XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico

XIX Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacífico
CLONACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR EN PLÁSMIDOS PARA GENERAR
CURVA DE CUANTIFICACIÓN EN TIEMPO REAL
Cecilia Guadalupe Aguirre Cossio, Alejandra Paola Martínez Camberos, Ingeniería en
Bioctecnología, Universidad Politécnica de Sinaloa, [email protected]. Asesor Dra.
Noemí García Magallanes. Laboratorio de Genética, Ingeniería en Biotecnología, Universidad
Politécnica de Sinaloa. [email protected]
Planteamiento del problema
La reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) en Tiempo Real, es una variación
de la PCR estándar utilizada para la cuantificación de DNA o mRNA presente en
una muestra. Comúnmente se utilizan dos estrategias de cuantificación; la relativa
para obtener magnitud de cambios fisiológicos en niveles de expresión genética
entre genes en comparación y la absoluta, la cual relaciona la señal obtenida con
la técnica al número de copias de una secuencia estándar y de esta manera poder
conocer el número de copias presente en la muestra problema.
El propósito de este estudio es generar los estándares indispensables para
realizar la cuantificación absoluta de diversos genes de interés.
Metodología
Protocolo de clonación de productos de PCR con pGEM-T Easy Vector System II
de Promega. Ligación: Se realizó la reacción adicionando el producto de PCR a la
mezcla de reacción para ligación (5 µL Buffer de ligación rápida 2X, 1 µL pGEM-T,
1 µL ADN ligasa T4, 10 µL agua des-ionizada), se mezcló por pipeteo y dejó
incubar durante la noche a 4°C. Transformación de células competentes JM109 de
alta eficiencia: Se preparan las placas LB/ampicilina/IPTG/X-Gal; se centrifuga la
reacción de ligación y agregan 2 µL de mezcla a tubos en hielo con 1.5 µL de
agua estéril. Se ponen las células JM109 en baño de hielo durante 5 min y
mezclan cuidadosamente; se transfieren 50 µL de éstas a los tubos con la mezcla
de ligación y agua, dejándose incubar en hielo durante 20 min. A continuación, se
provoca choque térmico por 40-45 seg a 42°C y regresan al baño de hielo por 2
min. Se agregan 950 µL de medio SOC a temperatura ambiente a la mezcla en
reacción e incuban por 1.5 hrs a 37°C en agitación a 150rpm. Se agregan 100 µL
de cada cultivo transformado por duplicado en las placas LB/ampicilina/IPTG/XGal e incuba durante la noche a 37°C. Las colonias transformadas tienen
coloración blanca. Posteriormente se seleccionan estas colonias para realizar la
curva de cuantificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) en
Tiempo Real.
Conclusiones
Hasta la fecha se continúa trabajando en la clonación de los plásmidos por el
método propuesto por Promega. Una vez terminada la clonación, se transformarán
las células competentes JM109 de alta eficiencia para realizar la posterior
cuantificación del vector recombinante por PCR de Tiempo Real.
© Programa Interinstitucional para el Fortalecimiento de la Investigación y el Posgrado del
Pacífico
Agosto 2014