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Detección de los Patógenos I
METODOS DE ANALISIS
M.Cs. Mercedes Iriarte P.
CASA – UMSS
Enumeración de Microorganismos
• Medidas cuantitativas
• Cualitativo (presence/absence)
• Para Bacteria: CFU=Unidad Formadora de Colonia
• Para Viruses: PFU =Unidad Formadora de placa
• Para Parásitos (y algunas bacterias) conteo celular
usando microscopia
• MPN : Número Más Probable (método estadístico
para estimar las concentraciones con múltiples
ensayos en diluciones para la extinción [0])
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Medida del crecimiento microbiano
• Métodos indirectos
– Actividad metabólica
– Peso seco
– Turbiedad
Cultivo/Métodos estandar para la detección de
patógenos en el medio ambiente
• Virus
– Concentración/separación
– Cultivo celular (una linea celular, no detecta todas)
– Identificacion por PCR
• Bacteria
–
–
–
–
Concentración/separación
Medio de enriquecimiento
Medio selectivo
Test Bioquímico, serologia, immunoquímica
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BACTERIAS EN UNA PLACA EN AGAR
COLONIAS FORMANDO UNIDADES UFC
Bacterias necesitan incubación para formar UFC
en 24 a 48 horas
Salmonella, E. coli, Staphylococcus
aureus, Streptococos faecalis
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Métodos basados en el crecimiento:
Organismos
indicadores fecales para medida de la calidad del agua
Filtración de
100 ml de
muestra de
agua
E.coli en agar y
colonias por FM
Total coliforms
En agar y colonias
por FM
Coliformes fecales
Coliformes
totales
En agar y colonias
por FM
E.coli
NMP
NMP
Número Mas Probable
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INDICADORES CLASICOS DE CONTAMINACION
Relación entre coliformes totales, termotolerantes y E. coli
Escherichia coli
cccc
Coliformes
termotolerantes
Coliformes totales
Métodos de coliformes Totales
Método de filtración por membrana (FM) - Un total de 100 ml
de muestra en uno o más filtros; por ejemplo, 1 filtro con
100 ml ó 4 filtros con 25 ml cada uno.
Método de fermentación en tubos múltiples (FTM) o del
número más probable (NMP) - 10 tubos con 10 ml cada uno
ó 5 tubos con 20 ml cada uno.
Método de presencia-ausencia (PA) - 100 ml en 1 botella.
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VENTAJAS DEL MÉTODO DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA
Proporciona recuentos directos.
Es más preciso (se obtienen resultados más
reproducibles) que la prueba de TM o NMP.
Rápido y fácil de realizar.
Analiza mayores volúmenes de muestras con
bajas concentraciones de organismos.
DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE
FILTRACIÓN POR MEMBRANA
Interfieren los altos niveles de turbiedad.
Los coliformes debilitados pueden sobrevivir
mejor en la prueba de TM o NMP.
Las altas concentraciones de no coliformes
interfieren en el recuento.
Efecto del tipo de filtro de membrana.
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Métodos rápidos: Colilert (Ausencia/Presencia)
• Su formulación es específica para crecimiento de coliformes y
E. coli en agua dulce o tratada. Está basada en la tecnología de
substrato definido (DST).
• Enzima ß-galactosidasa. Bacteria coliforme metabolizará al
ONPG formando una coloración amarilla.
• E. coli - enzima ß-glucoronidasa. Si está presente en la
muestra, metabolizará al MUG, produciendo fluorescencia.
Conteo directo al microscopio
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CRECIMIENTO DE VIRUS EN CULTIVO CELULAR
CELULAS no infectadas y células en tejido de mono
infectadas
Crecimiento puede tomar varias semanas para algunos virus
FAGOS (colifagos)
Siembra en placa en agar
Microfotografía electrónica
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INFECCION DEL VIRUS
UNIDAD FORMADORA
DE PLACA PFU
CULTIVO CELULAR,
CON AGAR DE RECUBRIMIENTO
TEÑIDO PARA MOSTRAR
DONDE HAY LISIS CELULAR
Metodos para la Detección de
Patógenos
• Protozoarios
• Concentración o elución
• Purificación
• Centrifugación diferencial
• Separación Inmuno Magnetica
• Tinción con anticuerpos monoclonales
• Observación bajo la luz UV
• Observación de características
• Forma y tamaño
• Estructuras internas
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Volumen (típico) de muestra de agua
• Bacterias indicadoras y patogénicas
• 100 to 1000 ml
• Viruses
• Aguas negras 1-5 litros
• Residual tratada 40 litros
• Agua superficial 400 litros
• Aguas subterraneas y de bebida 400 a
2000 litros
• Protozoarios
• Residual tratada 4 liters
• Agua superficial 10 a 100 litros
• Agua de consumo 10 a 100 litros
Concentración de viruses del agua
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Elución de los virus, reconcentracion, filtracion de
bacterias, tratamiento con antibióticos, listo para
qPCR o cultivo celular
1.5% beef
extract
(pH9.5)
Viral particles
were eluted
from 1MDS
filter using
1.5% beef
extract (pH 9.5)
1M
DS
filte
r
Dr, Xagoraraki, MSU
Peristaltic
pump
Cartri
dge
housin
g
sistema de
ultrafiltración de bajo
costo con filtros de
fibra porosa
desechables
Filtrate/waste
Ultrafilter
(MWCO
30kDa)
Feed
Retentate
Sample/retentate
reservoir
-
De exclusión por
tamaño
-
Amplia gama de
virus se puede
recuperar en una
única muestra de
agua
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Muestreo
de aerosol
• Impingers
• Impact- Anderson
Aerosol
• Filters
• High volume fluid
samplers
• Electrostatic
participators
• Settling plates
• Efficacy affected by
• Collection media
• Relative humidity
• Desiccation
Tipos de Fómites
Acrílico
Cerámica
Vidrio
Acero Inox
Laminado
Algodón
Poliéster
Dinero
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Muestreo de Fómites
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Graphic
representation
Cryptosporidium
y Giardia
del agua of the primary
concentration step
A: Sample
B: Filter inlet
C: Filter
outlet
D: Peristaltic
pump
E: Flow meter
F: To waste
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Giardia y Cryptosporidium
- EPA 1623 (EPA 2005), kit Dynabeads GC-Combo de Dynal Biotech, tinción IFA
(Cryptosporidium/Giardia de Merifluor)
concentración
-
Separación inmunomagnética
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Separación Inmunomagnética de
Cryptosporidium parvum oocysts
oocysts
IMS beads
captured
oocysts
Perlas: superparamagnético,
recubierto con una cubierta de
polímero delgada (contenido de
hierro: 20%)
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Observación al microscopio de epifluorescencia
Quistes de Giardia sp.
Conteo al microscopio de quistes de
parásitos Giardia y ooquistes de
Cryptosporidium.
Ooquistes de Cryptosporidium sp.
Microscopio de fluorescencia.
Estados medioambientales
Las estructuras son marcadas con
anticuerpos específicos con
marcadores fluorescentes
Huevos de helmintos
• Método modificado en el Centro de Aguas y
Saneamiento Ambiental bajo la versión del
Estándar Métodos de México (Secretaria de
Comercio y Fomento Industrial 1999).
- Comprende: Procesos de coagulación,
sedimentación, flotación, decantación y técnica
bifásica (para recuperar los huevos y realizar el conteo).
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Procedimiento:
- sedimentación (8 hrs. o una noche)
- Eliminación del sobrenadante
- Centrifugación
- Lavados sucesivos
- Lavado a través de tamices de
diferentes tamaños
• Homogenización del
concentrado
• ZnSO4.7 H2O (etapa
bifásica)
• Limpieza de la muestra
• Lavado a través de un
tamiz de 160 µ
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• Lavados sucesivos a través
de tamices
ayuda con una brocha
suave.
- Viabilidad: incubación de la
muestra tratada por 15 dias a
25°C
Observación al microscopio
•
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