efectos modulatorios de tirucalanos y cicloartanos citotóxicos en la

2º Congreso Nacional de Química Médica
Oviedo-Chávez y col.
EFECTOS MODULATORIOS DE TIRUCALANOS Y
CICLOARTANOS CITOTÓXICOS EN LA ACTIVIDAD DE
LA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASA
INDUCIBLE (INOS).
Ibeth Oviedo Chávez, Hortensia Parra Delgado y Mariano Martínez Vázquez. Instituto de Química,
Universidad Nacional Autónoma de México. C. Exterior, C. Universitaria, Coyoacán 04510, México,
D. F. México. [email protected]
RESUMEN
El óxido nítrico (NO) es sintetizado por tres formas conocidas de la óxido nítrico
sintasa (NOS), la inducible (iNOS), la neuronal (eNOS) y la endotelial (eNOS). Una
excesiva producción por la iNOS conduce a la vasodilatación e hipertensión observadas
en un choque séptico e inflamación. Adicionalmente, se ha demostrado la presencia de
NOS en varios tumores malignos. Tomando en cuenta lo anterior se decidió evaluar los
efectos sobre la producción de NO en macrófagos activados por LPS de triterpenos
citotóxicos a líneas de cáncer humanos. Para tal efecto, se seleccionaron las
argentatinasA (1) y B (2) así como los ácido masticadienónico(3) y 3αhidroximasticanienónico (4), cuyas propiedades citotóxicas son conocidas. Los
cicloartanos1 y 2 fueron evaluados a las dosis de 3.1, 10, 31 y 100 µM, mientras que los
tirucalanos 3 y 4 debido a su toxicidad a los macrófagos se evaluaron a las dosis de
0.001, 0.01, 0.1 y 10 µM. En el caso de 1 y 2, se observó un decremento en la producción
de NO. Es importante resaltar que 1 y 2 inhibieron la producción de NO tanto en
macrófagos activados como no activados. Estos resultados indican la potencialidad que
tienen estos triterpenos como agentes terapéuticos para el tratamiento de cáncer cuya
etiología este asociada a procesos inflamatorios. Por otro lado, los tirucalanos3 y 4
mostraron un perfil diferente. De acuerdo con nuestros resultados, no hubo inhibición de
la producción de NO. Estos hallazgos indican que a pesar de su alta toxicidad los
compuestos 3 y 4 no están indicados como agentes terapéuticos en cáncer donde la
actividad de NO sea crucial.
Palabras clave: regulación redox, cultivo celular, macrófagos
INTRODUCCIÓN
El óxido nítrico (NO) es una molécula biológica involucrada en una multitud de
procesos tanto fisiológicos como, patológicos, tales como la regulación de la presión
sanguínea, neurotransmisión, actividad antimicrobiana, regulación redox de la célula y
apoptosis.
En los mamíferos, existen tres diferentes isoformas de la óxido nítrico sintasa
(NOS), conocidas como la inducible (iNOS), la neuronal (nNOS) y la endotelial (eNOS).
De esta tres isoformas solamente la iNOS es capaz de producir grandes concentraciones
de NO. Esta isoforma es inducible en un gran número de células involucradas en
procesos inflamatorios mediante citocinas y otros agentes pro-inflamatorios. En contraste
nNOS y eNOS son constituyentes y producen pequeñas cantidades de NO (Kleinert et al,
2003, Alderton et al, 2001, Bredt, et al, 1999)
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No obstante que se ha demostrado las propiedades citoprotectoras del óxido
nítrico (NO), sin embargo se conoce que algunas especies reactiva de nitrógeno (RNS),
derivadas del NO, tales como peroxinitrito (ONOO-), nitroxilo (HNO), N2O3 y dióxido de
nitrógeno (-NO2) presentan un potencial patogénico en varias enfermedades,
posiblemente por un daño oxidante de ácidos nucleicos, proteínas y lípidos.
Adicionalmente, se ha propuesto, que el daño al DNA y los tejidos inducido por las RNS
contribuyen la velocidad de mutaciones, inestabilidad genómica, apoptosis, así como con
la proliferación celular. Eventos que pueden conducir a procesos de carcinogénesis.
Estudios recientes han demostrado que la inflamación en varios tejidos es
acompañada por una alta expresión de la oxido nítrico sintasa inducible (iNOS) la cual es
capaz de producir un exceso de NO durante un tiempo prolongado. Por lo anterior, la
inflamación crónica ha sido asociada a procesos cancerosos. Así, la gastritis producida
por Helicobcter pilori se ha relacionado con el cáncer gástrico, así como la inflamación
intestinal con el cáncer colorectal, entre otros ejemplos. Adicionalmente, un incremento de
la expresión de iNOS ha sido consistentemente informado en células de cáncer humano
en varios organismos como vejiga, próstata, boca y esófago y menos consistente en
estomago, colon y mama (Crowell et al, 2003). Asimismo, se ha determinado la relación
entre las iNOS y la enzima mieloperoxidasa (MPO) en cáncer de ovario. La inhibición
génica de la expresión tanto de MPO como de la iNOS representa una aplicación
terapéutica potencial (Abu-Soud, et al, 2006).
Por otro lado, nuestro grupo ha dedicado considerables esfuerzos en aislar y
modificar sustancias de origen natural que posean actividades citotóxicas a líneas de
cáncer humano. Así, recientemente hemos dado a conocer las propiedades citotóxicas
de las argentatinas A y B, triterpenos del tipo cicloartano aislados de Parthenium
argentatum (Parra-Delgado et al, 2005) y los tirucalanos ácido masticadienoníco y ácido
3α-hidroximasticadienónico asilados de Amphypterygium adstringens (Oviedo-Chávez, et
al 2005)
En este trabajo se informa del efecto en la producción de NO de las argentatinas A
y B, así como de los ácidos masticadienónico y 3α-hidroximasticadienónico en
macrofagos en presencia y ausencia de lipopolisacaridos (LPS).
METODOLOGÍA
Triterpenos. El aislamiento e identificación de las argentatinas A (1) y B (2), así
como de los ácidos masticadienónico (3) y 3-α-hidroximasticadienónico (4) se realizó de
acuerdo con estudios anteriores. (Parra-Delgado et al, 2005, Oviedo-Chávez, et al 2005).
Producción de nitritos. Las células adheridas (³ 95 % macrófagos) fueron
cultivadas en DMEM con 60 U/mL de SOD (la adición de SOD evita la interacción del NO
con el anión superóxido y permite valorar todo el NO generado), con o sin 10 mg/mL de
LPS ambos en ausencia y presencia de compuestos de prueba. Los compuestos de
prueba se evaluaron en las concentraciones entre 100 mM. Todos los compuestos se
disolvieron en EtOH. Una vez preparadas las placas se incubaron durante 24 h a 37 ºC.
Determinación de la concentración de nitritos. La acumulación de nitritos se
consideró como un indicador de la producción de NO en los sobrenadantes de cultivo
celular, y se determinó por medio de la reacción de Griess (Oviedo-Chávez, et al 2005).
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Brevemente, 100 mL de los sobrenadantes fueron mezclados con 100 mL del reactivo de
Griess [1 % sulfanilamida en H3PO4 al 5 % / 0.1 % dihidroclorhidrato de N-(1-naftil)etilenediamina en agua] en un plato de 96 pozos. Después de 10 min de reposo a
temperatura ambiente, se determinó la absorbancia a 515 nm usando un lector de
microplacas (Elx 808, BIO-TEK Instruments, Inc). La concentración de nitritos (mM) fue
determinada por interpolación de los resultados de densidad óptica (D.O.) en una curva
patrón de NaNO2 (hasta 50 mM). Los experimentos fueron realizados al menos tres veces
por triplicado. Las lecturas de absorbancia se relacionan directamente con la
concentración de nitritos. También se calcularon los porcentajes de inhibición de la
producción de nitritos (% I) de acuerdo con la siguiente ecuación:
I (%) = 100 – [B x 100 / A] donde A = concentración de nitritos (mM) del grupo control
positivo (aquél que recibió solo LPS), y B = concentración
RESULTADOS
Tabla 1. Producción de nitritos en macrófagos murinos (Mϕ) con argentatina A (1) y B (2) en
presencia o ausencia de lipopolisacarido (LPS).
Compuesto
Dosis ( M)
NO ( M)
Sin LPS
Con LPS
Control
30.84 ± 2.9
50.6 ± 5.3
1
3.1
33.9 ± 1.8
48.7 ± 4.7
10.0
25.5 ± 2.4
41.7 ± 4.9
31.0
22.6 ± 1.0*
34.5 ± 1.8*
100
15.9 ± 2.3*
17.8 ± 2.3*
Control
29.6 ± 2.3
53.7 ± 6.2
2
3.1
39.6 ± 1.0*
47.6 ± 6.6
10.0
31.6.4 ± 0.9
40.1 ± 4.9
31.0
30.0 ± 2.6
41.9 ± 6.0
100
20.0 ± 1.5*
23.6 ± 2.7*
Los resultados están expresados como promedios ± error estandar n=3-5, *p<0.05
comparado con los controles (prueba de Dunnet).
Tabla 2. Producción de nitritos en macrófagos murinos (Mϕ) con los ácidos masticadienónico (3) y
3αhidroximasticadienónico (4) en presencia o ausencia de lipopolisacarido (LPS).
Compuesto
Dosis ( M)
NO ( M)
Sin LPS
Con LPS
Control
24.4 ± 1.4
44.3 ± 1.7
3
0.001
42.7 ± 2.8**
54.3 ± 0.6
0.01
38.4 ± 3.0**
54.7 ± 4.9
0.1
35.9 ± 0.9*
47.2 ± 3.2
1.0
39.2 ± 1.2**
54.5 ± 4.5
10.0
40.1 ± 4.1**
51.1 ± 5.7
4
0.001
39.0 ± 0.3**
61.8 ± 2.7**
0.01
39.4 ± 0.9**
58.0 ± 1.6*
0.1
38.5 ± 2.6**
53.4 ± 5.2
1.0
42.6 ± 4.5**
53.6 ± 1.8
10.0
34.7 ± 2.6*
47.2 ± 4.9
Los resultados están expresados como promedios ± error estándar, n=3-5, *p<0.05
y **p <0.01 comparados con los controles (Prueba de Dunnet)
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DISCUSIÓN
Una intensa investigación en varios aspectos ha revelado que el óxido nítrico (NO)
participa en una gran variedad de eventos en una amplia gama de tejidos. El NO es
sintetizado por tres formas conocidas de la óxido nítrico sintasa (NOS), la inducible
(iNOS), la neuronal (eNOS) y la endotelial (eNOS), las cuales catalizan la formación de
NO y L-citrulina a partir de la oxidación de L-arginina en presencia de cofactores como
NADPH, FAD y donadores de tioles In vivo, NO y NOS pueden ser detectados en
individuos con infecciones, con procesos inflamatorios o bajo condiciones de estrés. In
vitro, cultivos de macrófagos son capaces de producir NO después de ser estimulados
con lipopolisacaridos (LPS) o con una variedad de citocinas como interferon-γ, TNF-α e
interleucina-1 (Reis, et al, 2001, Rimbach, et al, 2000, Ryu et al, 2003)(
Una excesiva producción por la iNOS conduce a la vasodilatación e hipertensión
observadas en un choque séptico e inflamación. Adicionalmente, el NO producido en
grandes cantidades durante los procesos de infección, frecuentemente causa daño a los
tejidos endoteliales causan muerte vascular y muerte.
Adicionalmente, se ha demostrado la presencia de NOS en varios tumores
malignos. No obstante, que es evidente que el NO por si mismo promueve los tumores
humanos facilitando tanto la angiogénesis como la diseminación, poco se sabe de los
efectos del NO en las células tumorales (Shang, et al. 2006).
Tomando en cuenta lo anterior se decidió evaluar los efectos sobre la producción
de NO en macrófagos activados por LPS de triterpenos citotóxicos a líneas de cáncer
humanos. Para tal efecto, se seleccionaron los cicloartanos argentatinas A (1) y B (2) así
como los tirucalanos ácido masticadienónico (3) y 3α-hidroximasticanienónico (4), cuyas
propiedades citotóxicas son conocidas (Parra-Delgado et al, 2005, Oviedo-Chávez, et al
2005)
De acuerdo con nuestros hallazgos, el tipo de estructura resultó importante para su
evaluación biológica, ya que los cicloartanos 1 y 2 fueron probados a las dosis de 3.1, 10,
31 y 100 µM, mientras que los tirucalanos 3 y 4 debido a su toxicidad a los macrófagos se
evaluaron a las dosis de 0.001, 0.01, 0.1 y 10 µM.
En el caso de los cicloartanos 1 y 2, se observó un decremento en la producción
de NO (Tabla 1). Sin embargo, a pesar de reflejar una actividad dependiente de la dosis,
varios valores no fueron estadísticamente significativos. No obstante los valores a 100 µM
en ambos casos si fueron estadísticamente significativos. Es importante resaltar que 1 y 2
inhibieron la producción de NO tanto en macrófagos activados como en descanso. Estos
resultados indican la potencialidad que tienen estos triterpenos como agentes
terapéuticos para el tratamiento de cáncer cuya etiología este asociada a procesos
inflamatorios.
Por otro lado, los tirucalanos 3 y 4 mostraron un perfil totalmente diferente al
mostrado por 1 y 2. De acuerdo con los resultados mostrados en la Tabla 2, la producción
de NO permanece constante, tanto en los macrófagos activos como aquellos en
descanso. Además, ésta siempre es mayor que los controles, hecho que indica que no
hubo inhibición de la producción de NO. Estos hallazgos indican que a pesar de su alta
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toxicidad los compuestos 3 y 4 no están indicados como agentes terapéuticos en cáncer
donde la actividad de NO sea crucial ya que probablemente aumentara su concentración.
H
O
OH
OH
O
1
O
O
2
COOH
O
OH
COOH
HO
3
4
BIBLIOGRAFÍA
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