OBTENCIÓN DE CEPAS HÍBRIDAS DE Pleurotus spp. POR

OBTENCIÓN DE CEPAS HÍBRIDAS DE Pleurotus spp. POR APAREAMIENTO DE
NEOHAPLONTES COMPATIBLES
RESUMEN
El cultivo de Pleurotus en los últimos años se ha incrementado considerablemente a escala
mundial, ocupando en la actualidad el tercer lugar de producción dentro de los hongos
comestibles cultivados. El nuestro país en los últimos años el cultivo de setas se ha
incrementado considerablemente por pequeños productores con cepas silvestres o
extrajeras. Por ello es importante desarrollar cepas híbridas con atributos comerciales de
alta calidad que garantice altos rendimientos. Como objetivo de este trabajo se planteó la
producción de cepas híbridas de Pleurotus spp. para seleccionar aquellas que puedan
contribuir a incrementar la comercialización de este hongo. Una de las técnicas que ha
demostrado gran potencial para la obtención de cepas híbridas con atributos comerciales
importantes es la desdicariotización química, a partir de la cual se obtienen los
componentes monocarióticos que se utilizan para la producción de cepas híbridas. Se
dedicariotizaron 3 cepas de Pleurtotus spp recuperándose los dos componentes
monocarióticos (neohaplontes) para ellas. A través del apareamiento de neohaplontes
compatibles fue posible obtener 3 cepas híbridas.
INTRODUCCIÓN
El cultivo de los hongos representa una industria biotecnológica económicamente
importante que se ha expandido marcadamente sobre todo el mundo en las últimas décadas.
La producción mundial de hongos comestibles cultivados en 1986 fue de 2.176 x 106
toneladas de hongos frescos y se incremento 125.6% para 1994: 4.909 x 106 toneladas de
hongos frescos (Chang, 1996, Royse, 1997). En la actualidad se estima que se producen
5x106 toneladas de hongos frescos por año (Kues y Liu, 2001). Es importante indicar que
en el año de 1986 Pleurotus spp. obtuvo el cuarto lugar de producción mundial con
1.69x106 toneladas después de Agarícus, Lentinus, y Volvariella, y para el año de 1994
paso al segundo lugar con 7.97x106 toneladas de hongos frescos logrando un incremento
del 371.%, entre los años 1986 y 1994 (Chang, 1996; Royse, 1997). En lo que respecta a la
producción de setas (Pleurotus spp ), en México la producción anual estimada en el año de
1990, fue de 356 toneladas de hogos frescos, y en 1997 la producción se estimó en 1,825
toneladas, lo que representa un incremento del 413% durante este periodo (MartinezCarrera, 1997; Sobal et al., 1997).
La adecuada implementación de programas de selección de cepas comerciales de setas
(Pleurotus spp.) que permitan evaluar la productividad (% EB, TP) de las mismas, así como
la identificación de esporóforos atractivos y novedosos con base a sus atributos de calidad
(tamaño, textura, morfología, color y sabor), son de gran importancia ya que pueden
contribuir en el incremento y mejoramiento de la calidad del hongo y por tanto en su
comercialización (Paredes, 1996, Paredes, et al., 1996).
Dada esta situación, se planteó en este trabajo la selección de cepas con colores estables, la
implementación del método de desdicariotización química para la obtención de los
componentes monocaríoticos de estas cepas, la generación de cepas híbrida, con la
finalidad de obtener germoplasma que es importante para el cultivo a escala comercial, así
como para su uso en programas de mejoramiento genético.
OBJETIVO
Obtención y caracterización de cepas híbridas de Pleurotus spp. por apareamiento de
neohaplontes compatibles
MÉTODOS Y MATERIALES
Material biológico.
Las cepas de Pleurotus spp. empleadas en este estudio fueron: lasmcepas parentales IB67,
Poro y RP, las cuales se encuentran depositadas en el cepario del laboratorio de hongos
comestibles de la Sección de Posgrado e Investigación de la UPIBI. El medio de cultivo
utilizado para mantener las cepas y hacer las pruebas de compatibilidad fue extracto de
malta con agar (EMA). Se utilizó una solución de glucosa peptona de carne (Oxid) al 50%
como solución desdicariotizadora (Leal Lara, 1980).
Producción de neohaplontes
Las modificaciones del procedimiento de Leal-Lara (1980) y Arteaga-Santillán et al. (1996)
fueron las siguientes: para la inoculación de la solución glucosa peptona se utilizaron cajas
petri con colonias en crecimiento que ocupaban 2/3 partes de la caja petri. La totalidad del
agar cubierto con micelio de una caja se depositó en un homogeneizador estéril, se
añadieron 50 ml de agua estéril y se homogeneizó por 1 minutos. Se tomaron 100 ml del
homogeneizado para inocular cada matraz con solución de peptona-glucosa, los que se
incubaron a temperatura de 25-28°C. A las 24 y/o 48 hrs. (presencia de desarrollo micelial)
se homogeneizó el contenido del matraz más 50 ml de agua estéril por 30 segundos; 20, 25
y 30 ml de este homogeneizado fueron inoculados en cajas petri. Éstas se incubaron a 28ºC
y al desarrollarse las colonias, la presencia de fíbulas se determinó microscópicamente.
Aquellas que presentaron hifas sin fíbula (neohaplontes) fueron resembradas en agar
extracto de malta para verificar la ausencia de fíbulas al desarrollarse nuevamente. Los
neohaplontes obtenidos fueron apareados para identificar los dos componentes de las cepas
dicarióticas.
Determinación de compatibilidad entre neohaplontes y formación de híbridos.
Los neohaplontes recuperados se propagaron individualmente en cajas petri con EMA hasta
que el diámetro de las colonias alcanzó 2 a 4 cm. Para determinar la compatibilidad entre
colonias monocarióticas, del margen en crecimiento de una colonia se cortó un trozo cúbico
de agar con micelio de 4mm de lado, el cual se colocó en una caja con medio EMA. Al lado
de este fragmento se colocó otro trozo de igual tamaño proveniente de un monocariote
distinto. En cada caja se realizaron 6 apareamientos hasta completar la combinación de
todos los neohaplontes. Después de 2 a 5 días de incubación se detectó con la ayuda del
microscopio la presencia de fíbulas en varios puntos de las colonias formadas por cada
apareamiento, identificándose de esta forma la formación de las cepas dicariótica
correspondientes
RESULTADOS
1.- Establecer las condiciones de dedicariotización de cepas seleccionadas de Pleurotus
spp. y obtener los componentes monocaríoticos de las cepas en estudio
Los estudios genéticos del color en hongos del género Pleurotus precisan de la selección de
cepas con colores estables y definidos. En la presente investigación se trabajaron 3 cepas de
diversas colecciones (cuadro 1), fueron cultivadas en paja de trigo para determinar el color
de esporóforos y esporadas
CUADRO 1. CEPAS DICARIÓTICAS DE Pleurotus spp. UTILIZADAS PARA DESDICARIOTIZACIÓN Y
OBTENCIÓN DE CEPAS HÍBRIDAS.
Crecimiento
Micelial2
(Tipo/Abundancia)
Cepa
Procedencia(Especie)
IB671
U. de Guadalajara, Méx. (Pleurotus sp)
A
POROS
Stamets, USA (P. ostreatoroseus)
RP
Productor en D.F., Méx. (Pleurotus sp)
(1)
(2)
(3)
Color1
Esporóforo
Esporada
EX
Gris rosaseo (3/1B)
Pardusco-amarillo (10/2A)
F
R
Rosa perla (1/8F)
Durazno (10/5B)
A
R
Rosa opera (1/8B)
Durazno (10/5B)
El color de cuerpos fructíferos y esporadas se determinó utilizando los atlas de colores de Kupers (1996)
Crecimiento micelial. Tipo: A = algodonoso, F = filamentoso, Abundancia, Ex = exuberante, R = regular.
Los parámetros de fructificación fueron: T = 15-30, % H.R. 85-95%, ciclo 12 h luz-obs., ventilación continua.
En el cuadro 2 se resume el número total de neohaplontes recuperados para cada cepa
dicariotica, la menor cantidad de componentes monocarioticos obtenidos pertenecieron a la
cepa IB67, con 5 neohaplontes respectivamente, en las demás cepas el número varió entre 9
y 12 neohaplontes. El número de componentes monocarioticos obtenido en general fue
pequeño comparado con los reportes de trabajos previos, en donde el intervalo de
neohaplontes obtenidos varia entre 27 y 45 (Leal-Lara, 1980).
CUADRO 2. RECUPERACIÓN DE COMPONENTES MONOCARIÓTICOS (NEOHAPLONTES) DE CEPAS DE
Pleurotus spp.
Neohaplontes Recuperados
Cepas
Dicarióticas
Total
Tipo nh1
Tipo nh2
Componentes
Recuperados
1B67
POROS
RP
5
11
9
2
8
3
3
3
6
2
2
2
Entre paréntesis se presenta el valor de la significancia (p).
Prueba χ2 para
recuperación simétrica
(nh1:nh2 = 1:1)*
0.20 (0.65)
2.27 (0.13)
1.00 (0.31)
2.- Determinar los factores de compatibilidad y Obtención de cepas híbridas, a través de
neohaplontes compatibles
Al aparear los neohaplontes recuperados se observó la presencia de un grupos interestériles
(cuadro 3). Dentro del se encuentran las cepas IB67, PORO y RP con colores gris rosáceo,
blanco y rosa, respectivamente, agrupándose sus neohaplontes dentro de 2 tipos de
compatibilidad con factores totalmente distintos, el AmBm y el AnBn. Como se puede
observar las cepas parentales se encuentran en este grupo, no obstante, cabe también la
posibilidad de que algunos de los tipos de incompatibilidad correspondieran a los tipos
complementarios de alguno de estos grupos, es decir que los factores del grupo fuesen
AmBn y AnBm. Para elucidar esta situación es necesario obtener los cuatro tipos de
compatibilidad de las progenies meióticas de cada cepa dicariótica con lo que sería posible
verificar sus patrones de interhibridización
CUADRO 3. TIPOS DE COMPATIBILIDAD DE COMPONENTES MONOCARIÓTICOS DE CEPAS DE
Pleurotus spp.
Tipos De
Compatibilidad
Grupo 1
AmBm
AmBm
AnBn
CEPAS
IB671
PORO1
RP1
IB672
IE2001
PORO2
RP2
IB671
+
+
+
+
Gris
rosaceo
PORO1
+
+
+
+
Rosa
AnBn
RP1
+
+
+
+
Rosa
IB672
PORO2
+
+
+
+
+
+
Gris rosaceo Rosa
RP2
+
+
+
Rosa
Color en el Dicariote
original
El signo (+) indica formación de fíbulas, apareamiento compatible. El signo (-) indica apareamiento incompatible o ausencia de fíbulas
A partir de las pruebas de compatibilidad se obtuvieron las cepa híbridas: IB671xRP2,
PORO1xRP2, y PORO2xRP1
IMPACTO DEL PROYECTO
La producción de cepas híbridas de Pleurotus spp. tiene importancia fundamental debido al
auge que adquiere en la actualidad la producción nacional de setas, el contar con
germoplasma que presente características de calidad es primordial para que las empresas
mexicanas puedan competir con los mercados internacionales, desarrollando sus propias
tecnologías de producción y comercialización.
Desde el punto de vista educativo el proyecto permitió un beneficio educativo que se reflejó
en la formación de recursos humanos, como son: Becas del programa PIFI, alumnos de
Servicio Social, y tesistas.
REFERENCIAS
Arias-García, A. 1998. Selección de cepas de Pleurotus ostreatus para el cultivo comercial
por apareamiento entre neohaplontes. Tesis Maestría en Biotecnología. UNAM. México
D.F.
Chang, S. T. 1996. Mushrooms research and development equality ans mutual benefit.
Mush. Biol. Mush. Prod. 2: 1-10.
Kues, U. 2000. Life history and developemental processes in the basidiomycete Coprinus
cinereus. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64: 316-353.
Kues, U. and Liu, Y. 2000. Fruiting body production in basidiomicetes. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 54: 141-152.
Leal-Lara, H., 1980. Sporelessness in basidiomycete Pleurotus ostreatus (Jacq. Ex Fr.)
Kummer. A genetical study by means of a new dedikariotization method. Ph. D.
Dissertation. Marburg University, Marburg/Lahn.
Martínez-Carrera D. 1997. Producción de Pleurotus en México. Memorias del VI Congreso
Nacional de Micología / IX Jornadas Científicas. Tapachula Chiapas, México.
Paredes P.Q., 1996. Evaluación de la productividad de diferentes cepas comerciales del
hongo comestible Pleurotus spp. Tesis Químico en alimentos. UNAM. Facultad de
Química. México.
Paredes, P., H. Leal, R. Ramírez, A. Arias-García, 1996. Criterios de selección de cepas de
Pleurotus spp. para mejorar la competitividad de la producción comercial. Micol. Neotrop.
Apl. 9: 67-79.
Royse, D. J. 1997. Speciality mushrooms: consumption, production and cultivation. Rev.
Mex. Micol. 13: 1-11.
Sobal, M. P., Morales, Martínez, W., Pegler, , D. N. and Martínez-Carrera, D. 1997.
Cultivation of Lentinus levis in México. Micol. Neotrop. Apl. 10:63-71.
Takekuma, S. , Takekuma, H., Matsubara, Y. Inaba, K., Yoshida., Z. 1994. A novel
mushroom pigment: Islation and charactrization. Journal American Chemiestry. 116: 88498850.
Valencia-Del Toro, G. And Leal-Lara, H. 1999. Estudios De Compatibilidad Entre Cepas
De Pleurotus spp Con Cuerpos Fructíferos D Microbiol. Mol. Biol. Rev e Diversos Colores.
Rev.Mex. Micol. 15: