UADY FACULTAD DE QUÍMICA Campus Ciencias De la Salud MÉTODOS ÓPTICOS, ELECTROQUÍMICOS Y CROMATOGRÁFICOS ALFREDO ARAUJO LEÓN ACTIVIDAD 5: “Reconocimiento de la instrumentación de un HPLC-DAD Agilent Technologies 1200 series” INTEGRANTES: KARLA ACEVEDO COOX CAROLINA SÓLIS CONDE MÓNICA GONZÁLEZ DÍAZ ALMA BASTO MOO 4to SEMESTRE FECHA DE ENTREGA: 22 DE MAYO DE 2014 CAPÍTULO 1 INTRODUCCIÓN La cromatografía. Según la IUPAC, la cromatografía es un método, usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, la estacionaria y la fase móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido retenido sobre un sólido o un gel. Esta fase puede estar extendida como una capa o distribuida como una película, etc. La fase móvil puede ser líquida o gaseosa. En un principio las siglas HPLC se debieron a High Pressure Liquid Chroatography, fueron cambiadas cuando los cromatografistas se dieron cuenta de que la presión sólo constituía una herramienta que forzaba a la fase móvil a atravesar la columna, sin constituirse por sí en una variable del sistema. Así, HPLC resulto High Performance Liquid Chromatography. Modalidades de la cromatografía. Se clasifican las modalidades cromatográficas en función de varios parámetros: La naturaleza de la fase móvil: si la fase móvil es un gas, se denimina cromatografía gaseosa (CG) y si es un líquido, cromatografía líquida (CL). Al último grupo pertenecen la cromatografía en capa delgada (TLC), la cromatografía líquida en columna abierta, y la cromatografía de ala performance (HPLC). La cromatografía gaseosa se emplea para separar mezclas que contienen compuestos orgánicos volátiles, pero presenta dificultades si las sustancias a analizar no son volátiles, si descomponen a altas temperaturas o poseen alto peso molecular. En CG la fase móvil es un carrier del soluto y no influye en la separación. El tipo de gas a utilizar se selecciona en función del detector a emplear. Por el contrario, en HPLC la fase móvil es el parámetro fundamental que gobierna la separación. En HPLC con una sola columna es posible separar sustancias polares, iónicas, ionizables y no polares simplemente modificando la composición de la fase móvil. La resolución puede ser mayor en HPLC, pero la eficiencia global es mayor en CG dado que la menor viscosidad de la fase móvil, un gas, permite usar columnas más largas. La selectividad aportada por la amplia variedad de solventes aptos para ser empleados como fase móvil en HPLC le otorgan mucho mayor versatilidad. La naturaleza de la fase estacionaria: si la fase estacionaria es un sólido y la fase móvil un líquido se denomina cromatografía líquido-sólido (LSC). Existirán una cromatografía líquido-líquido (LLC), gas-líquido (GLC) y gassólido (GC). El fenómeno que ocurre dentro de la columna: en la cromatografía de modalidad por afinidad se encuentran la cromatografía en fase normal, en fase líquida y en la modalidad de intercambio iónico. En la cromatografía por tamaño molecular se encuentran la GPC y la GFC. En la primera modalidad el analito interactúa directa e indirectamente, a través del solvente, con la fase estacionaria. En la segunda modalidad no existe ninguna interacción con la fase estacionaria. La cantidad de muestra aplicada: si la cromatografía seleccionada para una separación no destruye la muestra es posible recuperar el analito separado de su matriz a la salida de la columna. Aumentando la cantidad de muestra es posible obtener desde microgramos hasta kilogramos de una pura en una sola corrida. Formas de cromatografía líquida. Cromatografía líquido-sólido (LSC) o de adsorción: emplea una fase estacionaria polar, mayormente silicagel, y una fase móvil no polar, como hexano, con el agregado de un aditivo que provee selectividad. Cromatografía líquido-líquido (LLC) o de partición: las moléculas de soluto se distribuyen entre dos líquidos: una fase móvil y una fase estacionaria, que se encuentra homogéneamente dispersa en un soporte sólido, finamente dividido. Cromatografía de fase ligada (BPC): prácticamente el 90% de las separaciones cromatográficas modernas se efectúa sobre material químicamente modificado, el cual permite optar, según el reactivo empleado para su fabricación, entre materiales altamente hidrofóbicos o altamente hidrofílicos, con un amplio rango de polaridad y de selectividad: octadecilo, octilo, hexilo, butilo, etilo, etc. Cromatografía de intercambio iónico (IEC): se emplean rellenos en los cuales la partícula está constituida por un polímero o por silicagel, unida a un grupo funcional aniónico o catiónico. La elección del tipo de grupo funcional permite escoger entre intercambiadores débiles y fuertes. Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC): emplea materiales de porosidad controlada, que funcionan como un filtro o tamiz y clasifica las moléculas de la muestra según un orden decreciente de tamaño molecular. Si se dispone de estándares apropiados, de peso molecular adecuado, puede evaluarse el peso molecular de un compuesto desconocido, o bien la distribución de pesos moleculares de un polímero sintético. CAPÍTULO 2 INSTRUMENTAL Equipo de HPLC Los equipos de HPLC pueden clasificarse en integrales y modulados. En los integrales cada una de sus partes (reservorio de solventes, bomba, inyector y detector) están reunidas en un gabinete y su intercambio o conexión con otros componentes de la misma o diferente marca es difícil. Permiten un mejor aprovechamiento de espacio, menos cables, tuberías y conexiones expuestas. En los segundos los módulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo según la necesidad del analista sino aumentar su complejidad según esa necesidad varíe. PARTES DEL EQUIPO DE HPLC Reservorio de la fase móvil: Es el recipiente que contiene la fase móvil, puede ubicarse dentro de la caja negra de un equipo integrado o externamente en un equipo modular y algunos centímetros sobre el nivel de la bomba para que la fuerza de gravedad dirija el solvente hacia está manteniendo llenas las conexiones. Tuberías: Conectan el reservorio de solvente con la bomba, la bomba con el inyector, este con uno o más detectores conectados en serie y eventualmente con un colector de fracciones o válvulas de distribución. Estas tuberías deberán ser inertes y de acuerdo a su ubicación en el sistema cromatográfico resistentes a altas presiones. Se emplean tubos de acero inoxidable o poliméricas (polipropileno o teflón). Uniones: Permiten conectar las tuberías y ellas con los distintos componentes del sistema cromatográfico. Existen dos tipos d uniones: convencionales y universales. Las uniones universales son mucho más cómodas que las convencionales sin embargo pueden estar limitadas por la menor presión de trabajo. Las uniones debes ser inertes a fases móviles y muestras, deben cerrar herméticamente y no deben contribuir en forma notable al ensanchamiento de banda extracolumnar por la presión de volúmenes muertos. Bomba: Impulsan la fase móvil proveniente del reservorio de solvente hacia el inyector y desde allí hacia la columna. Su caudal puede ser muy variable según la escala de trabajo que se escoja. Existen dos tipos de bomba: las de presión (bombas reciprocantes) y las de desplazamiento continuo (bombas jeringa). Las de presión son muy versátil y fáciles de adaptar. Están construidas de materiales muy resistentes tanto al ataque químico como al desgaste mecánico. Las bombas tiene las siguientes características: Los caudales son entre 0.1 y 10.0 ml/min y trabajan a presiones de hasta 6000 psi., la exactitud del caudal reside en la determinación de los tiempos de retención del analito a analizar y puede determinarse midiendo el volumen del líquido entregado en un intervalo de tiempo preestablecido, el ruido se refiere a las variaciones denominadas pulsaciones que presentan las bombas del tipo recíprocamente y que conducen a variaciones en el caudal sobre el solvente entregad intervalos cortos de tiempo. La deriva es un cambio continuo (positivo o negativo) en la entrega de solvente que se produce en intervalos de tiempo muy largos. El sistema de corte de caudal, es conveniente que la bomba cuente con esta característica cuando se superan los valores límites de presión tanto superior como inferior. Sistemas de gradientes: La HPLC isocrática es capaz de separar un número limitado de picos por lo que para sistemas complejos o cuando la polaridad de los componente a separar es muy diferente es posible que la modalidad isocrática no sea capaz de resolverlos. En estos casos se puede optar por dos alternativas: la corrida multidimensional o la utilización de un gradiente de solventes el cual es comparable a la programación de temperaturas en cromatografía gaseosa, en HPLC se varía la composición de la fase móvil comenzando la elución con un solvente débil y aumentando progresivamente la proporción del componente fuerte. Inyectores: El inyector es el dispositivo que permite introducir la muestra en solucion sin nterrumpir el caudal de solvente a traves del site,a. el inyector debe reunir una serie de caracteristicas iportantes: debe ser fácil de operar, debe ser inerte al ataque químico y capaz de soportar altar presiones, debe se preciso en cuanto a la cantiad de muestra introducida en el sistema, no debe provocar diluciones importamtes de la solucio inyectada y en casos especale spuede requerirse que opere altar temperaturas. Actulmente la totalidd de los inyectores de HPLC son válvulas que orientan el caudal hacia una columna, pasando o no según su posicion, a través de un loop en el cuals e introduce la solición a inyectar. Las valvulas pueden accionarse manualmente o automaticamente. Detectores: Es la parte del equipo que permite ubicar en tiempo y espacio la posición de cada componete de una muestra a la sallida de la columna cromatografica. Deben reunir ciertas caracteristicas: tener un amplio rango dinámico de respuesta, poseer una rspuesta lineal, no contribuir al ensanchamiento de banda extracolumnar, responder a todos los solutos, tener la sencibilidad apropiada, no afectarse por cambios de temperatura, poseer una buena relacion señal-ruido, no destruir la muesra y tener una conste¿ante de tiempo baja. Pueden clasificarse en generales (miden el cambio de alguna propiedad física de la fase móvil que contiene el analito en comparacion con la misma fase móvil pura) y selectivos (son sencibles a alguna propiedad propia del soluto por ejemplo el detector de UV). Sistema de toma y procesamieto de datos: El resultado del ensayo cromatografico es la obtebcion de fracciones separadas de los componentes de la muestra y la obtencion de un grafico o cromaotrama de cuya interpretacion pueden extraerse conclusiones cualitativas y cuantitatvas. Este registro se obtiene a partir de la señal proveniente del detector por medio de un sistema y procesamiento de datos entre los cuales se encuentran un registrador gráfico, un integrador y una computadora. SÍNTESIS DE LA DINÁMICA DE GRUPO Y EL RECORRIDO POR EL LABORATORIO DE CROMATOGRAFÍA Se realizó una visita al laboratorio de cromatografía de la facultad de química en grupos pequeños. Se realizó una demostración de la partes del equipo de HPLC de acuerdo con la teoría vista en clase. Se pudo observar todas las partes del equipo y el orden en el cual están estructurados. Se observaron 2 equipos uno con inyector manual y otro con inyector automatizado. CAPÍTULO 3 BASES DE LA SEPARACIÓN La cromatografía líquida es un método separativo. La columna puede considerarse el corazón del sistema cromatográfico; el cromatógrafo líquido está constituido por: un reservorio de solvente que alimenta al sistema con la fase móvil, el inyector, la bomba, el detector, un sistema de registro de los datos proveniente del detector, el cromatograma que relaciona la concentración del soluto en función del tiempo, un eluído o eluato el fluído proveniente de la columna, contiene la fase móvil y los componentes de la muestra separados. Bases de la separación Las responsables de la mayor o menor afinidad de cada uno de los componentes de la muestra por la fase móvil o la fase estacionaria son las interacciones hidrofóbicas, puentes de hidrógeno, interacciones dipolares y electrostáticas. El componente más afín a la fase estacionaria tarda más en eluir, mientras el más afín a la fase móvil se retiene menos y eluye antes. Nomenclatura y cálculos La nomenclatura en cromatografía fue estandarizada por la American Society for Testing and Materials, ASTM y la Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC. Es necesario definir algunos conceptos. Cromatograma: es un grafico u otra representación de la respuesta del detector, concentración del efluente u otra cantidad usada como una medida de la concentración del efluente, versus el volumen de efluente o tiempo. Las abscisas corresponden al tiempo durante el cual se efectúa una medición. Las ordenadas corresponden a la señal analógica proveniente del detector, su significado dependerá del tipo de medición efectuada. La altura de la señal indica en cada momento la intensidad de la respuesta. El cromatograma comienza en el momento en el que la solución en ensayo es inyectada. Las señales encontradas en el cromatograma se clasifican de la siguiente manera: Volumen de elución: es el volumen de la fase móvil eluida entre la inyección y la elución de la concentración máxima del soluto. Volumen muerto: es el volumen total de solvente entre el punto de inyección y el de detección, exceptuando el correspondiente a las partículas de la fase estacionaria. Línea de base: es la porción del cromatograma donde sólo se aprecia la elución de la fase móvil, sin señal debida al soluto. Tiempo de retención: es el tiempo medido entre la retención y la elución de la concentración máxima del soluto enésimo. Tiempo de retención neto o relativo: es frecuente expresar el tiempo de retención neto de un pico determinado como diferencia entre su tiempo de retención y el tiempo muerto en lugar del tiempo de retención absoluto. Velocidad lineal: la comparación de métodos que emplean columnas de diferente diámetro interno hace preferible la expresión de la 𝑳 velocidad lineal en lugar del caudal : 𝒖 = 𝒕 𝒐 Factor de capacidad: es el cociente entre el número de moles de soluto en la fase estacionaria y el número de moles de soluto en la fase móvil y está relacionado con el coeficiente de distribución entre 𝒏ú𝒎𝒆𝒓𝒐 𝒅𝒆 𝒎𝒐𝒍𝒆𝒔 𝒅𝒆 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒇𝒂𝒔𝒆 𝒆𝒔𝒕𝒂𝒄𝒊𝒐𝒏𝒂𝒓𝒊𝒂 ambas fases. 𝒌′ = 𝒏ú𝒎𝒆𝒓𝒐 𝒅𝒆 𝒎𝒐𝒍𝒆𝒔 𝒅𝒆 𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕𝒐 𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒇𝒂𝒔𝒆 𝒎𝒐𝒗𝒊𝒍 El valor de k’ puede ajustarse modificando la fuerza de elución de la fase móvil: En fase reversa, k’ disminuye al aumentar la proporción del componente orgánico y aumenta al aumentar la proporción de agua. II. En fase normal, k’ disminuye al aumentar la proporción del solvente polar y aumenta al aumentar la proporción del no polar. III. En cromatografía de intercambio iónico, k’ disminuye al aumentar la concentración del contraión, o la proporción del solvente orgánico. Factor de separación: es el cociente entre los factores de capacidad 𝒌′ (k’) de un par de picos: 𝜶 = 𝒌′𝟐 I. 𝟏 A diferencia de k’, no depende de la fuerza de elución, sino de la afinidad del soluto respecto a la fase móvil y de la columna. Resolución: se calcula por cada par de picos adyacentes 𝑡 𝑡 𝑅 = 1 2− 1 t2 y t1 corresponden a los tiempos de retención de los 2 ( 𝑤2 + 𝑤1) picos 2 y 1, w2 y w1 a los anchos de pico medidos en su base. Ancho de pico: tiene varios objetivos; para calcular la eficiencia de la columna, la resolución, calculo manual del área de picos y en algunos integradores electrónicos se ingresa como dato de ajuste de integración. Platos teóricos: la eficiencia de una columna cromatográfica y su poder separativo se mide en función de su número de platos teóricos. 𝑡 𝑁 = 16 (𝑤 𝑛 ) ^2 el número de platos teóricos puede calcularse en 𝑡𝑎𝑛 función del ancho del pico. Asimetría: su medición es importante puesto que puede llevar, de acuerdo a su magnitud, a errores considerables de cuantificación, e incluso oscurecer picos adyacentes. Proceso de ensanchamiento de bandas Si en lugar de tiempos tomados frecuentemente por comodidad consideramos la retención en función del volumen de elución, para recolectar un pico debe fraccionarse el total del volumen entre el comienzo y la finalización de su señal. Considerando que el número de platos teóricos es aproximadamente constante para todos los solutos, se deduce que a mayor tiempo de retención, corresponderá mayor ancho de pico. Ensanchamiento de banda intracolumnar Según Van Deemter, las contribuciones al ensanchamiento de banda dentro de una columna cromatográfica son cuatro a saber: Proceso multipaso: en una columna rellena con partículas de la fase estacionaria, el soluto encontrara diversos caminos, los cuales será impulsado a recorrer la fase móvil. Su contribución al ensanchamiento de banda está dada por el diámetro de partícula y por una constante que depende del relleno y de la calidad de su empaquetamiento en la columna. Difusión longitudinal: la contribución de este efecto al ensanchamiento es una función inversa de la velocidad lineal de la fase móvil (u) y directa respecto del coeficiente de difusión del soluto en el solvente (Dm) y de alguna constante que evalúe el espacio ocupado por la fase móvil y su geometría (). Resistencia a la transferencia de masa en la fase móvil: la contribución de este efecto al ensanchamiento de banda será mayor cuanto mayor sea la retención del soluto. Así, será directamente proporcional a un factor dependiente de k’ (fm), a la velocidad lineal de la fase móvil (u) y al diámetro de la particula (dp), e inversamente proporcional al coeficiente de difusión del soluto de la fase móvil (Dm). Resistencia a la transferencia de masa en la fase estacionaria: este efecto es semejante al fenómeno de resistencia a la transferencia de masa en la fase móvil y es más pronunciado en la cromatografía de partición de líquido-líquido (LLC). El ensanchamiento será proporcional a una función del factor de capacidad, al espesor de la fase estacionaria en LLC o a la profundidad del poro e inversamente proporcional al coeficiente de difusión del soluto en la fase estacionaria. De la ecuación de Van Deemter se deduce que la HEPT será menor, lo que equivale mayor N: - Menor viscosidad de fase móvil, menor coeficiente de difusión. - Mayor temperatura esta resulta en una disminución de la viscosidad de la fase móvil. - Cuanto mejor sea el empaquetamiento del relleno, por la menor distancia entre partículas de fase estacionaria. Ensanchamiento de banda extracolumnar: los procesos de ensanchamiento de banda extracolumnares pueden medirse en función de la varianza del pico y son producidos por tres fuentes de dispersión: el volumen de inyección, la constante del tiempo del detector, el volumen de los componentes entre el inyector y la celda del detector, excluida la columna cromatográfica. La influencia global de la dispersión extracolumnar depende de la dispersión intracolumnar. Ensanchamiento de banda producido en el detector: el detector puede contribuir de dos formas al ensanchamiento de banda, en función de su componente hidráulico y su componente electrónico Ensanchamiento de bandas producido por tuberías: en HPLC se usan dos tipos de tubuladuras, las de sección interna fina y las de sección interna gruesa. Es recomendable utilizar la más delgada para todas las conexiones entre inyector y detector, para disminuir su contribución al ensanchamiento de banda y las de mayor calibre para las restantes. Ensanchamiento de bandas producido por el volumen de inyección: la muestra se introduce inyectando un volumen de solución. Este volumen se escoge de modo que el analito pueda ser detectado y cuantificado, debe controlarse para que no incida sensiblemente en el ensanchamiento de los picos. El máximo volumen de inyección permisible dependerá de la eficiencia de la columna, su radio y su longitud.