Genotoxic evaluation of D-003 on the chromosomal aberrations in

Revista CENIC Ciencias Biológicas. 41, No. Especial, 2010
Genotoxic evaluation of D-003 on the chromosomal aberrations in CHO cells cultures.
Evaluación Genotóxica del D-003 en el ensayo de aberraciones cromosómicas en cultivo
de células CHO.
Rafael Gámez1, Ivonne Fernández,2 Idania Rodeiro3 y Jorge González4
1
Departamento de Toxicología, Centro de Productos Naturales, Centro Nacional de
Investigaciones Científicas, La Habana, Cuba. 2Laboratorios Dalmer, Centro Nacional de
Investigaciones Científicas, La Habana, Cuba. 3Centro de Biopreparados Marinos, La Habana,
Cuba. 4 Centro de Protección e Higiene de las Radiaciones (CPHR), Agencia de Energía
Nuclear y Tecnologías de Avanzada, La Habana, Cuba
1
Correspondencia: Calle 198 entre 19 y 21, Atabey, Playa, Ciudad de La Habana, Apartado
Postal 6414, Cuba. Telef: 2714225, correo electrónico: [email protected]
RESUMEN. El D-003 es una mezcla de ácidos alifáticos primarios de alto peso molecular
purificada de la cera de caña, con efectos antiosteoporóticos, hipolipemiantes y antioxidantes.
El objetivo de este estudio fue investigar si el D-003 induce aberraciones cromosómicas en
cultivo de células CHO. Diferentes concentraciones de D-003 (50, 500, 1000, 2500 y
5000μg/ml) se añadieron a los cultivos en presencia o ausencia de activación metabólica,
incluyéndose controles positivos y negativos. Se examinaron 200 metafases por grupo,
cuantificando el número de aberraciones cromosómicas por metafases y las frecuencias de
células con aberraciones. El D-003 añadido a dosis de hasta 5000µg/mL a los cultivos de
células CHO no indujo aberraciones cromosómicas ni citotoxicidad en presencia o ausencia de
activación metabólica respecto al control negativo, ni tampoco se apreciaron tendencias con las
dosis. El índice mitótico no se modificó con el tratamiento, lo que indica que el D-003 no afectó
la proliferación celular.
ABSTRACT. D-003 is a mixture of very high molecular weight aliphatic primary acids purified
from sugarcane wax, with antiosteoporotic, cholesterol-lowering and antioxidant effects. This
study investigated the in vitro genotoxic potential of D-003 to produce chromosomal aberrations
in CHO cells culture. Fresh suspensions of D-003 were added 50, 500, 1000, 2500 and 5000
μg/mL to cultures with or without metabolic activation (microsomal liver fraction S9 mix).
Concurrent negative (Tween/water vehicle) and positive controls were included. Two hundred
(200) metaphases by group were examined and the numbers and frequencies of cells with
aberrations and cells proliferations index were quantified. D-003 added up to 5000µg/mL of
culture did not induce chromosomal aberrations or citotoxicity in CHO cells culture, in presence
or not of S9 mix compared with negative controls and no trends with the doses were observed.
D-003 did not show potential for induce chromosomal aberrations or citotoxicity in CHO cells
culture.
Palabras clave: D-003, Aberraciones Cromosómicas, Línea celular CHO
Keywords: D-003, Chromosomal Aberration, CHO cells.
1
INTRODUCCIÓN
La búsqueda constante de nuevos medicamentos que sean capaces de accionar sobre los
diferentes factores involucrados en el desarrollo de una enfermedad de tanto impacto como la
aterosclerosis y sus complicaciones, y que a su vez, puedan demostrar un balance riesgo
beneficio satisfactorio, está altamente justificada. Este es el caso del D-003, una mezcla de
ácidos alifáticos primarios de alto peso molecular aislada y purificada de la cera de la caña de
azúcar (Saccharum officinarum L), cuyo componente principal es el ácido 1-octacosanoico,
seguido por los ácidos 1-triacontanoico, 1-dotriacontanoico y 1-tetratriacontanoico.1 En estudios
de farmacología experimental ha sido demostrada su acción hipocolesterolemizante en conejos
normocolesterolemicos, de forma dosis dependiente (5-200 mg/Kg.) disminuyendo el Colesterol
total y la LDL-C, mientras que se incrementa la HDL-C.2. Estos efectos parecen estar mediados
por la inhibición de la biosíntesis de colesterol observada en cultivo de fibroblastos, en un paso
previo a la producción del mevalonato3, probablemente por la modulación de la enzima clave
HMGCoA reductasa. El D-003 también se ha visto que inhibe la peroxidación lipidica inducida
por diferentes agentes, en modelos experimentales,4 así como en voluntarios sanos con dosis
de 5 y 10 mg/día durante 8 semanas5. Por otra parte, el D-003 muestra un efecto antiagregante
plaquetario6 en animales de experimentación (25-200 mg/kg). Este efecto antiagregante del D003 trae consigo un aumento del tiempo de sangrado, en forma dependiente de la dosis a 50 y
200 mg/kg p.c. tras la aplicación única. Resultados similares han sido obtenidos en voluntarios
sanos, en cuanto a los parámetros lipídicos y el efecto antiagregante plaquetario.7,8 Sin
embargo, solamente a la dosis máxima estudiada, 50 mg/día se incrementó el tiempo de
sangrado, pero de forma reversible. Finalmente, el D-003 ha demostrado un efecto antiresortivo
en modelos experimentales.9 Por otra parte, los estudios de toxicidad oral por dosis únicas y
repetidas en roedores, no han mostrado evidencias de toxicidad atribuible al tratamiento en
dosis de hasta 5000 mg/kg.10,11 Similares resultados han sido obtenidos en estudios a largo
plazo en no roedores (perros Beagle).12 En cuanto a los ensayos de toxicología especial, el D003 no evidenció efecto genotóxico en el ensayo con microorganismos13 evaluando la inducción
de mutaciones génicas, ni un efecto clastogénico ensayado en el ensayo de micronúcleos de
médula ósea de roedores14, o por el ensayo cometa.13 Tampoco se evidenció daño en células
germinales de ratón a través del estudio de la morfología del espermatozoide.14 El ensayo de
aberraciones cromosómicas in vitro ha sido utilizado a través de los años para identificar
posibles agentes mutagénicos y carcinogénicos, por la importancia de este tipo de daño para el
fondo de enfermedades El objetivo, por tanto, del presente trabajo es determinar si el D-003
causa aberraciones cromosómicas estructurales tanto cromatídicas como cromosómicas in vitro
empleando para ello la línea celular CHO (ovario de hámster chino).
MATERIALES y METODOS
Línea celular
El estudio fue realizado empleando la línea celular de ovario de hámster chino (CHO), de
morfología epiteliode y la cual cuenta con un número modal de cromosomas de 20-22 (2n=22),
la cual esta bien caracterizada citogenéticamente, con un cariotipo estable y una baja
frecuencia de aberraciones cromosómicas espontáneas. Esta línea celular, junto a los linfocitos
de sangre periférica, son los modelos recomendados por las ICH para el estudio de la inducción
de aberraciones cromosómicas.15 La línea celular utilizada CHO (ATCC), fue donada al
laboratorio del Centro por el Dpto. de Cultivo de Tejidos del Centro de Ingeniería Genética y
Biotecnología (CIGB).
Mantenimiento y procedimiento para la obtención del cultivo celular
Las células fueron cultivadas en frascos de 75 cm2 con medio DMEM, suplementado con 0.85
g/L de Na2CO3, Hepes 4.3 g/L, glutamina 2 mmol/L y suero bovino fetal al 10 %. Las células son
2
desprendidas con la tripsina y después de recuperadas, se sembraron en frascos de 25 cm2 a
razón de 6x105 células por tratamiento y se incubaron por 24 horas a 37°C en atmósfera
húmeda.
Preparación y Exposición a las sustancias de prueba
Las suspensiones de D-003 fueron preparadas en Tween 20 al 0.4 % en PBS. Tanto para el
estudio de citotoxicidad como en el caso del ensayo de aberraciones cromosómicas, se
evaluaron 5 niveles de dosis de D-003: 50, 500, 1000, 2500 y 5000ug/mL, siendo esta última la
máxima dosis establecida para estos estudios según las ICH.15 Además, fue realizado un
control del solvente, con el vehículo empleado en la preparación de las suspensiones, un
control positivo directo (bleomicina, 5 µg/mL).
Ensayo de Inducción de Aberraciones Cromosómicas
Al concluir las primeras 24 horas de incubación, las células fueron expuestas durante 3 horas a
las diferentes dosis de D-003, el control de solvente, el control negativo y un control positivo. Al
finalizar los tratamientos durante este período, el sobrenadante fue eliminado y las células
fueron lavadas sucesivamente (3x) con PBS, dejando recuperarse las células por 17-20 horas,
tiempo necesario para que completen un ciclo celular (13-15 horas). Culminado este tiempo se
adicionó colchicina (5 x 105M) para un tratamiento por 2 horas, al término de las cuales, las
células son colectadas, extendidas en placas petri y teñidas con Giemsa, para el procesamiento
citogenético.
Fueron analizadas 200 metafases por dosis: expresándose el número y la frecuencia de células
con aberraciones, número y frecuencia de células con aberraciones (excluyendo los gaps) y el
índice mitótico.
Ensayo de Citotoxicidad
Las células, luego de 48 horas fueron sembradas en medio de cultivo y expuestas durante 3
horas a las 5 diferentes concentraciones del D-003 y el control negativo. Posteriormente, las
células se lavaron con PBS y fueron colectadas por tripsinización, resembrando 200
células/placa (4 placas/tratamiento) e incubándolas por 7 días a 37ºC. Al finalizar este período,
los cultivos fueron lavados con PBS, se fijaron con metanol (70%) y las placas fueron
coloreadas con Giemsa (10%). Las colonias fueron contadas en un contador de colonias. La
inhibición del crecimiento celular fue determinada mediante la comparación de las células
tratadas y el control de solvente (asumido como el 100%).
Análisis estadístico
El análisis de los resultados se realizó empleando la prueba no paramétrica χ2 en función del
número de células con aberraciones. La relación dosis-respuesta fue analizada mediante
análisis de regresión lineal para proporciones. Se fijó un nivel de significación p< 0.05. En todos
los casos se procesaron resultados de 2 cultivos y tres placas por nivel de dosis.16
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados relativos a la formación de colonias del control negativo (tween 20 al 0.4 %), y
las 5 concentraciones de D-003 evaluadas se muestran en la Tabla 1. La concentración de D003 que produce la muerte del 50% de las células no pudo ser detectada. No obstante, se
observó una ligera disminución del crecimiento celular a partir de la dosis de 500ug/mL, aunque
esta inhibición no alcanzó valores por encima del 17 % con respecto al crecimiento de las
colonias en el control de tween.
3
Tabla 1. Efectos de la exposición a D-003 sobre la proliferación celular
(formación de colonias) en células CHO.
Dosis (µg/mL)
+S9
-S9
Coloniasa %inhibición Coloniasa %inhibición
85,8
94,5
Control
86,3
-0.6
95,5
-1.1
50
72,8
15,2
80,8
14,5
500
73,0
14,9
80.0
15,3
1000
73,3
14,6
80,8
14,5
2500
70,5
17,8
78,8
16,7
5000
(a)
promedio de colonias en 6 placas. ns; p>0.05, prueba χ2.
Por otra parte, el tratamiento con D-003 a las 5 dosis evaluadas no modificó el índice mitótico
cuando se compara con los valores encontrados en el control de solvente, indicando que el
producto no tiene efecto sobre la proliferación celular.
Igualmente, el D-003 no indujo daños estructurales en los cromosomas, a las diversas
concentraciones, así como tampoco se observó una tendencia al incremento de las
aberraciones con el aumento de la dosis. Como era de esperarse y en contraste con estos
resultados negativos, se observó un aumento significativo en él número de aberraciones
estructurales en los cromosomas de aquellas células tratadas con bleomicina, mutágeno directo
y control positivo empleado en este ensayo, mientras que los niveles espontáneos en el control
negativo responde a los controles históricos del laboratorio (Tabla 2).
Tabla 2. Efecto del D-003 sobre la inducción de Aberraciones Cromosómicas en CHO.
Células con
Células con
Cél. AB
Cél. AB.-Gaps
DOSIS
Aberraciones
Aberraciones
(%)
(%)
-Gaps
-S9
11
5.5
5
2.5
Tween 20 ( 0.4 %)
D-003 (µg/mL)
12
6
4
2
50
9
4.5
3
1.5
500
11
5.5
8
4
1000
11
5.5
6
3
2500
10
5
4
2
5000
Bleomicina (5 µg/mL
41*
20.5*
35*
17.5*
µg/mL)
+S9
8
4
1
0.5
Tween 20 ( 0.4 %)
D-003 (µg/mL)
8
4
4
2
50
10
5
5
2.5
500
6
3
3
1.5
1000
6
3
2
1
2500
6
3
4
2
5000
Cél.: Célula, AB: Aberraciones, IM: Índice Mitótico. *p<0.05, prueba χ2.
4
Como parte de la evaluación toxicológica del D-003, se empleó una batería de ensayos para
determinar su potencial genotóxico, utilizando diferentes modelos con microorganismos y
células superiores (mamífero in vivo ), incluyendo distintos tipos de daño genético, como
mutaciones génicas, y daño cromosómico estructural y numérico, sin distinguir con precisión si
se producen aberraciones cromosómicas de algún tipo. He aquí la utilidad del presente modelo,
donde la inducción in Vitro de aberraciones cromosómicas en células de línea es utilizado en la
evaluación gentóxica de nuevos productos con potencial empleo en la terapia, dado que
evalúan directamente la inducción de este tipo de daño por el compuesto considerado.
En primer lugar al determinar, la citoxicidad inducida en la línea celular por cinco
concentraciones del D-003, se apreció una disminución del conteo del número de colonias a las
cuatro dosis mayores pero sin manifestar, un efecto dependiente de la dosis, y que sólo alcanza
una inhibición del crecimiento de alrededor del 15%. Esta reducción del número de colonias
puede ser explicada por muerte y/o inhibición de la proliferación celular. No obstante, esto
último no parece factible, teniendo en cuenta que no hay afectación en el índice mitótico,
determinado en el ensayo de aberraciones cromosómicas. Llama la atención, además que en el
ensayo de Ames, hasta la dosis de 5000 μg/placa, no se apreció efecto citotóxico, como
tampoco en los modelos “in vivo” con roedores. Estos datos, junto a la falta de respuesta
dependiente de la dosis le restan significación a este hallazgo.
Por otra parte, el número y frecuencia de aberraciones cromosómicas observado en control de
solvente y en todos los tratamientos empleados, fueron consistentes con lo reportado como
espontáneo para las células de la línea CHO.15 Mientras, el incremento del número de
aberraciones estructurales inducido por la bleomicina le confiere validez a estos resultados,
pues demuestra la sensibilidad del ensayo para detección de mutágenos en este sistema.
La ausencia de efecto mutagénico observada para el D-003 en este estudio, con y sin
activación metabólica se corresponden con resultados previos en modelos in vitro, ya que dosis
de hasta 5 000 μg /placa en el ensayo de AMES con las cepas TA 1535, TA 1537, TA 1538, TA
98 y TA 100 con y sin activación metabólica no dieron resultados positivos. De igual modo en
sistemas in vivo dosis orales de hasta 2 000 mg/kg no fueron citotóxicas ni mutagénicas en
roedores, de acuerdo a los resultados del ensayo de micronúcleos en médula ósea y ensayo
cometa.13,14
Los resultados del presente estudio, por tanto son coherentes con los obtenidos en previos
estudios de genotoxicidad y confirman la ausencia de potencial genotóxico y citotóxico
del D-003.
CONCLUSIONES
La adición de D-003 (50 - 5000 μg/mL) a cultivo de células CHO, en presencia o ausencia de
activación metabólica, no muestra potencial citotóxico o genotóxico en el ensayo de
aberraciones cromosómicas.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFÌCAS
1. 1. Mas R. D-003: A new substance with promising lipid modifying and pleiotropic effects
for atherosclerosis management. Drugs of the Future. 29:773-86, 2004.
2. Gámez R, Mendoza S, Más R, Mesa, R, Castaño G, Marrero, D. Dose-dependent
cholesterol-lowering effects of D-003 on normocholesterolemic rabbits. Curr Therap Res.
2000;61:8-16.
3. Menéndez R, Mas R, Pérez J, Gonzalez RM, Jímenez S. Oral administration of D-003, a
mixture of very long chain saturated fatty acids, prevents casein-induced endogenous
hypercholesterolemia in rabbits. Canadian J Physiol Pharmacol. 2004;82:22-9.
5
4. Menéndez R, Mas R, Ledón AM, Pérez J, González RM, Rodeiro I, et al. Inhibition of rat
lipoprotein lipid peroxidation by the oral administration of D-003, a mixture of very long
chain saturated fatty acids. Can J Physiol Pharmacol. 2002;67(1):19-24.
5. Castaño G, Menéndez R, Mas R, Ledón N, Fernández J, Pérez J, et al. Effects of D-003,
a new hypocholesterolemic and antiplatelet compound, on lipid profile and lipid
peroxidation in healthy volunteers. Clin Drug Investigation. 2003;23(3):193-203.
6. Molina V, Arruzazabala ML, Carbajal D. Antiplatelet and antithrombotic effect of D-003.
Pharmacol. Res. 2000;42:137-143.
7. Castaño G, Mas R, Fernández L, Illnait J, Gámez R, López E, et al. Assessment of the
effects of D-003, a new antiplatelet and hypocholesterolemic compound on healthy
volunteers: a Phase I Clinical Study. Drugs D & R. 2002;3(5):337-48.
8. Arruzazabala M, Carbajal D, Mas R, Molina V, Castaño G, Gámez R. Effects of D-003, a
new compound purified from sugar cane wax, on platelet aggregation in healthy
volunteers: A randomized, double-blind clinical study. Clinical Drug Invest. 2002;23
(2):107-18.
9. Noa M, Mas R, Mendoza S, Gámez.R, Mendoza N. Effects of D-003, a mixture of high
molecular weight aliphatic acids from sugarcane wax, on bones of ovariectomized rats.
Drugs Exp Clin Res. 2004;30(1):35-41.
10. Gámez R, Mas R, Noa M, Menéndez R, et al. Acute and subchronic oral toxicity of D-003
in rats. Toxicol Lett. 2000;118:31-41.
11. Gámez R, Mas R, Noa M, Menéndez R, García H, González J, et al. Six-month toxicity
study of oral administration of D-003 in Sprague Dawley Rats. Drugs D&R.
2002;3(6):375-86.
12. Gámez R, Mas R, Noa M, Menéndez R, García H, González J, et al. Effects of chronic
administration of D-003, a mixture of sugar cane wax high molecular weight acids, in
beagle dogs. Drugs under Exp Clin Res. 2004;30(2):75-88.
13. Gámez R, Rodeiro I, Fernández I, Acosta P. Preliminary evaluation of the cytotoxic and
genotoxic potencial of D-003: mixture of very long chain fatty acids. Teratogen Carcin
Mut. 2002;22:175-81.
14. Gámez R, González JE, Rodeiro I, Fernández I Alemán C, Rodríguez MD, et al. In vivo
genotoxic evaluation of D-003, a mixture of very long chain fatty acids. J Med Food.
2001;4:85-91.
15. EPA. Health effects test guidelines. In vitro cromosomal aberratrion test. OPPTS 1998,
.870.5375.
16. ICH. Guidelines on genotoxicity. 1997.S2B
17. Margolin BH, Resnick MA, Rimpo JY, Archer P, Galloway SM, Bloom AD, et al.
Statistical Analyses for in vitro cytogenetic assays using Chinese Hamster Ovary Cells.
Environ Mut. 1986;8:183-204.
6