I. INTRODUCCÌÒN Una amplia gama de interacciones

I. INTRODUCCÌÒN
Una amplia gama de interacciones ocurren entre las plantas y los
microorganismos, de estos, algunos pueden ser perjudiciales, resultando en
pérdidas millonarias por daños a los cultivos agrícolas (Birch y col. 2000), debido
a que las plantas proveen un atractivo reservorio de nutrientes y son un nicho
ecológico para las bacterias patógenas. En muchas plantas superiores, la
colonización de las bacterias acarrea una variedad severa de enfermedades, las
bacterias
Gram-negativas
fitopatógenas
han
desarrollado
sofisticadas
estrategias para colonizar a las plantas que son hospederas. Ellas entran a las
plantas a través aberturas naturales como son los estomas, o por heridas y se
multiplican en los espacios intercelulares a expensas del hospedero (Büttner y
Bonas, 2002).
Las interacciones entre las bacterias fitopatógenas y las plantas son complejas,
requieren que el patógeno se adapte al ambiente in planta, para modular la
fisiología del hospedero. Para el éxito de infectar y causar enfermedad, las
bacterias patógenas de plantas deben ser capaces de crecer epifitamente en la
superficie de las hojas, brotes, vainas, etc., se desconoce la identidad de los
factores de los patógenos involucrados en estos procesos, y no se entiende
como estos funcionan para promover el parasitismo y la enfermedad (Boch y col.
2002).
1.1. Género Pseudomonas.
El género Pseudomonas, es el grupo de bacterias más diverso del planeta. Se
han encontrado miembros de este género en la mayoría de los ambientes
naturales
como son suelo, agua dulce y salada, y por lo tanto, establecen
asociaciones intímas con las plantas y los animales, esta distribución universal,
sugiere un grado notable de adaptabilidad genética y fisiológica (Spiers y col.
2000). Debido a esto, las bacterias fitopatógenas del género Pseudomonas
presentan diferencias dentro de una misma especie y son conocidas como
variedades patógenas o patovares (pv.) dependiendo de la gama de plantas que
infectan (Agrios, 1998). Tal es el caso de las cepas de Pseudomonas syringae,
que se han notado por su gran diversidad en la interacción específica con las
plantas hospederas y así pueden ser asignadas a una de las 50 patovares
basadas en su especificidad. Por ejemplo, Pseudomonas syringae pv. tomato
(infecta al jitomate), Pseudomonas syringae pv. glicinea (infecta a la soya),
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (infecta al fríjol), y Pseudomonas
syringae pv. maculicola (infecta a crucíferas) por mencionar algunos ejemplos
(Bender y col. 1999).Las bacterias del género Pseudomonas son bacilos cortos
rectos o curvos, Gram-negativos, con dimensiones de 0.5 a 1.0 x 1.5 a 4.0 μm
(Figura 1). Se desplazan por medio de uno o muchos flagelos polares. La
mayoría de las especies patógenas de este género infectan plantas y sólo
algunas de ellas a los animales y al hombre. (Silver y col. 1990).
Figura 1. Imagen de microscopía electrónica de una bacteria del género
Pseudomonas syringae (Nach., B., 1975).
2
1.2. Pseudomonas syringae pv. maculicola.
Infecta principalmente cruciferas como cultivos de col, coliflor y brócoli, entre
otros. Esta bacteria es utilizada como patógeno modelo en el estudio de genes
de resistencia de Arabidopsis thaliana (Cordeiro y col. 1998; Gabriel, 1999).
Relación taxonómica: Bacteria; Proteobacteria; subdivisión gamma; grupo
Pseudomonaceae/Moraxellaceae;
familia
Pseudomonaceae
;
género
Pseudomonas ; especie Pseudomonas syringae; patovariedad maculicola.
Propiedades microbiológicas: Gram-negativa, aeróbica, motil, bacilo, lofotrica,
psicrotrófica. En cultivos jóvenes tienen una longitud de 0.6 a 3.4 μm y de 0.5 a
1.0 μm de diámetro, sin embargo, en cultivos viejos o en altas temperaturas los
bastones son más largos e incluso pueden tener forma filamentosa que forma
colonias blancas o amarillas, oxidasa negativo, arginina dihidrolasa negativa,
contenido de GC en el DNA de 58-60%, provoca respuesta de hipersensibilidad
en tabaco. Su temperatura óptima de crecimiento oscila entre 25 y 28 °C.
Variedad de hospederos: En un principio estudiada como el agente causal de
la mancha del jitomate y como modelo patogénico de A. thaliana, aunque a sido
aislada de una extensa variedad de crucíferas como son col, coliflor y algunas
hortalizas como brócoli y rábano (Figura 2).
3
A
B
C
D
Figura 2. Hojas, tallos y floretes de brócoli infectados con Pseudomonas
syringae pv. maculicola. A: florete de brócoli presentando síntomas de clorosis,
B: florete de brócoli presentando síntomas de necrosis, C: tallo de brócoli con
necrosis, D: hoja de brócoli presentando respuesta de hipersensibilidad
(Fotografías facilitadas por el Dr. Gustavo Hernández G.).
Síntomas de enfermedad: Manchas superficiales obscuras en frutas verdes,
lesiones húmedas dispersas, en ocasiones rodeadas por un margen clorótico en
A. thaliana.
Epidemiología: Sobrevive como saprófita en restos de plantas, suelo y
superficies foliares. Algunas bacterias tienen nutrición quimioorganotrófica, sin
embargo, se conocen especies que han vivido autotróficamente, cuentan con
poli-hidroxibutarato (PBH) como material de reserva el cual estimula el
crecimiento de células en un medio deficiente de nitrógeno, es esparcida por
lluvia. El desarrollo de síntomas es favorecido por la humedad en las hojas y las
temperaturas entre 13 y 25 °C.
4
Aproximadamente 80 especies de bacterias fitopatógenas están clasificadas en
numerosas patovariedades, con base en las especies vegetales que infecta, de
ahí que los síntomas varíen según la especie de la planta hospedera. Los
síntomas que presentan las plantas generalmente se deben a la liberación de
una o varias de las siguientes substancias (Madigan, 1998; Alberts, 1994):
•
Toxinas que afectan a la planta.
•
Enzimas líticas.
•
Factores de crecimiento vegetal.
•
Substancias que destruyen o modifican el tejido vegetal.
Las cepas de Pseudomonas syringae pv. maculicola, además de tener todas las
características morfológicas antes descritas, tiene la capacidad de crecer en un
medio nutritivo con bajo contenido de hierro, lo cual hace que se lleve a cabo la
producción de pigmentos fluorescentes (pioverdina) de un color que oscila entre
verde y amarillo, y con capacidad de difundirse al medio (Madigan, 1998;
Alberts, 1994).
1.3. Sistema de secreción tipo III.
Muchos patógenos bacterianos Gram-negativos de mamíferos y plantas, usan
un Sistema de Secreción de Proteínas de Tipo III (SSTT), también llamado
sistema Hrp en patogenos de plantas, para transferir proteínas y factores de
virulencia directamente a una célula hospedera (Jin y col. 2001) o al medio. El
SSTT, fue descubierto primeramente en Yersinia spp. un patógeno de humanos.
Este sistema está conservado en muchos patógenos Gram-negativos de plantas
(Ralstonia sp., Xanthomonas sp., Pseudomonas sp.) y animales (Escherichia
coli, Salmonela y Pseudomonas aeruginosa ; He y col. 2002).
5
El SSTT puede translocar proteínas efectoras directamente dentro de la célula
eucariótica huésped y al ambiente extracelular (Figura 3), una vez que la
interacción se a dado con el huésped (Jin y col. 2001; van Dijk y col., 2002). En
el ensamblaje de este sistema, participan diferentes proteínas, las cuales se
organizan en una estructura similar al pilum conjugativo o al flagelo con
proteínas que están localizadas en la membrana citoplasmática, en el
periplasma, en la membrana externa bacteriana y en lo que se cree qué sea el
pilum como se muestra en la Figura 3 (Alfano y col. 1997; Wolfgang y col. 2000).
En las bacterias fitopatógenas, los genes relacionados con el pili de secreción
están conservados como en Psm M2, el SSTT está compuesto por la proteína
HrpA (Figura 3), que es la proteína principal del pili de secreción y es codificada
por el gen hrpA (Jin y col. 2001). Otro gen llamado hrpC, que codifica para una
proteína de membrana esencial para el SSTT y que tiene un papel principal para
la translocación de proteínas a través de la membrana externa de la bacteria es
llamada HrpC (Preston y col. 1998). Estas dos proteínas mencionadas son de
las más importantes, pero el SSTT exhibe una arquitectura más compleja ya que
esta compuesto de alrededor de 20 proteínas involucradas en la formación de la
estructura filamentosa de este aparato (Hueck y col. 1998).
6
Figura 3. SSTT de PsmM2, la regulación general de los genes hrp y avr está
mediada por las condiciones del apoplasto vegetal, baja osmolaridad,
asimilación de nutrientes, señales metabólicas y de contacto con la célula
huésped (Modificado de: Willis y col. 1991; Alfano y col. 1996; Preston y col.
1998; Hueck y col. 1998; Collmer, 1998; Galan y Collmer, 1999; Wolfgang y col.
2000; Jin y col. 2001; Katagiri y col. 2002; Büttner y Bonas, 2002; He y col. 2002;
Buell y col. 2003).
7
1.4. Proteínas secretadas por el SSTT.
El SSTT secreta dos clases de proteínas efectoras principales hacia el exterior
de la célula bacteriana y probablemente hacia el interior de la célula vegetal
(Figura 3). Estas proteínas efectoras son las harpinas y proteínas Avr.
Las harpinas son proteínas pequeñas, estables al calor y ricas en glicina,
carentes de cisteina y son codificadas por los genes hrpZ y hrpW, secretadas en
un medio de cultivo como proteínas HrpZ y HrpW cuando se expresa el sistema
Hrp. Además, las harpinas poseen capacidad de producir HR o necrosis en
hojas de tabaco y en otras plantas, y son secretadas al medio extracelular
(apoplasto) in planta (Figura 3).
Interesantemente, se encontró que las harpinas de Pseudomonas syringae se
unen a la membrana plasmática de la célula vegetal, formando un poro que
causa la liberación de iones y otros nutrientes, que alcalinizan el medio y que
ayudan a promover el parasitismo de la bacteria (Alfano y col. 1996; Collmer,
1998; Collmer y col. 2000; Büttner y Bonas, 2002;).
Las proteínas Avr son los segundos efectores más estudiados y son productos
de los genes avr. Estas proteínas disparan una reacción de defensa en las
plantas no hospederas debido al producto de un gen de resistencia R específico
que presenta la planta y que interactúa específicamente con la proteína Avr
translocada por el SSTT al interior de la célula y que culmina en una HR (Figura
3; Büttner y Bonas, 2002; Galan y Collmer, 1999; Katagiri y col. 2002). Las
proteínas Avr colectivamente promueven el parasitismo (Alfano y col. 1996)
probablemente como factores de virulencia manipulando los procesos celulares
y fisiológicos del hospedero por el patógeno invasor, ayudando a la adaptación
bacteriana dentro del tejido infectado y la formación de síntomas en plantas
susceptibles (Büttner y Bonas, 2002; Alfano y col. 1996).
8
1.5. Regulación de la expresión de los genes avr y hrp.
Las bacterias usan estrategias variadas y específicas para regular la expresión
de sus maquinarias del SSTT (Galan y Collmer, 1999). La producción de
determinantes de virulencia es controlada por una compleja cadena regulatoria
que responde a múltiples señales ambientales así como carencia de nutrientes
(Figura 3; Genin y Boucher, 2002).
Las condiciones de expresión de los factores de patogenicidad es similar en
todas las bacterias fitopatogenas estudiadas, son parecidas a las que
prevalecen en el apoplasto vegetal (baja concentración de osmolitos,
temperatura, cationes divalentes en particular Ca+2, pH ligeramente ácido y bajo
contenido de nutrientes) y son reprimidos en medios ricos (Grimm y col., 1995;
Jianzhong y col., 1995; Missiakas y col., 1998; Preston, 2002;). Estas
condiciones pueden ser emuladas en un medio mínimo como el M9. Las
concentraciones mayores de 50 mM de algunos osmolitos como NaCl, KCl,
MgCl2, MgSO4, sorbitol y sacarosa, inhiben fuertemente la expresión de estos
genes y en el caso de algunos metabolitos como la sacarosa, fructosa y el citrato
a una concentración de 5 mM incrementan la expresión de los genes hrp y el pH
optimo de expresión es de 5.5. La temperatura también influye en la expresión
de algunos genes, y se ha determinado que diversos fitopatógenos producen
toxinas entre 10 y 20 °C (Budde y col., 1998; Budde y col., 2000), en lugar de 28
°C que es la temperatura óptima de crecimiento en el laboratorio. Como es el
caso del patovar glycinea que produce coronatina a 18 °C (Budde y col., 2000);
esto nos sugiere la presencia de secuencias reguladoras que responden a
factores físicos y que probablemente estén relacionados con aquellos genes que
responden a temperatura (Fang y col., 1998).
9
Tambien el contacto con la célula huésped puede ser una señal fisiológica que
estimule la red de regulación, como lo demostraron Aldon y col. (2000) con
Ralstonia solanacearum, que posee un receptor de señal por contacto con la
célula huésped llamado Par, que estimula la secreción y translocación de
proteínas efectoras a través del sistema de tipo III (Galan y Collmer, 1999).
1.6. Proteínas como factores de virulencia y patogenicidad.
Se definen como factores de virulencia aquellos productos de los genes que son
indispensables para la colonización y sobrevivencia de un patógeno en un
hospedero causándole daño (Wren, 2000; Jungblut y col. 2000; Boch y col,
2002). Pseudomonas syringae, produce una gran variedad de productos
extracelulares que contribuyen para la colonización de plantas hospederas y
para
causar
síntomas
de
enfermedad
(Genin
y
Boucher,
2002),
en
Pseudomonas existe una larga lista de estos factores ya identificados como son:
exopolisacáridos (EPS), lipopolisacáridos (LPS), enzimas pécticas, celulasas,
sideróforos. Existen otros factores de virulencia que todavía no están bien
documentados pero se sabe que tienen alguna función de virulencia como son:
proteínas de membrana y proteínas requeridas para movilidad como las
proteínas del flagelo (Jungblut y col. 2000).
Cabe mencionar que todos los factores de virulencia que se han documentado
son productos de genes relacionados con la patogenicidad y que pueden ser
expresados bajo ciertas condiciones idóneas de la bacteria. Por ejemplo, si la
bacteria crece en condiciones de no expresión, los productos génicos no serán
sintetizados y por ende, no habría factores de virulencia, por otro lado, si la
bacteria crece en condiciones de expresión, estos serán expresados
(Comunicación personal de Cesar Álvarez M.; Guttman y col. 2002).
10
1.7. Electroforesis bidimensional.
La electroforesis bidimenional es una técnica de alta resolución, cuyo objetivo
es la separación de mezclas complejas de proteínas. Los geles en 2D, pueden
separar mezclas de 1000 hasta 10,000 especies de proteínas en dos corridas
electroforéticas (Wilkins y col. 1996; Rabillout, 2000; Washburn y col. 2000;
Encarnación, 2002; Vázquez, 2003). Estos geles involucran la combinación
ortogonal de dos diferentes métodos electroforéticos, la base de su elevado
poder de resolución está precisamente en la bidimensionalidad, es decir, en que
las proteínas son separadas secuencialmente por dos criterios físicos. En primer
lugar las proteínas son separadas en un gel con gradiente de pH en condiciones
desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoeléctrico (Figura 4A).
Cuando una mezcla de proteínas es introducida en un gel con un gradiente de
pH, tanto los extremos amino y carboxilo terminal como los grupos funcionales
de las cadenas laterales ionizables de las proteínas que captan o liberan
protones de acuerdo con el pH, de modo que la carga eléctrica global de las
proteínas dependerá del pH del entorno. El punto isoeléctrico (pI) de una
proteína, es el valor específico de pH en que la carga neta de la proteína es
cero, y por eso ya no se desplaza al aplicar un campo eléctrico.
En la primera dimension (1ªD) de enfoque isoelectrico (IEF) cuando se aplica un
campo eléctrico, todas las moléculas con carga neta positiva serán atraídas
hacia el cátodo (-), y todas las moléculas con carga neta negativa hacia el ánodo
(+). A medida que las moléculas de proteína se van acercando a su pI, irán
perdiendo carga eléctrica o ganando cargas de signo contrario, hasta llegar al
valor de pH en que la carga neta sea cero y las proteínas dejen de moverse, se
dice que las proteínas se han focalizado, ya que todas las moléculas de una
especie dada de proteína, inicialmente dispersas a lo largo de todo el gradiente
11
de pH, se han concentrado en un solo punto del gradiente que corresponde a su
pI.
Figura 4. Electroforesis bidimensional. A: electroforesis por separación de
enfoque isoeléctrico; B: electroforesis por separación en base al tamaño de las
proteínas. Juntos estos dos métodos componen a la electroforesis en 2-D
(Encarnación, 2002).
En la segunda dimension (2ªD) se utilizan geles planos que contienen un
detergente aniónico dodecil sulfato de sodio (SDS) que desnaturaliza las
proteinas rompiendo los puentes de hidrogeno, bloquea las interacciones
hidrofóbicas y parcialmente desdobla las proteínas minimizando las diferencias
en la forma molecular, eliminando las estructuras terciaria y secundaria y un
agente reductor que permitira separar los puentes disulfuros entre cadenas
polipeptídicas (las cistinas intercadena). Sobre este gel se coloca el gel de la 1ªD
y se aplica una corriente electrica, ahora las proteínas se separan de acuerdo a
su tamaño. Por último para detectar las proteínas en el gel es indispensable
útilizar una técnica de tinción específica para proteínas, con colorantes como
azul de Comassie o tinción con plata, las proteínas aparecen formando manchas
12
circulares (Rabillout, 2000; Washburn y col. 2000; Encarnación, 2002; Vázquez,
2003).
1.8. Proteómica en microorganismos.
La meta básica del estudio de la proteómica, es identificar proteínas que están
involucradas en un proceso en particular, en un organismo o en alguna
interacción con otro y es deseable tener su genoma ya secuenciado.
Generalmente
un
organismo
se
cultiva
bajo
diferentes
condiciones
experimentales (Figura 5), para poder estudiar la expresión diferencial de
proteínas y que posteriormente son resueltas en electroforesis 2D (Washburn y
col. 2000).
Condición A
Solubilización de
proteinas
Reducción
Alquilación
Enfoque isoeléctrico en geles o tiras
preenfocadas (primera dimension)
Condición B
SDS-PAGE
(segunda dimension)
Tinción
1. Plata
2. Comassie
3. Fluorescencia
4. Autorradiografia
Identificación de
manchas por
espectrometría de
masas
Corte de spots de interés
Condición A
Condición B
Análisis de imagen
Figura 5. Secuencia esquemática de una investigación típica en proteómica.
(Pandey y Mann., 2000).
Usando esta metodología de proteómica, se han identificado grupos funcionales
de proteínas en Bradyrhizobium japonicum, cultivado bajo condiciones
13
anaerobias y aeróbicas (Dainese y col. 1999) y sujetas a condiciones
ambientales como el estrés por calor (Münchbach y col. 1999). También se
determinaron los cambios en los patrones o modelos de expresión de proteínas
en Sinorrhizobium meliloti expresados durante la fase de crecimiento
exponencial temprana y tardía (Vasseur y col. 1999).
Estos son ejemplos de estudios donde se ha contribuido exitosamente en el
conocimiento de nuevos descubrimientos en la biología de microorganismos. Sin
embargo, en Pseudomonas syringae pv. maculicola M2 el empleo de estas
herramientas abrirá nuevos horizontes en los estudios diferenciales de proteínas
expresadas en distintas condiciones de crecimiento.
14
II. JUSTIFICACIÓN
Existe mucho interés en estudiar las bacterias fitopatogenas a nivel genético,
molecular, bioquímico y biofísico para comprender cuáles son los mecanismos
de patogenicidad y virulencia. Hasta el momento en nuestro laboratorio se
cuenta con investigaciones referentes en Pseudomonas syringae pv. maculicola
M2, como son una colección de mutantes que están relacionadas con la
patogenicidad, la secuencia de los genes mutados y el mapa físico de restricción
del cromosoma de la bacteria, en donde se localizan físicamente estos genes de
patogenicidad que contienen la información. Pero todavía no se sabe como las
proteinas como productos génicos
proveen la manera de ejecutar esta
información. Todavia no se conocen perfiles proteínicos de esta bacteria en
condiciones de expresión y no expresión, y esto será muy útil para detectar qué
proteínas están relacionadas con la patogenicidad, es por eso, que realizar el
“Estudio de la Expresión Proteínica de Pseudomonas syringae pv. maculicola
M2 Bajo Diferentes Condiciones de Crecimiento”, nos ayudará a encontrar
cuales proteínas son diferentes y cuándo son expresadas bajo ciertas
condiciones de crecimiento al comparar los perfiles proteínicos de cada
condición de crecimiento.
Hasta el momento con en esta bacteria todavía no existen investigaciones donde
se haya utilizado la electroforesis bidimensional (2D) así como realizar
búsquedas informáticas de proteínas con otras bacterias patógenas para saber
qué proteínas están relacionadas con la patogenicidad.
15
III. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Este trabajo preliminar es parte de una investigacion tendiente a descifrar la red
de regulacion de la patogenicidad de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2
(Psm M2), que infecta crucíferas de gran interés agrícola como col, coliflor,
brócoli, produciéndoles clorosis y necrosis, también infecta a Arabidopsis
thaliana que es utilizada como planta modelo. Psm M2 utiliza un SSTT que es un
factor indispensable de patogenicidad y que es codificado por la isla de
patogenicidad Hrp. Los genes que codifican para este sistema y otros
relacionados con la virulencia y patogenicidad no son expresados cuando la
bacteria crece en medio rico (KB), pero sí son expresados cuando la bacteria
crece en medio mínimo (M9), parece haber una sobreexpresión cuando la
bacteria reconoce metabolitos y componentes de la planta, como en un jugo de
hojas. Entonces usando herramientas poderosas como la electroforesis
bidimensional, en muestras provenientes de diferentes condiciones de
crecimiento y comparando los perfiles proteínicos, se identificarán cuáles
proteínas están relacionadas con la patogenicidad. Por lo tanto, se eligió esta
técnica para la separación de extractos proteínicos totales de bacterias
cultivadas en cuatro condiciones de expresion: KB, KB más jugo de hojas de
Arabidopsis, M9 y M9 más jugo. Para el análisis comparativo de estos perfiles se
usará el programa llamado PDQuest®, que permite identificar todas las
diferencias entre dos o más perfiles proteínicos y llegar hasta la identificación
por homología de las proteínas expresadas diferencialmente.
16
IV. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general.
Determinar el patrón de expresión proteínica de Pseudomonas syringae pv.
maculicola M2, en medio rico y medio mínimo en presencia y ausencia de jugo
de hojas de Arabidopsis thaliana.
4.2. Objetivos particulares.
•
Determinar las cinéticas de crecimiento de Pseudomonas syringae pv.
maculicola M2 en medio rico (KB); medio rico mas jugo de hoja de
Arabidopsis thaliana (KB +j ); medio mínimo (M9) y medio mínimo mas
jugo de hoja de Arabidopsis thaliana (M9 + j).
•
Determinar el contenido total proteínico de Pseudomonas syringae pv.
maculicola M2 de cada una de las condiciones de crecimiento.
•
Comparar los perfiles proteicos de Pseudomonas syringae pv. maculicola
M2 obtenidos mediante electroforesis en 2D.
17
V. HIPÓTESIS
La comparación de expresion de proteínas de Pseudomonas syringae pv.
maculicola M2, cultivada en medio rico y medio mínimo más en presencia o
ausencia de metabolitos y otros componentes de Arabidopsis thaliana presentes
en el jugo de la planta, mostrarán patrones diferenciales de expresión de
proteínas entre cada condición de crecimiento. Estos patrones diferenciales
indicarán la magnitud del cambio fisiológico de la bacteria, cuando se inducen
los genes relacionados con la patogenicidad.
18
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. Materiales, medios de cultivo, reguladores, soluciones y métodos.
6.1.1. Materiales.
Se utilizaron micropipetas pipet-lite de la marca RAININ de 2 a 1000 μl.
La marca de los reactivos usados fueron: Gibco, KEM, BIORAD y Sigma-Aldrich.
Se utilizó KLETT-SUMMERSON Photoelectric Colorimeter MOD. 800-3 y los
matraces nefelométricos de BELLCOR 300 ml y paraverificar el crecimiento de las
bacterias y para mediciones de pH se utilizó el potenciómetro BECKMAN Φ340
pH/Temp Meter.
Para centrifugar se utilizó Centrifuge 5415 C
TM
SORVALL
de eppendorf
y la ultracentrífuga
T21 de DUPONT.
Para comprobar la concentración de proteínas; se utilizó el espectrofotómetro DU-6
SPECTOPHOTOMETER de la marca BECKMAN.
Se utilizarón anfolinas con gradiente de pH de 3.5-8, 4-7 y 3-10 de las marcas
Sigma-Aldrich y Amersham Bioscences, Uppsala, Sweden.
Se utilizaron tiras para enfoque isoeléctrico (IEF) de 7 y 18 cm con gradiente de 3-10
y 3-5.6 de la marca Immobiline DryStrip de Amersham Bioscences, Uppsala,
Sweden.
Para las corridas de enfoque isoeléctrico, se utilizó el sistema IPGphorTM Isolectric
Focusing System de Pharmacia Biotech. (Amersham Bioscences, Uppsala, Sweden).
Para todas las corridas de electroforésis en geles de poliacrilamida se utilizó el
equipo PROTEAN® II xi Cell de BIORAD.
La fuente de poder utilizada fue de Pharmacia Biotech. PS500 XT-115 V.
El análisis de los geles se llevó a cabo con PDQuestTM 2-D analysis software de
BIORAD.
La cepa utilizada para este trabajo fue Pseudomonas syringae pv. maculicola M2.
Las cuales se conservaron a -70ºC en un congelador REVCO.
6.1.2. Medios de cultivo.
Para la elaboración de este trabajo, se utilizaron los siguientes medios de cultivo:
Medio KB (King’s B)
Proteosa peptona # 3 (Difco)
20 g
K 2HPO4.3H2O
1.5 g
MgSO4.7H2O
1.5 g
Glicerol
15 ml
*Agar bacteriológico
15 g
Agua destilada
1000 ml
* Solamente cuando es medio sólido.
Se esteriliza a 15 lb/pulg2 por 15 min.
Medio M9 (medio mínimo)
Na2HPO4
6.0 g
20
KH2PO4
3.0 g
NaCl
0.5 g
NH4Cl
1.0 g
*Agar bacteriológico
Agua destilada c.b.p.
15.0 g
1,000.0 ml
* Sólo para preparar medio sólido.
Ajustar el pH a 7.0 y esterilizar en autoclave a 121°C/15 min.
Antes de usar agregar en condiciones de esterilidad, para 1,000 ml:
MgSO4 1 M
2.0 ml
Glucosa 20 %
10.0 ml
CaCl2 1 M
0.1 ml
6.1.3. Reguladores.
Regulador de corrida 10X para geles de poliacrilamida
SDS
10 g
Trisma-base
30.275 g
Glicina
144.1344 g
Agua desionizada (c.b.p)
1000 ml
No ajustar el pH; la mezcla de los reactivos debe dar un pH de 8.3. cuando se
corre una electroforesis el regulador debe estar a 1X.
Regulador de muestra de Laemmli 4X para marcadores de tamaño
Trisma-base
Glicerol
SDS
Azul de bromofenol
Agua desionizada (c.b.p)
1M
0.605 g
40 ml
4g
5 mg
100 ml
21
En una probeta medir el agua desionizada y el glicerol, adicionar el Trisma-base y
disolver; adicionar el SDS disolver y adicionar el azul de bromofenol. Revisar que el
pH sea 6.8, si es necesario ajustar con HCl y aforar, por último guardar a – 20 °C.
Regulador de equilibrio para tiras de IEF antes de la segunda dimension
Tris-HCl; pH 8.8
50 mM
5 ml
6M
36.035 g
30% (v/v)
34.5 ml
2%
2g
Azul de Bromofenol
trazas
pocos granos
Agua desionizada
c.b.p
100 ml
Urea
Glicerol (87% v/v)
SDS
Alícuotar en volúmenes de 10 ml y almacenar a -20°C. Se adiciona DTT al
momento de equilibrar y posteriormente se adiciona iodoacetamida.
Regulador de rehidratación para tiras de IEF
9.5 M
5.7 g
NP-40
2%
2 ml
β-mercaptoetanol
5%
0.5 ml
Anfolinas*
2%
-
c.b.p
10 ml
Urea
Agua desionizada
*Las anfolinas se agregan al momento de usar el regulador. El volumen de anfolinas
es de 3.5 μl para 350 μl de regulador de rehidratación.
Regulador de extracción UNS (Urea; Nonidep-40; SDS)
Urea
9.5 M
5.7 g
NP-40
20 %
1 ml
SDS
20%
1 ml
0.2 mM
10 μl
5%
-
PMSF
β-mercaptoetanol
22
Agua desionizada
c.b.p
10 ml
El β-mercaptoetanol; se adiciona en campana, ya que es hepatotóxico. Se
adicionan 6 μl. También se adicionan 4 mg de vidrio finamente molido para la lisis
celular.
6.1.4. Soluciones.
Soluciones para elaborar un gel de electroforesis de poliacrilamida y dodecil sulfato
de sodio (SDS-PAGE)
Bis-acrilamida 30% (29:1)
Acrilamida
N,N-metilenbisacrilamida
Agua desionizada
29 %
29.2 g
1%
0.8 g
c.b.p
100 ml
Tris 1M pH 8.8
Trisma-base
12.11 g
Agua desionizada c.b.p
100 ml
Disolver el Trisma-base en agua y antes de aforar ajustar el pH con HCl 6 N.
Tris 1M pH 6.8
Trisma-base
12.11 g
Agua desionizada c.b.p
100 ml
Disolver el Trisma-base en agua y antes de aforar ajustar el pH con HCl 6 N.
SDS 20 %
SDS
20 g
23
Agua desionizada c.b.p
100 ml
Disolver lentamente el SDS en agua y filtrar antes de usar.
TEMED (N,N,N’N’-tetrametiletilendiamina)
Solución al 100%
Persulfato de amonio 10 % (PSA)
PSA
100 %
100 mg
Agua desionizada
c.b.p
1 ml
Proteínas como marcadores de tamaño molecular para geles de SDS-PAGE
BSA
67 kDa
6 μl/μl H2O
2 μl
Citocromo
12 kDa
6 μl/μl H2O
2 μl
Anidrasa carbónica
29 kDa
3 μl/μl H2O
4 μl
Fosforilasa
90 kDa
3 μl/μl H2O
4 μl
Ovoalbúmina
45 kDa
3 μl/μl H2O
4 μl
1X
15 μl
Buffer de Laemmli 4X
Eliminado: Mioglobina
Solución para desteñir geles teñidos con azul de Comassie
Metanol
100 %
100 ml
Ácido acético
100 %
100 ml
c.b.p
1000 ml
Agua desionizada
Soluciones para teñir geles con plata
Solución I
Etanol
100 %
300 ml
24
Ácido acético
100%
100 ml
Agua
c.b.p
1000 ml
Etanol
100 %
300 ml
Acetato de sodio (4 M)
10 %
100 ml
Glutaraldehido
25 %
20 ml
Ácido acético
0.3 %
3 ml
Tíosulfato de sodio
0.1 %
1g
Agua desionizada
c.b.p
1000 ml
Nitrato de plata
100 %
1g
Formaldehído
37 %
0.24 ml
Agua desionizada
c.b.p
1000 ml
Carbonato de sodio
100 %
25 g
Formaldehído
37 %
0.4 ml
Agua desionizada
c.b.p
1000 ml
Solución II
Solución III
Solución IV
Solución V
Ácido acético
Agua desionizada
100 %
c.b.p
50 ml
1000 ml
25
6.2. Metodos.
6.2.1. Preparación de un jugo de hojas de Arabidopsis thaliana.
Para preparar un jugo de hojas de Arabidopsis thaliana, se cosechan hojas
(aproximadamente 100 g) de 4 a 6 semanas se edad y se lavan dos veces con agua
corriente y una con agua destilada estéril y se colocan en un mortero estéril, se
agrega nitrógeno líquido y se maceran las hojas hasta formar una pasta. El macerado
se coloca en tubos de centrífuga estériles y se centrifuga a 2,800 x g por 15 min a
4°C y el sobrenadante se extrae con pipeta en tubos de plástico estériles, que se
congelan a -20°C hasta su uso.
6.2.2. Subcultivos de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2.
6.2.2.1. Día 1.
Pseudomonas syringae pv. maculicola M2. fue cultivada en cuatro condiciones: la
primera en medio rico (KB); en medio rico con jugo de hojas de A.thaliana (KB+jugo)
y en medio mínimo (M9); en medio mínimo con de hojas de A.thaliana (M9+ jugo).
1. Sembrar por estría cruzada un inoculo de la cepa Pseudomonas syringae pv.
maculicola M2 (conservada a –70 °C) en una placa con agar KB
suplementado con 120μl de MgSO4
2 M y en otra placa igual pero
suplementado con 40μl de jugo de hojas de Arabidopsis thaliana.
Por otro lado sembrar por estría cruzada un inoculo de la cepa Pseudomonas
syringae pv. maculicola M2 en una placa de medio mínimo (M9) y medio mínimo
suplementado con 40μl de jugo de hojas de Arabidopsis thaliana.
2. Incubar las placas a 28°C por 24 horas.
26
6.2.2.2. Día 2.
Estos inóculos servirán para las cinéticas de crecimiento
1. Preparar en matraces independientes; 20 ml de medio liquido KB y 120 μl de
MgSO4 2 M; 20 ml de medio KB+jugo y 120μl de MgSO4 2 M, 20 ml de
medio M9; 20 ml de medio M9+jugo.
2. Inocular los matraces con una asada gruesa de los cultivos que crecieron en
la correspondiente placa.
3. Incubar los matraces a 28°C en agitación (250 r.p.m) por 48 horas.
6.3. Elaboración de cinéticas de crecimiento de Pseudomonas syringae pv.
maculicola M2.
6.3.1. Día 4.
1. Preparar 4 matraces nefelométricos con 20 ml de KB y 120μl de MgSO4 2 M; 4
con KB+jugo y 120μl de MgSO4 2 M; 4 con M9 y 4 con M9+jugo.
Nota: para cada condición elaborar un blanco.
2. Inocular cada matraz con 500 μl del inóculo correspondiente para llevar cada
matraz a 25 Unidades Kletts (UK).
3. Incubar los matraces a 28°C en agitación (250 r.p.m).
27
4. Hacer lecturas cada 2 horas.
5. Graficar Unidades Kletts (UK) contra tiempo.
6.3. Obtención de biomasa celular de Pseudomonas syringae pv. maculicola
M2.
6.3.1. Día 1.
1. Cultivar cepa de PsmM2 por 48 horas en 20 ml de medio KB; 20 ml de
KB+jugo; 20 ml en medio M9 y en 20 ml de medio M9+jugo.
2. Se incuban a 28°C en agitación (250 r.p.m) por 48 hrs.
6.3.2. Día 3.
1. Preparar matraces con 500 ml de KB con 3 ml de MgSO4 2M; 500 ml de
KB+jugo con 3 ml de MgSO4 2M y 1 ml de jugo de hojas de Arabidopsis
thaliana; 1000 ml de M9 y 1000 ml de M9+jugo con 2 ml de extracto de
Arabidopsis thaliana.
2. Se inoculan 12.5 ml en los medios KB y KB+jugo; en M9 y M9+jugo 50 ml en
cada uno.
3. tomar una alícuota y verificar las UK.
4. Incubar los matraces a 28°C en agitación (250 r.p.m).
5. Sacar los matraces a las 10 horas del crecimiento.
28
6. Colocar los matraces en baño de hielo.
7. Centrifugar a 10,000 rpm por 10 min a 4°C.
8. Descartar el sobrenadante de cada medio. La pastilla resultante congelarla
con nitrógeno líquido o congelarla con hielo seco y guardarla a – 70°C.
6.5. Lisis y obtención de extractos proteicos.
1. Pesar
un
tubo
eppendorf
de
1.9
ml
y
anotar
el
peso.
Agregar
aproximadamente 100 mg de pastilla celular. Adicionar 600 μl de regulador de
lisis UNS, 1 μl de PMSF, 4 mg de vidrio molido limpio y estéril, 5 μl de βmercaptoetanol.
2. Introducir un pistilo de vidrio esmerilado de la punta y dar 25 golpes
(homogenización).
Nota: trabajar estos pasos en campana.
3. Homogenizar con un vortex al máximo por 2 min.
4. Extraer por 14 horas en agitador eppendorf a temperatura ambiente.
5. Centrifugar 20 min al máximo a temperatura ambiente.
6. Extraer la fracción soluble de la fracción celular, medir y anotar los volúmenes
extraídos. Las fracciones separadas se congelan con nitrógeno líquido o con
hielo seco y guardarlas a – 70°C.
29
6.6. Precipitación de proteínas por el método del ácido tricloroacetico (TCA).
1. Se mide el volumen de muestra y se precipita con un volumen igual de TCA
preenfriado (4°C).
2. Se deja por 1 hr a 4°C ó baño de hielo.
3. Centrifugar 20 min a 4°C a 10,000 rpm en la microfuga.
4. Eliminar el sobrenadante (SN) por aspiración .
5. Lavar la pastilla agitando en el vortex, con 250 μl de etanol al 75% preenfriado
(-20°C).
6. Centrifugar 15 minutos a 4°C a 10,000 rpm en la microfuga.
7. Eliminar el SN por aspiración.
8. Repetir pasos 5 a 7 tres veces.
9. Lavar la pastilla agitando en el vortex, 250 μl de etanol al 95% preenfriado (20°C).
10. Centrifugar 15 minutos a 4°C a 10,000 rpm en la microfuga.
11. Eliminar el sobrenadante (SN) por aspiración.
12. Secar las pastillas 5 minutos hasta que no huela a etanol.
13. Resuspender la pastilla en 50 μl de agua ó en 50μl de 0.1N NaOH sólo si no
se puede disolver en agua y se va a utilizar para cuantificar proteína por el
método de BAC.
30
6.7. Determinación de la concentración de proteína mediante el método del
ácido bicinconínico (BAC).
El rango de medición es de 0.5 a 50 μg. Esta determinación se basa en la unión del ión
cobre (Cu+2) en un medio alcalino, al enlace peptídico de las proteínas, cambiando su
estado de oxidación a ión cuproso (Cu+1) en una primera etapa. En la segunda etapa
el ácido bicinconínico (BAC) forma un complejo colorido con el ión cuproso en medio
alcalino y se lee a 562 nm. Se requiere de una curva estándar, la cual se hace
variando la cantidad de seroalbúmina bovina (BSA). La determinación se lleva a cabo
ajustando el volumen final de la muestra y el estándar a 50 μl. En seguida se
adiciona 1.0 ml del reactivo de BAC, se mezcla y después de 30 minutos de
incubación a 37°C, se determina la Absorbancia a 562 nm. Los datos se grafican
para tener la curva estándar.
6.8. Preparación del reactivo de BAC.
Esté es estable por una semana a 4°C en un frasco ámbar.
1. Para 10 ml; adicionar 10 ml de solucion A y 200 μl de solucion B y homogenizar.
2. preparar la solución estándar de seroalbumina bovina (BSA): 1mg/ml H2O.
3. La curva estandar se prepara de la siguiente manera:
4. Curva estandar
Tubo #
(1xduplicado)
BSA
Estándar
1 mg/ml
1
2
3
4
5
6
0.0 μl
2.0 μl
5.0 μl
10.0 μl
15.0 μl
20.0 μl
Agua Desionizada Reactivo
BAC
V. Total = 50 μl
50.0 μl
48.0 μl
45.0 μl
40.0 μl
35.0 μl
30.0 μl
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
31
7
8
9
10
11
25.0 μl
30.0 μl
35.0 μl
40.0 μl
50.0 μL
25.0 μl
20.0 μl
15.0 μl
10.0 μl
--
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
5. Incubar a 37 °C por 30 minutos y leer a 562 nm. La curva se hace por
duplicado y se grafica.
Para la determinación de la concentración de proteína de cualquier muestra, por
duplicado se precipita el volumen de la proteína. La precipitación se hace con ácido
tricloroacetico (TCA) frío al 20%. Con la precipitación de la proteína, se elimina la
posible interferencia que pueden ocasionar cualquier componente de la muestra y
diferentes soluciones de extracción, que se utilizan para extraer proteínas.
En la curva estándar se extrapola el valor de absorbancia de la muestra, para
conocer la concentración de la proteína. Si las lecturas de absorbancia no quedan
dentro del rango de la curva estandar, diluir la muestra de proteína y volver a hacer la
determinación y un blanco. Si la muestra está muy diluída, concentrar por liofilización
dos muestras independientes y volver a cuantificar con un blanco.
6.9. Precipitación de extractos proteicos de Psm M2.
1. Tomar 5 μl del sobrenandante crudo proveniente de cada extracción y
condición de crecimiento (KB, KB+j y M9, M9+j) y adicionar 15 μl de TCA al
20%.
2. Dejar precipitar por 1 hr en baño de hielo.
3. Centrifugar a máxima velocidad por 15 minutos a 4 °C.
32
4. Adicionar 250 μl de etanol al 75%.
5. Centrifugar a 4°C al máximo y descartar el sobrenadante (repetir el paso
anterior 3 veces).
6. Adicionar 250 μl de etanol al 95%.
7. Centrifugar a 4°C al maximo y descartar el sobrenadante (repetir el paso
anterior 2 veces).
8. Secar las pastillas 5 minutos hasta que no huela a etanol.
9. Disolver la pastilla en100 μl de NaOH 0.1 N y tomar por triplicado 30 μl para
cuantificar.
10. Adicionar 20 μl de NaOH 0.1 N y 1 ml de BAC a cada muestra.
11. Leer a 562 nm.
12. Extrapolar en la curva estándar con los resultados obtenidos.
6.9.1. Electroforesis de enfoque isoeléctrico de tiras con gel para primera
dimension (1D).
1. Precipitar la muestra requerida; y adicionar 350 μl de regulador de
rehidratación para solubilizar la muestra y colocarla en agitador eppendorf.
2. Colocar 3.5 μl de anfolinas de cada rango (3.5-5 y 4-7); adicionar azul de
bromofenol y agitar en vortex.
33
3. Pipetear la muestra y colocarla en el deposito de corrida.
4. Colocar la tira Immobiline DryStrip en el deposito de corrida.
5. Colocar el deposito de corrida en el sistema IPGphorTM Isolectric Focusing
System.
6.9.2. Elaboración de un SDS-PAGE, segunda dimensión (2D).
De acuerdo a la metodología de Laemmli, un SDS-PAGE está constituido por un gel
concentrador y un gel separador. El gel separador es el que se debe elaborar
primero. Los dos geles son de diferente concentración y para cada uno de los geles
(el grosor del gel es de 0.75 mm) se hacen las siguientes mezclas:
6.9.1.1. Preparación de un gel concentrador al 5 % .
Para 6 ml:
Bis-acrilamida (30 %)
1 ml
Tris-HCl 1M pH 6.8
0.75 ml
Agua desionizada
4.18 ml
SDS 20%
30 μl
TEMED
6 μl
PSA 10 %
30 μl
6.9.1.2. Preparación de un gel separador al 14 %.
Para 40 ml :
Bis-acrilamida (30 %)
18.56 ml
Tris-HCl 1M pH 8.8
15.04 ml
34
Agua desionizada
5.92 ml
SDS 20%
200 μl
TEMED
40 μl
PSA 10 %
200 μl
6.9.2.3. Pasos para elaborar un gel separador y concentrador.
1. Armar el equipo de electroforesis PROTEAN® II xi Cell de BIORAD para
proteínas y verificar que no existan fugas, las dimensiones del gel que se
forma es de 22 cm por 18 cm.
2. Hacer la mezcla del gel separador al 14 % y mezclar suavemente. Aplicar los
40 ml al equipo electroforético, después de aplicar toda la mezcla, verificar que
no exista ninguna burbuja y aplicar un poco de isopropanol para equilibrar el
borde superior del gel separador, por último dejar polimerizar.
3. Hacer la mezcla del gel concentrador al 5 % y mezclar suavemente. Aplicar los
3 ml sobre el gel separador al 14% ya polimerizado. Introducir un diente para
cargar los marcadores de tamaño, verificar que no existan burbujas y aplicar
isopropanol por ultimo dejar polimerizar.
4. Colocar la tira con gel de enfoque isolelctrico y aplicar agarosa fundida al 0.8
% para que no se mueva la tira.
5. Preparar las proteínas como marcadores de peso molecular y calentarlos a 90
°C por 5 minutos y aplicarlos al gel.
6. Colocar regulador de corrida 1X y correr las muestras a 90 volts.
7. Teñir los geles con azul de Comassie o tinción con plata.
35
8. Analizar los geles con el programa PDQuest® de BIORAD.
6.9.2.4. Procedimiento para teñir geles con plata.
1. Incubar el gel con la solución I por 15 minutos y decantar.
2. Incubar el gel con la solución II por 15 minutos y obscuridad. Decantar en un
deposito adecuado para no contaminar.
3. Enjuagar el gel con agua desionizada por 15 minutos. Se hacen 3 lavados y
en obscuridad.
4. Incubar el gel con la solución III por 15 minutos y obscuridad. Decantar en
depósitos adecuados.
5. Adicionar un poco de solución IV homogenizar un poco (la solución se torna
café) y decantar; adicionar más solución IV e incubar por 15 minutos, decantar
en depósitos adecuados.
6. La tinción se detiene al adicionar la solución V al 5% por 1 hr, el gel puede
dejarse en esta solución para almacenarlo.
36
37
38
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.1. Cinéticas de crecimiento de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2.
Se determinaron las cinéticas de crecimiento para cada condición. Mediante estas
cinéticas de crecimiento (Figura 6) se estableció que a la mitad de la fase
exponencial (10 horas del crecimiento logarítmico) se recuperara la biomasa celular
de cada condición de crecimiento para la obtención de los extractos proteínicos.
Cinéticas de crecimiento de Psm M2
700
650
600
550
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Tiempo (h)
KB
KB+jugo
M9
M9+jugo
Figura 6. Cinéticas de crecimiento de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2 en
diferentes medios de crecimiento. Las flechas indican el momento en que los cultivos
fueron cosechados. KB: medio King’s B; KB+j: King’s B + jugo de Arabidopsis; M9:
medio mínimo; M9+j: medio mínimo + jugo de Arabidopsis. Todas las cinéticas fueron
repetidas cuatro veces. Las barras verticales indican el error de la desviación
estandar.
Como se ve en la figura 6, los cuatro tipos de cultivos se ajustaron para que las
cinéticas de crecimiento iniciaran de 25 unidades Klett. Se tomaron lecturas cada dos
horas hasta las treinta horas. Teniendo las cuatro cinéticas se decidió cosechar las
células a la mitad de la fase logarítmica, que en todos los casos fue a las 10 horas de
incubación. Las correspondientes unidades Klett para cada condición a las 10 horas
se detallan en la Tabla 1.
Al comparar las cuatro cinéticas de crecimiento, se observa que la mayor biomasa
se encuentra en el medio KB. Esto se puede explicar por el gran contenido de
nutrientes esenciales que la bacteria tiene a su disposición y que fácilmente puede
asimilar del medio para el crecimiento celular (Brook 1997). En la condición de
crecimiento KB de Psm M2 suplementado con jugo de hojas de Arabidopsis, se logra
ver una disminución de la biomasa en un 33% aproximadamente comparando con el
crecimiento en el medio sin jugo. Por otro lado en el medio minimo el jugo no afecta
el crecimiento de las bacterias, como se observa en la Figura 6.
La disminución del crecimiento de las bacterias, en el medio KB suplementado con
jugo de hojas de Arabidopsis, puede deberse a algunos compuestos fenólicos
encontrados principalmente en las hojas como: son las catequinas, el ácido
clorogénico, las epicatequinas, el ácido hidroxibenzoico, el ácido quínico y el ácido
vanílico (Mo y Gross, 1991). Es probable que la combinación de algunos de estos
compuestos que pudieran estar en el jugo de las hojas, con alguno o algunos de los
compuestos del medio KB, ejercieran un efecto inhibitorio en el crecimiento
bacteriano. Esto no es sorprendente, ya que en las plantas existen otros compuestos
como las fitoalexinas, que son compuestos antimicrobianos, así como en el jugo de
hojas existen otras substancias que pueden inhibir el crecimiento celular y que no se
descarta que se encuentren en el jugo crudo de hojas de Arabidopsis. Esto se puede
constatar, ya que el ácido clorogénico principal componente fenólico encontrado en
hojas de cereza, inhibe el crecimiento in vitro de Pseudomonas syringae pv. syringae
en alrededor del 75 % (Mo y Gross, 1991).
38
La diferencia en la velocidad de crecimiento en las bacterias en KB comparado con la
disminución en el crecimiento de la bacteria en M9 (al tratarse de un medio que sólo
tiene sales o un medio de cultivo definido), puede deberse a que la bacteria sólo
tiene como única fuente de carbono y energía a la glucosa del medio para elaborar
nuevo material celular, y que otros ingredientes se encuentran en cantidad limitante,
en cambio en KB, el medio es muy completo y no hay factores limitantes del
crecimiento.
Sin embargo, a diferencia del efecto inhibitorio del jugo en KB, en M9 no tuvo efecto.
Una explicación podría ser que los componentes del medio mínimo mimetizan las
condiciones del apoplasto vegetal para la bacteria, y además, los metabolitos de la
planta presentes en el jugo pueden inducir la expresión de factores de patogenicidad
relacionados con la defensa contra los metabolitos tóxicos de las plantas.
Se ha demostrado que el medio mínimo estimula el crecimiento de una mutante
PsmMut8 de P. s. maculicola M2 cuando se añade cloranfenicol (150 μg/ml) al medio
en comparación con el crecimiento en KB con cloranfenicol, la mutante tiene un
transposón insertado en el operón hrpAZBCDE, que codifica para la formación del pili
Hrp del sistema de secreción de proteínas tipo III y que es un factor esencial en la
patogenicidad, el transposón tiene el gen cat (cloranfenicol acetiltransferasa) que se
expresa bajo el promotor del operón. Cuando se agrega jugo de planta al medio
mínimo, se incrementa todavía más el crecimiento, sin embargo, cuando el medio
contiene casaminoácidos, se abate el incremento inducido por el jugo, pero no el
inducido por el medio mínimo, lo que indica que alguno o algunos aminoácidos
presentes en los casaminoácidos, inhiben la expresión del operón (Álvarez M. y R.
Marsch comunicación personal).
Por otro lado, usando Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, se obtuvo una
mutante en un gen homólogo a MexB de P. aeruginosa, el promotor de este gen
mutado se induce en medio mínimo y también cuando se añade jugo de plantas, el
producto de este gen forma parte de una bomba que está relacionada con la
39
expulsión de compuestos tóxicos del interior de la bacteria y hace a la bacteria
resistente a compuestos fenólicos y a antibióticos entre otros (Álvarez,M. C. Tesis de
maestría. 1999).
En resumen, es posible que los componentes del medio rico inhiban la expresión de
genes relacionados con la defensa o resistencia de la bacteria contra compuestos
tóxicos en el jugo de hojas de Arabidopsis, por lo que las bacterias sufren el efecto
de esos compuestos y disminuye su crecimiento. Por otro lado, tanto el medio
minimo como el mismo jugo inducen la expresion de factores de resistencia a estos
compuestos, por ello el crecimiento bacteriano no se ve afectado significativamente
por los compuestos toxicos del jugo en el medio minimo.
7.2. Morfología de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2 en medios
diferentes.
Cuando Psm M2 crece en los correspondientes medios existen diferencias
morfológicas, como se ven en la Figura 7. Comparando la morfología celular entre
los medios a las diez horas del crecimiento (mitad de la fase logarítmica ) se ve que
las células en los medios KB y KB más jugo son de forma bacilar (Figura 7A y 7B).
Mientras que la morfología de las células en los medios mínimos, las células
presentan una forma de bacilos cortos (Figura 7C y 7D).
El cambio de forma indica que hay un cambio en el área superficial de la célula, en
KB la cantidad de nutrientes es excesiva, y la célula requiere de suficiente cantidad
de moléculas de transporte para aminoácidos y otros componentes, por lo que podría
requerír más área superficial, en cambio en el medio mínimo, sólo necesita
transportar glucosa como única fuente de carbono y la célula necesita emplear toda
su maquinaria enzimática para poder sintetizar lo necesario y poder desarrollarse,
entonces la célula, tendería a ser más pequeña y con menor área superficial para
dividirse a la misma velocidad que en medio rico.
40
A
B
C
D
Figura 7. Tinción al Gram de células de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2
provenientes de diferentes medios de cultivos. A . Psm M2 en KB; B. Psm M2 en KB
+ jugo de Arabidopsis; C. Psm M2 en M9; D. Psm M2 en M9 + jugo de Arabidopsis.
41
7.3. Cuantificación de proteína total en Pseudomonas syringae pv. maculicola
M2.
En la Tabla 1, se muestra el contenido total de proteínas proveniente de Psm M2
bajo diferentes condiciones de crecimiento. Este contenido proteínico proviene de
100 mg de células empacadas en base a peso fresco. Una observación interesante,
es que el contenido de proteína se incrementó en las células creciendo en los medios
mínimos siendo más alto que en los medios ricos. Sin embargo, cuando se adiciona
jugo de planta al medio rico y al medio mínimo, éste tiene un efecto de incrementar la
concentración de proteína. Comparando la concentración de la proteína cuando la
bacteria crece en medio rico en ausencia de jugo de planta el rendimiento total es de
alrededor del 6.3% contra el 7.2 % de la concentración total en medio mínimo en
ausencia de extracto de planta y para la concentración total de proteína en medio rico
y medio mínimo ambos suplementados con jugo de planta el rendimiento es del 6.8
% y 9.0 % respectivamente. En medio rico más jugo el incremento es de 7.9 % con
respecto a medio rico en ausencia de jugo de planta y para medio mínimo más jugo
la concentración aumenta en 25 % contra medio mínimo solo.
42
Tabla 1. Concentración total de proteínas de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2 bajo diferentes condiciones de
crecimiento.
μg de proteína d
UK a las 10
horas del
crecimiento b
Volumen
de
cultivo
(ml) c
Fracción
soluble 1
Fracción
insoluble 2
Total (100 %
de 1+2)
Concentración
(%) e
Efecto del jugo en
la concentración
total de proteína
KB
345
9.5
5580 (88%)
750 (12%)
6330
6.3
-
M9
85
34
5604 (78%)
1575 (22%)
7179
7.2
-
KB+j A
227
11
6392 (94%)
412 (6%)
6804
6.8
+ 7.9 %
M9+j B
94
25
7519 (83%)
1500 (17%)
9019
9.0
Medios de
cultivo a
+ 25 %
y B Medios con 2 μl de jugo de planta/ml de medio de cultivo, en volumen final de 500 ml para KB y 1000 ml para
M9.
a
Los cuatro medios de cultivo se ajustaron a 25 UK (unidades Klett).
b
Unidades Klett a las 10 horas del crecimiento correspondiente a la mitad de la fase logarítmica.
c
Volumen necesario para obtener 100 mg de pastilla en base a peso húmedo.
d
Extracción total de proteínas por 14 horas.
e
Concentración calculada para 100 mg de pastilla húmeda.
A
43
7.4. Separación bidimensional de proteína total de Psm M2 utilizando en la
primera dimensión un rango de pH amplio.
En este estudio se usó la fracción soluble de los extractos proteínicos de Psm M2,
para resolver la composición proteínica mediante geles grandes de 2D. La figura 9
representa el análisis de proteínas en 2D. En la primera dimensión el extracto
proteínico de la fracción soluble se separó en tiras con geles de IEF, los cuales
contienen anfolinas con un rango de pH de 3 a 10 y una longitud de 7 cm. La
segunda dimensión (2D) se desarrolló en geles planos y grandes de 18 cm de ancho
por 20 cm de longitud.
IEF
SDS-PAGE
kDa
90
67
45
29
12
pI 3
10
7
Figura 8. Separación de proteínas provenientes de los extractos proteínicos de
Psm M2 cultivada en M9. La 1ª D un gradiente de pH de 3 a 10 en tiras con
geles de IEF de 7 cm. La 2ª D es en un SDS-PAGE al 14 %.
44
Las proteínas separadas en geles de 2D fueron visualizadas al ser teñidas con plata.
Con esta tinción (Figura 8), se encontró que los componentes totales de proteínas
estaban cargados en el lado ácido. Así que se trabajó en ampliar el lado ácido (pH de
3.0 hasta 5.6).
7.5. Análisis electroforético en geles de 2D de proteínas ácidas de extractos
totales de Psm M2 expresadas bajo diferentes condiciones de crecimiento.
Para investigar el grado de diferencias en los patrones de expresión de las proteínas,
bajo cada una de las condiciones de crecimiento de la bacteria (KB, KB + j, M9 y M9
+ j), se analizaron electroforeticamente en 2D los extractos proteínicos solubles
totales de las bacterias crecidas en las condiciones señaladas. Para este análisis
comparativo de perfiles proteómicos de proteínas acidas, en la 1ª D se utilizaron tiras
de geles comerciales de IEF con rango de pH de 3.0 a 5.6 y una longitud de 18 cm,
para la 2ª D se utilizaron geles planos de 18 cm de ancho por 20 cm de largo los
cuales separan proteínas en un rango de 5 a 100 kDa. Posteriormente se analizó
cada perfil proteómico y posteriormente estos se compararon entre sí.
Al comparar los patrones de proteínas en 2D, con los de otros microorganismos,
como Salmonella enteritis (Park y col. 2003), Pseudomonas aeruginosa (Sauer y col.
2002) y Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Buell y col. 2003) se encontró
que tambien predominan las proteínas ácidas, las cuales tambien
fueron
identificadas en estos patógenos.
En la Figura 9 se muestra el perfil proteómico en 2D del extracto soluble de las
proteínas ácidas de Psm M2 crecida en medio KB. En esta figura lo que salta a la
vista es el reducido número de proteínas que en esta caso fueron 24 (Tabla 2). Es
esperado el detectar un gran número de proteínas en esta región del gradiente de pH
de acuerdo con la Figura 8. Una de las explicaciones a este resultado fue que se
tuvieron que modificar las condiciones de tinción porque al teñir los geles con plata
no se podían detectar manchas únicas y se observaba un patrón proteínico saturado.
45
Por esta razón decidimos hacer tinciones rápidas con plata para detectar únicamente
las proteínas más abundantes a lapsos de alrededor de 10 min.
El perfil proteómico de las proteínas ácidas de KB + j (Figura 10), teñidas bajo las
condiciones arriba mencionadas, refleja una mayor complejidad en el número (64
proteínas; Tabla 2) y tamaño de las proteínas al compararlas con el perfil proteómico
de KB (Figura 9). La presencia del jugo de hojas de planta indujo una expresión
diferencial de 40 proteínas ácidas más abundantes. Este resultado concuerda con el
aumento de concentración de proteína total en el paquete celular (Tabla 1).
El perfil proteómico de las bacterias crecidas en M9 (figura 11) revela la presencia de
30 proteínas ácidas más abundantes. Por otro lado la adición de jugo de hojas a las
bacterias crecidas en este medio (Figura 12), reveló la expresion de 42 proteínas
(Tabla 2) más abundantes, esto concuerda con el aumento del contenido total de
proteína (Tabla 1).
En este trabajo, se analizaron los geles teñidos con un lapso aproximado de 10 min
lo que permitió poner de manifiesto solamente las proteínas ácidas más abundantes.
Bajo las condiciones experimentales utilizadas en este trabajo, se observó una gran
diferencia en los patrones de expresión de proteínas de la bacteria en las diferentes
condiciones de cultivo.
46
IEF
SDS-PAGE
kDa
90
67
45
29
12
pI
3.0
3.7
4.3
5.0
5.6
Figura 9. 2D de Psm M2 en medio KB. Los cuadros negros indican las proteínas
ausentes en KB + j, los cuadros amarillos indican las proteínas ausentes en M9, los
cuadros verdes las proteínas ausentes en M9 + j. Las dimensiones del gel son 18 x
20 cms.
47
IEF
SDS-PAGE
kDa
90
67
45
29
12
pI
3.0
3.7
4.3
5.0
5.6
Figura 10. 2D de Psm M2 en medio KB + j. Los cuadros negros indican las
proteínas ausentes en KB, los cuadros azules indican las proteínas
ausentes en M9 + j, los cuadros naranjas indican las proteínas ausentes en
M9.
48
SDS-PAGE
IEF
kDa
90
67
45
29
12
pI
3.0
3.7
4.3
5.0
5.6
Figura 11. 2D de Psm M2 en medio M9. Los cuadros negros indican las proteínas
ausentes en M9 + j, los cuadros amarillos indican las proteínas ausentes en KB, los
cuadros naranjas indican las proteínas ausentes en KB + j.
49
IEF
SDS-PAGE
kDa
90
67
45
29
12
pI
3.0
3.7
4.3
5.0
5.6
Figura 12. 2D de Psm M2 en medio M9 + j. Los cuadros negros indican las proteínas
ausentes en M9, los cuadros verdes indican las proteínas ausentes en KB, los cuadros
azules indican las proteínas ausentes en KB + j.
50
Al hacer un análisis comparativo lo primero que se observó fue un incremento en el
número de las proteínas expresadas por efecto del jugo de hojas de Arabidopsis. Por
otro lado también se observó la inhibicion en la expresión de algunas proteínas.
Tabla 2. Número de las proteínas ácidas solubles más abundantes en cada gel y su
expresion diferencial en cada condicion.
Comparación y proteínas diferenciales
Muestra
Proteínas
totales
KB
KB+j
M9
M9+j
KB
24
-
5
11
5
KB+j
64
43
-
38
44
M9
30
21
12
-
16
M9+j
42
21
21
24
-
En la Tabla 2, se muestran las combinaciones hechas, para obtener el número de
proteínas que estan ausentes en cada condición de crecimiento, se observó que las
variaciones más altas en el número de proteínas expresadas diferencialmente se
detectó cuando la bacteria creció en presencia de jugo de planta, pero cuando se
compara KB y M9 existen más proteínas que fueron expresadas en este último
medio. Cuando se compara KB + j y M9 + j, existe mayor expresión en el medio rico
suplementado con extracto de planta.
7.6. Análisis de los patrones de expresión de proteínas comparando las cuatro
condiciones de inducción.
Para hacer un análisis de las manchas de las proteínas que se observaron en cada
uno de los geles, primero se generó una figura con la sobreposicion de los cuatro
51
geles, tomando como referencia la posicion de las tres proteínas que estan presentes
en todos los geles (Tablas 3 y 4), enseguida se etiquetaron cada una de las proteínas
como se muestra en la Figura 13. Las proteínas se etiquetaron con números en
orden progresivo de proteína con mayor peso molecular a menor peso molecular (en
las figuras, de arriba hacia abajo, se etiquetaron 124 proteínas. Se comparó cada
uno de los geles mostrados en las Figuras 9, 10, 11 y 12 con la Figura 13 y se
preparó la Tabla 3, en donde se resumió en qué condiciones se presentó cada
proteína. Finalmente, se analizaron las condiciones en las que las proteínas se
presentaban (1; Tabla 3) o estaban ausentes (—; Tabla 3). En este análisis no se
tomó en cuenta la intensidad de la mancha solamente si estaba presente o ausente.
52
IEF
SDS-PAGE
kDa
Figura 13. Sobreposición de los cuatro perfiles de proteínas de Psm M2 expresadas
en las cuatro condiciones de crecimiento. Se identificó cada proteína con un número
progresivo del 1 al 124 empezando por la de mayor peso molecular. Los números
con flecha señalan las proteínas identificadas teóricamente de acuerdo a secuencias
de genes mutados en el laboratorio (Medina, 2003).
53
Tabla 3. Relación de las manchas de proteínas numeradas y su presencia o ausencia
en los geles de las figuras 9a, 10, 11 y 12.
#b
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
K KJ M MJ EXc
—d 1e — — KJ
— 1 — — KJ
1 — — 1 K-MJ
1 — — 1 K-MJ
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— — 1 — M
— 1 — — KJ
— — — 1 MJ
— — — 1 MJ
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— — — 1 MJ
— — — 1 MJ
— — 1 — M
— — 1 — M
— — 1 — M
1 1 1 1 TODOS
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— — 1 — M
1 1 1 1 TODOS
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— — — 1 MJ
— — — 1 MJ
— — — 1 MJ
— — — 1 MJ
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
#
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
K KJ M MJ EX
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— — — 1 MJ
— — — 1 MJ
— — — 1 MJ
— — — 1 MJ
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
—— 1 — M
— — — 1 MJ
1 1 — — K-KJ
1 1 — — K-KJ
—— 1 — M
1 — —— K
— — — 1 MJ
— — — 1 MJ
—— 1 — M
—— 1 — M
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— — — 1 MJ
— — — 1 MJ
— 1 — — KJ
— — — 1 MJ
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— — — 1 MJ
— 1 — — KJ
#
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
K KJ M MJ EX
— — 1 1 M-MJ
— 1 — — KJ
— — — 1 MJ
1 — —— K
— 1 — — KJ
— — — 1 MJ
— 1 — — KJ
— 1 — 1 KJ-MJ
— — — 1 MJ
— 1 — — KJ
— — — 1 MJ
— — — 1 MJ
— 1 — — KJ
1 — — 1 K-MJ
1 — — 1 K-MJ
1 1 — — K-KJ
1 — —— K
— — 1 1 M-MJ
— — 1 1 M-MJ
— 1 — — KJ
— 1 1 — KJ-M
1 1 — — K-KJ
1 1 — — K-KJ
— — 1 1 M-MJ
— — 1 1 M-MJ
—— 1 — M
— — 1 1 M-MJ
—— 1 — M
1 — —— K
—— 1 — M
—— 1 — M
#
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
123
124
K KJ M MJ
EX
— 1 1 — KJ-M
1 1 1 1 TODOS
— — — 1 MJ
— — — 1 MJ
— 1 — — KJ
1 1 — — K-KJ
1 1 — — K-KJ
1 1 — — K-KJ
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— 1 1 — KJ-M
— 1 1 — KJ-M
1 1 — — K-KJ
— — 1 1 M-MJ
— 1 — — KJ
1 1 1 — K-KJ-M
— — — 1 MJ
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
— — — 1 MJ
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
—— 1 — M
— 1 — — KJ
— 1 1 — KJ-M
— 1 — — KJ
— 1 — — KJ
1 — 1 1 K-M-MJ
— 1 1 — KJ-M
— 1 — — KJ
— 1 1 — KJ-M
a
Figura 9, K; Figura 10, KJ; Figura 11, M; y Figura 12, MJ.
Número asignado a la mancha en la figura .
c
Condiciones en que se expresó la mancha: K, King’s B; KJ, King’s B suplementado con
jugo de Arabidopsis thaliana; M, M9; y MJ, M9 con jugo de A. thaliana.
d
— significa “no se expresó la proteína en este medio, porque está ausente la mancha en
este gel”.
e
1 significa “se expresó la mancha en este medio, porque está presente la mancha en este
gel”.
b
Se encontró que tres proteínas se expresan constitutivamente, es decir, se encontró
la mancha correspondiente en todos los geles. Se encontró que 14 proteínas se
54
expresan en medio rico y no en medio mínimo, y el jugo de hojas de Arabidopsis
thaliana no tiene ningún efecto en su expresión (K-KJ).
El medio mínimo induce la expresión de 21 proteínas que no son expresadas en
medio rico, y el jugo de planta no tuvo ningún efecto en su expresión.
En las Tablas 3 y 4 muestran las siguientes observaciones:
1. Tres proteínas se expresaron constitutivamente puesto que se encontraron en
todos los geles.
2. Catorce proteínas fueron inducidas por los componentes del medio rico y no están
afectadas por el jugo.
3. De manera similar el medio mínimo indujo la expresión de 21 proteínas que no se
afecta por la presencia del jugo.
4. El medio KB indujo la expresion de 4 proteínas que tambien son expresadas en
M9 pero en presencia de jugo. Sin embargo, este jugo inhibe estas mismas
proteínas en KB.
5. Se detectaron 45 proteínas en medio rico con jugo de hojas Arabidopsis que no
se expresan en el medio rico sin jugo y tampoco en medio mínimo con jugo. Esto
sugiere un efecto potenciador entre los componentes del medio rico y los del jugo
de planta.
6. Se observó un efecto similar al anterior con respecto al estímulo del jugo sobre la
expresión diferencial de 26 proteínas que solamente se expresan en las bacterias
crecidas en M9.
7. La proteína 70 se expresó únicamente cuando tiene jugo independientemente del
medio.
8. En el medio mínimo y en el medio rico con jugo se expresaron 6 proteínas, estas
condiciones sugieren que la expresión de estas proteínas depende de emular las
condiciones del apoplasto o de la presencia de algun metabolito de la planta. Sin
embargo, estas proteínas no estuvieron presentes en M9 con jugo.
9. La expresion de la proteína 109 se inhibió por el jugo en medio mínimo.
10. La expresion de la proteína 121 se inhibió por el jugo en el medio rico.
55
11. La expresión de 55 proteínas se inhibió simplemente por el medio KB.
12. La expresión de 8 proteínas se inhibió simplemente por el medio KB con jugo.
13. La expresión de 33 proteínas se inhibió simplemente por el medio M9.
14. La expresión de 20 proteínas se inhibió simplemente por el medio M9 con jugo.
Tabla 4. Resumen de las condiciones de expresión o represión de las proteínas
etiquetadas en la Figura 13 y de acuerdo con la Tabla 5.
Proteínas que se:
Expresan constitutivamente (K-KJ-M-MJ)
Expresan en KB (K y K-KJ)
Expresan en M9 (M y M-MJ)
Expresan en KB o en M9 con jugo (K-MJ)
Expresan en KB con Jugo (KJ)
Expresa por algún metabolito de la planta,
pero sólo en M9 (MJ)
Se induce por el jugo de planta en cualquier
medio (KJ-MJ)
Se inducen por algún metabolito de la planta
y por el medio mínimo (KJ-M)
Se reprime su expresión por el jugo de planta
en M9 (K-KJ-M)
Se reprime su expresión por el jugo de planta
en KB (K-M-MJ)
Se reprime su expresión en KB
Se reprime su expresión en KJ
Se reprime su expresión en M9
Se reprime su expresión en MJ
Número de la proteína:
18, 23 y 95
30, 44, 45, 47, 66, 78, 79, 84, 85, 91, 99, 100,
101 y 106
7, 15, 16, 17, 22, 42, 46, 50, 51, 63, 80, 81,
86, 87, 88, 89, 90, 92, 93, 107 y 116
3, 4, 76 y 77
1, 2, 5, 6, 8, 11, 12, 19, 20, 21, 24, 25, 30, 31,
32, 33, 34, 35, 40, 41, 52, 53, 54, 57, 59, 60,
62, 64, 67, 69, 72, 75, 82, 98, 102, 103, 108,
111, 112, 114, 115, 117, 119, 120 y 123
13, 14, 26, 27, 28, 29, 36, 37, 38, 39, 43, 48,
49, 55, 56, 58, 61, 65, 68, 71, 73, 74, 96, 97,
110 y 113
70
94, 104, 105, 118, 122 y 124
109
121
5, 6, 8, 44, 12, 19, 20, 21, 24, 30, 31, 32, 33,
34, 35, 40, 41, 44, 45, 52, 53, 54, 57, 59, 60,
62, 64, 67, 69, 60, 62, 64, 67, 69, 70, 72, 75,
78, 82, 83, 98, 102, 103, 104, 105, 108, 111,
112, 114, 115, 117, 118, 119, 120 y 123
3, 4, 47, 66, 76, 78, 91 y 121
3, 4, 9, 10, 13, 14, 26, 27, 28, 29, 36, 37, 38,
39, 43, 48, 49, 55, 56, 58, 61, 65, 68, 70, 71,
73, 74, 76, 77, 96, 97, 110 y 113
7, 15, 16, 17, 22, 42, 46, 50, 51, 83, 88, 90,
93, 94, 104, 105, 109, 116, 118 y 122
56
7.7. Identificación funcional de proteínas inducidas por jugo o medio mínimo de
Psm M2.
En un estudio anterior, se usó una mutante de P. s. maculicola M2, la PsmMut8, que
tiene la inserción de un transposón artificial en el gen hrpZ. Con un segundo
transposón artificial se obtuvieron dobles mutantes. Se seleccionarón aquellas dobles
mutantes en las que la segunda mutación alteró la regulación de hrpZ y dobles
mutantes en las que el segundo gen mutado se expresaba más en medio minimo con
jugo que en KB. Se clonarón y secuenciaron 22 de estos genes mutados. Con las
secuencias se identificaron preliminarmente estos genes (Medina, 2003). En este
trabajo, se identificaron los productos de estos genes en base a su pI, tamaño y se
relacionaron con las proteínas de la Figura 13, se señalan las proteínas que
corresponden a los valores calculados y que están incluidos entre los límites de pH
analizados. En la Tabla 5, se indica cuál es la identidad de estas proteínas, cuales
fueron las condiciones de expresión y las condiciones de selección de las mutantes
(Medina, 2003).
Tabla 5 . Proteínas propuestas como candidatos expresados diferencialmente en las
condiciones probadas.
# Proteína
Proteína
Inducida
Afecta expresión
de hrpZ
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
GacS
P5CR
PGDH
EX5C
PYRB
DAMX
RuvA
PUR4
FABH
FdhD
PORB
PlsX
CYOC
RPR
KB + j
M9
KB + j
M9 + j
M9 y M9 + j
M9 + j
M9 + j
M9 + j
M9 + j
M9 + j
KB + j
KB + j
KB + j
KB + j
sí
sí
sí
sí
sí
sí
sí
sí
sí
-
Inducida en MJ
sí
sí
sí
sí
sí
57
En la Tabla 6 se muestran los datos relacionados con estas proteínas. Estos incluyen
la posible función, el microorganismo con el gen homólogo y el numero de acceso
con la secuencia completa a partir de la que se calculo el pI y el peso molecular.
Tabla 6. Proteínas de Psm M2 identificadas en 2D por su tamaño, pI y posible
función.
#. de
no. de
Microorganismo
Proteína
Proteína
1
GacS
Pseudomonas
syringae
pv.
syringae
P48027
2
P5CR
P22008
3
PGDH
4
EX5C
Pseudomonas
aeruginosa
Escherichia
coli
Escherichia
coli
5
PYRB
Q59711
6
DAMX
7
RuvA
Pseudomonas
putida
Serratia
marcescens
Pseudomonas
aeruginosa
8
PUR4
9
FABH
10
FdhD
Escherichia coli
P32177
11
PORB
Pseudomonas
aeruginosa
Q51485
Pseudomonas
aeruginosa
Rhodobacter
capsulatus
acceso
P08328
P07648
P45459
Q51425
Q9HXN2
P30790
kDa
pI
52
4.2
31
4.1
47
6.0
67
4.1
43
3.9
53
4.2
63
3.9
Función
Forma parte de un sistema regulador de
dos componentes GACA/GACS (LEMA).
Puede estar involucrado en la formación de
lesiones, swarming y en la producción de
proteasa extracelular, siringomicina y acilhomoserinlactona. Es requerida para la
patogenicidad en frijol.
Pirrolina-5-carboxilato reductasa, participa
en la ruta de biosíntesis de prolina.
En bacteria participa en el primer paso de
la biosíntesis de serina.
Exodeoxiribonucleasa V cadena gama.
Exhibe una extensa variedad de
actividades catalíticas incluyendo
exonucleasa ATP-dependiente, helicasa
ATP-dependiente y ATPasa DNA
dependiente.
Participa en el segundo paso de la
biosíntesis de la pirimidina.
Directa o indirectamente interfiere con la
división celular.
El complejo ruvA-ruvB, en presencia de
ATP, renaturaliza la estructura cruciforme
en DNA superenrollado con secuencia
palindrómica, indicando que este puede
promover las reacciones de intercambio en
recombinación homóloga. ruvA es una
helicasa que regula la migración y empalme
de la estructura Holliday por
desnaturalización y realineamiento. ruvA,
en presencia de DNA, estimula la débil
actividad ATPasa de ruvB.
Síntesis de purina de novo.
Cataliza la reacción de condensación de
síntesis de ácidos grados por la adición a
un acil aceptor de dos carbonos de
malonyl-acp. KASIII cataliza la primera
reacción de condensación la cual inicia la
síntesis de ácidos grasos y puede por lo
tanto destacar en la conducción de la
producción de ácidos grasos.
Necesaria para la actividad de formiato
deshidrogenasa inducible por nitrato.
Precursor de la porina B, que funciona
como canal selectivo de sustrato, para una
variedad de azucares diferentes. Facilita la
difusión de glucosa a través de la
membrana externa.
66
3.8
42
4.3
63
3.8
55.4
4.19
58
12
PlsX
13
CYOC
14
HrpR
Salmonella
typhimurium
Pseudomonas
putida
Pseudomonas
syringae pv.
syringae
O85138
Q9WWR3
P37930
No conocida, probablemente involucrada
en síntesis de ácidos grasos o fosfolípidos.
Complejo de oxidasa terminal del citocromo
o. Componente de la cadena respiratoria
aeróbica de E. Coli que predomina cuando
las células crecen a alto nivel de aireación.
Miembro del sistema regulador de dos
componentes HRPR/HRPS que regula la
activación del factor sigma HRPL el cual
esta involucrado con los genes de
patogenicidad de plantas, hrmA y avr.
Probablemente interactúa con sigma 54.
34
4.2
67
6.0
66.0
4.02
59
60
X. BIBLIOGRAFIA
Aldon, D., Brito, B., Boucher, C., Genin, S. 2000. A bacterial sensor in plant cell
contact controls the transcriptional inducción of Ralstonia solanacearum
pathogenicity genes. EMBO Journal. 19(10): 2304-2314.
Alfano, J.R. and Alan Collmer. 1996. Bacterial pathogens in plants: Life up agaist
the wall. Bacterial Plant Cell. (8)1683-1698.
Alfano, J.R., A. Collmer. 1997. The type III (Hrp) secretion pathway of plant
pathogenic bacteria: traffickin harpins, Avr proteins, and death. Journal of
Bacteriology. 179(18): 5655-5662.
Bender, C.L., y V. Rangaswamy. 1999. Poliketide production by plant-associated
Pseudomonads. Annual Review of Phytopathology. 37:175-196.
Bender, C.L., Alarcón, C.F., Gross, D. 1999. Pseudomonas syringae phytotoxins:
mode of action, regulation and biosíntesis byepeptide and polyketide síntesis.
Microbiology and Molecular Biology Reviews. 63(2): 266-292.
Boch, J., Joardar, V., Gao, L., Robertson, T.L., Lim, M., Kunkel, N.B. 2002.
Identification of Pseudomonas syringae pv. tomato genes induced during
infection of Arabidopsis thaliana. Molecular Microbiology. 44(1): 73-87.
Bonas, U, lahaye, T. 2002. Plant disease resistance triggered by pathogen-derived
molecules: refined models of specific recognition. Current Opinion in
Microbiology. 5: 44-50.
Budde, I.P., B.H. Rohde, C. L. Bender, y M.S. Ullrich. 1998. Growth phase and
temperature influence promoter activity, transcript abundance, and protein
stability during biosÌntesis of the Pseudomonas syringae phytotoxin
coronatine. Journal of Bacteriology. 180(6):13601367.
Budde, I.P., y M.S. Ullrich. 2000. Interactions of Pseudomonas syringae pv. glycinea
with host and nonhost plants in relation to temperature and phytotoxin
syntesis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13(9):951-9614.
Buell, C.R., Joardar, V., Lindeberg, M., Selengut, J., Paulsen, I., Gwinn,T.M L.,
Dodson, R.J., Deboy, R.T., Durkin, A.S., Kolonay, J.F., Madupu, R.S.,
Daugherty, B.L., Beanan, M.J., Haft, D.H., Nelson, W.C., T., Zafar, Davidsen,
N., Zhou, L., Liu, J., Yuan, Q., Khouri, H., Fedorova, N., Tran, B., Russell, D.,
Berry, K., Utterback, T., Van Aken, S.E., Feldblyum, T.V., D’Ascenzo, M.,
Wen-Ling D., Ramos, A.R., Alfano, J.R., Cartinhour, S., Chatterjee, A.K.,
Delaney, T.P., Lazarowitz, S.G.,Martin, G.B., Schneider, D.J., Tang, X.,
Bender, C.L., White, O., Fraser, C.M., Collmer,A. 2003. The complete
genome sequence of the Arabidopsis and tomato pathogen Pseudomonas
syringae pv. tomato DC3000. PNAS. 100(18): 10181-10186.
Büttner, D, Bonas, U. 2002. Getting across bacterial type III effector proteins on their
way to plant cell. EMBO Journal. 21(20): 5313-5322.
Cash P, Argo E, Ford L, Lawrie L, McKenzie H. 1999. A proteomic analysis of
erythromycin resistance in Streptococcus pneumoniae. Electrophoresis
20:2259-2268.
Collmer, A.,J. L. Badel, C.O. Amy, D. Wen-Limg, F.E. Derrick, A.L. Ramos, A.H.
Rehm, D.M. Yerson, O. Schneewinds, K.V..Dijk, y J.R. Alfano. 2000.
Pseudomonas syringae Hrp type III secretion system and effector proteins.
Procedure of National Academy of Science of the United States of America.
97(16):8770-8777.
63
Collmer, A. 1998. Determinants of pathogenicity and avirulence in plant pathogenic
bacteria. Current Opinion in Plant Biology. 1: 329-335.
Cordeiro,
M.C.R.,
R.
Piqueras,
D.E.
Oliveira,
y
C.
Castresana.
1998.
Characterization of early induced genes in Arabidopsis thaliana responding to
bacterial inoculation: Identification of centrin and of a novel protein with two
regions to kinases domains. FEBS Letters. 434:387-393.
Cornelis, G.R., y F.V. Gijsegem. 2000. Assembly and function of type III secretory
system. Annual Review of Microbiology. 54:735-774.
Dainese-Hatt P, Fischer H-M, Hennecke H, James P. 1999.Classifying symbiotic
proteins from Bradyrhizobium japonicum into functional groups by proteome
analysis of altered gene expression levels. Electrophoresis, 20:3514-3520.
Encarnación, G.S.M. 2002. El proteoma, una herramienta para el análisis global del
estado celular de organismos microbianos. Centro de investigación sobre
fijación de nitrogeno. UNAM.
Fang, L., Y. Hou, y M. Inouye. 1998. Role of cold-box region in the 5’ untranslated
region of the cspA mRNA in its transient expresiÛn at low temperature in
Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180(1):90-95.
Felix, G., Duran, J.D., Volko, S., Boller, T. 1999. Plants have a sensitive perception
system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant
Journal. 18(3): 265-276.
Galán, J.E., Collmer, A. 1999. Type III secretion machines: Bacterial devices for
protein delivery into host cells. Science. 284: 1322-1328.
64
Gabriel, D.W. 1990. Working of models of specific recognition in plant-microbe
interactions. Annual review of Phytopathology. 28:365-391.
Genin, S., Boucher, C. 2002. Ralstonia solanacearum: secretsof a major pathogen
unveiled by analysis of its genome. Molecular Plant Pathology. 3(3): 111-118.
Graves, P., R. And Timothy , A.J. 2000. Molecular Biologistís to proteomics.
Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (1): 39-63.
Grimm, C., W. Aufsatz, y N.J. Panopoulos. 1995. The hrpRS locus of Pseudomonas
syringae pv. phaseolicola constitutes a complex regulatory unit. Molecular
Microbiology. 15(1):155-165.
He, S. Y., H-C. Huang y A. Collmer. 1993. Pseudomonas syringae pv. syringae
HarpinsPss: a protein that secreted via Hrp pathway and elicits the
hypersensitive response in plants. Cell. 73:1255-1266.
Heath, M. 2000. The first touch. Physiological and Molecular Plant Pathology. 56:
49-50.
Hienonen, E., Roine, E., Romantshuk, y Taira, S. 2002. mRNA stability and the
secretion signal of HrpA, a pilin secreted by the type III system in
Pseudomonas syringae . Mol. Genet. Genomics. 266: 973-978.
Hueck, C.J. 1998. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of
animal and plants. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62(2): 379433.
65
Jianzhong, H., B.f. Carney, T.P. Denny, A.K. Weissinger, y M.A. Schell. 1995. A
complex network regulates expresion of epsand other virulence genes of
Pseudomonas solanaceum. Journal of Bacteriology. 177(5):1259-1267.
Jungblut, P., R., Bumann, D., Haas, G., Zimny-ardnt, P., Holland, Lamer, S., Slejak,
F., Aebischer, A., Meyer, T., F. 2000. Comparative proteome analysis of
Helicobacter pylori. Molecularm Microbiology. 36(3): 710-725.
Lee J, Godon C, Lagniel G, Spector D, Garin J, Labarre J, Toledano M. 1999Yap1
and Skn7 control two specialized oxidative stress response regulons in yeast.
J Biol Chem, 274:16040-16046.
Katagiri, F., Thilmony, R., He, S.Y. 2002. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas
syringae interaction. The Arabidopsis Book. 1-39.
Li, C., Brown, I., Mansfield, J., Stevens, C., Boureau, T., Romantschuck, M., Taira,
S. 2002. The Hrp pilus of Pseudomonas syringae elongates from its tip and
acts as a conduit for translocation of the effector protein HrpZ. EMBO Journal.
21(8): 1909-1915.
Mann, M., Jensen, O.N., 2003. Proteomic analysis of post-translation modifications.
Nature biotechnology review. 21: 255-261.
Madigan, T. Michael and Martinko John M. 1998. Brock. Biología de los
microorganismos. Ed. Prentice Hall. México. Primera edición. p. p. 149-167,
188-223, 305-353, 358-383.
Mercier, J., Lindow, S.E. 2000. Role of leaf surface sugars in colonization of plants
by bacterial epiphytes. Applied and Environmental Microbiology. 60(1): 369374.
66
Mo, T., Gross, C.D. 1991. Plant signal molecules activate the syrB gene, which is
required for syringomycin production by Pseudomonas syringae pv. syringae.
Journal of Bacteriology. 173(18): 5784-5792.
Mo, T., Geibel, M., Bonsall, R.F., Gross, C.D. 1995. analysis of sweet Cherry
(Prunus avium L) leaves for plant signal molecules that activate the syrB gene
required for synthesis of the phytotoxin, syringomycin, by Pseudomonas
syringae pv. syringae. Plant Physiology. 107: 603-612.
Missiakas, D., y S.Raina. 1998. the extracytoplasmic function sigma factors: role and
regulation. Molecular Microbiology. 28(6): 1059-1066.
Münchbach M, Dainese P, Staudenmann W, Narberhaus F, James P. 1999.
Proteome analysis of heat shock expression in Bradyrhizobium japonicum.
Eur. J. Biochem. 263: 39-48.
O’Farrell, P.,H. (1975). High resolution two dimensional electrophoresis of proteins.
J. Biol.. Chem. 250: 4007-4021.
Palmer, D. A., y C. L. Bender. 1993. Effect of environmental and nutritional factors
on production
of the poliketide phytotoxin coronatine by Pseudomonas
syringae pv. glycinea. Applied and Environmental Microbiology. 59(5):16191626.
Pandey, A. y Mann, M. 2000. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405:
837-846.
Park, M., Lee, E., Kim, Y., Jung, T., Shin, Y., Shin, G., Cha, H., Kim, G. 2003.
Journal of Veterinary Science. 4(2): 143-149.
67
Pitarch A, Pardo M, JimÈnez A, Pia J, Gil C, S·nchez M, Nombela C. 1999 Twodimensional gel electrophoresis as analytical tool foridentifying Candida
albicans immunogenic proteins.Electrophoresis, 20:1001-1010.
Patterson, S.D., Aebersold, R. 2003. Proteomics: the first decade and beyond.
Nature genetics supplement. 33: 311-323.
Preston, G., Deng, W., Huang, H., Collmer, A. 1998. Negative regulation of hrp
genes in Pseudomonas syringae. by HrpV. Journal of Bacteriology. 180(17):
4532-4537.
Preston, G.M. 2000. Pseudomonas syringae pv. tomato: the right pathogen, of the
right plant, at the right time. Molecular Plant Pathology. 1(5): 263-275.
Pugsley, A.P. 1993. The complete general secretory pathway in Gram negative
bacteria. 57(1): 50-108.
Rabilloud, T. 2000. Proteome Research: Two dimensional Gel Electrophoresis and
identification Methods. Ed. Springer. Germany. 1st. Edition. p.p. 2-3.
Ritter, C., Dangl, J.L. 1995. The avrRpm1 gene of Pseudomonas syringae pv.
maculicola is required for virulence on Arabidopsis. Molecular Plant-Microbe
Interactions. 8(3): 44-453.
Sarkar, F.S., Guttman, D.S. 2004. Evolution of the Core Genome of Pseudomonas
syringae,
a
Highly
Clonal,
Endemic
Plant
Pathogen.
Applied
and
Environmental Microbiology. 70(4): 1999-2012.
Sauer, K., Camper, A., K., Ehrlich, G., D., Costerton, W., J., Davies, D., G. 2002.
Pseudomonas aeruginosa displays multiples phenotypes during development
as a biofilm. Journal of Bacteriology. 184(4): 1140-1154.
68
Silver, S., A.M. Chakrabarty, B. Iglewsky, y S. Kaplan. 1990. Pseudomonas:
biotransformations, patogenesis and envolving biotechnology. American
Society for Microbiology, Washington, D.C.
Strauss, E.J., Falkow, S. 1997. microbial pathogenesis: Genomics and Beyond.
Science. 276: 707-711.
Valenzuela, S., J.H. 2003. Elaboración del mapa físico de restricción del cromosoma
de Pseudomonas syringae pv. maculicola M2, con PacI, PmeI y SwaI. Tesis
de Ingeniero Biotecnologo. Instituto Tecnológico de Sonora, Cd. Obregón,
Sonora, México. pp. 73.
Vasseur C, Labadie J, HÈbraud M. 1999. Differential protein expression by
Pseudomonas fragi submitted to various stresses. Electrophoresis. 20:22042213.
Van Bogelen R, Schiller E, Thomas J, Neidhardt F. 1999. Diagnosis of cellular states
of microbial organisms using proteomics. Electrophoresis, 20:2149-2159.
Van Dijk, K., Fouts, D.E., Rehm, A.H, Hill, A.R., Collmer, A., Alfano, J.R. 1999. The
Avr (Effector) proteins HrmA (HopPsyA) and AvrPto are secreted in culture
from Pseudomonas syringae pathovars via the Hrp (Type III) protein secretion
system in a temperature- and pH-sensitive manner. Journal of Bacteriology.
181(16): 4790-4797.
Van Dijk, K., Tam, V.C., Records, A.R., Petnicki, O.T. Alfano, J.R. 2002. the ShcA
protein is a molecular chaperone that assists in the secretion of the HopPsyA
effector system of Pseudomonas syringae. Molecular Microbiology. 44(6):
1469-1481.
69
Van Gijsegem, F., Gough, C., Zischek, C., Niqueux, E., Arlat, M., Genin, S.,
Barberis, P., German, S., Castello, P., Boucher, C. 1995. The hrp gene locus
of Pseudomonas solanacearum, which controls the production of a type III
secretion system, encodes eight proteins related to components of bacterial
flagellar biogenesis complex. Molecular Microbiology. 15(6): 1095-1114.
Vázquez, J., 2003. Presente y futuro de la proteomica. BioPress. 6.
Washburn, M., P. and Yates III, J.R. 2000. Analysis of the microbial proteome.
Current Opinion in Microbiology. 3: 292-297.
Wilkins, M.,R., Pasquall, C., Appel, R.,D., Ou, K., Golaz, O., Sanchez, J., Yan, J.,
Gooley, A.A., Hughes, G., Humphery-Smith,I., Williams, K.L., Hochstrasser,
D.F. 1996. Biotechnology. 14: 61-65.
Willis, D.K., Rich, J.J., Hrabak, E.M. 1991. hrp genes of phytopathogenic bacteria.
Molecular Plant-Microbe Interactions. 4(2): 132-138.
Wolfgang, M., J.P.M. Putten, S.F.Hayes, D. Dorward, y M. Koomey. 2000.
Componens and dynamics of fiber formation define a ubiquitous biogenesis
pathway for bacterial pili. European Molecular biology Organization.
19(23):6408-6418.
Wren, B.W. 2000. Microbial genome analysis: insights into virulence, host adaptation
and evolution. Nature Reviews. 1: 30-39.
70