UNIVERSIDAD DE COLIMA TESIS

UNIVERSIDAD DE COLIMA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMEDICAS
MODULACION KI-OPIACEA
DE LA EXCITABILIDAD DE FIBRAS NERVIOSAS DEL
NERVIO SURAL DE LA RATA /N VIVO.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGíA
P R E S E N T A
MED. CIR. ROBERTO ARCEGA SALAZAR
ASESOR: PH.D. MAURO FRANCISCO PACHECO CARRASCO
COLIMA, COL. ENERO DE 1998
Los trabajos que condujeron a la elaboración de la presente tesis se
realizaron en el Laboratorio de Neurobioiogía del Centro Universitario de
Investigaciones Biomédicas (CUIB) de la Universidad de Colima.
Los resultados de la presente investigación, se presentaron en los
siguientes congresos:
XL Congreso de la Sociedad Mexicana de Ciencias Fisiol6gicas,
MìchoacCln (1997).
IV Foro Estatal de Investigación en Salud, Colima, Colima (1997).
II
Morelia,
RESUMEN
Con la finalidad de evaluar las posibles acciones antinociceptivas
periféricas de agonistas rc-opiáceos, se investigó la posible existencia y función de
receptores ~1 -opiáceos en fibras nerviosas periféricas de origen cutáneo.
Para llevar a cabo la presente investigación se utilizaron ratas macho
adultas (Wistar) de 200 a 300 g de peso corporal, las cuales fueron mantenidas
bajo anestesia profunda (pentobarbital sódico, 35 mg/kg, LP.).
Mediante electrodos colocados alrededor del nervio sural (in situ) expuesto
en la región próxima a la piel, se llevó a cabo el registro (diferencial, A.C.) de los
potenciales de acción compuestos (PAC), inducidos por estimulación antidrómica
supramáxima (pulsos cuadrados catódicos, 3 ms, 0.2 Hz). Se analizaron los
efectos de la aplicación tópica (durante 30 min, utilizando una camarita colocada
en la región central del nervio) de dinorfina A 1-17 (DIN) y de los agonistas
opiáceos ~1 -selectivos no-peptídicos, el (+)-(&,8p)-N-metil-N-v-(
oxaspiro[45]dec-8-yl]-bencenacetamìda
1 -pirrolidinil)-l-
(U-69593) y el trans-( 1 S,2S)-3,4-Dicloro-
N-[2-(l-pirrolidinil)ciclohexiI]-bencenacetamida hidrocloruro (U-50488), sobre la
actividad de las diferentes poblaciones de fibras que constituyen el nervio sural.
Tanto los agonistas
Kl
-opiáceos no peptídicos (10 PM) como la DIN (4 OO
p/lJ) indujeron durante los primeros 20 min un decremento paulatino en la
velocidad de conducción de fibras A& hasta de 10 m/s (de 25 a 15 tis),
inicialmente sin cambio en la magnitud de la descarga de dichas fibras, y
posteriormente seguido por un bloqueo total a los 40 min y la completa
III
recuperación después de 60 min de lavado del fármaco. A partir de los 5 min de
aplicación de los agonistas Ic-opiáceos, los potenciales correspondientes a la
descarga de fibras C sufrieron un decremento paulatino en la amplitud y número
de componentes del PAC registrado hasta su total inhibición (dentro de los
primeros 30 min); estableciéndose dicha acción en un orden secuencial, de menor
a mayor velocidades de conducción (0.2 a 2 mk), y recuperándose en forma
inversa. La máxima recuperación obtenida (después de 3 h de lavado) para los
PAC de fibras C fue del 78.2 f 4.7 % con respecto a la magnitud de los registros
control. Por otra parte, el incremento en la frecuencia de estimulación (de 0.2 a
0.5 Hz) revirtió transitoriamente la inhibición inducida por DIN. Las acciones
inhibitorias observadas fueron bloqueadas por el antagonista
selectivo, nor-binaltorfimina
K1-op¡@?o
(n-BNI, 50 PM); y este antagonista per se indujo un
incremento significativo (24.3 f 1.7 %) en la magnitud del PAC.
Nuestros resultados demuestran la presencia de receptores
~1
-opiáceos
selectivos, localizados en nervios periféricos, cuya actividad modula en forma
diferencial la excitabilidad de las diferentes poblaciones de fibras nerviosas;
presentando una mayor sensibilidad a dicha modulación las fibras nerviosas de
conducción lenta (< 2 mk). Finalmente, el incremento en la magnitud del PAC
inducido por n-BNI, senala que: la excitabilidad de fibras nerviosas de nervios
periféricos se encuentra sujeta a una modulación basal tónica de naturaleza
KI-
opiácea. Estos datos sugieren la posibilidad de que, la disfunción de un sistema
constituido por un ligando endógeno (posiblemente la DIN), y los receptores
el-
opiáceos presentes en nervios periféricos, podría resultar en un incremento en la
excitabilidad de las fibras aferentes, y consecuentemente en procesos
neuropatológicos.
IV
INDICE
CONTENIDO
PAGINA
CAPITULO 1. INTRODUCCION
1. ANTECEDENTES INMEDIATOS
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
3. JUSTIFICACION
4. HIPOTESIS
5. OBJETIVOS
6. MARCO TEORICO
6.1. ANESTESICOS LOCALES
6.1.1 DEFINICION
6.1.2. INFORMACION HISTORICA
6.1.3. PROPIEDADES DESEABLES EN LOS
ANESTESICOS LOCALES
10
6.1.4. MECANISMO DE ACCION
l l
6.15 DEPENDENCIA DE LA FRECUENCIA Y DEL USO
12
6.2. TIPOS DE FIBRAS NERVIOSAS Y SUS VELOCIDADES
DE CONDUCCION
14
6.3. RECEPTORES, FARMACOS OPIACEOS, Y PEPTIDOS
OPIOIDES ENDOGENOS
6.3.1. ANTECEDENTES HISTORICOS
16
16
PAGINA
CONTENIDO
6.3.2. ESTRUCTURA QUhlCA, SITIOS DE UNION
16
Y PRECURSORES
6.3.3. DINORFINA Y AGONISTAS
6.3.4. ANTAGONISTAS
K-OF’IACEOS
17
19
K-OPIACEOS
CAPITULO I 1. METODOS
1. PREPARACION
21
EXPERIMENTAL
2. TECNICA DE REGISTRO
21
3. PROCEDIMIENTO FARMACOLOGICO
24
4. ANALISIS DE RESULTADOS
24
CAPITULO I I 1. RESULTADOS
1. EFECTOS DE AGONISTAS
K-OPIACEOS
SOBRE LA
EXCITABILIDAD Y CONDUCCION DE FIBRAS A6 Y C
28
2. EFECTO DE LA FRECUENCIA DE ESTIMULACION
(DEPENDENCIA DE USO) SOBRE IA ACCION DE LA
31
DINORFINA EN FIBRAS Ah Y C
3. NATURALEZA OPIACEA DE LOS EFECTOS EJERCIDOS
POR AGONISTAS
K-OPIACEOS
SOBRE FIBRAS A6 Y C
CAPITULO I V. DISCUSION
33
35
VI
PAGINA
CONTENIDO
CAPITULO V. CONCLUSIONES
40
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
43
VII
INDICE DE FIGURAS
CONTENIDO
PAGINA
FIGURA 1. ESQUEMA DE DISPOSITIVO EXPERIMENTAL
22
FIGURA 2. REGISTRO TIPICO DEL PAC REGISTRADO EN
UNA RAMA CUTANEA DEL NERVIO SURAL
26
FIGURA 3. EFECTO DEL AGONISTA KI-OPIACEO NO PEPTIDICO
U-50488 SOBRE EL PAC DE FIBRAS CUTANEAS DEL
NERVIO SURAL DE LA RATA IN VIVO
30
FIGURA 4. EFECTO DE LA FRECUENCIA DE ESTIMULACION
SOBRE LA ACCION DEPRESORA DE DIN EN FIBRAS
A6 Y C CUTANEAS DEL NERVIO SURAL DE LA RATA
IN VIVO
32
FIGURA 5. EFECTO DEL ANTAGONISTA KI-OPICEO SELECTIVO
34
n-BNI
VIII
CAPITULO I
INTRODUCCION
1. ANTECEDENTES INMEDIATOS.
En el sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos se han identificado tres
familias de péptidos endógenos con actividad opióide: las encefalinas, las endorfinas y
las dinorfinas. Al igual que los otros opióides, las dinorfinas juegan un papel en una
amplia variedad de parámetros fisiológicos, incluyendo: regulación del dolor, de la
actividad motora y c%rdiovascular,
así como en la regulación de la respiración,
temperatura, actividad alimentaria, balance hormonal, y respuestas al shock o al estrés
(Smith y Lee, 1988).
A concentraciones menores a 1 PM, las acciones ftsiolbgicas de las dinorfinas se
ejercen a través de su interacción con receptores
K-Op¡hiOS,
mientras que a
concentraciones mayores esta familia de peptidos se une a receptores p y 6 (Duggan y
Nort, 1983). Con base en las diferentes sensitividades a agonistas y antagonistas, se
han sugerido múltiples subtipos de
benzoacetamidas
tales
K-reCeptOreS
como
oxaspiro[45]dec-8-yI]-bencenacetamida
(l-pirrolidinil)ciclohexil]-bencenacetamida
el
en el cerebro: un lugar
~1,
sensitivo a
(+)-(5a,8P)-N-metil-N-[7-(l-pirrolidinil)-l-
(U-69593) y el trans-(lS,2S)-3,4-dicloro-N-[2(U-50488); y un sitio ~2 (insensible a &stos
compuestos) uniéndose principalmente a péptìdos derivados de prodinorfina (Zukin y
col., 1988).
A nivel del SNC, los efectos depresores ejercidos por agonistas
K-Op¡h?Os
puede estar relacionada con una influencia de estas drogas sobre el flujo sináptico de
los iones de calcio (Gross y col, 1990). De hecho, en preparaciones sinaptosomales
del tejido cerebral, se ha demostrado que los agonistas
K-Op¡&eOS
no peptídicos, el U-
69593 y el U-50488, reducen la entrada de los iones de calcio y por lo tanto la
liberación presináptica de neurotransmisores (Bradford y col., 1986).
-2-
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
La participación de las dinorfinas en el procesamiento de información
nociceptiva aferente en la médula espinal, ha sido propuesta en base a estudios
histoquímicos, los cuales muestran una discreta inmunorreactivídad a la dinorfina A l17 (DIN), concentrándose ésta en la zona marginal (lámina 1); así como evidencia
anatomice-funcional de que las neuronas de la lámina ll (lámina externa) transfieren
las señales nociceptivas de las aferentes primarias a las neuronas marginales
espinales.
En la rata, la administración i.t. de DIN ,
induce un decremento en el flujo
sanguíneo de la médula espinal (Long y col., 1987), parálisis flácida de los miembros
posteriores (Hermann y Goldstein, 1985; Spampinato y Candeletti, 1985), y la pérdida
de reflejos espinales (Caudle e Isaac,1988). La pérdida del reflejo de sacudida de la
cola (RSC), al ejercer un estímulo mecánico nociceptivo sobre la cola de la rata,
siempre ocurre concomitante con parálisis inducida por DIN, y ambos eventos se
presentan en forma de todo o nada, lo cual es dependiente de la dosis (Stewart e
Isaac, 1989). Sin embargo, estos fenómenos difieren en que una vez que se presenta
la inhibición del RSC éste se pierde permanentemente, mientras que la parálisis
inducida por DIN es reversible a dosis bajas de éste péptido e irreversible al
administrar dosis altas (Long y col,l988).
Además, datos electrofisiológicos han
demostrado que la administración i.t. de DIN induce potenciación transiente del reflejo
provocado por estimulación de las fibras “C”, el cual es seguido por una inhibici6n total
de la actividad inducida sobre la raíz ventral (Caudle e Isaac, 1988). Mientras que la
actividad representativa de los reflejos monosìnápticos y polisinápticos mielinizados
-3-
presentan
una
recuperación, la actividad refleja de las fibras “C” se pierde
permanentemente.
La pérdida permanente del RSC y de la actividad refleja de las fibras “C”, así
como la parálisis irreversible inducida por la administración i.t. de DIN ha mostrado ser
el resultado de neurotoxicìdad (pérdida de motoneuronas espinales) asociada al
receptor glutamatérgico NMDA. Sin embargo, los mecanismos a través de los cuales la
DIN ejerce la inhibición transiente de reflejos espinales permanece sin ser elucidada.
-4-
3. JUSTIFICACION.
Además de las ya bien caracterizadas acciones de los opióides en el SNC, se ha
incrementado la evidencia de un papel para los receptores opióides en la periferia.
Se sabe que hay receptores K-opiáceos funcionales en tejidos tales como íleo
de cobayo (Trendelemburg, 1971) y los vasos deferentes del ratón (Henderson y col.,
1972). Recientemente se ha demostrado la presencia de receptores K-opiáceos en
nervios periféricos (nervio ciático de la rana), lo cual sugiere un papel funcional en la
modulación de la excitabilidad de las fibras nerviosas (Luna y Pacheco, 1994).
El perfil farmacológico de los agonistas
K-opkeos
selectivos, originalmente
reportados por Szmuszkovicz y VonVoigtlander en 1982, (como el U-50488 y U-69593),
incluye sedación, analgesia, y efectos anticonvulsivantes que han sido atribuidos a
mecanismos presinápticos que regulan la liberación de neurotransmisores (Proietti y
col. 1991). Sin embargo, se ha postulado una regulación de canales de sodio voltaje
dependiente como mecanismo adicional involucrado en las acciones neurodepresoras
de ~-opiáceos (Iwama y col. 1987). Lo anterior, sugiere que los efectos ejercidos por
dichos fármacos podrían incluir una acción directa sobre la excitabilidad y conducción
nerviosa.
Con base en la información sefialada, surge la posibilidad de que los efectos
depresores inducidos por la administración i.t. de DIN sobre la actividad refleja espinal
(Caudle e Isaac, 1988),
resulte de una acción directa de este péptido sobre la
excitabilidad membrana1 en el soma neurona1
y/o sobre la conducción en las fibras
nerviosas. Por lo tanto, es necesario llevar a cabo una investigación que explore la
existencia y función de agonistas ~-opiáceos en fibras nerviosas periféricas.
-5-
4. HIPOTESIS.
Los agonistas wopiáceos modulan la excitabilidad y conducción en nervios
periféricos de origen cutáneo.
-6-
5. OBJETIVOS.
5.1. OBJETIVO GENERAL.
Investigar la posible existencia y función de receptores
K-opkheos
en fibras
nerviosas periféricas de origen cutáneo.
5.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS.
Mediante el registro de potenciales de acción compuestos en el nervio sural de
la rata:
52.1.
Determinar el efecto de la DIN y de los agonistas
K-Op¡hceoS
no-
peptídicos , sobre las excitabilidad y conducción en diferentes poblaciones de fibras
nerviosas.
5.2.2. Determinar farmacológicamente la naturaleza opiácea de los efectos
ejercidos por la DIN y por agonistas
K-op¡áCeOS
no-peptídicos, mediante la aplicación
del antagonista ~1 -opiáceo selectivo nor-binaltorfimina (n-BNI).
5.2.3. Determinar el efecto de la frecuencia de estimulación nerviosa
(dependencia de uso) sobre la acción de la DIN.
-7-
6. MARCO TEORICO.
6.1. ANESTESICOS LOCALES.
6.1 .l. DEFINICION.
La frase “anestesia local” es usada para describir la pérdida de la sensación en
una área discreta del cuerpo.
A diferencia de la anestesia general, en ésta no hay
perdida de la conciencia. La perdida de la sensación puede ser en una pequeña área
del cuerpo ó incluir la mitad inferior del tronco y las extremidades inferiores. Aunque la
anestesia local produce analgesia local, por ejemplo por bloqueo de las fibras que
transmiten información nociceptiva, también bloquea las fibras autonómicas y motoras,
de esta forma la frase anestesia local es más apropiada para describir la condición
producida por la aplicación o inyección de un agente anestésico local.
Todos los agentes anestésicos locales son agentes que bloquean los nervios o
la conducción, pero no todos los agentes que son capaces de bloquear la conducción
en la fibras nerviosas son agentes anestésicos locales. La frase “agente anestésico
local” es, usualmente reservada para agentes que tienen o son investigados con el
animo de definir si cumplen o no con los criterios necesarios para ser clínicamente
usables. Agentes tales como tetrodotoxina, batracotoxina, fenol y etanol, aunque
producen bloqueo nervioso reversible a concentraciones apropiadas, no son
normalmente vistos como agentes anestésicos locales.
6.12. INFORMACIÓN HIST6RICA.
La historia de la anestesia local en la medicina moderna inicia con el aislamiento
de la cocaína de las hojas de Erithroxylon coca por Niemann en 1860 y estudiadas
subsecuentemente por von Anrep y Koller, y otros, quienes demostraron los usos
-8-
clínicos de esta substancia como un agente anestésico local. Una necesidad había
sido cubierta, pero durante los siguientes afios la toxicidad y sus capacidades
altamente adictivas se hicieron evidentes.
Esto apresuró la búsqueda de otros
componentes que llenaran la necesidad de un agente anestésico local libre y efectivo.
La procaína, sintetizada por Einhorn en 1905, fue nombrado como el primer agente
anestésico local para ser cuidadosamente usado. Su toxicidad es baja, pero es muy
poco potente, es inestable y su duración de acción, siempre que es usado junto con un
agente vasoconstrictor, es demasiado corta para muchos procedimientos quirúrgicos.
Consecuentemente, la búsqueda de agentes más potentes con una larga duración de
acción y una toxicidad aceptable continuaron.
No obstante que, la procaína fue el
primer agente anestésico local a ser cuidadosamente usado, su sinónimo, la
novocaína, es actualmente usado incorrectamente por ambos, legos y profesionales,
como un termino genérico para cualquier agente anestésico local. La continuación en
la búsqueda de un mejor agente anestésico local dio como resultado la tetracaína en
1931. Es éste un agente potente con una larga duración de accibn. Es también tóxico
para muchos tipos de bloqueo, y es usado casi exclusivamente para anestesia espinal
y tópica.
En 1943 Löfgren sintetizó la lidocaína, y éste agente, por que posee una
excelente combinación de potencia adecuada, estabilidad física, moderada toxicidad, y
una duración de acción suficiente para muchos procedimientos quirúrgicos, se volvió
en corto tiempo el agente anestésico local disponible más frecuentemente usado.
Como se ha enfatizado, no hay agentes universales. Aunque algunos, tales
como la lidocaína, son extremadamente versátiles, no pueden llenar adecuadamente
las necesidades en el campo de la anestesia regional.
-9-
Así, la búsqueda de agentes anestésicos locales continúa en la actualidad. De
los numerosos componentes sintetizados y probados cada aíio, muy pocos llegan a las
pruebas clinicas y, de aquellos que lo hacen, sólo un pequeno porcentaje se ha
encontrado que son suficientemente superiores en uno o más aspectos a los agentes
actualmente disponibles para ser utilizados. Un ejemplo de tales, es, la bupivacaína, la
cual fue sintetizada en 1957 por af Ekenstam. La bupivacaína es un congénere de la
mepivacaína, la cual es un agente similar a la lidocaína en potencia, toxicidad, y
duración de acción, sin embargo, es más potente y más tóxica que cualquiera de los
componentes y tambibn tiene una gran duración de acción. Tales agentes son usados
ampliamente para procedimientos quirúrgicos de larga duración y para reducir la
necesidad de agentes analgésicos postoperatorios. La etidocaína, primero reportada
por Adams y col. en 1973, es también un potente anestésico con una larga duración de
acción. Se ha reportado que es especialmente usado en procedimientos quirúrgicos en
los que se requiera buena relajación muscular.
La búsqueda de agentes con una ultralarga duración de acción se ha promovido
por la necesidad de su uso en el control del dolor. En vista de las desafortunadas
consecuencias que resultaron de mezclas tales como Efocaina, la posibilidad de
obtener una analgésis de larga duración por medio de preparaciones ya sea de
depósito o liberación prolongada no debe ser abandonada.
6.1.3. PROPIEDADES DESEABLES EN LOS ANESTESICOS LOCALES
Dentro de las propiedades que debe tener todo buen anestésico local están:
a) No debe ser irritante para el tejido donde se aplica.
b) No debe causar daño permanente a la estructura nerviosa.
- lo-
c) Su toxicidad sistemica debe ser baja, ya que puede ser se absorbida de su sitio de
aplicación. Consecuentemente, el índice terapéutico es un factor importante para
evaluar la eficacia y eficiencia de los anestésicos locales.
d) Debe ser efectivo tanto cuando se inyecta a tejidos, como localmente cuando se
aplica a mucosas.
e) Que el tiempo para la iniciación del efecto anestésico sea lo más breve posible y su
acción debe durar lo suficiente para realizar la cirugia que se pretenda; pero no a tal
grado que el periodo de recuperación sea prolongado. Particularmente un efecto
prolongado del anestésico local puede ser deseable, por ejemplo para obtener control
de dolor tipo crónico.
Solo que los fármacos utilizados para este fin generalmente
tienen gran efecto tóxico local, pudiendo producir desde neurolisis con esfacelo y
necrosis de tejidos vecinos, hasta, lesión transversal parcial o total de la medula
espinal con parálisis permanente si la lesión se produce cerca del raquis.
6.1.4. MECANISMO DE ACCIÓN.
La forma en que actúan los anestésicos locales es impidiendo la producción y
conducción de los impulsos nerviosos, a nivel de la membrana celular. De acuerdo con
los trabajos de Hodking y Huxley, es posible explicar (al menos parcialmente), la acción
de los anestésicos locales en base a la teoría iónica de la actividad nerviosa.
Los
mencionados fármacos bloquean la conducción, ya sea disminuyendo o impidiendo el
aumento transitorio de permeabilidad de la membrana a los iones de sodio que se
produce por una ligera despolarización de la membrana ( Rítchie, 1975 y Stricharts,
1976 ). La acción anestbsica en un nervio se lleva a cabo por un aumento progresivo
del umbral de excitabilidad eléctrica y una disminución del factor de seguridad de la
conducción; si
ésta acción
se desarrolla adecuadamente se produce
consecuentemente bloqueo de la conducci6n.
- ll -
Además los anestésicos locales
disminuyen la permeabilidad del nervio en reposo tanto al sodio como al potasio, lo
cual explica por que el bloqueo de la conducción no presenta cambios en el potencial
de reposo que sean grandes o sostenidos (Straub, 1956 ). De acuerdo con estudios
realizados por Narahashi y Frasier en 1971, se considera que el sitio de acción de los
anestésicos locales (forma iónica ), se establece únicamente desde la superficie
interna de la membrana. Cuando se aplican externamente éstos deben cruzar la
membrana en la forma no cargada, para luego poder ejercer su acción bloqueante. El
mecanismo preciso por el cual los anestésicos locales influyen sobre la permeabilidad
membrana1 actualmente se desconoce. Shanes en 1958, sugirib que los anestésicos
locales producen el bloqueo nervioso aumentando la tensión superficial de la capa
lipídica que constituye la membrana nerviosa, produciendo así el cierre de los poros
por donde circulan los iones, lo cual produciría una disminución general de
permeabilidad en raposo, limitando también el aumento de la permeabilidad al sodio,
siendo el cambio fundamental para la producción del potencial de acción. Por otra
parte Metcalfe y Burgen en 1968, sugirieron que estos f&macos afectan la
permeabilidad aumentando el grado de desorden de la membrana. La reversión parcial
del bloqueo anestksico
local por presión externa elevada concuerda con la última
opinión ( Kinding y Cohen, 1977 ), sin embargo, por lo menos un mecanismo de acción
de los anestésicos locales involucra su combinación con un sitio receptor específico
dentro del canal de sodio que de esta manera queda bloqueado ( Narahashi y Frasier,
1971; Ritchie,l975; Stricharts, 1976; Hille, 1977 ).
6.1.5. DEPENDENCIA DE LA FRECUENCIA Y DEL USO.
El grado de bloqueo producido por una concentración dada de anestésico local
depende principalmente de cuando ha sido estimulado el nervio. Por lo tanto un nervio
en reposo es menos sensible que otro estimulado reciente y repetidamente. Cuanto
- 12-
mayor es la frecuencia de la estimulación precedente, mayor es el grado de
desbloqueo obtenido. Estos efectos dependientes de la frecuencia y el uso existen
porque la molécula del anestésico local en su forma cuaternaria tiene acceso al
receptor solamente cuando las compuertas de la cara interna del canal de sodio se
abren, y por que la afinidad del fármaco por el receptor de sodio depende del voltaje
(Strichartz,
1973; Courtney, 1975; Hille, 1977; Courtney y col., 1978; Ritchie, 1979 ).
- 13-
6.2. TIPOS DE FIBRAS NERVIOSAS Y SUS VELOCIDADES DE
CONDUCCION.
De acuerdo con la clasificación fisiolbgica de las fibras nerviosas tenemos que:
Las fibras de tipo A, son fibras mielinizadas y se les considera conforman
principalmente los nervios raquídeos. Las de tipo B difieren del tipo A únicamente por
el hecho de que no presentan un pos-potencial negativo después de la estimulación;
aunque también son fibras mielinizadas, y se les encuentra formando los nervios
vegetativos preganglionares.
Las fibras de tipo C, son fibras no mielínicas muy
delgadas que conducen los impulsos a bajas velocidades, constituyen más de la mitad
de los nervios sensitivos y también todas las fibras neurovegetativas pos-ganglionares.
Más de las dos terceras partes de todas las fibras nerviosas de los nervios periféricos
son fibras de tipo C. Dado su gran número, pueden transmitir enormes cantidades de
información desde la superficie del cuerpo, aunque la velocidad de conducción sea
muy lenta. La utilización de este tipo de fibras para transmitir esta gran cantidad de
información, representa una importante economía de espacio en los nervios, ya que el
empleo de fibras tipo A necesitaría nervios periféricos de las dimensiones de grandes
cables y una medula espinal casi tan voluminosa como nuestro propio cuerpo.
Las fibras de tipo A se subdividen en fibras a, 8, y 6. Las primeras tienen un
diámetro entre 13 y 22 Pm, con velocidades de conducción entre 70 y 120 mk, siendo
su función de tipo motora; las AQ, cuyos diámetros se encuentran entre 8 y 13 Pm y
velocidades de conducción de 40 a 70 m/s, tienen funciones táctiles, de presión y
cinestésicas; por su parte las fibras tipo A6, tienen diámetros que van de 1 a 4 Pm y sus
velocidades de conduccion estCtn entre 5 y 30 tn/s. Se sabe estas fibras
funcionalmente conducen infonnacion nociceptiva, prurito, frío, y calor. Por su parte las
fibras de tipo B, que tienen 1 a 3 Pm de diámetro y velocidades de 3-14 mk, participan
- 14-
en funciones neurovegetativas a nivel preganglionar. Finalmente las fibras de tipo C
las cuales participan funcionalmente a nivel vegetativo posganglionar, así como con
respecto a nocícepcíón, prurito, en sensaciones térmicas (calor y frío), además de
presión. Estas presentan diámetros tan pequefios que se encuentran entre 0.2 y 1 .O
Pm, y sus velocidades de conducción varian de 0.2 a 2 mls.
-lis-
6.3. RECEPTORES, FARMACOS OPIACEOS, Y PEPTIDOS OPIOIDES
ENDOGENOS.
6.3.1. ANTECEDENTES HISTORICOS.
Theophrastus en el siglo tercero A.C., es el autor de la primera referencia sobre
el uso de los opiáceos, destacando sus propiedades analgésicas.
Goldstein y col. a consecuencia de sus trabajos en cerebro de ratón, observaron
la posibilidad de indentificar
los receptores opiáceos cuantificando su unión
estereoespecifica a membranas cerebrales aisladas (Dole y col, 1971).
Las dinorfinas A I-17 y A l-l 3 (familia de péptidos endógenos) fueron
identificadas y aisladas de glándulas hipofisarias por Goldstein y col. en 1979. El
descubrimiento de este tipo de péptidos, se ha traducido en aumento de su aplicación
terapeutica, por su semejanza de acción con la morfina, por lo que se considera que
estos compuestos deben tener funciones fisiologicas y que el efecto de la morfina y
otros alcaloides opiáceos se lleva a cabo actuando sobre sistemas funcionales que
utilizan péptidos opióides endógenos ( Lee y col. 1964 ).
6.3.2. ESTRUCTURA QUIMICA, SITIOS DE UNION, Y PRECURSORES.
En el sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos se han identificado tres
diferentes familias de péptidos endógenos con actividad opioide: las encefalinas,
endorfinas y dinorfinas.
Sus precursores son: Proencefalina (Proencefalina A);
Proopiomelanocortina ( POMC); y Prodinorfina (proencefalina B), respectivamente.
Cada uno de estos precursores contiene una cantidad de péptidos biológicamente
- 16-
activos, opióides y no opióides, los cuales se detectaron en la sangre y en diversos
tejidos.
La POMC contiene la secuencia de aminoácidos de la hormona melanocitoestimulante (y-MSH), adrenocorticotrofina (ACTH), y p-lipotrofina (/3-LPH); dentro de la
secuencia de 91 aminoácidos de la p-LPH están tas p-endorfinas y la p-MSH. Aunque
la P-endorfina contiene la secuencia para la Met-encefalina deriva del procesamiento
de la proencefalina. La leu-encefalina y otros péptidos opióides se producen a partir
de la Proencefalina y la Prodinofina.
Esta última produce cinco péptidos que
contienen Leu-encefalina, la dinorfina A l-17 (DIN) que puede clivarse a dinorfina A l13 ó a dinotftna A 1-8; la dinorfina B (rimotfina); las neoendorfinas CL y p, que sólo
difieren entre sí en un aminoácido.
Dichos péptidos opióides u opiopeptinas son capaces de afectar la excitabilidad
neurona1 por la interacción con varios sitios de reconocimiento en la membrana
neurona1
( receptores
p, K , 6 , 6, etc.
). Las
encefalinas
se Unen principalmente
a 6-
receptores, mientras que la B-endorfina parece interactuar con los receptores p y 6.
Los sitios de unión de las dinotfinas en el cerebro no han sido extensamente
estudiadas, pero los resultados in vitro obtenidos por Chavkin y col. (1982), indicaron
que esta opiopeptina presenta alta afinidad a otro tipo de receptor, el
6.3.3. DINORFINA Y AGONISTAS
K-receptor.
K-OPIACEOS.
El hipotálamo es el lugar en el que se concentra la mayor cantidad de dinorfina,
aún cuando también se le encuentra en otras regiones del sistema nervioso central
como son: raíz dorsal de la tidula espinal, hipocampo y núcleo estriado. Goldstein y
col. en 1979, fueron quienes demostraron la secuencia de los primeros 13
- 17-
aminoácidos, cuyas propiedades se estudiaron junto con la secuencia completa de 17
aminoácidos. Mediante bioensayos en musculo liso se encontró que la DIN y la
dinorfína 1-13 fueron más potentes que la normorfina,
la Leu-encefalina
o la p-
endorfina. La DIN también desplaza a la naloxona y a la dihidromorfina (DHM) en
experimentos in vitre, aún cuando este péptido es degradado rápidamente en el tejido
cerebral. Trabajos posteriores mencionan que la DIN l-13 tiene propiedades de Kagonista y opiáceos relacionados que se unen a receptores distintos a los que se une
la morfina (u) 0 las encefalinas (6).
administracibn
Estudios adicionales revelaron que la
i.v.c. de DIN no parece tener acciones analgésicas en la rata. La falta
de este efecto fue atribuido a una rápida degradación de la dinorfina en el cerebro.
El perfil farmacológico de los agonistas
K-op¡&ceos
selectivos, originalmente
reportados por Szmuszkovicz y VonVoigtlander en 1982, (como el U-50488 y U-69593),
incluye sedación, analgesia, y efectos anticonvulsivantes que han sido atribuidos a
mecanismos presinápticos que regulan la liberación de neurotransmisores (Proietti y
col. 1991). Sin embargo, se ha postulado una regulación de canales de sodio voltaje
dependiente como mecanismo adicional involucrado en las acciones neurodepresoras
de
K-opi&eOS
(Iwama y col. 1987). De echo, en los sinaptosomas de cerebro, el U-
69593 y U-50488 reducen la entrada de los iones de calcio y la líberación presináptíca
de neurotransmisores (Bradford, Crouder y White, 1986). Lo anterior, sugiere que los
efectos ejercidos por dichos fármacos podrían incluir una acción directa sobre la
excitabilidad y conducción nerviosa. El U50488 es un agonísta altamente selectivo al
receptor opíoide K (Von Voigtlander et al., 1983). Alzheimer y Bruggencate (1990)
mostraron evidencia experimental, mediante registros electrofisiolbgicos
intracelulares, de que U-50488 ejerce una aparente acción de anestesíco
extra e
local,
reduciendo la amplitud de los potenciales de acción sodio-dependientes en neuronas
- 18-
CA3 del hipocampo in vitre, en forma reversible y mediante acciones de naturaleza no
opiácea.
6.3.4. ANTAGONISTAS OPIACEOS.
Las acciones farmacológicas de estos compuestos dependen de si un agonista
opiáceo se administró previamente, del perfil farmacológico del opiãceo, así como del
grado en que se ha desarrollado la dependencia física a ésa sustancia. La Naloxona es
un antagonista competitivo sobre receptores
p,8,K
y (r.
Por otra parte la nor-
binaltorfimina (n-MV& se ha encontrado que es un antagonista ~-1 selectivo.
- 19-
CAPITULO I I
METODOS
-
20 -
1. PREPARACION EXPERIMENTAL.
Los sujetos experimentales utilizados en esta investigación fueron ratas macho
de la cepa Wistar de 200 a 300 g de peso corporal, las cuales se mantuvieron bajo
anestesia profunda con pentobarbital sódico a dosis de 35 mg/Kg de peso por vía
intraperitoneal. Posteriormente se canuló la traquea (traqueostomía) para mantener la
vía respiratoria permeable durante todo el proceso experimental, procediéndose en
seguida a la disección de una rama cutánea del nervio sural en la cara interna de la
extremidad posterior izquierda.
Disecándose una pequefla sección del nervio en la
parte mas proximal de la extremidad para en este lugar colocar los electrodos de
estimulación, disecándose también otra pequeña area de la sección más cercana a la
piel (región dista1 de la extremidad) donde se colocaron los electrodos de registro.
Posteriormente se monto la porción central del nervio en la ranura de una camarita
(diámetro 6 mm) colocada bajo éste nervio, tratando de mantener intacta la circulación
en toda el area (fig.1). En la camarita se depositaron los fármacos en estudio.
2. TECNICA DE REGISTRO.
La estimulación antidrómica supramáxima del nervio se llevo a cabo mediante
pulsos cuadrados catódicos (0.1-3 ms, 0.2 Hz). Se analizaron los efectos de la
aplicación tópica de dinorfina
A 1-17 (DIN) y de los agonistas re-opiáceos no
peptídicos, sobre la actividad de las diferentes poblaciones de fibras que constituyen el
nervio sural (fig. 1).
El registro diferencial (A.C.) de los potenciales de acción
compuestos (PAC) se realizó mediante electrodos bipolares conectados a una punta de
prueba activa (Al 401 X10 , Axon Intruments) conectada a su vez a un
amplificadorkondicionador programable de señales (Cyberamp 320, Axon Instruments)
a través de una interfase digitalizadora (DigiData 1200A, Axon Instruments) conectada
-2l-
a una computadora 466 DX, utilizando el programa de adquisición Clampex (Pclamp6,
Axon
Instruments).
Las senales electrofisiológicas fueron registradas en un ancho de
banda de 4Hz a 3 KHz, y digitalizadas a 6.6 KHz.
- 22 -
Figura 1.
ESQUEMA DE DISPOSITIVO EXPERIMENTAL
Exposición del n. sural (aprox. 1 cm) en 3 regiones.
Región femoral, electrodo de estimulación
Región tibial próxima cutánea, electrodo de registro.
Región media, cámara para aplicación de fármacos.
Registro (diferencial, A.C.)
Potenciales de acción
compuestos (PAC)
Estimulacibn antidrómica
pulsos cuadrados
catódicos supramáximos
(0.1-3 ms, 0.2 Hz)
Punta de prueba X 10
CyberAmp 320
DigiData 1200A
AxoClamp 6
- 23 -
3. PROCEDIMIENTO FARMACOLOGICO.
Una vez que se obtuvo un potencial de acción compuesto estable, se procedió a
la aplicación de los fbrmacos en la camarita central. Los fármacos utilizados fueron
Dinorfina
A I-17 (Bachem) a concentraciones de 50 y 100 FM; los agonistas
opiaceos no peptídicos , a concentraciones de 0.1, 0.5, 1, lo@; y el antagonista
opiáceo selectivo nor-binaltorfimina
K-
el-
(n-BNI), a concentración 50 PM. Todos los
fármacos fueron llevados a su concentración final en solución salina isotónica (NaCI
0.9 “x3).
4. ANALISIS
DE RESULTADOS.
Los trazos obtenidos mediante el promedio digital de 10 registros unitarios
continuos de los PAC, fueron analizados mediante el programa Clampfit (Pclamp6,
Axon Instruments) y el módulo pclamp del programa Origin (Microcal).
Los potenciales de acción compuestos registrados en ramas cutáneas del nervio
sural de la rata, estuvieron constituidos consistentemente por uno a tres componentes
lentos, y en algunas ocasiones por un componente rápido. El componente rápido
presentó velocidades de conducción de 25 a 5 rnk; mientras que los componentes
lentos mostraron velocidades de conduccibn
que oscilaron entre 2 y 0.2 mk.
De
acuerdo con la clasifkaci6n de fibras nerviosas de origen cutáneo, el componente
rápido corresponde a fibras tipo AS; mientras que los componentes lentos
corresponden a diferentes subpoblaciones de fibras tipo “C” ( referencia).
En la fig. 2A se muestra un registro típico del PAC del nervio sural, inducido por
estimulación antidrómica supramáxima (pulsos cuadrados catódicos, 3 ms, 0.2 Hz). En
- 24 -
éste registro se observa un primer componente polif&ico (fibras A6) con una latencia
de 1.62 ms (velocidad de conducción = 24.7 m/s) y una duración de aproximadadente
13 ms (fig. 2B), cuya primer deflexión positiva se sobrepone al artefacto del pulso de
estimulación. Por ésta razbn, los efectos ejercidos por los fdrmacos probados sobre la
velocidad de conduccih de fibras A6 se analizaron midiendo los cambios en la latencia
al pico de la segunda deflexión (primera negativa). En la fig. 2C se muestra el registro
correspondiente a varias subpoblaciones de fibras C, con velocidades de conducción
menores de 2 mis. Los efectos de los fármacos probados sobre la magnitud de los
componentes correspondientes a fibras A6 y C, se analizaron tomando como par&netro
el área total (suma de áreas correspondientes a las deflexiones positivas y negativas)
de los componentes correspondientes a cada una de dichas ftbras.
- 25 -
100
Tiempo (ms)
l
/
1.62 ms
(24.7 mis)
C
9ms
0 ///
J b
0.5 mV
3 ms
/
/
--l
0.2 mV
50 ms
Fig. 2. A) Registro típico del PAC registrado en una rama cutánea del nervio sural. 8)
Componente rápido (24.7 mk), correspondiente a la descarga de fibras A6, cuya primer
deflexih positiva se sobrepone al artefacto de estimulación. C) Componente lento,
correspondiente a la descarga de diferentes poblaciones de fibras tipo C, con
velocidades de conducción de 2 a 0.2 mk. Las línea diagonales muestran el área bajo
la curva del primer componente negativo a partir de la línea basal. Ver texto
correspondiente a la sección de análisis de resultados.
- 26 -
CAPITULO I I I
RESULTADOS
-
27 -
1. EFECTO DE AGONISTAS
K-OPIACEOS
SOBRE LA EXCITABILIDAD Y
CONDUCCION DE FIBRAS Ai? Y C
La aplicación local (sobre el n. sural) durante 30 min, tanto de DIN (100 @M,
n=6) como de U-50488 (10 ~JM, n=9) ó de U-69593 (10 PM, n=4) indujo durante los
primeros 20 min un decremento paulatino en la velocidad de conducción de fibras A6
hasta de 10 mk; inicialmente sin cambio en la magnitud de la descarga de dichas
fibras, y posteriormente seguido por un bloqueo total entre los 35 y 45 min. Después
de 60 a 90 min de lavado del fármaco, la magnitud de la descarga de éstas fibras se
recuperó totalmente. A partir de los 5 min de aplicación de los 3 fármacos estudiados,
los potenciales correspondientes a la descarga de fibras C sufrieron un decremento
paulatino en la amplitud y número de componentes del PAC registrado hasta su total
inhibici& (dentro de los primeros 30 min); estableciéndose dicha acción en un orden
secuencial sobre poblaciones de fibras C de menor a mayor velocidades de conducción
(0.2 a 2 mk), y recuperándose en forma inversa.
La mhxima recuperación obtenida
(después de 3 h de lavado) para los PAC de fibras C fue del 78.2 f 4.7 % con respecto
a la magnitud de los registros control.
En la fig. 3 se muestran los efectos del agonista
K?-Sek?Ct¡VO
no peptídico U-
50488 (10 @) sobre la descarga de fibras de origen cutáneo del nervio sural. Cada
trazo corresponde al promedio digital de diez registros, los cuales fueron inducidos por
medio de estímulos de intensidad supramáxima (3 ms, 0.2 Hz). En el panel de la
derecha se observan los cambios ocurridos en el componente correspondiente al
potencial de fibras A6, donde el trazo señalado a los 0 mín corresponde al registro
control, el cual fue obtenido cuando en la camarita central se tenía únicamente solución
salina isotónica (0.9%) A los 5 min de iniciada la aplicacibn del fármaco se observa un
desplazamiento de este potencial compuesto hacia la derecha indicando un incremento
- 28 -
en la latencia. La velocidad de conducción de estas fibras sufrió un decremento
paulatino sin cambio en la magnitud de dicho potencial hasta los 20 min de la
aplicación del fármaco. A los 30 min la latencia al pico del componente negativo de
este potencial aumentó en 1.06 ms; así mismo, se observa un decremento de la
magnitud (tomando en consideración el área bajo la curva), correspondiendo a una
inhibición de aproximadamente el 72 % con respecto al control.
componente totalmente bloqueado a los 40 min.
Siendo este
Después de 60 min de iniciado el
lavado del fármaco, observamos una recuperación total en la magnitud del área bajo la
curva; sin embargo, persiste una disminución en la velocidad de conducción en este
componente el cual se continuó recuperando paulatinamente. Después de 2.5 h de
lavado, la latencia al pico del primer componente negativo corresponde a 5.75 ms,
comparativamente con una latencia de 5.7 ms para el registro control. En el panel
izquierdo de dicha figura se observa que a partir de los 5 min de la aplicación de este
fármaco los componentes lentos, correspondientes a la descarga de fibras tipo “C”, son
inhibidos paulatinamente hasta el bloqueo total de dichas fibras a los 30 min. Sin
embargo 10 min después de iniciado el lavado del fármaco observamos una
recuperación en forma inversa,
recuperándose inicialmente los componentes mas
lentos, para a los 180 mín tener una recuperación parcial cuya Cirea bajo la curva
corresponde al 76.2 % comparativamente con el control.
- 29 -
(As)
/\
U-50488 (10 pM)
(9
(min)
~~
nr-----
I
0
50 ms
v 3ms
Figura 3. Efecto del agonista Kl-opiáceo no peptídico U-50488, sobre el PAC de fibras
cutáneas del n. sural de rata in vivo. Cada trazo corresponde al promedio digital de 10
registros del PAC inducido por estimulación antidrómica, mediante pulsos cuadrados
catódicos de intensidad supramáxima (3 ms, 0.2 Hz). El tiempo señalado corresponde
al periodo transcurrido a partir de la aplicación del fármaco.
- 30 -
2. EFECTO DE LA FRECUENCIA DE ESTIMULAClON (DEPENDENCIA DE
USO) SOBRE LA ACCION
DE LA DIN EN FIBRAS A6 Y C
En otra serie experimental (n=4), se investigc5 el efecto de la frecuencia de
estimulación sobre la acción depresora ejercida por DIN (100 PM) en fibras de origen
cutáneo del n. sural.
En la fig. 4 se observa que 10 min después de iniciada la
aplicación de DIN se presenta una depresión de los componentes correspondientes a
la descarga de fibras C, obteniéndose a los 20 min una inhibición del 68% (área bajo la
curva) con respecto a la magnitud del registro control (trazo correspondiente a los 0
min). En estas condiciones, se incrementó la frecuencia de estimulación de 0.2 a 0.5
Hz, observándose en los minutos subsecuentes una recuperación paulatina en la
magnitud de la descarga de dichas fibras.
A los 6 min de haber incrementado la
frecuencia de estimulación (26 min después de iniciar la aplicación de DIN), la
magnitud de los componentes de fibras C se recuperó hasta 84% del control; sin
embargo, 2 min después se observan nuevamente los efectos depresores ejercidos por
DIN, presentándose el bloquéo total de todos los componentes registrados (fibras A6 y
C) a los 30 min de haber iniciado la aplicación del fármaco. En éste momento se
procedió a lavar el fármaco y a cambiar la frecuencia, reduciéndola de nuevo a 0.2 Hz.
Después de 60 min (trazo señalado 90 mín) se presentó una recuperacii>n parcial del
componente correspondiente a fibras AS y a los 90 min ya observamos una
recuperación franca de la descarga de fibras C. Finalmente, a los 150 min de lavado,
el componente rápido se ha recuperado totalmente, mientras que el área bajo la curva
correspondiente al componente lento de fibras “C”, se recupró en un 76% con respecto
al registro control.
-31-
DIN (100 @)
P
0 . 2 H z (min)
0
-
20
22
24
26
(lavado)
50 ms
Figura 4. Efecto de la frecuencia de estimulación sobre la acción depresora de DIN en
fibras AZ y C cutáneas del n.sural de la rata in vivo. Cada trazo corresponde al
promedio digital de 10 registros del PAC inducido por estimulación antidrómica,
mediante pulsos cuadrados catódicos de intensidad supramáxima (3 ms, 0.2 ó 0.5 Hz).
El tiempo sefialado corresponde al periodo transcurrido a partir de la aplicación del
fármaco.
- 32 -
3. NATURALEZA OPIACEA
K-OPIACEOS
DE LOS EFECTOS EJERCIDOS POR AGONISTAS
SOBRE FIBRAS A6 Y C
Con el objetivo de determinar la naturaleza farmacológica de las acciones
inhibitorias ejercidas por DIN, U-50488, y U-69593 sobre la excitabilidad del nervio
sural, se estudiaron los efectos del antagonista KI-opiáceo selectivo n-BNI en ausencia
y en presencia de los agonistas opiáceos.
La aplicación de n-BNI (50 PM) sobre el nervio sural de la rata, indujo por si
misma un incremento (24.3 + 1.7 %; n=lO) significativo (PC 0.001, t de Student
pareada) en la magnitud de todos los componentes del PAC registrado. Por otra parte,
al aplicar n-BNI (50 pnn) conjuntamente con DIN (1 OO pM, n=3), U-50488 (10 PM, n=3),
6 con U-69593 (IOpM, n=4), no solo se bloquearon los efectos inhibitorios del agonista,
sino que se presento un ligero incremento (no significativo; fi 0.05, t de Student
pareada) en la magnitud del PAC registrado.
En la fig. 5 se muestra un incremento del 28.2 % (con respecto al registro
control) en la magnitud (área bajo la curva) del PAC, después de 30 min de la
aplicación de n-BNI (50 $W). Dicho incremento se presento tanto en los componentes
de fibras C como en una población de fibras A6 (velocidad de conducción = 13.1 m/s)
prácticamente imperceptible en el trazo control. A continuación se procedió a aplicar
conjuntamente n-BNI (50 $W) y U-69593 (IOpM), observandose 30 min después un
PAC con una magnitud correspondiente al 105 % del registro control. Transcurridos 90
min de lavado de estos fármacos, el PAC se mantuvo semejante (102%) a la magnitud
del registro control.
- 33 -
control
-
n-BNI (50 PM)
n-BNI (50 j.M)
+
U-69593 (10 PM)
lavado
50 ms
Fig. 5. Efecto del antagonista
Kl-Op¡keo
selectivo n-BNI, en ausencia y presencia de
U-69593, sobre el PAC de fibras cutáneas del n. sural de rata in vivo. Cada trazo
corresponde al promedio digital de 10 registros del PAC inducido por estimulación
antidrómica, mediante pulsos cuadrados catódicos de intensidad supramáxima
0.2 Hz).
- 34 -
(3 ms,
CAPITULO I V
DISCUSIÓN
-
35 -
Los componentes rápido y lento de los potenciales de acción compuestos,
registrados en el nervio sural de la rata, corresponden a poblaciones de fibras de tipo
AS y “C”, ya que, el primero (componente rápido), presentó velocidades de conducción
entre 25.4 y 5 mk siendo congruentes con las reportadas para estos tipos de fibras
(A6). Mientras que, el segundo (componente lento), de acuerdo con las latencias sus
velocidades de conducción se encontraron en todo el rango de las correspondientes a
las fibras tipo “C” (0.2 a 2 mIs).
Los datos obtenidos en la presente investigación, muestran que los tres
fármacos estudiados (DIN, U-50488, y U-69593) ejercen acciones depresoras sobre los
diversos componentes de los PAC registrados en el nervio sural de la rata. El efecto
de estos compuestos se establece en forma paulatina, apareciendo el máximo efecto
aproximadamente a los 30 min (despues
de la aplicación de los fármacos), y
requiriendo un tiempo mayor de una hora para mostrar recuperación (después de lavar
el fármaco). Estos datos concuerdan con los reportados por Luna y Pacheco (1994)
sobre las acciones neuromoduladoras que la DIN ejerce sobre la excitabilidad y
conducción en el nervio ciático de la rana.
En dicha preparación, el análisis de la
relación entre la intensidad de estimulación y la amplitud del PAC (relación entradasalida), indican que éste péptido induce un decremento en la velocidad de
reclutamiento de fibras activadas al incrementar la intensidad de estímulo,
requiriéndose mayores intensidades de estimulación para activar al 50% de las fibras,
pero sin reducir (a concentraciones menores de 100 PM) el número total de fibras que
pueden ser activadas.
Dado que la intensidad del estímulo utilizado en nuestros experimentos fue
supramáximo, una disminución en la velocidad de conducción de las fibras A6 sin
cambio en la magnitud (área bajo la curva), observadas como efecto inicial de los
- 36 -
agonistas
K-OpihceOs
estudiados es indicativo de una acción de los fármacos sobre las
propiedades pasivas de la membrana nodal de dichas fibras mielinizadas. Una
explicación tentativa a éste fenómeno es aportada por datos de Aguirre y col. (1993) en
donde, mediante el registro intracelular de neuronas CA3 del hipocampo del cobayo in
vitre, se ha encontrado que los fármacos
K-Opih!Os
inducen un incremento
significativo en la constante de tiempo (de 22 a 35 ms); por lo cual se requiere un
tiempo mayor para que un pulso despolarizante alcance el potencial umbral.
Por otra parte, la secuencia temporal de los efectos depresores inducidos por
los fármacos
K-opi&eOS
estudiados se presentó en forma diferencial en las
poblaciones de fibras nerviosas que conforman al nervio sural, siendo afectadas en
primer termino las fibras de tipo “C” y posteriormente las tipo AG; observándose que la
recuperación en todos los casos se efectuó en forma inversa a la mencionada. Asi
mismo, los fármacos
K-Opiados
no peptídicos, presentaron una potencia relativa 10
veces mayor que la DIN para bloquear completamente los PAC. El diferente curso
temporal para el bloqueo podría deberse a una mayor sensibilidad de las fibras C, lo
cual indicaría una mayor densidad de receptores
K-Op¡keOs
en la membrana de dichas
fibras nerviosas. Esta propuesta implicaría que la concentración a la cual se induce el
bloqueo total de fibras C debería bloquear solo parcialmente a las fibras rápidas.
Sin
embargo, nuestros resultados descartan dicha explicación, dado que a pesar de las
diferencias temporales, tanto las fibras C como las fibras A6 fueron totalmente
bloqueadas a las mismas concentraciones de DIN y de los agonistas
K-opiheos
no
peptídicos (1 OO y 10 uM, respectivamente). De tal suerte que, tanto la diferencia en el
curso temporal de la inhibición de los diferentes grupos de fibras nerviosas, como la
diferencia en la potencia relativa entre la DIN y los compuestos no peptídicos, es
explicada con base en: a) La barrera dífusional dada por la mielinización de las fibras
A& y b) Factores difusionales debidos a las diferencias estructurales y pesos
- 37 -
moleculares de éstos fármacos. Mientras que la DIN tiene un P.M. de 2148 y está
constituida por 17 aminoácidos, U-50488 y U69593 tienen pesos moleculares. de 465.4
y 356.5 (respectivamente), y estructuralmente son bencenacetamidas.
Dichas
características confieren a éstos últimos compuestos una mayor liposolubilidad
(comparativamente con DIN) que les permite difundir a traves del peri y endo-neuro
hasta las membranas de las fibras nerviosas.
electrofisiológicos
Lo anterior es apoyado por datos
obtenidos en laminillas del hipocampo del cobayo, en donde el
bloqueo de los potenciales de acción, dependientes de sodio, se presenta a dosis
equimolares (100 n/W) de DIN y de los agonistas K-opiáceos no peptídicos (Aguirre y
col, 1993).
Es de destacar que el bloqueo total del PAC, ejercido por los agonistas Kopiáceos estudiados, fue parcialmente revertido al incrementar la frecuencia de
estimulación (de 0.2 a 0.5 Hz); lo cual indica una dependencia del uso contrario al
reportado para fármacos anestésicos locales (tales como la lidocaina) ya que en estos
un incremento en la frecuencia de estimulacibn facilita el bloqueo de canales de sodio
voltaje dependientes al tener el anestésico local acceso desde el interior celular a los
canales de sodio voltaje dependientes en estado activo (Stricharts, 1973; Courtney,
1975; Hille, 1977; Courtney y col., 1978; Ritchie, 1979).
Por otra parte, nuestros resultados apoyan al planteamiento formulado en la
justificación del presente trabajo, en cuanto a que, en la rata, los efectos depresores
inducidos por la administración i.t. de DIN sobre la actividad refleja espinal (Caudle e
Isaac, 1988), fuese el resultado de una acción directa de este péptido sobre la
excitabilidad y conducción en las fibras nerviosas de las raíces espinales. Así mismo,
nuestros datos revelan los mecanismos electrofisiologicos responsables de las
acciones analgésicas periféricas inducidas por la administración i.v. de U-50488 en un
- 38 -
modelo de inflamacion-hiperalgesia
la administración i.t. del agonista
unilateral en la rata (Hiden y col., 1991) en el que
K-Op¡b?O
carecib de actividad analgésica.
En el nervio sural de la rata, los efectos inhibitorios inducidos tanto por la DIN
como por U-50488 y U-69593 fueron bloqueados por n-BNI, indicando que tales
efectos son de naturaleza
presencia de receptores
K1-op¡kea.
Kl-op¡h?OS
Mientras que éstos resultados indican la
funcionales en nervios periféricos, el incremento
en la amplitud del PAC inducido por n-BNI per se, indica que dichos receptores se
encuentran sujetos a una modulación basal t&nica por un K-agonista endógeno, el cual
podría ser la DIN.
Estudios histoquimicos han mostrado la presencia de
inmunorreactivìdad a DIN dentro de los paquetes neurovasculares, lo cual apoya la
hipotesis planteada (Moskowitz y col., 1987). Lo anterior senala la posibilidad de que,
la disfunción de un sistema constituido por un ligando endógeno (posiblemente la DIN),
y los receptores
K-op¡íkeos
presentes en nervios periféricos, podría resultar en un
incremento en la excitabilidad de las fibras aferentes y consecuentemente en procesos
neuropatok5gicos.
Finalmente, dado que la aplicación de los fármacos estudiados se llevo a cabo
en una región dista1 al sitio en el que se colocó el electrodo de estimulación,
realizándose el registro del PAC antidrómicamente; los pulsos de estimulación
indujeron reflejos espinales que resultaron en contracciones de músculos ípsilaterales.
Dichos reflejos no fueron bloqueados por la aplicación de los agonistas
K-op¡áceos,
senalando que las acciones ejercidas sobre el PAC del nervio sural se llevaron a cabo
localmente.
- 39 -
CAPITULO V
CONCLUSIONES
-4o-
a) En el nervio sural de la rata in vivo, la administración local de DIN y de los agonistas
~-opiáceos no peptídicos estudiados, modulan la excitabilidad de fibras sensoriales A6
YC*
b) Dicha modulación se ejerce disminuyendo las velocidades de conduccí6n
y
deprimiendo la amplitud de los PAC en forma paulatina, hasta su bloqueo total;
recuperándose totalmente las fibras AS (después de 1 h de lavado); y parcialmente las
fibras C (después de 3 h de lavado).
c) En contraste con la acción de anestésicos locales tales como la lidocaína, el
incremento en la frecuencia de estimulación (de 0.2 a 0.5 Hz) revierte transitoriamente
la acción depresora de DIN.
d) Los efectos depresores ejercidos por dichos ftirmacos, así como su bloqueo por
acción de la n-BNI, demuestra la presencia de receptores
Kl-opideos
funcionales en
fibras nerviosas sensoriales periféricas.
e) El bloqueo farmacológico de receptores Kl-opiáceos, mediante n-BNI, incrementa
la amplitud del PAC inducido por estímulos de intensidad supramáxima; demostrando
que las fibras sensoriales de nervios periféricos se encuentran sujetas a una
modulación basal tónica de naturaleza
Kl-op¡áma,
por acción de un ligando
endógeno.
9 En conjunto, los datos anteriores aportan evidencia experimental en apoyo al
planteamiento de la existencia de mecanismos fisiológicos que modulan la transmisión
de información sensorial nociceptiva a nivel períférico, además de la modulación
central de información nociceptiva (a nivel espinal y del tallo cerebral):
-4l-
Finalmente nuestros resultados sefialan la posibilidad de que, la disfunción de
un sistema constituido por un ligando endógeno (posiblemente DIN), y los receptores
Kl-opiáceos presentes en nervios periféricos, podría resultar en un incremento en la
excitabilidad de las fibras aferentes,
neuropatológicos.
-
42 -
y consecuentemente en procesos
REFERENCIAS
BIBLIOGRAFICAS
-
43 -
- Aguirre,f.J.; Moy, N.A.; Luna, M.R. y Pacheco, M.F. (1993). “Differential nature of
dinorphin actions on calcium- and sodium-dependent actions potentials in CA3
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