Evaluacin de actividad metanognica en lodos anaerbicos industriales

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOTECNOLOGICAS
UNIVERSIDAD DE SAN MARTIN
BIOTECNOLOGIA DE
MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
ALGUNAS REGLAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN
LABORATORIOS QUÍMICOS
Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas
destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos
propios derivados de la actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro
de su ámbito de trabajo, como hacia el exterior.
Las reglas básicas aquí indicadas son un conjunto de prácticas de sentido común
realizadas en forma rutinaria.
El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la información que permita
reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Será fundamental la
realización meticulosa de cada técnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo
excelente puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja.
1- Se deberá conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de
trabajo, tales como: matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignífugas,
lavaojos, gabinete para contener derrames, accionamiento de alarmas, etc.
2- No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos, máquinas u
otros elementos que entorpezcan la correcta circulación.
3- No comer, beber, fumar o maquillarse dentro de los laboratorios.
4- No se deberán guardar alimentos en el laboratorio, ni en las heladeras que
contengan drogas.
5- Se deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y
cabello recogido (guardapolvo preferentemente de algodón y de mangas largas,
zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes).
6- Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable
directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.
7- Las manos deben lavarse cuidadosamente después de cualquier manipulación
de laboratorio y antes de retirarse del mismo.
8- Se deberán utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias
química o material biológico. Toda persona cuyos guantes se encuentren
contaminados no deberá tocar objetos, ni superficies, tales como: teléfono,
lapiceras, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc.
9- No pipetear con la boca.
10- No correr en los laboratorios.
11- Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o
impactos se utilizarán anteojos de seguridad, viseras o pantallas faciales u otros
dispositivos de protección. Cuando se manipulen productos químicos que emitan
vapores o puedan provocar proyecciones, se evitará el uso de lentes de
contacto.
12- Todo material corrosivo, tóxico, inflamable, oxidante, radiactivo, explosivo o
nocivo deberá estar adecuadamente etiquetado.
13- Se requerirá el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de
producción de aerosoles (mezcla de partículas en medio líquido) o polvos,
durante operaciones de pesada de sustancias tóxicas o biopatógenas, apertura
de recipientes con cultivos después de agitación, etc.
14- Las prácticas que produzcan gases, vapores, humos o partículas, aquellas que
pueden ser riesgosas por inhalación deben llevarse a cabo bajo campana.
15- Se deberá verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una
fuente de ignición. No se operará con materiales inflamables o solventes sobre
llama directa o cerca de las mismas. Para calentamiento, sólo se utilizarán
resistencias eléctricas o planchas calefactoras blindadas. Se prestará especial
atención al punto de inflamación y de autoignición del producto.
16- El material de vidrio roto no se depositará con los residuos comunes. Será
conveniente ubicarlo en cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas
plásticas. El que sea necesario reparar se entregará limpio al taller.
17- Está prohibido descartar líquidos inflamables o tóxicos o corrosivos o material
biológico por los desagües de las piletas, sanitarios o recientes comunes para
residuos. En cada caso se deberán seguir los procedimientos establecidos para
la gestión de residuos. Consultar al Servicio de Higiene y Seguridad (Interno
275).
18- El IIB cuenta con un botiquín de primeros auxilios con los elementos
indispensables para atender casos de emergencia.
Procedimientos ante emergencias:
Emergencias médicas
Si ocurre una emergencia tal como: cortes o abrasiones, quemaduras o ingestión
accidental de algún producto químico, tóxico o peligroso:
Comunicarlo al docente a cargo, a cualquier investigador del IIB o al personal de
secretaría (Interno 325).
A los accidentados se les proveerán los primeros auxilios.
El docente notificará el accidente al Servicio de Higiene y Seguridad y a la oficina de
Personal para su evaluación e informe, donde se determinarán las causas y se
elaborarán las propuestas para modificar dichas causas y evitar futuras repeticiones.
Si la emergencia es menor y el involucrado puede trasladarse, los Centros para requerir
ayuda médica son:
x S.A.M.E. Teléfono 107
x Hospital Pirovano Av. Monroe 3555 Tel. 4542-5552 / 9279
INTOXICACIONES:
x Hospital de Niños. Dr. R. Gutiérrez, Sánchez de Bustamante 1399. Capital
Federal. Tel: 4962-6666.
x Hospital de Niños. Dr. P. de Elizalde, Av. Montes de Oca 40 Tel. 4307-7491
Toxicología 4300-2115
QUEMADURAS:
x Hospital de Quemados, P.Goyena 369 Tel. 4923-4082 / 3022
OFTALMOLOGÍA
x Hospital Santa Lucía, San Juan 2021 Tel. 4941-7077
x Hospital Dr. P. Lagleyze, Av. Juan B. Justo 4151 Tel. 4581-0645 / 2792
Incendio:
1. Mantenga la calma. Lo más importante es ponerse a salvo y dar aviso a los
demás.
2. Si hay alarma, acciónela. Si no, grite para alertar al resto.
3. Se dará aviso inmediatamente al personal de secretaría int. 325 informando el
lugar y las características del siniestro.
4. Si el fuego es pequeño y sabe utilizar un extintor, úselo. Si el fuego es de
consideración, no se arriesgue y manteniendo la calma ponga en marcha el plan
de evacuación.
5. Si debe evacuar el sector apague los equipos eléctricos y cierre las llaves de gas
y ventanas.
6. Evacue la zona por la ruta asignada.
7. No corra, camine rápido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas.
Descienda siempre que sea posible.
8. No lleve consigo objetos (carpetas y apuntes, mochilas, carteras, etc.), pueden
entorpecer su salida.
9. Si pudo salir por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos
especializados se encarguen.
Si bien no se espera que usted tenga que usarlos, los teléfonos útiles son:
x BOMBEROS Teléfono 100
x EMERGENCIAS Teléfono 911
Derrame de productos químicos
1.
Atender a cualquier persona que pueda haber sido afectada.
2.
Notificar a las personas que se encuentren en las áreas cercanas acerca del
derrame.
3.
Evacuar a toda persona no esencial del área del derrame.
4.
Desparrame sobre el derrame las piedritas absorbentes colocadas en los
laboratorios para tal fin.
5.
Si el derrame es de material inflamable, apagar las fuentes de ignición, y las
fuentes de calor.
6.
Evite respirar los vapores del material derramado, si es necesario utilizar una
máscara respiratoria con filtros apropiados al tipo de derrame.
7.
Ventilar la zona.
10.
Deje actuar y luego recoger con pala y colocar el residuo en una bolsa y
cerrarla.
11.
El docente indicará cómo descartar la bolsa con los residuos.
12.
Si el derrame es de algún elemento muy volátil deje dentro de la campana
hasta que lo retire para su disposición.
13.
Lave el área del derrame con agua y jabón. Seque bien.
14.
Cuidadosamente retire y limpie todos los elementos que puedan haber sido
salpicados por el derrame.
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Programa Análítico de Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
1- Introducción
1.1- Biotecnología. Definiciones. Hitos en el desarrollo biotecnológico. Disciplinas y
campos de actividad. Tecnologías concurrentes y vinculación con disciplinas
básicas.
1.2- Impacto económico (mercados, productos, perspectivas de desarrollo). Estado
actual en el mundo, la región y el país. Prioridades en Biotecnología.
1.3- Desarrollo de productos biotecnológicos, conceptos. Relaciones de la
biotecnología con la industria alimentaria y de la salud.
2- Biotecnología Microbiana. Bioreactores
2.1- Desarrollo de cepas. Aislamiento y selección de microorganismos. Metabolitos
de interés. Hibridación, fusión de protoplastos. Mutación y selección de
mutantes. Mutantes auxótrofos y regulatorios. Canalización de flujos
metabólicos. Recombinación. Regulación y superproducción de metabolitos.
2.2- Introducción a las técnicas de ingeniería genética. Uso de técnicas de ingeniería
genética. Identificación de genes, clonado, transformación, y expresión en
microorganismos.
2.3- Procesos de fermentación. Generalidades de las fermentaciones confinadas.
Condiciones ambientales para el crecimiento microbiano. Formulación de
medios de cultivo industriales. Esterilización. Condiciones técnico-económicas.
Operaciones unitarias. Fermentación al estado sólido.
2.4- Bioreactores. Tipos de bioreactores y su comportamiento. Aireación y agitación.
Cambio/salto de escala, parámetros útiles. Biosensores: sistemas miniaturizados,
bioluminiscencia, electrodos enzimáticos, sondas de ADN, inmunoensayos.
Separación y purificación de
productos biotecnológicos. Productos
extracelulares. Cosecha y ruptura de células. Procesamiento aguas abajo.
2.5- Cinética de las fermentaciones. Conceptos de crecimiento microbiano. Curvas de
crecimiento. Velocidad específica de crecimiento. Cinética de formación de
producto y utilización de sustrato. Productividad y rendimiento. Ecuación de
Monod. Métodos de producción: Batch, Fed-Batch y cultivo continuo.
Ecuaciones de balance de masa.
3- Síntesis y producción de productos comerciales
3.1- Biomasa microbiana como fuente de proteína. Microorganismos involucrados.
Metabolismo. Materias primas. Utilización de compuestos xenobióticos.
Proteína unicelular. Aspectos nutricionales. Perspectivas de futuro.
3.2- Aminoácidos y ácidos orgánicos. Introducción. Producción. Ejemplos y
aplicaciones de aminoácidos: ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, triptofano.
Corvnebacterias y E. Coli. Ejemplos y aplicaciones de ácidos orgánicos: ácido
cítrico, ácido acético. Perspectivas de futuro. Otros productos orgánicos: acetona,
butanol, glicerol.
3.3- Biopolímeros. Biopolímeros producidos por microorganismos. Estructura.
Procesos fermentativos. Polisacáridos..., dextranos, alginatos, pululanos, otros
polisacáridos. Otros polímeros microbianos. Perspectivas de futuro.
2
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
3.4-
Vitaminas, aditivos. Ácido ascórbico, vitamina B12, -caroteno. Saborizante y
resaltadores del sabor (MSG, 5’ nucleótidos). Antioxidantes naturales (glutatión).
Edulcorantes. Colorantes. Antimicrobianos para uso en alimentos.
3.5- Productos de interés farmacológico I: Antibióticos. Metabolismo primario y
secundario. Cinética de formación de productos. Tipos de antibióticos y
mecanismos de acción. Regulación de la biosíntesis y su impacto en las
tecnologías de producción. Biosíntesis de antibióticos en Streptomyces y
Aspergillus. Clonado de genes que dirigen la síntesis de antibióticos. Nuevos
antibióticos.
3.6- Productos de interés farmacológico II: Producción de medicamentos.
Introducción. Aislamiento de cDNAs. Interferón y hormona de crecimiento
humanos. Optimización de la expresión génica. Anticuerpos. Vacunas por
ingeniería genética (distintos tipos). Agentes terapéuticos. Diseño racional de
drogas. Perspectivas de futuro.
4- Procesos Fermentativos
4.1- Productos lácteos. Bacterias del ácido láctico, taxonomía. Descripción de
productos lácteos fermentados. Ingeniería genética de las bacterias del ácido
láctico. Sistemas metabólicos, metabolismo de azúcares y del citrato, sistema
proteolíticos y metabolismo lipídico. Bacteriófagos, estrategias genéticas para la
producción de cepas insensibles. Bacteriocinas. Modificaciones genéticas de las
bacterias del ácido láctico.
4.2- Las levaduras en la industria panadera y enológica. Cepas y su obtención.
Levaduras industriales y levaduras de laboratorio. Estabilidad. Materias primas.
Procesos. Subproductos. Fermentación aeróbica y anaeróbica. Osmotolerancia.
Tolerancia a etanol y ácidos orgánicos. Resistencia al estrés. El fenómeno killer.
Bebidas destiladas. Producción de etanol combustible. Perspectivas de futuro.
4.3- Las levaduras en la industria de la cerveza. Cepas. Proceso. Modificaciones.
Malteado y macerado. Utilización de carbohidratos. Mejora en la eficiencia de la
fermentación. Floculación. Tolerancia a etanol. Producción de diacetilo.
Eliminación y producción de aromas. Uso de levaduras no convencionales en
Biotecnología; ejemplos, aplicaciones.
4.4- Productos cárnicos, vegetales y de origen marino fermentados. Control
microbiológico de alimentos. Descripción. Cultivos starter. Mejora. Detección
de patógenos en alimentos. Sondas de DNA, PCR y métodos inmunológicos para
detectar microorganismos patógenos y toxinas. Detección de Listeria,
Clostridium, Salmonella, etc. en muestras de aguas y alimentos. Uso de sondas
de DNA para detectar productos adulterados.
5- Tecnología enzimática. Bioconversiones
5.1- Enzimas en inmovilización de enzimas. Características relevantes de las
enzimas. Relación estructura-función. Producción y estabilización de enzimas
inmovilizadas. Importancia económica. Uso de proteasas, -glucanasas,
amilasas, celulasas y hemicelulasas, pectinasas, fitasa y glucosa-isomerasa en la
industria agro-alimentaria. Mercados. Perspectivas de futuro.
5.2- Biocatalizadores. Ejemplos, nomenclatura. Procesos, tasa de conversión, tiempo
de residencia. Cinética de los reactores enzimáticos.
3
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
5.3-
5.4-
Aplicaciones de biotransformaciones. Reacciones catalizadas por hidrolasa y
oxidoreductasas. Ejemplos. Resolución de mezclas racémicas con lipasas
inmovilizadas. Biotransformaciones para preparar fármacos quirales, resolución
de racematos. Introducción de nuevos centros quirales en las moléculas.
Biotransformaciones de interés en la industria alimentaria. Industria láctea
(quesos, leches maternizadas). Industria de la panadería (biotransformaciones del
almidón). Industria aceitera (lipasas). Aplicaciones de células enteras.
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Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Bibliografía básica de Biotecnología
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Biotechnology & Bioengineering
Biotechnology Progress
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Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
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Trends in Biotechnology
Trends in Food Science & Technology. Elsevier Science Publ. Ltd. NY USA.
Journal of Agricultural and Food Chemistry
Journal of Food Science
Journal of Pharmaceutical Science
Journal of th Science fo Food and Agricultural
Nature Biotechnology
Algunas de estas publicaciones pueden ser consultadas en la biblioteca del INTI.
6
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
CRONOGRAMA
Clases Teóricas: Miércoles de 14 a 16.30; Viernes de 13 a 15
Trabajos Prácticos: Miércoles de 8.30 a 13
Fecha
25 de marzo
1 de abril
8 de abril
14 de abril
21 de abril
28 de abril
6 de mayo
13 de mayo
TP
Actividades
Problemas
1. Selección de Microorg.
2. Biomasa
3. Fermentación Alcohólica
Entrega ejercicio 1
Entrega Informe TP1
Entrega Informe TP 2
4. Prod. de ácido cítrico
Entrega
5. Inmovilización de
Entrega
20 de mayo
levaduras
27 de mayo 6. Fermentador
Entrega
10 de Junio
Entrega
17 de Junio
Parcial
Informe TP 3
Informe TP 4
Informe TP 5
Informe TP 6
Docentes:
Dr. Miguel Galvagno
Marcela Brocco
Silvina Rosa
Pablo Níkel
Gastón París
Virginia Tribulatti
Valentina Cattaneo
Juan Burdiso
Federico
Mariana Hernández
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Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
PREPARACIÓN DE INFORMES
¿Por qué preparar informes?
El proceso de descubrimiento científico depende de una correcta y eficiente
comunicación entre los actores involucrados, es decir los investigadores. Este flujo de
información ocurre en su mayor parte mediante los periódicos científicos (journals) y
forma parte integral del proceso que mencionamos anteriormente. Es por ello muy
importante aprender las reglas y costumbres que se utilizan en la comunicación escrita
entre científicos. La elaboración de informes es una etapa importante en el aprendizaje
de la comunicación escrita que ocurre no sólo en la ciencia básica, sino también en la
ciencia aplicada donde es habitual la elaboración de informes dentro de las compañías o
como resultado de análisis.
Por tanto, no sólo el contenido de los informes, sino también la claridad,
gramática, ortografía como así también la estructura, el formato y la presentación del
texto serán evaluados en cada informe.
A continuación se detallan algunas normas que sirven como referencia para
escribir informes. Esta lista no pretende ser extensiva sino sólo una guía de ayuda.
Estructura de un informe
Cuando hablamos de estructura podemos mencionar dos conceptos diferentes, la
estructura formal, que consta de las secciones en que se divide el informe y la estructura
lógica que es la manera en que organizaremos la presentación de los datos siguiendo una
secuencia lógica. La primera es relativamente fácil conocerla y no tenemos más que
seguir las instrucciones para autores que nos brindan todos los periódicos científicos. La
segunda es más difícil, es donde no existen reglas específicas sino más bien generales:
como claridad, precisión lógica y orden. Allí es donde más esfuerzo y trabajo debemos
invertir para que el informe sea legible. Puesto que por más que sigamos las reglas de la
estructura formal pero sin contenido, el informe es absolutamente irrelevante.
A continuación y a modo de instrucciones para autores se describe la estructura
formal que debe contener al informe a presentar.
A. El informe se debe presentar en forma claramente legible, con información muy
precisa y ordenada, utilizando tercera persona (en algunas ocasiones se puede utilizar
la primera persona del plural). No debe extenderse en temas irrelevantes. Tendrá un
mínimo de 2 páginas y un máximo 4 páginas. Todas las páginas deben estar
numeradas.
B. El informe (que constará de gráficos y/o figuras) tiene que ser editado con un
procesador de texto, corregido (la mayoría de los procesadores tiene corrector
ortográfico, ¡úselo!) e impreso con calidad y tamaño de letra aceptable. Es decir usar
letra de 10 a 12 puntos.
C. El informe debe contener las siguientes partes:
1- Encabezamiento: Este incluye el título del T. Práctico y nombre del alumno,
asi como el año y nombre de la materia.
8
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
2- Introducción: Debe contestar la siguiente pregunta: ¿cuál es el tema?
Consiste en una explicación del trabajo a realizar y una presentación de los principales
antecedentes bibliográficos. La intención de escribir la introducción es situar el tema en
perspectiva y permitir la comprensión de los resultados y discusión que se escriben a
continuación. Es fundamental comprender que no debe incluir temas no relacionados
con el objetivo del trabajo, para facilitar la compresión de los resultados y la discusión.
Debe incluir citas bibliográficas y debe indicarse el fundamento del/los método(s)
empleado(s) ¿Qué se mide? ¿Cómo se mide?. La extensión debe ser alrededor de una
página.
3- Objetivo: Corresponde la definición de las metas y logros a alcanzar en el
proyecto, especificando el marco del tema y las consideraciones ó simplificaciones a
realizar.
4- Metodología: Debe indicarse los distintos tipos de materiales y
procedimientos experimentales utilizados. Esta sección constituye una enumeración de
los pasos del procedimiento o un esquema del mismo.
5- Resultados: Se deben presentar los resultados resumidos. Por un lado, se
exponen los datos experimentales (cuadros, tablas, etc.) y se realiza un breve
comentario, si fuera necesario, de las observaciones cualitativas de los ensayos
realizados. La segunda parte se conforma con los cálculos de resultados (reglas de tres
explicitadas). En caso de instrumentos controlados por computadora inserte las imágenes
o datos en el informe.
Los resultados deberán estar indicados con las unidades correspondientes y el
correcto número de cifras significativas. Cuando se crea conveniente, indicar los
principales errores y confiabilidad de los resultados reportados.
Tablas: es la forma más habitual de presentar los datos, permite describir datos
paralelos en forma concisa. La tabla no debe estar sobrecargadas de líneas y debe estar
contenida en una página. Lo óptimo es presentar los datos es en forma de columnas. Se
debe incluir las unidades utilizadas en la medición, el lugar más habitual es a
continuación del título de la columna de datos, entre paréntesis. Todos los datos de la
tabla deben estar completos, en caso de carecer del dato correspondiente se debe incluir
el texto NR (no realizado) o NA (no aplicable) o ND (no detectado). Al pie de tabla se
debe aclarar el significado de esta abreviatura. La tabla debe tener un titulo acorde asi
como un número de acuerdo al orden de aparición en el informe. Este número sirve para
hacer referencia en el texto. Al pie de tabla se debe incluir una leyenda conteniendo las
abreviaturas utilizadas, así como una corta referencia metodológica que permita
comprender la misma.
Gráficos: Existen, básicamente, tres tipos de gráficos: de línea, de barra y tortas;
los últimos no son utilizados con frecuencia en la literatura de bioquímica y biología
molecular. En tanto que los dos primeros son muy comunes. El gráfico de línea es
utlizado para presentar una línea de tendencia, o cambio de estado, en función de una
9
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
variable continua. También se lo utiliza para mostrar la dependencia entre dos variables.
Debe incluir un título y un número de gráfico que permita referirlo cuando se escribe.
Siempre debe incluir los títulos de los ejes, asi como las unidades de medición a
continuación del mismo, entre paréntesis. Incluir los errores de los datos mediante barras
asociadas a cada punto. La leyenda debe incluirse en el texto al pie de la figura, así como
una breve referencia metodológica que permita su interpretación. Los gráficos de barras
se utilizan para mostrar datos groseros o cambios de estado en función de variables
discontínuas, las reglas son las mismas que para el gráfico de líneas.
Decidir la forma de presentación de los datos, barras, lineas o tablas, es parte del
trabajo de elaboración de un informe. Para elegir entre las tres formas hay que utilizar
criterios de claridad y lógica.
6- Discusión: Consiste en un análisis crítico del trabajo realizado, incluyendo un
análisis de los errores cometidos durante la experiencia. Comparar los valores de las
variables de operación, coeficientes, rendimientos, etc., con los antecedentes obtenidos
de la literatura. También se pueden incluir recomendaciones o sugerencias para futuras
experiencias. Se suelen incluir referencias bibliográfias que situan los resultados en el
contexto del conocimiento actual. Es muy importante aprender a distinguir cuando se
menciona un resultado, dato objetivo obtenido por mediciones o cálculos, y la discusión
correspondiente, elaboración personal que brinda una interpretación del resultado. Esta
diferencia debe estar reflejada en la secciones resultados y discusión.
7- Conclusiones: En esta sección se presentan en forma resumida las diversas
deducciones que se originan del trabajo realizado, respaldadas por los resultados
obtenidos y en concordancia con los objetivos planteados. Lo óptimo es enumerar las
distintas conclusiones mediante una lista de puntos o ítems.
8- Bibliografía: Las referencias a la bibliografía se anotan en el texto del
informe con un número entre paréntesis, el que corresponde al orden indicado en la
sección de bibliografía.Las referencias bibliográficas son de dos tipos: las de revistas
científicas y las de libros.
Revistas: autores (año) titulo del artículo. Journal, volumen, páginas. Ejemplo:
Tugendreich, S., Bassett, D.E.,Jr, McKusick, V.A., Boguski, M.S. and Hieter,P. (1994)
Genes conserved in yeast and humans. Hum. Mol. Genet., 3, 1509-1517.
Libros: autores (año) título del capítulo editor, título del libro. nombre y
dirección de la editorial, volumen, páginas. Ejemplos:
Gehring, W. (1994) A history of the homeobox. In Duboule, D. (ed.), Guidebook to the
Homeobox Genes. Oxford University Press, Oxford, UK, pp. 1-10.
Lewin, B. (1994) Genes V. Oxford University Press, Oxford, UK.
10
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
La producción de un texto científico
En un texto científico, buscamos información, no belleza literaria por lo que los datos
tienen que ser claramente expuestos. Sin embargo, es importante que haya un hilo
conductor a lo largo de todo el texto para poder contar una historia. Pese a tratarse de
textos científicos, el texto tiene que ser entendido por personas que no manejan el tema.
Además, quiénes leen los textos no son necesariamente expertos en el tema pero sí
necesitan comprender lo que queremos comunicarle.
He aquí una lista de los principales ítems a tener en cuenta al momento de producir un
texto científico (informes, papers, exámenes, etc.).
Optar por la voz activa. Es más directa y vigorosa, además las oraciones en voz
activa son más breves que las escritas en voz pasiva.
Para compensar la concentración de sales en el agua, los sulfatos fueron
adicionados 24 h después del tratamiento.
Para compensar la concentración de sales en el agua,
sulfatos 24 h después del tratamiento.
adicionamos los
En este experimento, las ratas fueron entrenadas para evitar la descarga de
corriente. La descarga de corriente fue asociada con estímulos diversos (por los
animales).
En este experimento, las ratas fueron entrenadas para evitar la descarga de
corriente. Los animales asociaron la descarga de corriente con estímulos diversos.
Sin embargo, la voz pasiva tiene su lugar y es adecuado usarla cuando corresponde:
ƒ Cuando se sobrentiende quién es el sujeto a partir del contexto:
Para este experimento, las ratas fueron entrenadas para evita la descarga de corriente.
[El contexto deja claro que los investigadores entrenaron a las ratas.]
ƒ Cuando el sujeto es desconocido:
La galaxia fue mencionada por primera vez en la antigüedad.
[No sabemos quién mencionó la galaxia.]
ƒ Cuando el sujeto es menos importante que la acción:
El paciente fue llevado rápidamente al hospital por la policía.
ƒ
Cuando mencionar al sujeto puede resultar inconveniente, peligroso o
inapropiado.
Su contrato no ha sido renovado
[Podría no ser apropiado decirle quién no le renovó el contrato.]
11
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Limitar el uso del verbo ser. Cuando un texto abunda en este verbo resulta
débil. Las oraciones que no lo incluyen genera un texto más directo y preciso.
Este mecanismo es un factor importante para el entendimiento de las infecciones
citomegalovirales en el cerebro.
Este mecanismo explica cómo el citomegalovirus infecta el cerebro.
EPO es el principal factor de crecimiento para el crecimiento, proliferación
diferenciación y supervivencia de los precursores de glóbulos rojos.
El factor de crecimiento EPO permite que los precursores de glóbulos rojos
crezcan, proliferen, se desarrollen y sobrevivan.
La amígdala es la principal estructura del sistema límbico y funciona en la
regulación de la memoria emocional.
La amígdala, la principal estructura del sistema límbico, regula la memoria
emocional.
Evitar el uso de sustantivos derivados de verbos, tales como los terminados en
–ión (regulación, formación), -miento (funcionamiento, requerimiento), -encia
(dependencia, resistencia). En su lugar, usar los verbos correspondientes para
obtener una escritura más clara y precisa.
Este estudio es el resultado de la investigación de estos fenómenos usando
movimientos pasivos.
Investigamos estos fenómenos usando movimientos pasivos.
Concluimos que el interferón gamma produce la activación microglial y podría
tener un papel significativo en los cambios en la plasticidad sináptica relacionados con la
edad.
Concluimos que el interferón gamma activa la microglía y...
Comenzar las oraciones con la información conocida. Finalizarlas con lo
novedoso, con la información que los lectores no podrían anticipar.
Estos factores derivados del órgano blanco contribuirían a la formación de árboles
de neuronas pontinas complejos en la corteza cerebelar.
En la corteza cerebelar, estos factores derivados del órgano blanco
contribuirían...
La idea de reemplazar las neuronas colinérgicas dañadas en la enfermedad de
Alzheimer con terapia de neuroreemplazo con células madre es atractiva.
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Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
En pacientes con enfermedad de Alzheimer, la terapia con células madre
permitiría reemplazar las neuronas colinérgicas dañadas.
Evitar las frases con demasiados sustantivos y adjetivos seguidos, confunde y
hace que el texto sea aburrido. El lector se pierde antes de llegar al verbo que le
dará la idea de lo que se quiere expresar.
La disfunción cognitiva post-operativa es común en pacientes ancianos y ha sido
atribuida a la anestesia general.
Frecuentemente, pacientes ancianos sometidos a anestesia general
experimentan disfunción cognitiva.
Una activación talámica ipsilateral significativa fue observada con la estimulación
dolorosa en estudios previos de PET.
Los estímulos dolorosos activan el tálamo ipsilateralmente en forma
significativa.
13
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
LIDIANDO CON EL SAA EN SCIENCE
William D. Romey. East Orleans, MA USA.
Science (1999) 293: 1067
Por más de treinta años, he leído regularmente la revista Science y finalmente he
decidido protestar contra el síndrome de abuso de abreviaturas (SAA). Como la mayoría
de mis ocupados colegas, dispongo de poco tiempo para leer artículos por lo que tengo
un sistema de lectura acelerada que consiste en una mirada rápida (MR) inicial al
artículo en el siguiente orden: título, resumen, primer párrafo (PP), títulos destacados en
negritas (TDN), figuras y leyendas (FL) y el último párrafo (UP), con algunos vistazos
al cuerpo del artículo (CA) para ver si hay algo que me llame la atención. Si esta lectura
rápida atenta (HRA) me indica que puede haber algo de interés, leo el trabajo más en
detalle.
Días atrás, leía un artículo y un TDN me llamó la atención: “El LGS y la deglaciación”.
No recordé inmediatamente qué significaba LGS y tuve que leer el resumen para
decodificar la abreviatura. Líneas más abajo, leí sobre concentraciones Cl- y NO3- en el
LGM. Es esperable que -si estoy leyendo Science, sin importar mi área- recuerde los
símbolos de los elementos de la tabla periódica (TP). Sin embargo en el CA, me topé
con la DCR, el YD y el GISP. El artículo era de un área de la geología, muy relacionada
con mi propio trabajo, sin embargo me sentí muy molesto pues el SAA me había
forzado a salirme de mi habitual HRA y a leer varios párrafos en busca de los
significados de estas abreviaturas. De igual manera, las FL me llevaron al texto para
decodificarlas.
Preguntándome si el SAA era un problema particular de AG, miré artículos de otras
áreas. Allí también el SAA impidió que llevara a cabo mi HRA. Aunque se habla mucho
por estos días de la literatura científica (LC), el problema del SAA parece ser aceptado,
aceptando textos de aquellos especialistas que continúan expresándose con sus colegas
mediante códigos oscuros...
Moraleja:
No incluir abreviaturas en títulos y resúmenes.
Usar solo las necesarias y aclararlas en el texto la primera vez que aparecen.
Si el texto excede las 2-3 carillas, incluir una lista de las abreviaturas al pie de la
primera carilla.
14
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
PREPARANDO UN RESUMEN
Existe cada vez más bibliografía disponible, con lo cual no es posible leer todos los
artículos de una disciplina particular, y por supuesto, es imposible escuchar todas las
conferencias de un congreso multitudinario. Por eso, usamos los resúmenes para
decidirnos acerca de cuál artículo leer o cuál conferencia escuchar. La búsqueda
bibliográfica se ha facilitado desde la aparición de PubMed y de los libros de resúmenes
de los congresos, por ello la confección de los resúmenes es de crucial importancia. El
resumen es la unidad básica de comunicación. Se usa como carta de presentación para
la mayoría de las actividades: manuscritos, pedidos de subsidios, congresos, tesis,
informes, etc.
¿Por qué es esencial que los resúmenes sean fáciles de entender? Porque eso incrementa
las posibilidades de ser leídos (o que alguien escuche la conferencia de uno). En unas
cuantas oraciones, los resúmenes deben indicar explícitamente el objetivo del
trabajo, cómo se hicieron los experimentos, los resultados más importantes y su
importancia. Un título específico e informativo también resulta un incentivo para el
potencial lector y/o oyente. El resumen es para el éxito de un manuscrito desde el
momento que es enviado a la revista. Muchas veces, la primera impresión que causa el
resumen en el editor le sirve para tomar la decisión de enviarlo a revisión o no. De
manera similar, un revisor puede decidir revisarlo o no, dependiendo del resumen. Este
tipo de impresiones no siempre son correctas, pero un resumen mal escrito, usualmente,
es indicativo de un artículo deficiente. Por otro lado, un muy buen artículo puede pasar
desapercibido, si el resumen no está bien escrito.
A continuación, una guía para la escritura de un resumen:
¾ Usar un título específico e informativo pero que sea llamativo.
¾ Informar solo uno o dos resultados por resumen.
¾ Usar oraciones en voz activa y limitar el uso del verbo estar.
¾ Evitar detalles innecesarios en materiales y métodos y resultados.
¾ Limitar el uso de la estadística.
¾ Evitar el uso de abreviaturas (excepto para los términos comunes).
¾ Excluir las referencias.
¾ Respetar el límite del número de palabras (usualmente 200-300).
¾ Pedirle a alguien que trabaje fuera del tema que lea el borrador.
15
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Problemas
1. ¿Cuál será el % p/v de una solución que presenta 45 g de triptona disueltos en
240 ml de solución?
2. ¿Cuántos gramos de solución al 15 % p/p de glucosa se necesita para extraer 39 g
de glucosa?
3. ¿Cuántos gramos de agua deberán usarse para disolver 150 g de NaCl para
producir una solución al 20% p/p?
4. ¿Cuántos ml de acetona se debe agregar a 250 ml de agua para que la solución
resulte al 10 % v/v?
5. ¿Cuántos gramos de Ca(NO3)2 están contenidos en 75 ml de solución al 25 %
p/v?
6. ¿Cuántos ml de acetona se debe agregar a 300 ml de agua para que la solución
resulte al 5 % v/v?
7. ¿Cuántos ml de metanol se debe agregar a 250 ml de agua para que la solución
resulte al 15 % v/v?
8. Calcular el % p/p de una solución que contiene 7,5 g de NaNO3 en 150 g de
agua.
9. ¿Cuál es la cantidad de Na2HPO4 necesaria para preparar 130 ml de solución al 3
% p/v.
10. Un frasco de laboratorio tiene escrito un rótulo con 10,0 M NaOH. (PM 40)
¿Cuántos gramos de NaOH hay contenidos en 0.2 l de solución?
11. ¿Cuál es la molaridad de una solución que se prepara disolviendo 18.56g de
KOH (PM 56) en 100 ml de solución?
12. ¿Cuál es la molaridad de una solución preparada por solución de 20 g de
Na2CO3 (PM 106) en cantidad suficiente de agua para hacer 600 ml de solución?
13. Se prepara una solución disolviendo 15 g de Al(OH)3 en agua suficiente para
completar 300 ml de solución. ¿Cuál es la molaridad de la solución?
16
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
14. Tenemos una solución de HCl (PM 36) 0.70 N. Para una determinada reacción
necesitamos 0.0525 moles de HCl. ¿Qué volumen de la solución debemos
tomar?
15. ¿Cuál es la molaridad de una solución que contiene 25 g de K2CrO4 (PM 194)
disueltos en cantidad de agua suficiente para tener 300 ml de solución?
16. Se mezclan 25 ml de propanol con 55 ml de CCl4. calcular el % v/v.
17. Se disponen de 0.05 l de etanol. Calcular el volumen de solución al 30 % v/v que
podría preparar.
18. Se disuelven 7 g de CuSO4 en 53 g de agua. Calcular la concentración en % p/p
19. Se disuelven 45 g de NaNO3 en 300 ml de agua, obteniéndose 321 ml de
solución. ¿Cuál es la concentración en % p/p y % p/v?
20. ¿Cuántos gramos de NaNO3 son necesarios para preparar 50 ml de una solución
al 7 %p/v?
21. ¿Cuántos gramos de BaCl2 son necesarios para preparar 125 g de solución al 12
% p/p?
22. ¿Cuántos gramos de una sal deberá disolverse en 315 g de agua para darnos una
solución al 25 % p/p?
23. El etanol es esterilizante en soluciones al 70 % v/v. Teniendo en cuenta que el
alcohol común se comercializa al 95 %, calcule cuanta agua deberá agregar a 0,5
l de alcohol para obtener la solución esterilizante.
24. Un ácido sulfúrico concentrado tiene una densidad de 1.81g/cc y una riqueza del
91.6% en masa de ácido puro. Calcule el volumen de esta solución concentrada
que se debe tomar para preparar 500 cc de solución de ácido 0.5M.
25. Un ácido sulfúrico concentrado tiene una densidad de 1.81g/cc y una riqueza del
91.6% en masa de ácido puro. Calcule el volumen de esta solución concentrada
que se debe tomar para preparar 500 cc de solución de ácido 0.5M.
26. ¿Qué volumen (ml) de una solución de etanol (C2H6O) que tiene 94% de pureza
en masa, contiene 0.2 moles de etanol? La densidad de la solución es 0.807 g/ml
27. ¿Cuántos gramos de sosa (NaOH) húmeda se necesitan pesar para preparar 250
ml de una solución 1.5M? (La sosa contiene 10% en masa de agua).
17
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
28. Se quiere preparar un volumen de 8L de una solución de KNO3 al 20% en masa
y una densidad de 1.1326 g/ml a 20°C. ¿Qué volumen de agua (densidad del
agua para este problema: 1 g/ml) y qué masa de nitrato de potasio se debe
mezclar?
29. Calcule el volumen de H2SO4 que se necesita para preparar 300 ml de una
solución 0.75N. Considere que el H2SO4 tiene una densidad de 1.4 g/ml y 80%
de pureza.
30. Se tomaron 5 ml de H2SO4 cuya densidad es de 1.8 g/ml y 90% de pureza, y se
aforaron hasta un volumen final de 500 ml, calcule la concentración de la
solución en % m/m, molaridad y normalidad.
31. Para preparar la solución A se pesa 1 g de NaOH y se afora hasta un volumen
final de 20 ml.
Para preparar la solución B se toman 10 ml de la solución A y se llevan a un
volumen final de 25 ml.
Para preparar la solución C se toman 10 ml de la solución B y se llevan a un
volumen final de 25 ml.
Calcule la concentración de las soluciones A, B y C.
32. En el laboratorio se prepara una solución (a la que llamaremos solución A)
pesando 5 g de cromato de potasio y agregándole agua hasta llegar a 1 l de
solución. De esta solución A, se toma una alícuota de 100 ml y se coloca en un
matraz aforado de 250 ml, agregándole agua hasta la marca de aforo (solución
B). Finalmente, de la solución B se toma una alícuota de 25 ml y se coloca en un
vaso de precipitado.
a) ¿Cuál es la concentración molar de la solución A?
b) ¿Cuál es la concentración normal de la solución B?
c) ¿Cuál es la concentración en porcentaje en peso de la solución A?
d) ¿Cuántos moles de cromato de potasio hay en la solución A, en la solución B y
en el vaso de precipitado donde se colocó la alícuota final?
e) ¿Cuál es la concentración molar de la solución que se encuentra en el vaso de
precipitado que contiene la alícuota final?
33. Se desean preparar 3 l de una solución de un suero que contiene glucosa en
concentración 2.5 M. Explique cómo debe prepararse esta solución.
34. Seleccione la opción en que se encuentren indicados correctamente los valores de
concentración de soluciones de H2SO4 de diferentes concentraciones:
a) 5M < 5 N < 5%
b) 5 M 5 N 5%
c) 5% 5 M 5 N
d) 5% < 5 M 5 N
e) Ninguna de las anteriores
Justifique
18
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
35. La concentración molar de una sustancia puede ser:
a) Mayor a su concentración normal
b) Igual a su concentración normal
c) Mayor o igual a su concentración normal
d) Menor que su concentración normal
e) Ninguna de las anteriores
Justifique
36. ¿Qué concentración final tiene una solución de permanganato de potasio que se
prepara diluyendo 1 ml de solución 0.1M a un volumen final de 1l? Si de la
solución anterior si se toma una alícuota de 10 ml y se afora con agua a 100 ml.
¿Qué concentración obtendrás?
37. ¿Cuál es el volumen de agua destilada que debe agregarse a 50 ml de ácido
fosfórico (H3PO4 PM 98) 0.1M, para que la concentración final de la nueva
solución sea 0.1N?
38. Se desea preparar una solución 0.2 M de NaOH, pero sólo se tienen dos matraces
aforados de 50 ml, una pipeta graduada de 10 ml, 2 g de NaOH previamente
pesado. No se cuenta con una balanza para pesar una menor cantidad de NaOH.
Diga cómo preparar la solución 0.1 M de NaOH en las condiciones anteriores.
39. Las diluciones 10:100; 2,5:25,0; 50:500 son:
a) Todas de la misma molaridad
b) Todas diluciones 1:10
c) Todas de la misma estequiometría
Justifique.
40. La soda (Na2CO3) se vende en dos formas: como sal anhidra Na2CO3 y como sal
decahidratada. Considerando que el constituyente activo es el Na2CO3, ¿cuál
forma resulta más barata al consumidor, la sal anhidra a 20 centavos por kilo o la
sal decahidratada a 10 centavos por kilo?
41. De acuerdo a la fórmula indicada, calcule las cantidades necesarias para preparar
las siguientes soluciones, teniendo en cuenta las soluciones madre que se
enumeran.
a.
b.
c.
d.
e.
f.
1 l de medio ABC
50 ml de buffer borato
100 ml de medio XYZ
20 ml de buffer MOPS
500 ml de medio IIB agar
15 ml de solución UNSAM
19
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Medio ABC
triptona
extracto de levadura
NaCl
PO43Agua c.s.p.
5g
10 g
80 g
1 mM
1l
Buffer borato
borato de sodio
ácido bórico
NaCl
50 mM
75 mM
145 mM
2,5 g
1,5 g
0.15 M
100 ml
4,3 % p/v
25 μmoles
50 ml
Medio XYZ
Compuesto X
Compuesto Y
Compuesto Z
Agua c.s.p.
100 μM
0,75 g
500 ml
Buffer MOPS
MOPS
Na2HPO4
NaCl
agua c.s.p.
Medio IIB agar
IIB
Agar
Agua c.s.p.
3g
1,5 g
250 ml
Solución UNSAM
UN
SAM
Etanol 95 % c.s.p.
Soluciones stock
NaCl (PM 58)
Na2HPO4 (PM 119)
Borato de sodio
Ácido bórico
Compuesto X
Compuesto Y (PM 200)
MOPS
IIB
SAM
Etanol absoluto
1,38 M
1M
0,5 M
0,5 M
50x
20 % p/v
10 % p/v
30 %v/v
2,5 M
20
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
TRABAJO PRACTICO Nº 1
Aislamiento y selección de microorganismos
Objetivo
Seleccionar microrganismos por sus características metabólicas.
Introducción
Los microorganismos, como los seres vivos, pueden modificar su entorno y
utilizar los compuestos presentes en él, como fuente de carbono y energía para su
crecimiento y reproducción. En todas estas actividades celulares intervienen enzimas
que actúan en forma aislada o secuencial. Se puede determinar la dotación enzimática de
un tipo de microorganismo dado, determinando la aparición de los productos finales de
una reacción enzimática o bien la desaparición del sustrato del medio. A su vez, es
posible identificarlo, diferenciándolo de otras especies relacionadas.
Se denomina METABOLISMO al conjunto de reacciones químicas que tienen
lugar en la célula viva. Participan numerosos sistemas enzimáticos y abarca tanto
reacciones de degradación de nutrientes, o CATABOLISMO, como de síntesis, o
ANABOLISMO. Los intermediarios que se forman en estas reacciones reciben el
nombre de metabolitos y la secuencia de reacciones en sí vía o ruta metabólica.
Dado que los microorganismos permiten reemplazar procesos químicos o
mejorar bioprocesos ya existentes, se hace necesario seleccionar y mejorar las cepas de
interés. En la siguiente tabla se señalan algunos criterios a tener en cuenta al momento
de seleccionar y mejorar cepas.
TABLA I: Criterios generales para la selección de microorganismos aplicables a
fines determinados
x El diseño del procedimiento de selección debe tener en cuenta tanto al tipo de
actividad requerido como las condiciones del proceso a escala comercial.
x La selección y el mejoramiento del agente biológico deben considerarse actividades
permanentes y en contínua evolución, ya que la competitividad del mercado así lo exige.
x Producción en cantidad elevada en tiempo relativamente corto y preferentemente en
cultivo sumergido (resistencia a estrés hidrodinámico).
x Alta velocidad de crecimiento a gran escala con máxima utilización de nutrientes.
x Producción constitutiva de enzimas, preferiblemente termofílicas y en forma
exocelular; resistencia a represión catabólica.
x Utilización de nutrientes de bajo costo y disponibles a gran escala.
x Los procesos de separación de células y/o productos deben ser sencillos y de bajo
costo.
x El agente biológico no debe ser patógeno ni estar relacionados filogenéticamente con
un patógeno.
x El agente biológico no debe producir compuestos indeseables (alergenos,
carcinógenos, antibióticos, ciertas enzimas, sustancias odoríferas o de fuerte sabor, etc.).
21
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
x El agente biológico debe ser genética y fisiológicamente estable y no susceptible a
virus.
Las metodologías de obtención y mejoramiento de cepas de microorganismos y
de líneas aplicables a fines biotecnológicos requieren su inserción en un proceso global
de optimización. Para ello se deben tener en cuenta las características generales de dicho
proceso y evaluar el agente biológico obtenido en la condición más aproximada posible
a la de utilizacion. Esto permitirá efectuar una estimación práctica de factibildad de
implementación que involucra aspectos técnicos, económicos y legales de muy diversa
índole. Si bien el investigador de laboratorio en general no interviene en todas estas
facetas, es de suma importancia que no pierda de vista el proceso global, ya que el éxito
del mismo dependerá de la integración e interacción de todas y cada una de las
disciplinas y etapas que lo componen. En la fig. 1 se muestran las más importantes
operaciones de obtención y mejoramiento de cepas aplicables a fines biotecnológicos.
22
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
DEFINIR PROPIEDADES DEL
AGENTE BIOLOGICO BUSCADO
Diseño y ejecución del
aislamiento selectivo
Mejoramiento del
procedimiento
Aislar positivos o
eliminar negativos
Selección secundaria
(propiedades adicionales)
Mutagénesis, manipulación
genética, selección adaptativa,
fusión de protoplastos
Cultivos positivos
Evaluación del catalizador
Controles: productos, cepas de referencia
Caracterización
Scale-up
Patentes
Estudios económicos
y legales
PRODUCCION
Figura 1: Diagrama de flujo de las operaciones más importantes de selección y mejoramiento de cepas
aplicables a fines industriales. La definición de las características deseables del biocatalizador está
generalmente fijada a priori por el proceso productivo.
23
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
PARTE PRÁCTICA
A continuación se detallan tres experiencias sencillas (pruebas metabólicas) que
permiten seleccionar microorganismos con determinadas características metabólicas, y
una vez obtenidas las cepas, podrán ser utilizadas posteriormente en procesos
biotecnológicos.
LOS ALUMNOS DEBERÁN TRAER:
* Anzas
* Granos de maíz, porotos, garbanzos, semillas, arroz, cebada, etc.
* Papeles de envoltorios de alimentos y medicamentos.
1. Selección de microorganismos amilolíticos
Se tomará en este caso como sustrato al ALMIDON, que es un polisacárido,
polímero de glucosa. Para que los microorganismos lo asimilen, debe ser
hidrolizado, y para ello deben contar en su metabolismo con las enzimas apropiadas,
denominadas AMILASAS. En ese caso se dice que el organismo posee poder
amilolítico.
™ Materiales y métodos:
Caja de Petri con agar almidón (almidón soluble 0,2 %)
Anzas estériles.
Solución de Lugol.
Muestra a analizar.
x
x
x
x
x
x
Se siembra a partir de las muestras una anzada para formar una colonia
gigante en la caja de Petri que contiene agar almidón.
Se incuba a 37qC y 28qC durante 48 horas.
Una vez visibles las colonias de microorganismos se agrega a la caja la
solución de lugol.
Si se produce un halo incoloro que rodea la colonia gigante, el cultivo es
amilolítico.
Cepas a ensayar: Bacillus subtilis y Bacillus megaterium.
Tratamiento de muestras: granos de maíz (u otro) partidos, salvado de trigo,
suspendidos en agua estéril y agitados a 28 ºC durante 1 h.
2. Selección de microorganismos proteolíticos
Las proteínas son moléculas demasiado grandes para penetrar en la célula
microbiana, ésta debe degradarlas para poder utilizarlas como elementos nutritivos.
El proceso de degradación de proteínas se denomina PROTEOLISIS y se lleva a
cabo mediante enzimas extracelulares segregadas por los microorganismos,
PROTEASAS. La capacidad de elaborar enzimas proteolíticas se limita a pocas
especies bacterianas.
La proteólisis puede ocurrir en dos etapas:
proteínas + H2O
polipéptidos
24
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
proteinasas
polipéptidos + H2O
aminoácidos
peptidasas
™ Materiales y métodos:
Tubos de ensayo con caldo carne - gelatina bacteriológica.
3g
Extracto de carne
Peptona (o triptona)
5g
150 g
Gelatina bacteriológica
Agua c.s.p.
1 l.
Agujas estériles.
Muestra a analizar.
x A partir de una muestra dada, se siembra por punción en un medio de gelatina
(caldo carne adicionado con 15% de gelatina bacteriológica).
x Se lo incuba a 37qC durante 24 a 48 horas.
x La gelatina funde a más de 20qC, por lo tanto, cuando se saque el tubo de la
estufa de 37qC deberá ser llevado a temperaturas de refrigeración.
x Si la gelatina permanece líquida, el cultivo es proteolítico (el sustrato fue
degradado).
x Cepas a ensayar: Bacillus cereus y Bacillus megaterium.
3. Selección de microorganismos celulolíticos
La metodología descripta a continuación es utilizada para establecer la
resistencia fúngica de papeles, en particular de aquellos que han sido sometidos a
tratamientos para evitar el deterioro causado por hongos. Este es el método aprobado por
la Asociación Técnica de la Industria de la Pulpa y el Papel (Technical Association of
the Pulp and Papers Industry -TAPPI).
Se usan las siguientes cepas de hongos para esta prueba: Aspergillus niger y
Aspergillus terreus. Otras especies pueden ser incluidas, pero deben ser aisladas de
papeles que hayan sido atacados por las mismas. Los stocks de hongos se mantienen en
un medio agar-dextrosa-papa. En tanto que el medio de cultivo para las pruebas es un
medio agar-sales minerales, en donde la única fuente de hidratos de carbono es la
celulosa del papel en análisis.
Medio agar-sales minerales
NH4NO3
K2HPO4
KCl
MgSO4˜7H20
Agar
Agua dest. c.s.p.
3,0 g
1,4 g
0,25 g
0,25 g
10,0 g
1l
25
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Procedimiento
Piezas de papel de 5 cm de lado se incuban en placas de Petri de 100 mm con
medio agar-sales minerales (una placa por cada cepa de prueba para cada muestra de
papel). Si el papel es grueso, es conveniente utilizar placas más grandes con mayor
cantidad de medio.
Las placas son inoculadas con una solución de esporas y micelios de cada uno de
los microorganismos.
La incubación se lleva a cabo durante 2 semanas a 28 °C, preferiblemente en
atmósfera húmeda.
La lectura de los resultados consiste en la examinación visual de las placas. Es
necesario examinar las placas varias veces durante la primera semana para controlar que
no se produzca el crecimiento de otros hongos.
Un papel se considera resistente al deterioro fúngico cuando no hay crecimiento
al cabo de dos semanas, en comparación con controles positivos. Si hay crecimiento
durante los primeros 7 días, se dice que el papel no tiene resistencia fúngica. Si al cabo
de una semana, no se observa desarrollo de hongos, se continúa la incubación por una
semana adicional. Durante esta segunda semana puede existir un desarrollo leve, en
cuyo caso, se considera que el papel es moderadamente resistente.
26
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
TRABAJO PRACTICO Nº2
Levaduras - Obtención de Biomasa
Objetivo
Valorar el desarrollo de biomasa trabajando con un cultivo de S. cerevisiae.
Introducción
Las levaduras son hongos unicelulares que intervienen en distintos procesos
productivos: elaboración de pan, vino, cerveza, bebidas destiladas; síntesis de proteínas
y vitaminas; son fuente de proteína microbiana y de vitaminas del grupo B; sus
subproductos se usan como resaltadores de sabores en alimentos, se utilizan para
producir pigmentos, etc. Algunas son agentes de deterioro (jugos de frutas, dulces,
encurtidos), pero no se los considera peligrosos para la salud del consumidor al ser
ingeridos.
Desde el punto de vista tecnológico, las levaduras tienen sus ventajas en relación
con otros microorganismos por la capacidad de asimilar gran variedad de sustratos,
velocidades de crecimiento altas y su biomasa es fácilmente separable.
Están difundidas ampliamente en frutos, granos, suelos, aire, etc. Inicialmente los
procesos fermentativos se realizaban con levaduras naturales, pero con la aparición de
un mercado cada vez más exigente en cuanto a la constancia de la calidad de los
productos, se fueron seleccionando cepas, por lo tanto es importante poder identificarlas.
Para ello se estudian las siguientes características:
1) Morfología de las células y de las colonias
Se observa la forma de las células: esférica, ovoide, cilíndrica o elipsoidales
(por ej: Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus).
Las colonias se identifican en medio sólido por su aspecto, borde, consistencia y
color (ver TP N 1). Además se estudia, en medio de malta líquido, la capacidad de
formar película (crecimiento superficial) y anillo (crecimiento por las paredes del
frasco).
2) Fisiología (bioquímica y metabolismo).
Se utilizan ciertas características del metabolismo de las levaduras para su clasificación:
por ejemplo fermentación de azúcares determinados (a concentraciones t 2% p/v en el
medio) con producción de ácido (viraje de un indicador en el medio de cultivo) y gas
(tubo de Durham). También se investiga la asimilación aeróbica de los mismos azúcares
( < 2% ).
3) Métodos actuales de clasificación: Además de las características mencionadas arriba
entre las técnicas de la biología molecular utilizadas para identificar levaduras podemos
citar: contenido de bases (G-C) del ADN, hibridización DNA-DNA, DNA-RNA,
patrones de isoenzimas, ultraestructura de la pared celular, etc.
4) Reproducción
Algunas especies de levaduras presentan reproducción asexual y sexual y se las
incluye dentro de la Clase Ascomycetes, otras tienen solamente reproducción asexual y
se las clasifica como Deuteromycetes u hongos imperfectos. Las levaduras que
presentan reproducción sexual forman ascos con ascosporas y el número (2-8) y forma
27
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
(esféricas, cilíndricas, como sombreros, etc) de las ascosporas son útiles para la
clasificación. Las levaduras imperfectas se llaman así porque solo se les conoce la
reproducción asexual por gemación (o por fisión como ocurre con
Schizosaccharomyces). Muchas formas levaduriformes (con reproducción asexual por
gemación) forman parte del ciclo de vida de hongos filamentosos de la Clase
Basidiomycetes.
Existen aproximadamente 33 géneros con más 350 especies reconocidas de
levaduras de Ascomycetes.
Ciclos de vida: (Figura 1) Si bien típicamente S. cerevisiae presenta alternancia
de generaciones haploides (n), producto de la meiosis y diploides (2n, producto de la
unión de núcleos (n) cada generación se propaga asexualmente por gemación).
Aunque las levaduras son predominantemente unicelulares, en algunas especies
(v.g. S.cerevisiae), se produce un seudomicelio (fase 2n) o un micelio invasivo (fase n) ,
como respuesta a alguna deficiencia nutricional. Además, la formación de seudomicelio
es una caracteristica diferencial entre especies.
Figura 1. Ciclo de vida de levaduras con reproducción por gemación y por fisión.
Las levaduras crecen mejor en medios a una temperatura óptima está entre 25 y
30°C (mesofílicas) y a un pH entre 4.5 - 5.5.
28
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Desde el punto de vista de su metabolismo las levaduras son microorganismos
heterótrofos (no fijan CO2)y quimiorganotrofos (la fuente de energía proviene de la
oxidación de compuestos químicos de naturaleza orgánica) como por ejemplo azúcares .
S. cerevisiae es capaz de utilizar monosacáridos como glucosa, manosa y fructosa;
disacáridos: sacarosa, maltosa (pero no lactosa) y no utiliza polisacáridos
eficientemente.
La degradación de los azúcares la hacen en forma anaeróbica (fermentación), o
aeróbica (respiración). Las ecuaciones globales correspondientes son:
En anaerobiosis:
a) vía glicólisis (EMP): más del 95% del metabolismo de la glucosa
2 C2 H5 OH + 2 CO2 + 2 NADH2
ATP/mol glucosa
C6 H12 O6
hexosa
etanol
b) vía de la pentosa-fosfato (o hexosa-fosfato):
1 Glucosa P
6 CO2 + 12 NADPH2
Ambos caminos ocurren en el citoplasma y ocurren aún en condiciones aeróbicas.
En aerobiosis:
C6 H12 O6 + 6 O2
6 CO2 + 6 H2O
36 ATP/mol glucosa
hexosa
Las reacciones aeróbicas se llevan a cabo por el ciclo de Krebs y se forma CO2,
H2O y NADH2. Este último (al igual que el proveniente de glucólisis) se oxida por la
cadena de transporte de electrones generando ATP. Ambos procesos ocurren en la
mitocondria (matriz y crestas respectivamente).
Ambos procesos, aeróbico y anaeróbico, no tienen el 100% de rendimiento, ya
que se forman productos secundarios (glicerina, aldehídos, ácidos orgánicos) a expensas
del azúcar.
Las levaduras pueden usar alternativamente una u otra ruta metabólica. Por
ejemplo, en la elaboración de cerveza y durante la panificación con S. cerevisiae, se
utiliza un proceso fermentativo (producción de etanol y CO2 ), en el cual no hay
aireación, pero para la generación de biomasa (levadura para panadería), resulta un
mayor rendimiento/ Sustrato utilizado (5 veces mayor) si se realiza con aporte de
oxígeno (Efecto Pasteur).
En el proceso de producción de biomasa de levadura el requerimiento de oxígeno
es alto como lo indica la siguiente ecuación de balance de masa (aproximado):
Levadura + CO2 + H2O
Sacarosa + NH4 + O2 + minerales
200 g
10 g 102 g 8 g
100 g 145 g 77 g
Propagación de la Levadura
De la ecuación anterior se puede ver que S. cerevisiae, además de una fuente de
azúcar fermentescible y O2, necesita de una fuente de nitrógeno en forma reducida
(generalmente NH3, NH4.OH, urea, sulfato de amonio u otra) y de determinados
minerales (PO4-3, SO4-2, K+, Mg+2), micronutrientes (Ca, Zn, Cu, Mo, Fe, Mn, etc.)
además de vitaminas del grupo B. En general los medios de propagación industrial,
29
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
generalmente melaza de caña o de remolacha, representan una buena fuente de azúcares
utilizables, micronutrientes y de varias vitaminas pero son deficientes en N, P y Mg
como para satisfacer los requerimientos para producir biomasa de levadura (basándose
en la composición elemental de la misma)
Para evaluar la biomasa, se determina el número de microorganismos totales y
viables mediante distintas técnicas de dosaje habituales:
1- Recuento microscópico
Ventajas:
x barato, rápido, sencillo.
x no requiere material estéril.
x posibilita la diferenciación de algunos microorganismos y la detección precoz de
contaminaciones.
Desventajas:
x Se emplea poca muestra en relación al volúmen a cuantificar.
x el método resulta inseguro a concentraciones celulares 104/ml y ! 109/ml.
x las células vivas pueden no diferenciarse de las muertas o pueden hacerlo
dificultosamente.
x el método puede resultar tedioso a altas concentraciones microbianas o con
microorganismos muy pequeños.
x resulta muy dificultoso el recuento cuando las células se aglutinan o forman cadenas.
Error del método: 10%.
Recuento en cámara de Neubauer
cuadrante
1 cuadrado de 25 del
reticulado central
Figura 3. Reticulado de la cámara de Neubauer
30
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Atención: Para contar células que están
sobre las líneas, adoptar el mismo criterio en
todos los casos para no contar dos veces una
misma célula (Ej. Siempre contar las células
que están sobre las líneas derecha e inferior
como pertenecientes a ese cuadrado. Fig. 4).
En el caso de las levaduras, tener en cuenta
que al dividirse pueden permanecer unidas.
Se cuenta como 2 células si las hijas tienen el
mismo tamaño y se cuenta como una célula,
2 células
1 célula
si la hija es de menor tamaño que la célula
madre (fig. 4).
Figura 4. Recuento de células en división y
células que caen sobre las líneas divisorias
Para suspensiones de células diluidas, se cuenta en los cuadrantes de 16 cuadrados.
Volumen de 1 cudrante = lado x lado x altura = 1 mm x 1 mm x 0,1 mm = 0,1 mm3
Ejemplo: Para contar células de un frasco agitado de 50 ml, se diluyó la muestra 1/10 y
se contó lo siguiente:
25 células por cuadrante
20
"
32
"
35
"
112 células
- El promedio = 112 / 4 = 28 células por cada cuadrante en 0,1 mm3 { 0,1 Pl.
0,1 Pl
28 células
1000 Pl { 1 ml
X cél/ml = 280000
- Corregir por la dilución si se hubiere contado una muestra diluida. En este caso
multiplcar x 10 = 2800000 = 2,8 x 106 cél/ml.
- Finalmente, se calcula el número total de células de la suspensión:
2,8 x 106 cél
1 ml
X cél = 140 x 106 cél
50 ml
Para suspensiones de células concentradas, se cuenta en el cuadrante central de 25
cuadrados. Se cuentan por lo menos 5 cuadrados
Volumen de 1 de los 25 cuadrados = 0,2 mm x 0,2 mm x 0,1 mm = 0,004 mm3
31
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Ejemplo: Para contar células de un frasco agitado de 50 ml, se diluyó la muestra 1/10 y
se contó lo siguiente:
17 células por cuadrado
23
"
23
"
18
"
19
"
100 células
- El promedio = 100/5= 20 células por cada cuadrado en 0,004 mm3 { 0,004 Pl.
0,004 Pl
20 células
1000 Pl { 1 ml
X cél/ml = 5000000
- Corregir por la dilución, en este caso multiplcar x 10 = 50000000 = 5 x 107 cél/ml.
- Finalmente, se calcula el número total de células de la suspensión:
5 x 107 cél
1 ml
50 ml
X cél = 250 x 107 cél
Por lo tanto, para calcular el número por ml deben aplicarse las siguientes fórmulas:
- Suspensiones diluidas
cél./ml = N x 10000
donde N es el promedio de células por cuadrante.
- Suspensiones concentradas
cél./ml = N x 0,25 x 106
donde N es el promedio de células por cuadrado del retículo central.
2- Recuento en placa
Ventajas:
x Permite la determinación de microorganismos viables en un amplio rango de
concentraciones.
Desventajas:
x como se determinan las “unidades formadoras de colonias” (U.F.C.), las células
aglutinadas se contarán como una sola unidad (error por defecto).
x por inadecuada composición del medio o inadecuadas condiciones de incubación,
algunos microorganismos potencialmente viables pueden resultar incapaces de
formar colonias.
x errores sistemáticos en las diluciones.
Error del método: 100% o más.
3- Centrifugación
En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas. Por ser un
método gravimétrico (por pesada) conlleva bastantes errores: es difícil pesar menos de 1
mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio y 1 mg de peso seco equivale
a unas 5 x 10 9 bacterias.
32
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
x Peso húmedo:
Ventaja: es rápido y sencillo
Desventaja: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, que depende a su
vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.
x Peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado
(105ºC, toda la noche).
Ventaja: más preciso que el anterior
Desventaja: método tedioso (requiere mucho tiempo).
4- Absorción o turbidimetría:
Ventajas:
x Da información sobre el peso seco. Muy útiles y poderosos. La absorbancia es
directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del
microorganismo.
Desventajas:
x cuando los tamaños de las células bacterianas son diferentes se encuentran
absorbancias muy diferentes por partícula o por UFC (Unidad Formadora de
Colonia).
x debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de microorganismo,
microorganismos totales o con UFC para establecer el rango de linearidad.
PARTE PRÁCTICA
1- Se trabaja con frascos agitados de 250 ml de capacidad conteniendo 50 ml de caldo
Sabouraud (pH 5.5). Es un medio semi-sintético que contiene los nutrientes necesarios
para el crecimiento de S. cerevisiae.
2- Se prepara un inóculo de S. cerevisiae, sembrando un caldo Sabouraud a partir de una
estría joven. El caldo así sembrado se incuba a 28°C durante 24 horas, con agitación.
3- Se inocula el frasco, se homogeiniza y se toma una muestra estérilmente (Muestra
Inicial o tiempo 0). Se inoculan además 4 frascos más que se crecerán aproximadamente
por 8; 12; 24 y 48 hs
4- Se incubarán los frascos en un baño termostatizado a 28-30 °C con agitación y
abundante aireación.
Sobre alícuotas de todas las Muestras (T0, T8, T12, T24 y T48), se efectuará:
1. Recuento microscópico directo: se cuentan las levaduras en la Cámara de Neubauer
(número de levaduras/ml). Contar de manera directa (sin preparar diluciones), las
muestras T0 y T8. Realizar diluciones para el resto de las muestras.
33
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
2. Recuento en placa: se harán
diluciones seriadas para sembrar en cajas
de Petri con agar Sabouraud. Las cajas se
incubarán de 3 a 5 días a 28°C. Se
contarán aquellas diluciones que tengan
entre 20 y 200 colonias. Realizar
diluciones seriadas partiendo de 100 Pl
de cada cultivo (ver fig.2).
Figura 2. Esquema de diluciones seriadas
3. Densidad óptica: Leer a 600 nm 2 (duplicados) alícuotas de cada muestra. El rango
de absorbancia donde la medición es lineal es 0,150 a 0,500. Por lo tanto, las muestras
que tengan una absorbancia mayor, deberán ser diluidas y medidas nuevamente.
4. Centrifugación: a 5000 rpm durante 15 minutos. Con este método se determinará:
I. Rendimiento al final de la fermentación, expresado como gramos de levadura
obtenida en función de g de azúcar utilizado : Y X/C
II. Velocidad de crecimiento específico de la fermentación (P total):
i)
Tomar dos tubos de 1,5 ml para cada muestra. Pesar el tubo vacío, anotar.
Agregar 1 ml de cultivo previamente homogeneizado. Centrifugar 1 ml de la suspensión
de células a 5000 rpm x 10 min. Descartar el sobrenadante. Pesar nuevamente el tubo,
sacar el peso húmedo por diferencia.
ii)
Teniendo en cuenta el volumen del frasco, calcular la biomasa (X) de la levadura
como: x (g/l). Vol (ml). Obteniéndose X (en g). Mediante la diferencia XT48 – XT0 =
X neta [biomasa neta de la levadura producida (g)].
iii)
Calcule el YX/C: [X neto (g) /azúcar en el fermentador (g) x 100] = Rendimiento
de biomasa de levadura en función del azúcar consumida expresado como gramos de
levadura obtenida vs. g de azúcar utilizado (se presume que la levadura utilizó todo el
azucar presente en el medio Sabouraud al final de la fermentación).
iv)
Calcule el: P total = ln X final – ln X inicial
' tiempo
34
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
TRABAJO PRACTICO N° 3
Fermentación alcohólica
Objetivo
Obtener alcohol por fermentación de harina de maíz.
Introducción
Una de las fermentaciones industriales más importante y mejor conocida es la
que da lugar al alcohol etílico al actuar las levaduras sobre los azúcares.
El alcohol etílico puede obtenerse a partir de cualquier azúcar fermentescible, por
acción de las levaduras, en condiciones favorables. Puesto que el almidón y otros
hidratos de carbono pueden ser hidrolizados a azúcares fermentescibles por métodos
biológicos o químicos, se puede disponer de muchas fuentes de azúcar.
La materia prima puede clasificarse en tres tipos principales:
a) materias sacaroideas: azúcar de caña, remolacha, melazas y jugos de frutas.
b) materias que contienen almidón: comprenden los cereales (maíz, malta, cebada,
avena, centeno, trigo, arroz, sorgo y otros), papas, batatas.
c) materias celulósicas: madera y los residuos de fabricación de la pasta de papel.
Las materias sacaroideas requieren por lo general poco o ningún tratamiento
preliminar aparte de la dilución; las materias amiláceas y las celulósicas deben ser
hidrolizadas a azúcares fermentescibles antes que actúen sobre ellas las levaduras.
En todos los casos el éxito depende de la eficacia del tratamiento preliminar (si lo
hubiera), del empleo de una concentración óptima de azúcar, de un pH y temperatura
óptimos, del empleo de una variedad fuerte de levadura con alta tolerancia alcohólica,
capaz por lo tanto de producir grandes cantidades de alcohol.
Concentración de azúcar: 10-18%. Valor más corriente: 12%.
Sustancias nutritivas: en algunos casos, para suplir la posible deficiencia en P o
N, puede añadirse PO43-ó SO42- amónico.
pH del mosto: 4- 4.5. Este favorece a la levadura y es lo suficientemente bajo
para inhibir el desarrollo de muchos tipos de bacterias. Para alcanzar este pH se emplean
SO4H2 y ácido láctico.
Tensión de O2: en los primeros momentos es necesaria una alta concentración de
este gas para la reproducción de las células de levadura. Durante la fermentación se
desprende CO2 y se establecen pronto condiciones anaerobias.
Obtención del alcohol a partir de harina de maíz
Por ser la harina de maíz una materia prima de naturaleza amilácea, debe
efectuarse un tratamiento preliminar para transformar el almidón en azúcares
fermentescibles.
El almidón es un polisacárido que desempeña funciones de reserva en tejidos
vegetales, y está compuesto por dos tipos de polímeros: la amilosa y la amilopectina.
La amilosa es una cadena lineal formada por unidades de glucosa (en número
elevado), unidas entre sí por uniones D-1-4 (uniones entre el grupo aldehído de cada
molécula con el OH del C4 de la molécula siguiente).
35
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
La amilopectina tiene una estructura ramificada en la que las unidades de glucosa se
unen por enlaces glucosídicos D-1-4 y D-1-6. En cada C6 que participa de una unión se
produce un punto de ramificación.
En su estado natural en el tejido vegetal, el almidón se encuentra formando
gránulos. El tamaño de los gránulos varía entre los 5 y 100 Pm y poseen una estructura
interna consistente en capas concéntricas. En ellos coexisten regiones internas cristalinas
y amorfas. Las regiones amorfas representan el 70% de la estructura y contienen la
mayor parte de la amilosa. Un comportamiento particular de los gránulos de almidón es
su capacidad de gelificar al ser calentados en presencia de agua. La gelificación del
almidón implica la ruptura de los puentes hidrógeno intercatenarios especialmente en las
regiones cristalizadas del gránulo.
Los métodos para sacarificar materiales amiláceos implican el uso de
preparaciones enzimáticas, ácidos diluídos o una combinación de ambos.
Entre las preparaciones enzimáticas se incluyen la malta y otras de origen
microbiológico derivados de hongos y bacterias. Estas preparaciones contienen amilasas,
enzimas capaces de hidrolizar el almidón y el glucógeno a diversos productos.
Las distintas amilasas se pueden clasificar de la siguiente manera:
AMILASAS
Endoamilasas D amilasas (enzima licuante)
Ataca las uniones D- 1-4 de la amilosa y la
amilopectina a ambos lados de la unión D- 1-6.
Produce maltosa, glucosa, oligosacáridos.
Exoamilasas E amilasas (enzima sacarificante)
Ataca las uniones D- 1-4. Produce matosa y dextrinas
límites.
amiloglucosidasa (enzima sacarificante)
Ataca las uniones D- 1-6 y D- 1-4. Produce glucosa.
La designación de D y E amilasas no se refiere a la configuración del enlace
glucosídico que hidrolizan, ya que ambos grupos de enzimas hidrolizan los enlaces D-14.
La E-amilasa hidroliza rápidamente la fracción amilosa a maltosa, a partir de los
extremos no reductores de la molécula. Esta conversión es prácticamente cuantitativa sin
que se formen cantidades apreciables de dextrinas (oligosacáridos superiores).
Cuando la E-amilasa actúa sobre la amilopectina, la hidrólisis se realiza en un 5060% aproximadamente de la máxima teórica (calculada como maltosa). Este efecto
puede ser prácticamente completo en la amilosa de cadena lineal, sin ramificar; en
cambio en la amilopectina la acción enzimática cesa en los puntos de ramificación de la
cadena, es decir en los enlaces D-1-6 glicosídicos (dejando dextrinas límites).
En contraste con las Damilasas, las E-amilasas hacen muy lento el ritmo de
aparición de la maltosa. En este caso la hidrólisis del polisacárido tiene lugar en los
enlaces glicosídicos del interior de la cadena, formándose oligosacáridos que se escinden
lentamente en maltosa y glucosa.
36
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Otra diferencia que presentan las D amilasas con respecto a las E amilasas, es que
las primeras pueden hidrolizar los enlaces D-1-4 de las amilopectinas a uno y otro lado
de las ramificaciones formando oligosacáridos del orden de los pentasacáridos, unidos
por enlaces D-1-6. Este acortamiento tan grande de la cadena lleva a una disminución
rápida de la viscosidad. De ahí que a las D amilasas se las llame también “enzimas
licuantes”. Preparan así el camino para la E amilasa a la que se llama “sacarificante”. En
la malta existen D y E amilasas. Trabajando a alta temperatura se favorece la acción de la
D (70-75°C) con lo cual tiene lugar la licuefacción, mientras que a temperaturas más
bajas (60°C) trabaja la E amilasa produciéndose la sacarificación.
La amiloglucosidasa (enzima sacarificante) es otra amilasa que ataca las uniones
D-1-6 y D 1-4 a partir de los extremos no reductores de la molécula de almidón,
produciendo glucosa. La velocidad de hidrólisis de la amiloglucosidasa aumenta con el
peso molecular del sustrato. La velocidad de hidrólisis de los enlaces D-1-6 es un orden
de magnitud menor que para las uniones D-1-4.
Estructura del almidón:
37
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
PARTE PRACTICA
La práctica tiene por objeto preparar el mosto a partir de harina de maíz,
mediante dos enzimas (D amilasa y amiloglucosidasa), y la posterior fermentación del
mosto por la acción de levaduras, en condiciones anaeróbicas.
El rendimiento de la fermentación se calcula en base al peso de etanol obtenido.
Microorganismo utilizado: Saccharomyces cerevisiae (levadura de alta).
1- Preparación del inóculo: en un Erlenmeyer de 250 ml de capacidad, se colocan 50 ml
de caldo Sabouraud y 0.5% p/v de macerado de maíz.
Se esteriliza 30 minutos a 110°C. Se enfría y se siembra con un cultivo de 24
horas de la levadura. Se incuba durante 24 horas, a 28°C, en agitador rotatorio.
2- Preparación del mosto: en un Erlenmeyer de 500 ml de capacidad previamente tarado
(incluyendo el tapón de algodón), se colocan 45 g de harina de maíz y 200 ml de agua
destilada.
a) Gelificación: el Erlenmeyer se coloca en el autoclave a 121°C durante media
hora, a fin de liberar el almidón contenido en la harina de maíz.
b) El Erlenmeyer se enfría a 70°C, y se le agrega 2 ml de amilasa bacteriana. El
contenido del Erlenmeyer se agita con una varilla durante 15 minutos, manteniéndolo
sumergido en un baño termostatizado a 70°C.
c) El Erlenmeyer se retira del baño termostatizado y se coloca durante 5 minutos
en un baño de agua hirviente. Este paso tiene por objeto inactivar la D amilasa.
d) Se enfría el Erlenmeyer a 55°C y se le agrega 4 ml de amiloglucosidasa.
El contenido del Erlenmeyer se agita con una varilla durante 30 minutos, en un
baño termostatizado a 55°C.
Se prepararán 4 fermentaciones:
Fermentación 1: sin enzimas
Fermentación 2: con ambas enzimas
Fermentación 3: solo con -amilasa
Fermentación 4: solo con amiloglucosidasa.
3- Siembra del inóculo: el mosto se enfría a 28°C y se siembra con 5 ml del inóculo,
preparado según 1. Luego se incuba en forma estática a 28°C, durante 72 a 96 horas,
hasta que la fermentación haya terminado.
4- Destilación: finalizada la fermentación, se pesa el Erlenmeyer. Se miden 100 ml y se
pasan a un balón de destilación de 500 ml y se vuelve a pesar el Erlenmeyer, para
conocer el peso de la fracción que se va a destilar.
Se agregan al balón 100 ml de agua destilada, lavando la probeta en que se han
medido los 100 ml. Se destila lentamente, hasta asegurarse que la temperatura haya
llegado a 100°C. El destilado se recoge en un matraz aforado de 100 ml, se lleva a
volumen con agua destilada, y se determina su densidad por medio del densímetro
(alcoholímetro), ajustando la temperatura al valor indicado en las tablas de
concentración adjuntas.
Obtenida la densidad, se busca la concentración de alcohol en % p/v.
38
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
5- Cálculo del rendimiento:
a) Rendimiento teórico
Ecuación de Gay-Loussac:
2 C2H5OH + 2 CO2
C6H12O6
PM 180
PM 2 x 46
PM 2 x 44
180 g glucosa
92 g alcohol
100 g glucosa
51.1 g alcohol
(C6H10O5)n + n H2O
n C6H12O6
almidón
glucosa
PM (162)n
n 180
n 162 g
n 180 g glucosa
100 g
111 g glucosa
100 g almidón
111 g glucosa
56.7 g alcohol
b) Rendimiento práctico
Se calcula el rendimiento de etanol por 100 g de harina integral de maíz
por 100 g de almidón, considerando que el contenido de almidón de la harina de
maíz es de 60% p/p.
El rendimiento en la práctica industrial, en la que se prepara el mosto con
enzimas de la malta, es de 59 litros de alcohol por 100 kg de almidón.
Esto corresponde aproximadamente a 82% del valor teórico.
c) Eficiencia de la fermentación
rendimiento práctico
Eficiencia =
x 100
rendimiento teórico
39
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
TRABAJO PRÁCTICO Nº 4
Producción de ácido cítrico
Objetivos:
Comparar el efecto de la agitación y de la adición de Mn2+ sobre el rendimiento de ácido
cítrico en cultivos de Aspergillus niger
Introducción
El ácido 3 - carboxi - 3 – hidroxipentanodioico o ácido cítrico es el ácido
orgánico más producido mediante fermentaciones. Es ampliamente usado en varias
ramas de la industria, particularmente en la industria alimenticia (alimentos y bebidas,
70 % de la producción); en la fabricación de detergentes y limpiadores (18 %); en la
industria farmacéutica y cosmética (6 %) y en la producción química e industrial (6 %).
Sus ventajas son alta solubilidad, poder quelante, sabor agradable y baja toxicidad,
clasificado como GRAS (generally recognized as safe) por la Administración de Drogas
y Alimentos de EE.UU. (FDA). Se utiliza como condimento, conservante (en bebidas y
dulces), antioxidante en conjunto con ácido ascórbico y para ajustar el pH (en conservas
de frutas enlatadas). En la industria farmacética es usado en la formulación de tabletas
efervescentes y como anticoagulante en transfusiones sanguíneas. Adicionalmente, el
ácido cítrico en combinación con otros principios activos elimina bacterias, mohos y
hongos patogénicos causantes de olor, remueve la espuma de jabón, herrumbre, limos y
depósitos de calcio; por lo que es incluido en la formulación de desinfectantes,
fungicidas y otros pesticidas. Estos productos son usados en baños y en la limpieza de
equipos de procesamiento de lácteos y carnes. En ciertos detergentes reemplaza el
tripolifosfato de sodio, un contaminante ambiental.
El ácido cítrico se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza, en
diversas frutas y en animales, en hueso, músculo y sangre. Puede ser extraido de cítricos,
pero a escala industrial se produce por métodos microbiológicos a partir de materias
primas que contengan azúcares. Si bien se han empleado un gran número de
microorganismos para producir este ácido, el hongo Aspergillus niger continúa siendo el
principal productor industrial, existiendo cepas capaces de exceder el rendimiento
teórico sobre la fuente carbonada del 70%. Bajo una condición de glicólisis activa, tal
como sucede en medios ricos en azúcares, los hongos filamentosos son capaces de
acumular ácidos orgánicos en el medio. La composición del medio de fermentación tiene
una muy fuerte influencia en la producción de ácido cítrico, ya que sólo se acumula
cuando ciertos nutrientes están presentes en altas concentraciones (i.e. azúcar, acidez,
oxígeno disuelto) y otros en cantidades limitadas (i.e fósforo, nitrógeno y cationes
divalentes como Fe2+ y Mn2+). Dado que son varios los eventos bioquímicos que
contribuyen conjuntamente a la sobreproducción, muchas veces no es posible estudiar el
efecto de factores individuales sin afectar los otros.
40
Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Metodología
1- Cultivo
i- Preparación de medio de cultivo: Se preparan Erlenmeyers de 250 ml conteniendo 50
ml de medio de cultivo definido (Shu & Johnson, 1947):
Componentes principales (g/l)
Glucosa:
100,00
(NH4)2NO3:
2,50
KH2PO4:
1,00
Mg2SO4.7H2O:
0,25
Micronutrientes (mg/l)
2,4
Cu2+:
2+
0.34
Zn :
0.8
Fe2+:
A la mitad se le adicionan 9 mg/l de Mn2+.
ii- Obtención de esporas: Se agregan 5 ml de agua destilada con una gota de Tween-20 a
un cultivo de Aspergillus niger en pico de flauta agar papa-dextrosa. Se agita hasta
obtener una suspensión de esporas
iii- Inoculación: Los Erlenmeyers se inoculan con 0,5 ml de la suspensión de esporas.
iv- Cultivo: Los cultivos se incuban durante 10 días a 28 ºC a 200 rpm y en condiciones
estáticas. Antes de cosechar, se observa y registra la morfología del hongo en las
diferentes condiciones ensayadas (forma de pellet o filamentosa, presencia de esporas,
etc); se pueden observar estructuras reproductivas y vegetativas al microscopio óptico.
v- Cosecha: Los cultivos se filtran sobre un papel de filtro pesado previamente
(TRABAJAR CON CUIDADO, EVITANDO ESPARCIR LAS ESPORAS). El filtrado
se lava dos veces con 50 ml de agua destilada. Se centrifuga 1 ml del filtrado para
realizar las determinaciones de glucosa y ácido cítrico.
2- Determinaciones
i- Peso seco: Retirar el papel de filtro del embudo y colocarlo en una placa de Petri
(pesar previamente la base); dejar secar en estufa a 80 ºC durante 24 h. Volver a pesar y
obtener el peso neto del micelio.
ii- Determinación enzimática de glucosa: Diluir la muestra aproximadamente 1:10 –
1:100. Agregar 1 ml de solución de glucosa oxidasa (1000 U/ml) y peroxidasa (120
U/ml) a 10 Pl de la muestra y agitar. Incubar a 37 ºC durante 10 minutos. Leer
absorbancia a 505 nm. Realizar una curva de calibración con 5, 10 y 20 Pl de una
solución de glucosa 1g/l. Se utilizará el test para la determinación de glucosa en sangre,
de uso habitual en los laboratorios de análisis clínicos (ver anexo).
ii- Determinación de ácido cítrico: TRABAJAR BAJO CAMPANA! Agregar 0,7 ml de
anhídrido acético a 125 Pl de la muestra (sin diluir o a diluciones 1:10 a 1:100) y agitar.
A continuación, agregar 0,160 ml de piridina y mezclar cuidadosamente. Incubar a 30 ºC
durante 20 minutos. Leer absorbancia a 435 nm (cubrir las cubetas con parafilm).
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Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Realizar una curva de calibración con 10, 30 y 70 Pl de una solución de ácido cítrico
1g/l.
Cálculos
Calcular el rendimiento de ácido cítrico respecto al azúcar consumido y la biomasa.
Discutir el efecto de los distintos tratamientos ensayados.
Referencias
Shu, P; Johnson, MJ. Effect of the Composition of the Sporulation Medium on Citric
Acid Production by Aspergillus niger in Submerged Culture. 1947. J Bacteriol. 54
(2):161–167
Papagianni, M. 2007. Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger:
biochemical aspects, membrane transport and modeling. Biotechnol. Adv. 25(3):244263.
Soccol, C; Vandenberghe, L; Rondriques, C. & Pandey, A. 2006. New perspectives for
citric acid production and application, Food Technol. Biotechnol. 44, 141–149.
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Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
TRABAJO PRACTICO Nº 5
Acción de la invertasa de células inmovilizadas de Saccharomyces cerevisiae
Objetivo:
Inmovilizar células de S. cerevisiae y evaluar la actividad invertasa.
Introducción
El azúcar invertido es una mezcla de glucosa y fructosa en cantidades
equivalentes que se obtiene a partir de sacarosa. La conversión de un dímero de sacarosa
en monómeros se produce por la siguiente reacción:
glucosa + fructosa
glucosa-fructosa + H2O
sacarosa
azúcar invertido
Este proceso requiere una molécula de agua que se incorpora químicamente a los
monómeros. Esto es importante ya que el agua libre es removida y el peso del azúcar se
incrementa. Este incremento es significativo en la producción de grandes cantidades de
golosinas, que son comercializadas por peso. Otra característica importante es que el
azúcar invertido es higroscópico, por lo cual, por ej. es incluido en la fabricación de
chicles, para evitar que se resequen y tornen quebradizos; o en la elaboración confituras
bañadas en chocolate para prevenir una excesiva cristalización.
La reacción de conversión está catalizada por ácidos o por la enzima invertasa.
Parte Práctica
Materiales
Agar-agar 1,2 % en agua; células de Saccharomyces cerevisiae en pan; aceite vegetal;
sacarosa 20 % p/v; buffer acetato 0,1 N, pH 5; agua para lavados.
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Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
Esquema de trabajo
Agar-agar 1,2 % p/v
células de Saccharomyces cerevisiae
esterilización
Mezcla a 50º C 25 % p/p
fase hidrofóbica
(aceite vegetal)
agitación
(formación de esferas)
enfriamiento a 0º C
lavado, filtración, recolección de esferas
llenado de la columna
sacarosa 20 % p/v
contacto, 15 min. t. amb.
Dosaje de glucosa por HPLC
(test de glicemia)
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Biotecnología de Medicamentos y Alimentos
En laboratorios bromatológicos, para el análisis cuantitativo de azúcares se
utilizan técnicas cromatográficas: HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
o GLC (Gas Liquid Chromatography).
HPLC es un forma de cromatografía líquida, cuya fase estacionaria está
conformada por pequeñas partículas y el uso de elevadas presiones para el pasaje del
solvente o fase móvil a través de la fase estacionaria características que permiten
separaciones más eficientes que la cromatografía convencional. También suele ser
conocida como cromatografía líquida de alta presión.
En el caso de separación de hidratos de carbono se utilizan columnas de
intercambio catiónico. Los grupos OH- de los azúcares interactúan con los cationes de la
columna con diferentes fuerzas, resultando en diferentes tiempos de elución. La
detección se realiza por refractometría diferencial de lo eluido de la columna. El área
bajo el pico correspondiente a cada azúcar es analizada por un sistema de integración
acoplado al cromatógrafo y luego comparada con la obtenida por soluciones testigos.
En el caso del TP, se utilizará el test para la determinación de glucosa en sangre,
de uso habitual en los laboratorios de análisis clínicos, ya usado en el TP Nº 4.
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