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Revista Cubana de Investigaciones Pesqueras
Enero-junio, 2011, vol. 28, No. 1, ISSN 0138-8452, pp. 12-18
Comportamiento de los virus de crustáceos de declaración
obligatoria de la OIE en Litopeneaeus vannamei de cultivo en Cuba
en el período 2003-2009
Crustacean virus of obligatory declaration by OIE performance in cultured
Litopeneaeus vannamei in Cuba from 2003 to 2009
Adriana Artiles,1 Manuel Rubio,1 Ernesto Gonzalez,2 Raico Laria1 y Raquel Silveira1
1
Centro de Investigaciones Pesqueras, 5ta. Ave. y 246, Santa Fe, Playa,
Ciudad de La Habana, Cuba, CP: 19100, Teléfono: (537) 209-7852,
Fax: (537) 204-5895, E-mail: [email protected]
2
Instituto Medicina Veterinaria, calle 12 entre 15 y 17, Vedado,
Plaza, Ciudad de La Habana, Cuba.
RESUMEN
Uno de los principales problemas del cultivo del camarón blanco del Pacífico, Litopeneaeus vannamei, es la susceptibilidad
de esta especie a diversas enfermedades virales, que pueden conducir a grandes mortalidades y/o pérdidas económicas.
En este trabajo se reportan los resultados obtenidos en la ejecución de los muestreos periódicos y chequeos de
cuarentenas correspondientes al programa de vigilancia, desde la primera introducción de esta especie en Cuba
en 2003 hasta el 2009. Para ello se emplearon técnicas de análisis en fresco, histológicas y de biología molecular.
En este período, no se detectó ninguno de los virus de crustáceos que son de declaración obligatoria por la Organización
Mundial de la Salud Animal (OIE, de sus siglas en francés): el virus de la Necrosis Infecciosa Hematopoyética
(IHHNV, de sus siglas en inglés), el virus de la Mancha Blanca (WSSV, de sus siglas en inglés), el virus del Taura
(TSV, de sus siglas en inglés), el virus de la Cabeza Amarilla (YHV, de sus siglas en inglés), el virus de la Mionecrosis
Infecciosa (IMNV, de sus siglas en inglés) y el Baculovirus penaei, PsSOV Bonami (antes BP). Como conclusión se
establece que las medidas de bioseguridad adoptadas, así como el establecimiento de muestreos periódicos y chequeo
de cuarentenas ha permitido que nuestras camaroneras se mantengan libres de estos virus.
Palabras clave: Litopenaeus vannamei, virus, histopatología, PCR, cultivo, bioseguridad.
ABSTRACT
One main problem for cultured white Pacific Shrimp, Litopeneaeus vannamei is viral disease susceptibility, which
can cause important mortalities and/or economic losses. This work is a report of the results obtained in periodic
tests and quarantine checking belonging to the Surveillance program since the first introduction of these specie
in 2003 until last year, 2009. Fresh analysis, histologic and molecular biology techniques were used for this aim.
In this period, none of Crustacean viruses of obligatory declaration by OIE (World Animal Health Organization by
French abbreviations) was detected: Infectious Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV), White Spot Syndrome
Virus (WSSV), Taura Syndrome Virus (TSV), Yellow Head Virus (YHV), Infectious Mionecrosis Virus (IMNV) and
Baculovirus penaei, PsSOV Bonami (before BP). As a conclusion it is stated that biosecurity measures and the
establishment of periodic tests and quarantine checking have made the farms be free from those viruses.
Keywords: Litopenaeus vannamei, virus, histopatoogy, PCR, culture, biosecurity.
INTRODUCCIÓN
El camarón blanco del Pacífico, Litopenaeus vannamei,
se introduce por primera vez en Cuba en el año 2003
(Tizol et al., 2004), proveniente del Centro de Mejora
12
del Camarón (SIS, de sus siglas en inglés), en EE. UU.
Esta especie es susceptible a varios virus que ocasionan
severas mortalidades y pérdidas económicas. Una
estrategia ampliamente utilizada por muchos cultivadores en el mundo para prevenir la presencia de estos
virus, es el empleo de líneas libres de patógenos o Shrimp
Pathogen Free (SPF de sus siglas en inglés) (Lightner,
2005). Los camarones L. vannamei que se cultivan
en Cuba provienen de estas líneas, lo que garantiza
salud, mejor rendimiento productivo y mayor
rentabilidad.
Dos de los virus de ADN a los que es susceptible
Litopeneaus vannamei y que son de declaración
obligatoria por la OIE, son el virus de la Necrosis
Hemorrágica y Hematopoyética Infecciosa (IHHNV, de
sus siglas en inglés) y el virus de la Mancha Blanca
(WSSV, de sus siglas en inglés). Para estas enfermedades la histopatología clásica y las técnicas
moleculares han demostrado ser eficientes para los
diagnósticos presuntivos y confirmatorios cuando hay
un brote de la enfermedad (OIE, 2009). Sin embargo,
para la vigilancia de los portadores asintomáticos en
el período de incubación de ambos virus, solamente
las segundas han demostrado su certeza, rapidez y
sensibilidad. Para los virus de ARN: el virus del Taura
(TSV, de sus siglas en inglés), el virus de la Cabeza
Amarilla (YHV, de sus siglas en inglés) y el virus de la
Mionecrosis Infecciosa (IMNV, de sus siglas en inglés),
la hibridación in situ y/o la reverso trascripción
acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR, de sus siglas en inglés) son los métodos
recomendados por la OIE para su detección. Baculovirus
penaei, también es un virus ADN de declaración
obligatoria, pero no se necesitan las técnicas de
Biología Molecular ni la histología para detectarlo, en
virtud de los evidentes cuerpos de oclusión tetraédricos
que forma y que son fácilmente detectables por
microscopía convencional de preparaciones frescas de
las heces (Couch, 1974).
De estos virus, solo ha habido reportes previos en
Cuba de IHHNV, infectando a Litopennaeus shmitti de
cultivo (Laria et al., 2004); no así en el medio natural.
Baculovirus penaei, que también se ha encontrado en Cuba
en Litopenaeus schmitti en ambientes naturales (Fajer et al.,
1998), no ha sido reportado en nuestro país para el
camarón introducido, y el presente estudio confirma
también este resultado.
También se ha reportado la infección por reovirus
(Cruz & Laria, 2006) y el parvovirus del hepatopáncreas (HPV) (Cruz et al., 2004). Con respecto a estos
que no son de declaración obligatoria se mantiene
igualmente una vigilancia epidemiológica, ya que
pueden ocasionar pérdidas en los cultivos, principalmente, retardo en el crecimiento y afectación en
los animales preadultos.
Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo
de este trabajo es analizar los resultados de la vigilancia
de los virus de declaración obligatoria de la OIE en
L. vanamei, que se lleva a cabo en Cuba desde la
introducción en 2003 hasta el 2009.
MATERIALES
Y MÉTODOS
Se creó una base de datos con la información tomando
como fecha de inicio el año 2003, de las fechas de las
introducciones, cantidad de animales que entraron al
país, sexo y estadio de los camarones. Del mismo modo,
se compiló la información con los resultados obtenidos
en los análisis en fresco, histopatológicos y por PCR de
los virus, en los muestreos periódicos realizados a las
cuatro camaroneras del país: Cultizaza, Cultisur, San Ros,
Calisur y en el Centro de Producción y Cría de Larvas
Yaguacam, como parte del programa de vigilancia de
enfermedades donde cada instalación se chequea cuatro
veces al año.
Toma de muestra
Se realizaron dos muestreos: uno al arribo de los
camarones al centro de cuarentena y otro a los 21 días
del período de cuarentena en cada una de las cinco
introducciones realizadas durante el período 20032008. En cada uno de ellos se emplearon en el
diagnóstico técnicas de biología molecular e
histopatológicas, así como montajes en fresco para la
observación directa al microscopio de frotis de piel y
heces. En el caso de los muestreos periódicos se hizo
una toma de muestra en el período 2008-2009 de cada
camaronera cada cuatro meses.
Para los análisis se tomaron 150 larvas (95 % de límite
de confianza y una prevalencia del 5 %). Para PCR se
colocaron de 20-30 PL5 a PL15 en un tubo con tapa de
rosca y se fijó con etanol absoluto hasta su utilización.
Para histopatología las larvas fueron fijadas en solución
Davidson por 24 h, luego transferidos a etanol 95 %
manteniendo una relación 10:1 fijador – larvas hasta su
procesamiento.
Para el análisis de los reproductores se utilizaron
60 camarones (95 % de límite de confianza y una
prevalencia del 5 %) en cada muestreo realizado, de los
que se tomaron fragmentos del cuarto par de pleópodos
entre el exo y endopodito y branquias que se colocaron en viales con etanol absoluto para su posterior
utilización.
Para el estudio histopatológico, muestras de todos
los órganos fueron fijadas en solución Davidson durante
48 h y luego trasladadas a alcohol 50 %, manteniendo
una relación 10:1 fijador – fragmento. Las larvas y los
fragmentos de los reproductores fueron procesados
mediante la técnica propuesta por Lightner y Redman
(1998), utilizando la tinción con hematoxilina – eosina de
Meyer-Bennett. Las preparaciones fueron observadas en
microscopio óptico.
13
Extracción de ADN y ARN
La extracción de ADN y ARN se realizó siguiendo las
instrucciones de los fabricantes del kit (Farming IntelliGene
Tech. Corp. http://www.iq2000kit.com) teniendo en cuenta
el principal órgano diana que afecta cada virus y el tipo de
material genético que porta este. De este modo, de las
branquias solamente se purificó ARN y cada pleópodo se
dividió en dos luego de eliminar la cutícula para extraer tanto
ADN como ARN. Una vez realizado el protocolo de extracción,
las muestras se disolvieron en agua libre de nucleasas el
ADN y en agua con DEPC el ARN. En el caso de la quinta
introducción la extracción de ADN se hizo por el método
fenol cloroformo modificado (Sambrook et al., 2001).
Condiciones de PCR y RT-PCR
Las reacciones de PCR o RT-PCR se llevaron a cabo por
triplicado en un termociclador MJResearch, con la mezcla
de reacción especificada en el kit y su programa
correspondiente (Farming IntelliGene Tech. Corp. http://
www.iq2000kit.com). Los productos amplificados de las
muestras y los respectivos controles se corrieron en
electroforesis de agarosa al 1,5 % teñida con bromuro
de etidio y se visualizaron en un transiluminador FBTI – 88
(Fisher Biotech). En todos los ensayos se utilizó un control
positivo del kit, un control negativo con agua o ARNt de
levadura y se aplicó en la corrida electroforética un patrón
de peso molecular del kit con tres bandas: 848 pb, 630 pb
y 333 pb.
Criterios de positividad
A continuación se muestran en la TABLA 1 los tamaños
de los amplicones correspondientes a los controles
internos de cada kit (regiones del genoma conservadas
en L. vannamei) y de genes de patogenicidad para cada
virus pesquisado.
TABLA 1. Virus muestreados, ensayo que se realiza para su detección y tamaños de los amplicones y controles
internos para cada ensayo
Virus
Tipo de
ensayo
Pares de base
del control interno
Pares de base
de los amplicones del virus
IHHNV
WSSV
YHV/GAV
PCR
PCR
RT-PCR
243 pb
848 pb
680 pb
TSV
IMNV
RT-PCR
RT-PCR
680 pb
680 pb
438 pb, 644 pb
296 pb, 550 pb
277 pb, 777 pb: para YHV
406 pb, 777 pb: para GAV
284 pb, 476 pb
255 pb, 510 pb
La composición en cuanto a sexo, estadio, cantidad
de animales y otros datos de interés de cada una de las
introducciones de L. vannamei desde 2003, han sido
previamente descritas por Jaime Ceballos et al. (2009).
RESULTADOS
La observación al microscopio de las células epiteliales y el tejido conectivo de tegumento, branquias,
esófago, estómago e intestino posterior, glándula
antenal, órgano linfoide y músculo esquelético no
mostró alteraciones histopatológicas que indicaran
la presencia de alguna de las enfermedades investigadas.
14
Las observaciones del tegumento (Fig. 1) muestran
la cutícula, el epitelio cilíndrico y el tejido conectivo de
epidermis subyacente sanos, sin la presencia de cuerpos
de inclusión intranucleares o citoplasmáticos característicos de los procesos virales.
Los cortes de branquias (Fig. 2a) no muestran
lesiones en sus filamentos, entre las paredes cuticulares
se desarrollaron procesos celulares típicos del epitelio
columnar, no se observó necrosis ni otro tipo de
alteraciones celulares. El tejido muscular esquelético
(Fig. 2b) y el resto de los órganos evaluados no mostraron
alteraciones celulares agudas o crónicas, cuerpos de
inclusión o procesos de inflamación, fibrosis o necrosis
que indiquen desarrollo de algún proceso patológico
causado por enfermedades virales.
Fig. 1 Cutícula del exoesqueleto cefalotoráxico dividida en cuatro capas y el epitelio cilíndrico del tejido subcuticular
en condiciones normales. Aumento 20X.
Fig. 2 Panel A (izquierda): Filamentos branquiales secundarios no ramificados, con vasos aferentes y eferentes
separados por el septum. Entre las paredes cuniculares desarrollan procesos celulares típicos del epitelio columnar.
Aumento: 20X. Panel B (derecha). Sección transversal músculo esquelético de camarón compuesto por células alargadas
formando miofilamentos. Aumento: 20X.
En la figura 3, se muestra un gel de agarosa al 1,5 %
teñido con bromuro de etidio, en el que se verifican las
reacciones de PCR para la detección de los virus cuyo
material genético es el ADN: IHHNV y WSSV. En los
casos de todas las muestras se ven las bandas de control
interno, de 243 pb en el primer caso y de 848 pb en el
segundo. Obsérvese que en los pocillos donde se aplicó
el producto amplificado correspondiente a la reacción
de PCR para los controles positivos, se observan
claramente las bandas especificadas anteriormente:
438 pb para IHHNV y 296 pb y 550 pb para la mancha
blanca.
Fig. 3 Electroforesis del gel de agarosa al 1,5 % teñido con bromuro de etidio de los productos de PCR con cebadores
específicos para IHHNV (Panel A, izquierda) y para WSSV (Panel B, derecha) A: 1; 2; 3; 5 y 6: Muestras negativas.
7: Control positivo del kit IQ 2000 para IHHNV. 4: Control negativo del kit (tRNA de levadura). 8: Marcador de peso
molecular del kit, con bandas de 848 pb, 630 pb y 333 pb. B: 1 y 10: Marcador de peso molecular del kit. 2; 3; 4; 7;
8 y 9: Muestras negativas con control interno de 848 pb. 6: Control negativo del kit (tRNA de levadura). 5: Control
positivo del kit IQ 2000 para WSSV.
15
En la figura 4, se muestra un gel de agarosa al 1,5 %
teñido con bromuro de etidio, en el que se verifican las
reacciones de RT-PCR para la detección de los virus cuyo
material genético es el ARN: YHV/GAV, TSV e IMNV.
Observe en las líneas 6; 7; 14 y 21 los controles positivos
para YHV, GAV, TSV e IMNV respectivamente.
Fig. 4 Electroforesis en agarosa 1,5 % teñida con bromuro de etidio de los productos de la RT-PCR, a partir de RNA
de branquias o pleópodos de Litopeneaus vannamei para detección de los siguientes virus RNA: YHV/GAV, TSV e
IMNV. 1-5: Productos amplificados a partir de ARN aislado de branquias. 6: Control positivo de YHV. 7: Control
positivo de GAV. 8; 15 y 22: Patrón de peso molecular del kit con bandas de: 848, 630 y 333 pb. 9-13: Productos
amplificados a partir de ARN de pleópodos. 14: Control positivo para TSV. 16-20: Productos amplificados a partir de
ARN de pleópodos. 21: Control positivo para IMNV. En todos los casos los productos de PCR a partir del ARN de
camarones fueron una región conservada utilizada como control interno de la reacción y no hubo amplificación
de las bandas de los virus RNA analizados.
En resumen, el criterio de negatividad para la presencia
de los cinco virus en todas las muestras y réplicas
analizadas y la positividad de los controles de los kits,
así como la ausencia de signos patognomónicos en los
análisis histológicos y en fresco, permite concluir que no
han sido introducidos al país camarones infectados con
virus desde el año 2003, y del mismo modo, todos los
análisis de monitoreo han sido negativos para la presencia
de BP, IHHNV, WSSV, YHV/GAV, TSV e IMNV. Este
último, comenzó a pesquizarse en el 2007 en los
muestreos periódicos, pues es el virus que afecta
camarones peneidos más recientemente descubierto
(Nunes et al., 2004; Lightner et al., 2004) y
posteriormente comenzó a comercializarse el kit (http://
www.iq2000kit.com) y en ese propio año fue listada la
enfermedad como de declaración obligatoria por la OIE
(http://www.oie.int).
DISCUSIÓN
Como ya se ha presentado a lo largo de este trabajo, en
2003 se realiza la primera introducción de L. vannamei
procedente de un centro de cría y mejoramiento genético
del camarón de la Florida, EE. UU. (Shrimp Improvement
System, SIS, de sus siglas en inglés). Este centro
comercializa larvas y reproductores libres de patógenos
específicos (Shrimps Pathogen Free, SPF, de sus siglas
en inglés), certificadas por el Laboratorio de Salud Animal
de Organismos Acuáticos de la Universidad de Arizona.
16
Desde entonces, se creó un sistema de vigilancia para
mantener niveles adecuados de salud en estos cultivos,
que incluye, además de la puesta a punto de los sistemas
de diagnósticos necesarios, una capacitación constante
del personal de trabajo de las camaroneras, así como de
los investigadores que ejecutan proyectos relacionados
con estas temáticas. Del mismo modo este programa
vela por el cumplimiento de las medidas de bioseguridad
en todas las instalaciones en las que se lleva a cabo
(Silveira, 2006) y parte de la premisa de que los animales
que entran están certificados como libre de los principales
patógenos virales de declaración obligatoria por la OIE.
Por su ubicación geográfica y los brotes de enfermedades que han conducido a pérdidas económicas
importantes en América Latina, Cuba es susceptible a
posibles entradas de los virus. Con excepción del virus
del complejo de la Cabeza Amarilla (YHV/GAV), que hasta
el momento no está reportado en nuestro hemisferio
occidental, los otros cuatro de los que se habla en el
presente trabajo, han provocado brotes de enfermedades
o han sido encontrados en portadores crónicos sanos.
Por ejemplo, el IHHNV está extendido por casi todo el
mundo, tanto en camarón en cultivo como en poblaciones
salvajes. En el Pacífico este se ha reportado desde Perú
hasta México (Lightner & Redman, 1998a y b; Lightner,
1999), solamente en granjas de cría, al igual que en las
islas del Pacífico como Hawai, Polinesia Francesa y Nueva
Caledonia (Brock & Main, 1994). Particularmente en
Cuba, Laria et al. (2004) detectaron este virus en el camarón
de cultivo L. schmitti, con una metodología similar a la
utilizada en este trabajo, aunque con un kit comercial de
la firma DiagXotics Inc. Ellos plantean, sin embargo, que
en la población de origen de los animales analizados no
se presentaba ninguna deformidad o cualquier signo
característico que pudiera indicar la presencia del agente.
En la fase crónica de la enfermedad, las altas mortalidades
son inusuales, pero hay una disminución significativa del
crecimiento y son comunes las deformidades cuticulares,
especialmente del rostrum (Ligthner, 1999). No obstante,
en Litopenaeus vannamei, para los niveles de prevalencia
ya descritos, no se ha detectado el IHHNV.
Con respecto a Baculovirus penaei, reportado
previamente en Cuba en L. schmitti, no se ha encontrado
en L. vannamei ni en los muestreos periódicos ni en las
cuarentenas, a pesar de que esta especie foránea también
es susceptible a este patógeno. Indiscutiblemente las
medidas de bioseguridad aplicadas en las granjas
camaroneras, especialmente el cuidado en la larvicultura
ha posibilitado la no infección.
La enfermedad de las Manchas Blancas, producida
por el virus homónimo, ha arrasado en todo nuestro
continente, produciendo grandes mortalidades en muchas
regiones de América del Norte, Central y del Sur (Global
Aquaculture Alliance, 1999; OIE, 2009). Este virus,
además, tiene múltiples hospederos que pueden portarlo
de manera asintomática, tales como rotíferos, bivalvos,
gusanos poliquetos, copépodos y crustáceos no
decápodos como Artemia salina (Chang et al., 2002). De
manera que su temprana detección en los camarones de
cultivo es una medida importante para la biocontención
de la enfermedad en caso de que existiera, y del mismo
modo el análisis de los alimentos que consumen estos
animales en cultivo.
El virus del Taura se reconoció por primera vez en
Ecuador (Jiménez, 1992) en P. vannamei cultivado y a
partir de ahí se diseminó mayormente en los cultivos en
EE. UU., Hawaii y al igual que el IHHNV, por la costa del
Pacífico, desde Perú hasta México. También se ha
reportado en algunas poblaciones salvajes en la costa
del Pacífico que no incluyen el Caribe y Golfo de México
(Tang & Lightner, 2005). Por último, la mionecrosis
infecciosa también tuvo su primer brote en América, en
este caso en el noreste de Brasil (Nunes et al., 2004;
Lightner et al., 2004) aunque el resto de sus localizaciones
corresponden al continente asiático (Saengchan et al.,
2007).
Por otra parte, son imprescindibles los pesquisajes de
las cuarentenas y el análisis de los proveedores exigiéndose
siempre pruebas de laboratorio y documentos que
demuestren que los animales están verdaderamente libres
de patógenos. El virus del Taura fue introducido en China
Taipei en 1999, mediante animales infectados provenientes
de América Central y del Sur, y a partir de ahí se diseminó
a la República Popular de China, Tailandia, Malasia e
Indonesia (Yu & Song, 2000; Nielsen et al., 2005).
De esta manera, como se han reportado brotes de
enfermedades causadas por estos virus de crustáceos
en países cercanos e incluso, en el país de origen de los
animales importados por nuestro país, se hace
imprescindible continuar realizando este trabajo para
garantizar la salud de los cultivos en Cuba de L. vannamei
y, por consiguiente, no convertirnos en posibles
exportadores de alguna de estas enfermedades para el
área del Caribe.
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