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TÍTULO: Presentación didáctica de evaluaciones genotóxicas.
TITLE: Didactic presentation of genotoxic evaluation.
Autores: Daniel Francisco Arencibia Arrebola1*, Luis Alfredo Rosario
Fernández2**, Janet Morffi Figueroa3**, Yulieé López Feria4*.
1Doctor en Medicina Veterinaria y Zootecnia, 2Licenciado en Microbiología,
3Licenciado en Microbiología, MsC, 4Doctor en Medicina Veterinaria.
Centro de Trabajo:
*Instituto Finlay, Vicepresidencia de Investigaciones, Calle 17 e/ 198 y 200, Atabey,
Municipio Playa, Apartado Postal 16017, Ciudad de La Habana, Cuba.
**Instituto de Farmacia y Alimentos (IFAL, U.H), calle 222 e/ 25 y 27, La Coronela,
Municipio Lisa, Ciudad de La Habana, Cuba.
Correspondencia a: Daniel Francisco Arencibia Arrebola, [email protected].
Teléfono: 057072716911.
Resumen.
En nuestros días se le ha dado gran importancia a las evaluaciones genotóxicas
gracias a su vinculación natural de predecir importantes fuentes de agentes
carcinogénicos potenciales, por lo cual el conocimiento de esta materia es
fundamental para la introducción de nuevos fármacos, insecticidas, suplementos
alimenticios, vacunas, adyuvantes y otros productos. Que en la evaluación
farmacotóxica de los productos se cumplan todos los requisitos establecidos es el
objetivo fundamental de la mayoría de las autoridades regulatorias. El objetivo de
este trabajo es realizar una actualización sobre los ensayos de genotoxicidad en las
evaluaciones de nuestros productos de forma didáctica, tomando está forma de
presentación como medio de enseñanza. Tuvimos en cuenta la actualización sobre
toxicología genética, batería de ensayos genotóxicos, el objetivo fundamental de
cada ensayo y otras consideraciones.
Palabras claves: Genotoxicidad, toxicología genética, batería de ensayos
genotóxicos, presentación didáctica.
Abstract.
In our days the genotoxic evaluations has been given great importance thanks to their
natural linking of predicting important sources of carcinogenic potentials agents,
reason why the knowledge of this matter is fundamental for the introduction of new
drugs, insecticides, nutritious supplements, vaccine, adjuvants and others products.
That in the pharmacotoxic evaluation of the products all the established requirements
are completed it is the fundamental objective of most regulatory authorities. The aim
of this work is to carry out a current on the genotoxicity assays in the evaluations of
our products in a didactic form, taking these presentation form as means of teaching.
We kept in mind about the current of genetic toxicology, battery of genotoxic assays,
the fundamental objective of each assays and other considerations.
Key words: Genotoxicity, genetic toxicology, battery of genotoxic assays,
didactic presentation.
Toxicología Genética : Es la ciencia encargada de identificar y
analizar los agentes con toxicidad sobre el ADN. Estudia los llamados
tóxicos genéticos o genotoxinas.
Genotoxinas: Son agentes físicos o compuestos químicos que dañan
la molécula de ADN.
La importancia de las genotoxinas radica en que ejercen su acción a
concentraciones subletales y que las lesiones que provocan en el material
genético se pueden transformar en cambios hereditarios.
Agente genotóxico: Cualquier agente capaz de dañar el ADN.
Mutágeno: Agente genotóxico que induce la aparición de mutaciones.
G2
Período premitótico
S
Período de síntesis
de ADN
M
Período de división
celular (Mitosis)
1. Profase
2. Metafase
3. Anafase
4. Telofase
G1
Período postmitótico
CICLO CELULAR
Mutaciones
Inducidas
Espontáneas
Ocurren en presencia de un
Surgen en ausencia
Agente mutagénico
agente mutagénico
Causas
Quimioterapia
Dieta
Exposición
Causas
Tautomería ceto-enol
Procesos oxidativos
Procesos alquilantes
Errores en la replicación
Mutaciones
Células
Células
Germinales
Somáticas
Transmitida a la descendencia y
quedar incorporada al acervo
génico de la población.
Afectan sólo al soma del individuo
Mueren con el individuo
Dañan en el sentido físico
Mutaciones
Microlesiones
Sustituciones de
pares de bases
Cambio del
marco de
lectura
(Frameshift)
Macrolesiones
Daño cromosómico
Numérico
Estructural
ƒPérdida
•Deleciones
ƒGanancia
•Rupturas
Tanto las micro como las macrolesiones son inducidas por diferentes
mecanismos resultan de gran importancia para la toxicología genética y
pueden ser detectados utilizando técnicas específicas
Rayos Ultravioletas (U.V)
Agentes
Radionizantes (α, β y ∂)
físicos
Rayos X
- Agentes análogos
de Bases
Mutágenos
Agentes desaminantes
Compuestos
- Agentes modificadores Agentes alquilantes
de Bases
químicos
- Agentes intercalantes
Agentes hidroxilantes
- Agentes que bloquean el
apareamiento entre bases
Métodos de Evaluación Genotoxicológicos
Tienen como fín medir de forma directa o indirecta la actividad
mutagénica, estos se realizan tanto in vivo como in vitro y deberán
ser capaces de identificar el daño al ADN y su fijación.
Factores a tener en cuenta para la selección de
los ensayos apropiados
9 Tipo de daño genético.
9 Capacidad metabólica del sistema de ensayo.
9 Uso propuesto para el agente.
9 Exposición y distribución en el organismo.
9 Valor predictivo del ensayo en términos de mutagenicidad y
carcinogenicidad.
9 Requerimientos legislativos.
Batería de Ensayos Genotóxicos
1. Daño directamente al ADN.
Segmento (I). Daño en la
estructura primaria del ADN.
-Ensayo cometa in vivo en ratones
-Ensayo cometa in vitro (distintas variantes)
-SOS Chromotest (E. coli PQ 37)
1. Mutaciones puntuales
en células procariotas
Segmento (II). Daño a los
genes.
-Ensayo de Ames (S. typhimurium)
-Ensayo en Escherichia coli uvr
-SOS Chromotest (E. coli PQ 37)
2. Estudio in vitro para detectar
efectos cromosomales en células
de mamíferos. Segmento (III).
Daño a los cromosomas.
-Ensayo de Micronúcleos
-Ensayo en la Línea celular CHO
-Ensayo en Linfocitos de sangre
periférica humana
3. Estudio in vivo para detectar efectos
cromosomales en células
hematopoyéticas y otras de roedores.
Segmento (IV). Daño a los cromosomas.
4. Otras alteraciones. Segmento (V).
Daño a la célula.
-A.C en médula ósea
-A.C en espermatogonias
-Micronúcleos en eritrocitos de
médula ósea
-Morfología de la cabeza del
espermatozoides en rata y ratón
Ensayos más utilizados para medir el daño existente o no
de una sustancia a evaluar por nivel de daño:
- Segmento 1: Ensayo cometa in vitro en su variante alcalina.
- Segmento 2: Ensayo de Ames y de SOS Chromotest.
- Segmento 3: Ensayo de aberraciones cromosómicas en linfocitos
de sangre periférica humana.
- Segmento 4: Ensayo de Micronúcleos en eritrocitos de médula
ósea de ratón.
- Segmento 5:
Ensayo de la Morfología de la cabeza del
espermatozoides en ratón.
En los estudios in vitro es necesario realizar la evaluación con Fracción
Microsomal Hepática (S9).
Todas las sustancias genotóxicas no son activas por si mismas. Algunas deben ser convertidas en
intermediarios reactivos capaces de interactuar con los sitios nucleofílicos de los constituyentes
celulares y otras macromoléculas, valiéndose para ello de reacciones de activación, catalizadas por
sistemas enzimáticos celulares.
Genotóxicos indirectos:
Los compuestos genotóxicos indirectos por el metabolismo de
organismos susceptibles, pueden no ser activados en aquellos sistemas biológicos que carezcan de
las enzimas necesarias para convertirlos en sus formas genotóxicas. Las enzimas que intervienen
en el metabolismo de estas sustancias los activan e inactivan por mecanismos de toxificación o
detoxificación respectivamente.
Genotóxicos directos:
Sustancias genotóxicas que poseen propiedades intrínsecas
necesarias para interactuar con blancos celulares críticos e iniciar procesos genotóxicos.
Los ensayos genotóxicos in vitro carecen de un sistema de activación metabólica como lo
constituye el hígado en los organismos superiores. Con el objetivo de mimetizar la función
metabolizadora de este órgano, en los ensayos in vitro se utiliza una fracción microsomal hepática
(S9), la cual contiene enzimas de fase I fundamentalmente, que permite predecir el posible
comportamiento del compuesto a evaluar a su paso por la vía hepática.
La fracción microsomal S9 se obtiene del hígado de rata especialmente las líneas de ratas SpragueDawley y Wistar, ya que estas son de fácil manipulación, obtención y este órgano presenta un buen
tamaño.
En la preparación de la mezcla de activación metabólica se utilizan como cofactores el NADP y la
glucosa-6-fosfato, sustrato de la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, además se adicionan
otros cofactores como: riboflavina, NAD y el ATP, ya que estos aumentan la actividad mutagénica de
algunos compuestos.
Objetivo de cada ensayo
1. Ensayo cometa in vitro en su variante alcalina:
En general el principio básico del ensayo, es la migración del ADN en una matriz de agarosa bajo
condiciones de electroforesis. Luego, al ser observada la célula al microscopio (por fluorescencia
o por tinción con plata del material nuclear), presenta la apariencia de un cometa, con una cabeza
(región nuclear) y cola (formada por fragmentos nucleares que han migrado en dirección del
ánodo) por lo que este ensayo es también conocido como ensayo Cometa, debido al patrón de
migración del ADN que se produce en las células dañadas.
2. Ensayo de Ames:
Método en el cual se utilizan cepas de Salmonella typhimurium manipuladas genéticamente,
capaces de detectar compuestos que causan mutaciones génicas por corrimiento del marco de
lectura (frameshift) o por sustitución de pares de bases en el ADN.
Diferentes cepas de S. typhimurium auxotróficas a histidina son expuestas a una muestra con y sin
activación metabólica y plaqueadas en agar medio mínimo con histidina/biotina. Dada la
composición del medio de cultivo, se forman colonias con las células prototróficas a histidina (his),
procedentes de mutaciones espontáneas u originadas de mutaciones provocadas por la muestra
problema. Se utilizan ambas variantes con y sin S9, para ello debe conocer a la hora de utilizar una
sustancia control positivo cual debe utilizar con esta mezcla y cual no, según el tipo de mutágeno.
3. Ensayo de SOS Chromotest:
Sistema de emergencia celular que consiste en la inducción de más de 20 genes no ligados
(regulón) que están bajo el control del circuito RecA/LecA permitiendo la sobrevivencia celular
ante la detención de la replicación del ADN que ha sido dañado por agentes genotóxicos. Permite
evaluar radioprotección, genotoxicidad, antigenotoxicidad y estrés oxidativo.
El circuito RecA/LecA regula y modula importantes funciones celulares tales como:
-Reparación del ADN, recombinación homóloga y síntesis post-lesión.
-Formación del septo celular y división celular (sfiA).
-Inducción del fago lambda (recA).
¿Qué factor desencadena la respuesta SOS?
ADNsc generado por cualquier agente que dañe el cromosoma bacteriano.
4. Ensayo de aberraciones cromosómicas en linfocitos de sangre
periférica humana:
Este ensayo tiene por objetivo detectar agentes que provocan aberraciones cromosómicas
estructurales en células de mamífero en cultivo.
Estos cambios corresponden a roturas y reordenaciones dentro de un cromosoma o entre
cromosomas diferentes. Estas reorganizaciones son producidas sobre todo por aquellas
sustancias que rompen directamente la cadena de ADN (radiaciones ionizantes) o que distorsionan
la doble hélice de ADN (agentes intercalantes).
Las aberraciones cromosómicas pueden ser de dos tipos atendiendo al momento del ciclo celular
en el que tenga lugar la exposición: aberraciones de tipo cromatídico (afectan a una sola cromátida
del cromosoma) y aberraciones de tipo cromosómico (afectan a ambas cromátidas del
cromosoma). Igualmente en este estudio debe tener en cuenta el tipo de control positivo para cada
tipo de tratamiento a utilizar (agudo o crónico).
5. Ensayo de Micronúcleos en eritrocitos de médula ósea de ratón:
Es una prueba in vivo ampliamente validada que permite detectar agentes que causan tanto
rupturas cromosómicas y cromatídicas como pérdidas de cromosomas completos, al afectar el
huso mitótico.
Los micronúcleos son fragmentos de cromosomas acéntricos o completos que espontáneamente
o por causa de determinados agentes que ocasionan lesiones citogenéticas, dan lugar a la
formación de micronúcleos con fragmentos de cromosomas o cromosomas enteros retardados
durante la anafase.
Se emplea para detectar lesiones provocadas por la sustancia de ensayo en los cromosomas o el
aparato mitótico de eritroblastos mediante el análisis de eritrocitos tomados de la médula ósea de
ratones. Debe de tenerse en cuenta y conocerse el índice espontáneo en la especie animal a
utilizar
6. Ensayo de la Morfología de la cabeza del espermatozoides de
ratón:
Esta herramienta permite evaluar cambios en la concentración espermática, así como el aumento
de la frecuencia espontánea de cabezas de espermatozoides morfológicamente anormales ya que
es capaz de detectar el daño irreversible que queda fijado por un período de tiempo relativamente
largo.
Entre los sistemas que se emplean para evaluar los daños ocurridos en las células germinales se
encuentra el ensayo basado en los criterios morfológicos de Wyrobek y Bruce, lo cual permite el
estudio y la clasificación de la cabeza del espermatozoides al incluir dentro de las clasificaciones,
cabezas normales, anormales y dentro de este último los que tienen morfología en forma de
banana, los amorfos, sin gancho y con dos colas. Conocer la duración del ciclo espermático de
cada especie.
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Micronúcleos de médula ósea de ratón
Metafases en el estudio de aberraciones
Cromosómicas (10X)
Metafases en el estudio de aberraciones
Cromosómicas (100X)
Esquema de niveles de daños en el
Ensayo cometa
Esquema de la morfología de la
cabeza del espermatozoide
Observación de las colonias revertantes de Salmonella
typhimurium en el ensayo de Ames