
nitroprusiato
indofenol
1
Fosfocreatina
(PCr)
Muestra
Eliminación por
vía renal
Figura 8-1. Vía metabólica para la síntesis de creatinina.
Suero, plasma (no hemolizado) u orina. La urea en suero
o plasma es estable durante 7 días a temperatura de 2 a
8°C. Se recomienda la heparina como anticoagulante.
70
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Cuadro 8-1. Organización y contenido de los tubos
para determinar concentración de urea.
Tubo
Blanco
Patrón
Muestra
Patrón de
urea (S)
—
10 μl
—
Muestra
—
—
10 μl
1 ml
1 ml
1 ml
Reactivo (A)
Determinación de ácido úrico
uricasa/peroxidasa
Fundamento
El ácido úrico presente en la muestra origina, de acuerdo
con las reacciones acopladas que se describen a continuación, un complejo coloreado que se cuantifica mediante
espectrofotometría.
Ácido úrico + O2 + 2H2O
Procedimiento
1. Atemperar los reactivos a temperatura ambiente.
2. Pipetear en tubos de ensayo, de acuerdo con el cua-
dro 8-1.
Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16 a 25°C) o durante
5 minutos a 37°C.
3. Pipetear, de acuerdo con el cuadro siguiente:
Reactivo (B)
Experimento 2
Blanco
Patrón
Muestra
1 ml
1 ml
1 ml
4. Agitar bien e incubar los tubos 10 minutos a tempe-
ratura ambiente o (16 a 25°C) durante 5 minutos a
37°C.
5. Leer la absorbancia (A) del patrón y de la muestra, a
600 nm, frente al blanco. El color es estable durante
2 horas.
6. Calcular la concentración de urea en la muestra a
partir de la siguiente fórmula general:
AMuestra
× CPatrón × Factor de dilución de la muestra
APatrón
= CMuestra
Si se utiliza para calibrar, el patrón de urea suministrado,
Urea sérica = (Amuestra Apatrón) × 50 = mgdl
Resultado _________
Valores de referencia
Suero y plasma: 15 a 39 mgdl de urea = 7 a 18 mgdl =
2.5 a 6.5 mmolL de urea.
En el periodo neonatal, las concentraciones son inferiores; en personas mayores de 60 años, se encuentran
valores superiores a los de adultos. Las concentraciones
también tienden a ser un poco mayores en hombres que
en mujeres.
uricasa
Alantoína + CO2 + H2O2
2H2O2 + Aminoantipirina + DCFS
Quinonaimina + 4H2O
peroxidasa
Muestra
Suero o plasma (no hemolizado) u orina. El ácido úrico
en suero o plasma es estable durante 7 días a 2 a 8°C. Los
anticoagulantes como heparina, EDTA, oxalato o fluoruro, no interfieren.
Procedimiento
1. Atemperar el reactivo a temperatura ambiente.
2. Pipetear en tubos de ensayo de acuerdo con el cua-
dro 8-2.
Agitar bien e incubar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente (16 a 25°C) o durante
5 minutos a 37°C.
3. Leer la absorbancia (A) del patrón y la muestra, a
520 nm, frente a blanco. El color es estable durante
30 minutos, por lo menos.
4. Calcular la concentración de ácido úrico en la muestra a partir de la siguiente fórmula general:
AMuestra
× CPatrón × Factor de dilución de la muestra
APatrón
= CMuestra
Si se utiliza para calibrar, el patrón de ácido úrico
suministrado, el ácido úrico sérico = (AMuestra APatrón ×
6 = mgdl
Resultado _________
Valores de referencia
Suero y plasma:
Hombres: 3.5 a 7.2 mgdl = 210 − 420 μmolL
Mujeres: 2.6 a 6.0 mgdl = 150 − 350 μmolL
Es recomendable que cada laboratorio establezca sus
propios intervalos de normalidad.
Práctica 8. Metabolismo de compuestos nitrogenados
Cuadro 8-2. Organización y contenido de los tubos
para determinar concentración de ácido úrico.
Tubo
Blanco
Patrón
Muestra
25 μl
—
—
Patrón de
ácido úrico
(S)
—
25 μl
—
Muestra
—
—
25 μl
1 ml
1 ml
1 ml
Agua
destilada
Reactivo (A)
Actividades de aprendizaje
1. Investigar y completar el siguiente cuadro.
Parámetros
Densidad
Experimento 3
Identificación de metabolitos
en orina con tira reactiva
Fundamento
El análisis de orina se realiza con pruebas secas listas para
su empleo; se trata de tiras recubiertas de reactivos inmovilizados en un soporte plástico. Al sumergir la tira en la
muestra de orina, se inicia una reacción que proporciona
un producto coloreado. La lectura se efectúa frente a una
escala de color estandarizada.
71
pH
Resultados
obtenidos
Valores
normales
Patología
relacionada
con la
alteración
1.000 a 1.030
5y6
Leucocitos
Negativos
Nitritos
Negativos
Proteínas
Negativos
Glucosa
Normal
Cuerpos
cetónicos
Negativos
Urobilinógeno
Negativo
Bilirrubina
Negativa
Sangre
Negativa
2. Investigar qué medicamento inhibe a la enzima xanti-
na oxidasa y para qué enfermedad se utiliza.
Muestra
Orina.
Procedimiento
1. Emplear orina fresca y no centrifugada. Mezclar bien
2.
3.
4.
5.
la muestra. La orina a analizar no debe tener más de
4 horas de emitida.
Sumergir la tira reactiva por un instante (1 segundo
como máximo) en la orina.
Al retirarla, rozar el canto lateral del borde del recipiente para eliminar el exceso de orina.
Después de 60 segundos (zona de leucocitos después
de 60 a 120 segundos) comparar el color de reacción
con la escala cromática.
Los cambios de color que aparecen en el margen de
las zonas reactivas o después de más de 2 minutos, carecen de importancia diagnóstica. Las coloraciones
rosas más débiles deben valorarse como hallazgos
positivos, es decir, patológicos.
3. Investigar cuáles son las causas de la hiperbilirrubi-
nemia.
72
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
4. Completar el siguiente cuadro de las porfirias (en-
Discusión
fermedades por alteraciones en la síntesis del grupo
hemo).
Enfermedad
Enzima
deficiente
Manifestaciones
clínicas
Tratamiento
Conclusiones
5. Investigar cuáles son los productos terminales de la
degradación de las pirimidinas (citosina, timina y
uracilo).
Bibliografía
Bayardo Pérez B. Apuntes de Análisis Clínicos. Facultad de
Ciencias Químicas, 1978:32-33.
Baynes JW, Dominiczak MH. Bioquímica Médica, 2a ed. Elsevier Mosby, 2006:251 y 328.
Borel JP. Bioquímica dinámica. Síntesis de creatina y fosfocreatina. Ed Médica Panamericana, 1989:677-678.
Garzón de la Mora P. Proyecto X metabolismo de substancias
nitrogenadas. 2002:159-167.
McKee T. Bioquímica. Metabolismo del Nitrógeno I y II, 3a ed.
Cap 14 y 15. McGraw-Hill, 2003:502-529.
Práctica
Extracción de DNA
de células vegetales
• Sonia Uribe Luna
• Irma Noemí Lúa Ramírez
• María Rosalba Ruiz Mejía
Introducción
Los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos unidos
por enlaces fosfodiéster. Por su composición química, se
han clasificado en dos tipos: ácido desoxirribonucleico
(DNA) y ácido ribonucleico (RNA). Los nucleótidos que
forman al DNA están constituido por el azúcar 2′-desoxirribosa unido mediante enlace éster a ácido fosfórico
y mediante enlace N-glucosídico a una de las cuatro bases
nitrogenadas (adenina, guanina, timina o citosina).
Los nucleótidos del DNA forman una hélice constituida por dos hebras antiparalelas que se mantienen unidas mediante puentes de hidrógeno. Para empaquetarse,
el DNA se une a nucleoproteínas, denominadas histonas;
y cuando se quieren separar estos componentes, se aplica
tratamiento con ácidos o con concentraciones altas de
sales.
Los nucleótidos del RNA se encuentran formados
por el azúcar ribosa, unida mediante enlace glucosídico a
una de cuatro bases nitrogenadas (adenina, guanina, uracilo o citocina), formando moléculas de una sola cadena.
La función del DNA es la de almacenar y transferir
la información genética que conforma a un organismo y
a su descendencia. El genoma de un individuo comprende
la totalidad de la información genética contenida en el
DNA. El DNA junto con los tres tipos de RNA (rRNA,
tRNA y mRNA) participa en la biosíntesis ordenada de
los componentes de la célula, codificando la expresión
espacio temporal de las proteínas y respondiendo a los
estímulos del medio ambiente.
El genoma se encuentra organizado en forma diferente en las células procarióticas y eucarióticas; en estas
últimas presenta un mayor grado de complejidad. El genoma de las células procarióticas está integrado dentro de
9
• Mercedes Romero Gómez
• Sergio Sánchez Enríquez
una sola molécula de DNA circular, dispuesta de modo
compacto en una zona nuclear denominada nucleoide. El
tamaño del genoma bacteriano se puede ejemplificar con
el de Escherichia coli; tiene 1 360 nm y se encuentra constituido por 4 700 kilopares de bases (kpb).
El genoma de las células eucarióticas se encuentra
organizado en cromosomas, que son estructuras de DNA
relacionadas con proteínas básicas, a las que se les denomina histonas, y proteínas no histonas; las histonas tienen
carga positiva a pH fisiológico y neutralizan las cargas
negativas del fosfato de los nucleótidos, lo que confiere
estabilidad y permite que el DNA que mide casi 2 metros de longitud se empaquete en un núcleo de 10 μm
de diámetro. El genoma humano está constituido por 46
cromosomas y contiene 5 × 106 kpb en su totalidad.
De acuerdo con el tipo de célula en estudio, para aislar los ácidos nucleicos es necesario romper la membrana
y la pared celular mediante métodos físicos, químicos o
enzimáticos, para liberar las moléculas de DNA al medio
extracelular. A partir de esto, la purificación de los ácidos
nucleicos se realiza mediante la extracción de las proteínas y los lípidos con solventes orgánicos, y su recuperación, en un paso posterior, al precipitarlos con alcohol
(isopropanol o etanol).
En la actualidad, se obtiene DNA de diferentes tipos
de células; bacterias, linfocitos, hepatocitos, espermatozoide humano y de otros mamíferos, células vegetales,
etcétera.
Objetivo general
• Aislar e identificar el DNA extraído del germen de
trigo.
74
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Objetivos específicos
• Obtener DNA de germen de trigo.
• Identificar el DNA mediante la reacción de la difenilamina.
tración de cloruro de sodio en el amortiguador CSC hace
que el DNA se precipite en presencia de alcohol y a baja
temperatura.
Obtención de DNA de germen de trigo
1. Colocar en el congelador (−20ºC) un vaso de precipi-
Materiales y equipo
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Mortero con pistilo
Vasos de precipitado de 250 ml
Vaso de precipitado de 125 ml
Pipetas de 1, 5 y 10 ml
Centrífuga
Tubos de centrífuga de 13 × 100
Gasa
Varilla de vidrio o cucharita de plástico
Hielo
Plato caliente
Embudo
Probeta de 25 ml
Etanol de 96º frío
Agua destilada
Soluciones y reactivos
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Amortiguador SAS
Solución de TRIS a 0.4 M y pH 8.5
Lauril sulfato de sodio a 4% en agua vv
EDTA salino a pH 8
Amortiguador CSC
Difenilamina
Ácido sulfúrico concentrado
Citrato de sodio
Cloruro de sodio
Sacarosa
Cloruro de magnesio
Mercaptoetanol
Ácido acético glacial
tado que contiene 100 ml de etanol absoluto.
2. Pesar 5 g de germen de trigo y colocarlo en un morte-
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
ro. Agregar al mortero un trocito de hielo y moler el
germen hasta que el material quede macerado.
Transferir el germen molido a un vaso de precipitado
y agregar 20 ml de amortiguador SAS y un trozo de
hielo.
Congelar y dejar reposar durante 10 minutos.
Descongelar bajo el chorro de agua de la llave.
Transferir el homogeneizado a tubos de ensayo, a través de una gasa doble, y exprimir el material.
Centrifugar el filtrado durante 10 minutos a 3 000
rpm y desechar el sobrenadante.
Resuspender el botón en 5 ml (para todos los tubos)
de solución amortiguadora Tris, pH 8.5.
Pasar el contenido a un vaso de precipitado de 100 ml.
Agregar 0.5 ml de EDTA salino.
Añadir 5 ml de lauril sulfato de sodio.
Agregar 1 ml de amortiguador CSC y mezclar.
Verter el contenido de la mezcla anterior, con mucha
lentitud, por la pared de un vaso de precipitado que
contenga 100 ml de etanol enfriado a −20ºC.
Nota: En este paso, el DNA forma una nata
blanquecina como resultado de su precipitación con
el etanol.
Pasar la nata con la varilla de vidrio o la cucharita de
plástico a un tubo de ensayo.
Actividad de aprendizaje
Desarrollo experimental
Realizar el diagrama de flujo del procedimiento para la
obtención del DNA.
Experimento 1
Obtención del DNA de germen de trigo
Extracción del DNA
Fundamento
El germen de trigo se muele con el objetivo de obtener
partículas más finas y destruir las nucleasas del DNA. El
siguiente objetivo consiste en romper la pared celular, lo
que se lleva a cabo al agregar la solución amortiguadora
SAS. Posteriormente se fija para obtener células más disgregadas, se centrifuga para obtener un botón que contiene las células, que se mantienen en una solución amortiguadora. Se agrega un detergente como el lauril sulfato
de sodio, para emulsificar las membranas lipídicas. En la
siguiente etapa, se utiliza EDTA y citrato de sodio, que
son quelantes de Ca++ y Mg++, respectivamente; estos
cationes estabilizan las nucleoproteínas. La alta concen-
Práctica 9. Extracción de DNA de células vegetales
Anote las observaciones, explicando el proceso realizado y el aspecto del material obtenido.
75
Discusión
Experimento 2
Identificación de la desoxirribosa
Fundamento
Se basa en la reacción del azúcar desoxirribosa, presente
en el DNA, con el reactivo difenilamina, que forma un
complejo azul en condiciones ácidas.
Conclusiones
Procedimiento
1. En un tubo de ensayo de 15 ml, colocar la nata de
DNA obtenida a partir del germen de trigo y lavarla
de manera cuidadosa con agua destilada para eliminar el exceso de alcohol.
2. Agregar 5 ml del reactivo de difenilamina.
3. Poner el tubo de ensayo en baño de agua hirviendo
durante 8 minutos.
4. Observar la coloración.
Actividad de aprendizaje
Realizar el diagrama de flujo del procedimiento para la
identificación de la desoxirribosa.
Identificación de la desoxirribosa
Preparación de reactivos
1. Amortiguador SAS.
Pesar:
• 1.21 g de TRIS (hidroximetil amino metano).
• 17.1 g de sacarosa.
• 0.5 g de MgCl2.
Disolver cada compuesto en agua destilada utilizando vasos de precipitado, de manera individual.
Vaciar las diluciones anteriores en un matraz volumétrico al que se añaden 1.75 ml de mercaptoetanol
y aforar con agua a un litro.
76
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
2. Solución de TRIS a 0.4 M.
Pesar 48.4 g de TRIS (hidroximetil amino metano),
disolver y aforar a un litro con agua destilada, ajustando a un pH de 8.5.
3. Lauril sulfato de sodio a 4%.
Pesar 20 g de lauril sulfato de sodio, disolver en
agua destilada y aforar en un matraz volumétrico de
500 ml.
Disolver cada compuesto en agua destilada utilizando vasos de precipitado de manera individual.
Vaciar las diluciones anteriores en un matraz volumétrico y aforar a 500 ml.
6. Difenilamina.
Disolver 5 g de difenilamina en 500 ml de ácido
acético glacial, agregar 14 ml de ácido sulfúrico concentrado.
4. EDTA salino.
Pesar:
• 18.6 g de EDTA (etilendiamino tetraacético).
• 4.25 g de NaCl.
Disolver cada compuesto en agua destilada utilizando vasos de precipitado de manera individual.
Vaciar las diluciones anteriores en un matraz volumétrico de 500 ml. Aforar con agua destilada y ajustar
la solución a un pH de 8.
5. Amortiguador CSC.
Pesar:
• 22 g de citrato de sodio.
• 43.8 g de NaCl.
Bibliografía
McKee T. Bioquímica, 3a ed. Cap 17. Ácidos nucleicos. McGrawHill, 2003:562-608.
Pérez García G. Bioquímica: temas selectos y prácticas, 3a ed.
Laboratorio de Bioquímica CUCS, 1996:130.
Plummer DT. Bioquímica práctica, 2a ed. McGraw-Hill,
1981:208.
http:learn.genetics.utah.edu. Extracción de DNA de germen
de trigo. [Revisado el 22 de septiembre de 2013.]
Apéndice
Definición de prefijos,
unidades y constantes físicas
• Sonia Uribe Luna
Prefijos de uso frecuente
Prefijo
Simbología
Equivalente a
tera
T
1012
giga
G
109
mega
M
106
kilo
k
103
hecta
H
102
deci
d
10−1
centi
c
10−2
mili
m
10−3
micro
μ
10−6
nano
n
10−9
pico
p
10−12
femto
f
10−15
atto
a
10−18
yacto
y
10−21
1
78
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Constantes físicas
Constante física
Símbolo o abreviatura
Valor
Número de Avogadro
N
6.022 × 1023 mol−1
Curie
Ci
3.7 × 1010
desintegraciones s−1
Dalton
Da
1.661 × 10−24 g
Constante de Faraday
F
96 487 JV mol−1
23 062 cal V−1 mol−1
Constante de los gases
R
8.314 J mol−1 K−1
1.987 cal mol−1 K−1
Constante de Planck
h
6.626 × 10−34 J s
1.584 × 10−34 cal s
Velocidad de la luz (vacío)
c
2.997 × 10−10 cm s−1
Otros factores
Pi
ln (loge) X = 2.303 log10 X
1.0 J = 0.239 cal = 107 erg = 1 W s
3.1416
Apéndice
2
Constantes biológicas
• Mercedes Romero Gómez
Prueba
Muestra
Unidades convencionales
Factor de
conversión
Unidades SI
Varón: 140 a 440 μmolL
Mujer: 80 a 350 μmolL
Ácido úrico
Suero
Varón: 2.4 a 7.4 mgdl
Mujer: 1.4 a 5.8 mgdl
Bilirrubina
Suero
Total: 0.1 a 1.2 mgdl
Directa (conjugada con glucuronato): 0.1 a 0.4 mgdl;
indirecta (no conjugada): 0.1 a
0.7 mgdl
Bióxido de carbono
(CO2) total
Suero
22 a 28 meqL
Peligro: <15 o >40 meqL
1.00
22 a 28 mmolL
Calcio (Ca2+) total
Suero
22 a 28 meqL
Peligro: <15 o >40 meqL
0.25
2.1 a 2.6 mmolL
Colesterol
Suero
Deseable: <200 mgdl
Valor límite: 200 a 239 mgdl
Riesgo grande: >240 mgdl
0.03
Deseable: <5.2 mmolL
Valor límite: 5.2 a 6.1
mmolL
Colesterol de HDL
Suero
Varón: 27 a 67 mgdl
Mujer: 34 a 88 mgdl
0.026
0.7 a 1.73 mmolL
0.88 a 2.28 mmolL
Colesterol de LDL
Suero
<130 mgdl
0.026
<3.37 mmolL
Creatinina (Cr)
Suero
0.6 a 1.2 mgdl
Depuración
de creatinina
Orina de 24 h
simultánea con
creatinina en
suero o plasma
Adultos: 90 a 140 mlmin1.73
m2 BSA
Electroforesis de
proteínas
Suero
Adultos:
Albúmina: 3.3 a 4.7 gdl
α1: 0.1 a 0.4 gdl
α2: 0.3 a 0.9 gdl
β: 0.7 a 1.5 gdl
γ: 0.5 a 1.4 gdl
59.48
17.10
83.3
0.017
10.00
2 a 21 μmolL <7
μmolL
50 a 100 μmolL
1.5 a 2.3 mls1.73 m2
BSA
33 a 47 gL
1 a 4 gL
3 a 9 gL
7 a 15 gL
5 a 14 gL
(Continúa)
80
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Prueba
Muestra
Unidades convencionales
Factor de
conversión
Unidades SI
Glucosa
Suero
60 a 105 mgdl
Peligro extremo:
<40 o >500 mgdl
0.06
3.3 a 6.3 mmolL
Hematócrito
Sangre completa
Varón: 39 a 49%
Mujer: 35 a 45%
0.01
Varón: 0.39 a 0.49%
Mujer: 0.35 a 0.45%
Hemoglobina
(HbA1c)
(glucosilada)
Suero
3.9 a 6.9% (según el método)
Hemoglobina total
(Hb)
Sangre completa
Varón: 13.6 a 17.5 gdl
Mujer: 12.0 a 15.5 gdl
Hierro (Fe2+)
Suero
50 a 175 μgdl
0.18
9 a 31 μmolL
Magnesio (Mg2+)
Suero
1.8 a 3.0 mgdl
0.41
0.75 a 1.25 mmolL
Nitrógeno de la
urea en sangre
Suero
8 a 20 mgdl
0.36
2.9 a 7.1 mmolL
Oxígeno, presión
parcial de (pO2)
Sangre
completa
heparinizada
83 a 108 mmHg
0.13
11.04 a 14.36 Kpa
pH
Sangre completa
Arterial: 7.35 a 7.45
Venosa: 7.31 a 7.41
Plomo (Pb)
Sangre completa
Niño: <25 μgdl
Adulto: <40 μgdl
0.05
Niño: <1.21 μmolL
Adulto: <1.93 μmolL
Proteínas totales
Plasma o suero
6.0 a 8.0 gdl
Sodio (Na+)
Suero
135 a 145 meqL
Tiempo de
protrombina (PT)
Sangre completa
11 a 15 s
Peligro: ≥30
(específica de laboratorio)
Tiempo parcial de
tromboplastina
activada (PTT)
Plasma
25 a 35 s
(varían los valores)
Peligro: ≥60 s
Triacilgliceroles
Suero
<165 mgdl
Bibliografía
Nicoll CD. Apéndice de valores de laboratorio de referencia.
En: Tierney LN, Jr, McPhee SJ, Papadakis MA. Diagnóstico
clínico y tratamiento, 39a ed. México: El Manual Moderno,
2006:1613-1623.
10.0
10.0
1.0
0.01
60 a 80 gdl
135 a 145 mmolL
Apéndice
Determinación del gasto
energético diario (GED)
3
• Sergio Sánchez Enríquez
• Patricia Heredia Chávez
El GED indica la cantidad de calorías que un individuo
debe consumir para abastecer los requerimientos energéticos que le permitan realizar las actividades tanto fisiológicas como físicas. Si el gasto corresponde a lo que
consume en los alimentos, el individuo mantendrá su
peso ideal; por lo contrario, si el consumo de alimentos
supera el gasto energético diario, el individuo aumentará
de peso. El gasto energético comprende los siguientes mecanismos termogénicos:
a) Metabolismo basal o gasto energético basal en repo-
so (MB) de 60 a 70%.
b) Actividad dinámica específica de los alimentos de 6
a 10%.
c) Termogénesis inducida por el ejercicio de 20 a 100%.
Metabolismo basal (MB)
Una forma práctica para determinar el metabolismo basal es multiplicando 24 kcal por el peso del individuo en
kilogramos, dando por resultado la cantidad de calorías
que requiere el individuo para sobrevivir durante 24 h (si
estuviera en reposo, acostado, boca arriba, sin ingesta de
alimentos y sin realizar actividades intelectuales).
Ejemplo: para un individuo de 80 kg de peso
24 kcal × 80 kg = 1 920 kcal24 h
Acción dinámica específica
de los alimentos (ADE)
Se refiere a las calorías que quema la persona durante
el proceso de masticación, digestión y absorción de los
alimentos, también conocida como termogénesis inducida
por la ingesta y digestión de los alimentos. Su valor varía
entre 6 y 10% del gasto energético basal, dependiendo de
la cantidad y tipo de ingesta.
Termogénesis
por la actividad física (AF)
En forma práctica, la actividad física se puede clasificar
de la siguiente manera:
Actividad física leve = 20% (del gasto energético basal).
Ejemplo. La mayor parte de su actividad física la realiza sentado.
Actividad física moderada = 30% (del gasto energético
basal).
Ejemplo. La actividad física que desarrolla un ama
de casa.
Actividad física intensa = 40% (del gasto energético basal).
Ejemplo. La actividad de un albañil.
Actividad física extrema = 100% (del gasto energético
basal).
Ejemplo. Deportistas de alto rendimiento.
Fórmula de Harris
Benedict para determinar
el gasto energético diario
Varones: 66.5 + 13.75 (P) + 5.08 (T) – 6.78 (E) + ADE + AF
Mujeres: 65.51 + 9.56 (P) + 1.85 (T) – 4.68 (E) + ADE + AF
En donde:
P = peso expresado en kilogramos
E = edad expresada en años
T = talla expresada en centímetros
ADE = acción dinámica específica de los alimentos
AF = actividad física
Las proporciones ideales de nutrimentos para mantenerse sano son las siguientes:
82
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Cuadro A3-1. Calorías aportadas por cada
gramo de proteínas, lípidos y carbohidratos.
Nutrimento
Cuadro A3-3. Grupos de alimentos y raciones
recomendadas.
kcal/gramo
Cereales y tubérculos
Proteínas
4
Arroz cocido
½ de taza
Lípidos
9
Arroz inflado
½ de taza
Carbohidratos
4
Bolillo con migajón
⅓ de pieza
Tortilla
1 pieza mediana
Bollo para hamburguesa
½ pieza
Camote en cuadritos
¼ de taza
Donas azucaradas
⅓ de pieza
Galletas de barquillo
rellenas
2 piezas
Galletas con chispas de
chocolate
1 ½ piezas
Galletas con malvavisco
1 pieza
Galletas de animalitos
6 piezas
Galletas de avena y pasas
1 pieza mediana
Galletas de centeno
3 piezas medianas
Galletas de coco y nuez
1 ⅓ de piezas
Galletas de higo
1 ½ piezas
Galletas de mantequilla
3 piezas medianas
Galletas dedos de novia
1 ¾ de piezas
Galletas palitos salados
2 piezas
Galletas para sopa
20 piezas
Galletas saladas
3 piezas
Galletas sándwich de
vainilla o chocolate
1 ⅓ de piezas
Harina de arroz
1 ½ cdas. soperas
Harina de centeno
2 ⅓ de cdas. soperas
Harina de trigo integral
2 ½ cdas. soperas
Harina de trigo refinada
2 cdas. soperas
Hojuelas de avena
¼ de taza
Hojuelas de maíz
¾ de taza
Hojuelas de maíz azucaradas
½ taza
Proteínas = 20% como máximo (0.78 a 1.27 gkg de peso).
Lípidos = 20 a 30% de las calorías calculadas, de las
cuales:
20% lípidos insaturados y 10% saturados.
Carbohidratos = 50 a 60% de las calorías calculadas.
En el cuadro A3-1 se presentan las calorías que aporta cada uno de los nutrimentos.
Es muy recomendable conocer los grupos de alimentos, las cantidades de nutrimentos que cada uno de ellos
aporta y las kilocalorías que proporcionan por cada ración ingerida; esta información se encuentra en el cuadro
A3-2.
Con toda la información presentada se puede diseñar
un menú saludable al combinar algunos de los alimentos
mencionados, los cuales, si son del mismo grupo, resultan
intercambiables para que se varíe día con día el menú,
siempre y cuando se respeten las raciones. Las cantidades
de alimentos específicos de cada grupo de alimentos se
muestran en el cuadro A3-3.
Cuadro A3-2. Grupos de alimentos, equivalentes
y composición promedio de nutrimentos.
Grupo
Energía Proteínas Lípidos Carbohidratos
(kcal)
(g)
(g)
(g)
Cereales y
tubérculos
68
2
0
15
Leguminosas
97
7
1
15
Verduras
28
2
0
5
Frutas
40
0
0
10
Carne,
queso y
huevo
(grupo A)
75
7
5
0
Leche
160
8
8
12
Hojuelas de papa
⅓ de taza
Grasa
45
0
5
0
Hot cakes (panqueques)
1 pieza mediana
Azúcares
40
0
0
10
(Continúa)
Apéndice 3. Determinación del gasto energético diario (GED)
Cuadro A3-3. Grupos de alimentos y raciones
recomendadas (Continuación).
Cereales y tubérculos
Verduras
Berenjena
Libre
Berro
Libre
Betabel
½ taza
Brócoli
Libre
Calabacita
½ taza
Cebolla
½ taza
Cilantro
Libre
Col
Libre
Maicena
2 cdas. soperas
Maíz (granos)
½ taza
Maíz palomero inflado
3 tazas
Medias noches
½ pieza
Pan alemán
1 rebanada delgada
Pan de caja blanco, tostado o integral
1 rebanada
Panqué casero
1 rebanada delgada
Col de Bruselas
½ taza
Panqué de jengibre
1 rebanada delgada
Coliflor
Libre
Papa en cuadritos
½ taza
Chayote
Libre
Pastas para sopa
½ taza
Chilacayote
Libre
Pastelitos con nueces
(brownies)
1 pieza
Chile poblano
½ taza
Ejote tierno
Libre
Pay de cereza
1 rebanada muy delgada
Espárrago
½ taza
Pay de durazno
1 rebanada muy delgada
Espinaca
Libre
Pay de fresa
1 rebanada muy delgada
Flor de calabaza
Libre
Pay de limón con merengue
1 rebanada muy delgada
Flor de colorín
Libre
Pay de manzana
1 rebanada muy delgada
Hongos
½ taza
Pay de piña
1 rebanada muy delgada
Huazontle
½ taza
Pay de zarzamora
1 rebanada delgada
Jitomate
Libre
Salvado de trigo
½ taza
Lechuga
Libre
Tapioca cruda
1 ½ cdas. soperas
Nabo
½ taza
Nopal
Libre
Leguminosas
Arverjones
½ taza
Pepino
Libre
Chícharos (guisantes)
½ taza
Perejil
Libre
Frijoles ( judías)
½ taza
Pimiento morrón
½ taza
Garbanzos
½ taza
Poro
½ taza
Habas
½ taza
Quelite
½ taza
Lentejas
½ taza
Rábano
Libre
Soya texturizada
1 ½ tazas, rehidratada
Romerito
Libre
Tomate
Libre
Verduras
83
Acelga
Libre
Verdolaga
Libre
Alcachofa
Libre
Zanahoria
½ taza
Apio
Libre
(Continúa)
84
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
Cuadro A3-3. Grupos de alimentos y raciones
recomendadas (Continuación).
Frutas
Ración
Contenido
de fibra
Carnes, huevo y pescado
Subgrupo A
Aves sin piel: avestruz, codorniz, pavo,
pollo
30 g
Clara de huevo
2
Capulín
12 piezas
Mediana
Ciruela
8 piezas
Mediana
2 piezas
Baja
Conejo desgrasado: costilla, lomo,
pierna
30 g
Ciruela pasa
Chabacano
fresco
3 piezas
Mediana
Cordero desgrasado
30 g
5 mitades
Mediana
Mariscos: almejas, camarones, jaibas,
ostiones
30 g
Chabacano seco
Chicozapote
1 pieza pequeña
Mediana
Quesos: cabra, cottage, fresco,
parmesano, requesón
30 g
Chirimoya
110 taza
Alta
2 piezas
Baja
Pescado: fresco, congelado o ahumado,
sardinas drenadas, atún drenado
30 g
Dátil
Durazno
1 pieza pequeña
Mediana
30 g
Fresa
¾ de taza
Alta
Res desgrasada: aguayón, bola,
empuje, falda, filete, lengua, T-bone,
rosbif
Granada
2 piezas
Alta
2 piezas pequeñas
Alta
Ternera desgrasada: costilla, lomo,
pierna
30 g
Guayaba
Higo fresco
1 pieza
Mediana
Jícama
¾ de taza, en cuadritos
Baja
Agua de coco natural
1 taza
Lima
2 piezas
Mediana
Almendra con chocolate
2 piezas
Mamey
110 taza
Baja
Azúcar refinada
2 cucharaditas
Mandarina
1 pieza
Mediana
Caramelo macizo
2 piezas
Mango
½ pieza pequeña
Mediana
Chocolate en barra de 23 g
⅓ barra
Manzana
1 pieza
Mediana
Gelatina preparada
⅓ de de taza
Manzana en
puré
½ taza
Baja
Horchata de arroz
½ taza
Jalea
Naranja
1 pieza pequeña
Alta
1 rebanada
delgada
Nectarina
½ pieza
Baja
Leche condensada
1 cucharada
Papaya
¾ de taza
Mediana
Mermelada de frutas
1 cucharadita
Pasas
2 cdas. soperas
Baja
Miel de abeja
1 cucharadita
Pera
½ pieza pequeña
Alta
Miel de maíz
1 cucharada
Piña
½ taza, en cuadritos
Mediana
Miel de maple
1 cucharada
Plátano (banana)
½ pieza (9 cm)
Baja
Nieve
¼ de taza
Sandía
1 taza, en cuadritos
Baja
Piloncillo refinado
2 cucharadas
Toronja
½ pieza
Baja
Queso de tuna
Tuna
½ pieza
Alta
½ rebanada
delgada
Uva
10 piezas
Baja
Refresco
⅓ de taza
Zarzamora
½ pieza
Alta
Azúcares
(Continúa)
Apéndice 3. Determinación del gasto energético diario (GED)
Cuadro A3-3. Grupos de alimentos y raciones
recomendadas (Continuación).
Grasas
Aceites vegetales
1 cucharadita
Aceitunas
15 piezas
pequeñas o
7 grandes
Aguacate
30 g o
1⁄5 de pieza
Ajonjolí (sésamo)
1 cucharada
Almendra
10 piezas
Avellana
7 piezas
Cacahuate (maní)
5 piezas
Coco rallado
1 cucharada
Crema de cacahuate
1 cucharadita
Crema espesa
1 cucharada
Manteca de cerdo
1 cucharadita
Manteca vegetal
1 cucharadita
Mantequilla
1 cucharadita
Margarina
1 cucharadita
Mayonesa
1 cucharadita
Nuez
2 piezas
Paté de hígado
1 cucharada
Pepitas (semillas)
1 cucharada
Pistacho
4 piezas
Piñón
2 cucharaditas
Queso crema
1 cucharada
Semillas de girasol
1 cucharada
Tocino
1 rebanada
delgada
Leche
Leche descremada
1 taza
Yogurt de leche descremada
1 taza
85
Bibliografía
Espinosa T. Aspectos básicos de calorimetría. En: Casanueva E
y cols. Nutriología médica, 2a ed. México: Editorial Panamericana, 2001:516-527.
Pérez-Lizaur AB. Plan alimentario para el individuo sano y el
individuo enfermo. En: Casanueva E y cols. Nutriología Médica, 2a ed. México: Editorial Panamericana, 2001:532-672.
ERRNVPHGLFRVRUJ
Apéndice
4
Historia clínica
• Sergio Sánchez Enríquez
Fecha ____/____/____
día mes año
DATOS DE REGISTRO
NÚMERO DE FICHA:
NOMBRE:
DIRECCIÓN:
CALLE:
COLONIA:
CÓDIGO POSTAL:
CIUDAD:
TEL. CONVENCIONAL:
TEL. CELULAR:
RADIOLOCALIZADOR:
E-MAIL:
EDAD:
GÉNERO:
LUGAR DE NACIMIENTO:
LUGAR DE RESIDENCIA:
URBANA
URBANA
RURAL
MESES:
AÑOS:
RURAL
¿DESDE CUÁNDO?
MASCULINO
FEMENINO
ESTADO CIVIL:
SOLTERO
CASADO
DIVORCIADO
UNIÓN LIBRE
VIUDO
OTRO
ESCOLARIDAD:
PRIMARIA
SECUNDARIA
PREPARATORIA
LICENCIATURA
MAESTRÍA
DOCTORADO
SÍ
NO
OCUPACIÓN:
DESEMPLEADO
88
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
ANTECEDENTES HEREDOFAMILIARES
¿VIVE SU PADRE?
SÍ
NO
SÍ
NO
CAUSA DE MUERTE
¿VIVE SU MADRE?
CAUSA DE MUERTE
HERMANOS
TOTAL
FEMENINOS VIVOS
MASCULINOS VIVOS
CAUSA DE MUERTE DE HERMANOS
OBESIDAD EN ABUELO PATERNO
SÍ
NO
OBESIDAD EN ABUELA PATERNA
SÍ
NO
OBESIDAD EN ABUELO MATERNO
SÍ
NO
OBESIDAD EN ABUELA MATERNA
SÍ
NO
OBESIDAD EN PADRE
SÍ
NO
OBESIDAD EN MADRE
SÍ
NO
OBESIDAD EN HERMANOS
SÍ
NO
OBESIDAD EN TÍOS PATERNOS
SÍ
NO
OBESIDAD EN TÍOS MATERNOS
SÍ
NO
ABUELO PATERNO DIABÉTICO
SÍ
NO
ABUELA PATERNA DIABÉTICA
SÍ
NO
ABUELO MATERNO DIABÉTICO
SÍ
NO
ABUELA MATERNA DIABÉTICA
SÍ
NO
PADRE DIABÉTICO
SÍ
NO
MADRE DIABÉTICA
SÍ
NO
HERMANOS DIABÉTICOS
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
TÍOS PATERNOS DIABÉTICOS
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
TÍOS MATERNOS DIABÉTICOS
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
FAMILIARES CON PRESIÓN ALTA
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
FAMILIARES CON INFARTO AL CORAZÓN
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
FAMILIARES CON EMBOLIA CEREBRAL
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
FAMILIARES CON ASMA BRONQUIAL
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
FAMILIARES CON HONGOS EN UÑAS
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
FAMILIARES CON HONGOS EN PIEL
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
FAMILIARES CON ALERGIA A ALIMENTOS
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
FAMILIARES CON OTRA ALERGIA
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
Apéndice 4. Historia clínica
89
ANTECEDENTES PERSONALES NO PATOLÓGICOS
¿CUÁNTO PESÓ AL NACER?
RAZA/ETNIA
MESTIZA
VACUNAS
SÍ
GRAMOS
NO SÉ
CAUCÁSICA
NATIVA
NEGRA
ORIENTAL
OTRA
BCG
DPT
POLIO
TRIPLE
QUÍNTUPLE
PISO:
TIERRA
CEMENTO
MOSAICO
OTRO
TECHO:
MATERIAL
LÁMINA
TEJA
OTRO
SERVICIOS:
AGUA
DRENAJE
LUZ
TELÉFONO
ANIMALES DOMÉSTICOS:
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
NO
RESPECTO DE LA CASA QUE HABITA:
NÚMERO DE CUARTOS:
NÚMERO DE PERSONAS POR CUARTO:
HIGIENE:
BAÑO:
DIARIO
CADA TERCER DÍA
1 VEZ POR SEMANA
OTRA
ASEO DE LAS
MANOS:
SIEMPRE ESTÁN
SUCIAS
ANTES DE COMER
DESPUÉS DE IR AL
BAÑO
OTRA
LAVADO DE LOS
DIENTES:
DESPUÉS DE CADA
ALIMENTO
1 VEZ POR DÍA
EN OCASIONES
NUNCA
CAMBIO DE ROPA:
DIARIO
CADA TERCER DÍA
SEMANAL
OTRO
HISTORIA LABORAL:
TRABAJOS DESARROLLADOS:
¿TIENE ALGÚN RIESGO EN SU TRABAJO?
SÍ
¿ACTUALMENTE TIENE TRABAJO?
SÍ
¿HA TENIDO PERIODOS DE DESEMPLEO?
SÍ
¿CÓMO CONSIDERA SU SITUACIÓN
ECONÓMICA ACTUAL?
EXCELENTE
BUENA
REGULAR
¿TIENE ALGO QUE LE PREOCUPE?
SÍ
NO
¿QUÉ COSA?
SÍ
NO
YA NO
EDAD DE
INICIO
¿CUÁNTO TIEMPO HA
FUMADO (EN AÑOS)?
CANTIDAD
DE
CIGARRILLOS
POR DÍA
¿CONOCE EL RIESGO?
SÍ
NO
YA NO
CANTIDAD
EDAD DE
INICIO
TIEMPO DE CONSUMO
(EN AÑOS)
¿DESDE CUÁNDO DEJÓ DE
BEBER?
ALCOHOL
CERVEZA
BRANDY
NO
NO
FIJO
OCASIONAL
OTRO
NO
MALA
SOBRE ADICCIONES:
TABAQUISMO
INGESTIÓN DE BEBIDAS ALCOHÓLICAS
TIPO DE BEBIDA
TEQUILA
¿DESDE
CUÁNDO
DEJÓ DE
FUMAR?
FRECUENCIA
VODKA
90
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
¿TOMA ALCOHOL EN SITUACIONES DIFÍCILES, PARA TOMAR VALOR O
SENTIRSE ALEGRE?
SÍ
NO
¿HA FALTADO A SU TRABAJO POR PROBLEMAS EN LA MANERA DE BEBER?
SÍ
NO
¿HA TENIDO PROBLEMAS LEGALES POR CAUSA DEL ALCOHOL?
SÍ
NO
¿HA TENIDO PROBLEMAS SOCIALES POR CAUSA DEL ALCOHOL?
SÍ
NO
¿BEBE POR LA MAÑANA ANTES DE REALIZAR CUALQUIER OTRA ACTIVIDAD?
SÍ
NO
¿LE APETECE BEBER CUANDO ESTÁ SOLO?
SÍ
NO
¿PRESENTA ENROJECIMIENTO DE LA CARA, PALPITACIONES, FALTA DE AIRE Y
MALESTAR GENERAL ANTES DE TERMINAR LA PRIMERA BEBIDA?
SÍ
NO
¿A CUÁNTAS COPAS O CERVEZAS
PRESENTA USTED ESTOS SÍNTOMAS?
1A3
3A5
MÁS DE 5
¿HA SIDO NECESARIO RECURRIR A ALGÚN TRATAMIENTO
DEBIDO A SU FORMA DE BEBER?
SÍ
NO
ESPECIFIQUE
¿SABE LOS DAÑOS A LA SALUD QUE OCASIONA?
SÍ
NO
ESPECIFIQUE
YA NO
EDAD DE INICIO
¿DESDE
CUÁNDO
YA NO?
¿CUÁNTO
TIEMPO HA SIDO
DEPENDIENTE
(EN AÑOS)?
FRECUENCIA DE
LA ADICCIÓN
EN NÚMERO DE
VECES POR DÍA
¿CONOCE EL
RIESGO?
MENOS DE 1
TOXICOMANÍAS
DROGADICCIÓN
SÍ
NO
TIPO DE DROGA
SOLVENTE
MARIGUANA
COCAÍNA
TACHAS
DE DISEÑO
¿CONSUME
CAFÉ?
SÍ
NO
YA NO
EDAD DE INICIO
¿DESDE
CUÁNDO
YA NO?
¿CUÁNTO
TIEMPO HA SIDO
DEPENDIENTE
(EN AÑOS)?
TAZAS AL DÍA
ÚLTIMA FECHA
DE CONSUMO
MEDICAMENTOS
TIPO DE
MEDICAMENTOS
¿USA PLANTAS
MEDICINALES?
SÍ
NO
YA NO
¿DESDE
CUÁNDO?
ÚLTIMA FECHA
DE CONSUMO
¿LOS HA
SUSPENDIDO
POR SU
CUENTA?
SÍ
NO
FRECUENCIA DE
CONSUMO
¿DESDE
CUÁNDO
YA NO?
ANTIBIÓTICOS
ANTIINFLAMATORIOS
LAXANTES
DIURÉTICOS
OTROS
SÍ
NO
YA NO
CANTIDAD
FRECUENCIA
FRECUENCIA DE
CONSUMO
¿DESDE
CUÁNDO YA NO?
NOMBRE DE LA
PLANTA
PREPARACIÓN
¿PARA QUÉ
ENFERMEDAD?
MEJORÓ
EMPEORÓ
IGUAL
RESULTADO
Apéndice 4. Historia clínica
ANTECEDENTES PERSONALES PATOLÓGICOS
¿PADECE
ALGUNA
ENFERMEDAD?
SÍ
¿DESDE
CUÁNDO?
NO
¿RECIBE
TRATAMIENTO?
SÍ
FECHA DIAGNÓSTICA:
¿ES USTED
DIABÉTICO?
SÍ
¿PADECE
CONVULSIONES?
SÍ
NO
NO
TIPO
I
II
TRATAMIENTO:
LESIONES
OCASIONADAS
SÍ
FECHA DIAGNÓSTICA:
TRATAMIENTO:
SÍ
NO
TIPO
FECHA
DIAGNÓSTICA:
¿SU
ENFERMEDAD SE
RELACIONA CON
AUMENTO DE
PESO?
SÍ
¿PADECE
PRESIÓN ALTA?
SÍ
NO
¿DESDE CUÁNDO?
FECHA
DIAGNÓSTICA:
¿SU
ENFERMEDAD SE
RELACIONA CON
AUMENTO DE
PESO?
¿LE HAN
DETECTADO EL
ÁCIDO ÚRICO
ALTO?
SÍ
¿HA PADECIDO
HONGOS EN
LA PIEL O LAS
UÑAS?
¿HA PADECIDO
ALGUNA
ALERGIA?
¿PADECE ASMA?
¿CUÁL?
TRATAMIENTO:
FECHA DIAGNÓSTICA:
NO
¿CUÁL?
NO
NO
TRATAMIENTO:
SÍ
NO
TRATAMIENTO:
NO
¿DESDE
CUÁNDO?
TRATAMIENTO:
SÍ
NO
¿DESDE
CUÁNDO?
TRATAMIENTO:
SÍ
NO
¿DESDE
CUÁNDO?
TRATAMIENTO:
CAUSA
ALIMENTOS
MEDICAMENTOS
ANIMALES
OTRAS ENFERMEDADES QUE HAYA PADECIDO
OTRAS
91
92
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
ANTECEDENTES GINECOOBSTÉTRICOS
EDAD DE SU PRIMERA REGLA
(MENARQUIA)
AÑOS
IRREGULARIDADES MENSTRUALES
SÍ
¿CADA CUÁNDO TIENE SU REGLA?
DÍAS
¿CUÁNTO DURA SU REGLA?
DÍAS
¿SE HA EMBARAZADO?
NO
TIPO
TRATAMIENTO
SÍ
NO
NÚMERO DE VECES
NÚMERO DE ABORTOS
SÍ
NO
¿CUÁNTOS?
CAUSAS
NÚMERO DE CESÁREAS
SÍ
NO
¿CUÁNTAS?
CAUSAS
¿UTILIZA MÉTODOS ANTICONCEPTIVOS?
SÍ
NO
TIPO
FECHA DE ÚLTIMA REGLA
FECHA DE ÚLTIMO PARTO, CESÁREA, O
AMBOS
INTERROGATORIO POR APARATOS Y SISTEMAS
DOLOR DE CABEZA
SÍ
NO
MAREOS
SÍ
NO
VÉRTIGO
SÍ
NO
CANSANCIO FÁCIL
SÍ
NO
CALAMBRES
SÍ
NO
MUCHO SUEÑO
MALA CALIDAD DEL
SUEÑO
SANGRADO FÁCIL O EXCESIVO (NO MENSTRUAL)
SÍ
NO
MORETONES FÁCILES
SÍ
NO
PALIDEZ DE LA PIEL
SÍ
NO
DOLORES ARTICULARES (COYUNTURAS)
SÍ
NO
ALTERACIONES DEL
SUEÑO
SÍ
NO
INSOMNIO
RIGIDEZ DE LAS ARTICULACIONES
SÍ
NO
¿CUÁNTO TIEMPO LE DURA?
HINCHAZÓN, EDEMA DE MIEMBROS
SUPERIORES E INFERIORES
SÍ
NO
POR LA
MAÑANA
DURANTE EL
DÍA
POR LA
NOCHE
HINCHAZÓN, EDEMA DE LA CARA
SÍ
NO
POR LA
MAÑANA
DURANTE EL
DÍA
POR LA
NOCHE
DOLOR DE PECHO
EDEMA DE ARTICULACIONES
SÍ
SÍ
NO
NO
¿CUÁL?
ANSIEDAD
SÍ
NO
IRRITABILIDAD
SÍ
NO
TRISTEZA EXAGERADA
SÍ
NO
LLORA FÁCILMENTE
SÍ
NO
COMPULSIONES
SÍ
NO
AUTOMEDICACIÓN
SÍ
NO
Apéndice 4. Historia clínica
HOSPITALIZACIONES
SÍ
NO
CAUSA
FECHA
CIRUGÍAS
SÍ
NO
CAUSA
FECHA
INFECCIONES FRECUENTES DE VÍAS
RESPIRATORIAS ALTAS
SÍ
NO
¿CUÁLES?
INFECCIONES FRECUENTES DE VÍAS
RESPIRATORIAS BAJAS
SÍ
NO
¿CUÁLES?
INFECCIONES FRECUENTES DE VÍAS
URINARIAS
SÍ
NO
¿CUÁLES?
INFECCIONES FRECUENTES DE LA
PIEL
SÍ
NO
¿CUÁLES?
INFECCIONES FRECUENTES DEL
ESTÓMAGO
SÍ
NO
¿CUÁLES?
OTRAS INFECCIONES FRECUENTES
SÍ
NO
¿CUÁLES?
93
HÁBITOS PERSONALES
¿A QUÉ HORA SE LEVANTA?
¿A QUÉ HORA SE ACUESTA?
¿CUÁNTO TIEMPO DUERME?
¿TOMA SIESTA?
SÍ
NO
DURACIÓN
¿CUÁNTAS VECES COME AL
DÍA?
VECES
¿COME ENTRE COMIDAS?
SÍ
¿COME FUERA DE LA CASA?
SÍ
NO
FRECUENCIA
VECES
¿CÓMO PREFIERE LA COMIDA?
ASADA
COCIDA
FRITA
DE TODO
¿COME ALIMENTOS
INTEGRALES?
SÍ
NO
FRECUENCIA
VECES
¿COME PRODUCTOS
CHATARRA?
SÍ
NO
FRECUENCIA
VECES
¿DESDE CUÁNDO TIENE
SOBREPESO?
DESDE LA
NIÑEZ
EN LA ADOLESCENCIA
DE ADULTO
DESPUÉS DEL
PARTO
¿ALGUNA SITUACIÓN LE
PROVOCA HAMBRE?
SÍ
NO
¿CUÁL?
¿SE CONSIDERA ADICTO AL
REFRESCO?
SÍ
NO
¿CUÁL?
¿CÓMO SONSIDERA EL CONSUMO DE SAL DE
MESA?
LEVE
MODERADO
¿CUÁNTA AGUA TOMA DURANTE EL DÍA?
LITROS
¿PADECE ESTREÑIMIENTO?
NO
SÍ
FRECUENCIA DE
EVACUACIONES
NO
OTROS
DESPUÉS
DE LA
MENOPAUSIA
INTENSO
VECES
94
Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica
ACTIVIDAD FÍSICA
¿PRACTICA EJERCICIO?
SÍ
NO
TIPO DE EJERCICIO/DEPORTE
CAMINA
CORRE
MOTIVO
YA NO
DESDE
GUSTO
SALUD
OTRO
¿HA SENTIDO MEJORÍA EN SU SALUD CON EL
EJERCICIO?
SÍ
NO
ESPECIFIQUE
FRECUENCIA DE VECES A LA SEMANA
0A2
3A5
5A7
DURACIÓN DEL EJERCICIO
(MINUTOS/SESIÓN)
20 A 30
45 A 60
60 A 90
MÁS DE 90
MUY LEVE
LEVE
MODERADA
ALTA
TIEMPO DE PRACTICARLO
MESES
AÑOS
¿LO REALIZA ACOMPAÑADO?
SÍ
NO
ESPECIFIQUE
¿PERTENECE A ALGÚN CLUB DEPORTIVO?
SÍ
NO
ESPECIFIQUE
SÍ
NO
ESPECIFIQUE
5 A 15
INTENSIDAD
EDAD DE INICIO
AÑOS
¿EN DÓNDE REALIZA LA SESIÓN DE EJERCICIO?
¿LE GUSTARÍA ASISTIR A ALGÚN GRUPO PARA
PRACTICAR EJERCICIO?
ACTIVIDAD LABORAL
HORAS AL DÍA
NÚMERO DE
DÍAS A LA
SEMANA
NIVEL DE INTENSIDAD
ACTIVIDAD EN EL HOGAR
HORAS AL DÍA
NÚMERO DE
DÍAS A LA
SEMANA
NIVEL DE INTENSIDAD
FACTORES DIETÉTICOS
¿CON QUÉ FRECUENCIA BEBE
LECHE?
VECES
CANTIDAD
¿CON QUÉ COCINA?
ACEITE
¿CUÁLES UTILIZA EN
SUS PLATILLOS O BIEN
EN SU PREPARACIÓN?
CREMA
MANTEQUILLA
CHORIZO
OTROS
ml
MANTECA
QUESOS
TOCINO
ADEREZOS
FRECUENCIA DE CONSUMO
CARNE
SÍ
NO
VECES
TIPO
HUEVO
SÍ
NO
VECES
¿CUÁNTOS?
FRIJOLES
SÍ
NO
VECES
¿CUÁNTOS?
VERDURAS
SÍ
NO
VECES
¿CUÁNTOS?
FRUTAS
SÍ
NO
VECES
¿CUÁNTOS?
PAN
SÍ
NO
VECES
¿CUÁNTOS?
CEREALES
SÍ
NO
VECES
¿CUÁNTOS?
POSTRES
SÍ
NO
VECES
¿CUÁNTOS?