“Cómo buscar bioherbicidas para la Agricultura Ecológica: del laboratorio al campo” Puig CG, Álvarez- Iglesias L, Souza P, Reigosa MJ y Pedrol N Departamento de Bioloxía Vexetal e Ciencia do Solo, Facultade de Bioloxía, Universidade de Vigo. Campus Lagoas-Marcosende, 36310, Vigo, España; [email protected]; Tlf: 986 812616; Fax: 986 812556. Palabras clave: Alelopatía, metodología, fitotoxicidad, ensayos de invernadero, extractos vegetales, abonos verdes. Resumen Desde tiempos lejanos se han obtenido extractos de plantas con actividad biológica como remedios para la salud humana, insecticidas, promotores del crecimiento, o herbicidas, entre otros usos. Sin embargo, y a pesar de que la química de productos naturales en colaboración con la botánica y otras ciencias han incrementado nuestro conocimiento sobre los metabolitos secundarios de las plantas, todavía hay muchísimas especies que nunca se han considerado o estudiado, y mucho menos se ha realizado la prospección de toda la biodiversidad existente. Así pues, el principal objetivo de nuestro trabajo es realizar una prospección de la diversidad vegetal cuyos metabolitos secundarios y potencial fitotóxico aún no hayan sido estudiados, para encontrar extractos y compuestos naturales (=especies vegetales) que pudiesen actuar como bioherbicidas ambientalmente correctos, suponiendo una importante aportación al desarrollo de la Agricultura Ecológica. Para alcanzar este objetivo, nuestro grupo de trabajo pretende optimizar el manejo de especies vegetales alelopáticas para el control de malas hierbas en Agricultura Ecológica, usando tanto sus extractos acuosos como el propio material vegetal incorporado como abono verde. También, profundizar en el conocimiento de su potencial bioherbicida a través de distintas tareas de investigación secuenciales, utilizando un amplio abanico de materiales y métodos en agronomía y ecofisiología vegetal, como se detalla a lo largo de este trabajo. Introducción Desde comienzos de la agricultura, el control de plantas no deseadas ha sido clave para la producción de los cultivos. A lo largo del tiempo, los agricultores han ido apreciando las interacciones entre sus cultivos y otras plantas que crecían de forma espontánea, con distintas especies compitiendo por el espacio, los nutrientes, y el agua. La presencia de especies arvenses se observó como un perjuicio para los cultivos, y con la experiencia se fueron desarrollando distintas técnicas naturales (rotación, falsa siembra, acolchado, barbecho, intercultivo, control manual, control mecánico) con las que controlar la flora no deseada (González Ponce 2006a, 2006b; Guzmán y Alonso 2008a, 2008b, 2008c). En los años 60 surgió la mal llamada “revolución verde”, y con ella los fitosanitarios de síntesis. El uso masivo de estos compuestos ha contribuido notablemente a la contaminación y al deterioro de los agroecosistemas. Además, algunos de ellos se incorporan a la cadena trófica y son bioacumulables, presentando un riesgo para la salud animal y humana (Khalid et al. 2002). En Agricultura Ecológica (AE) está absolutamente prohibido el uso de herbicidas de síntesis (EC 834/2007). Una de las formas de afrontar el control de la flora arvense en AE se basa en el conocimiento de las interacciones entre cultivo y “mala hierba”, ya sea por competencia directa por los recursos del medio (espacio, luz, agua, nutrientes) como por otras formas de interferencia, como los fenómenos alelopáticos. La alelopatía es el efecto directo o indirecto, positivo o negativo, mediado o no por microorganismos, que ejerce una planta sobre otra a través de la liberación de sustancias químicas a su entorno (Rice 1984). La competencia entre cultivo y flora arvense en los agroecosistemas viene determinada por el clima, el suelo, y los factores biológicos y de cultivo. Observando con detenimiento la distribución de las plantas en la naturaleza, llegamos a la conclusión de que ésta no es al azar, y que no responde solamente a parámetros físico-químicos. De hecho, durante miles de años, las plantas silvestres han desarrollado numerosas y muy variadas estrategias para competir por el nicho donde establecerse. Uno de estos mecanismos moldeado por la evolución es precisamente la alelopatía. Las sustancias que liberan las plantas en su entorno se denominan aleloquímicos, pudiendo interferir en la germinación y el crecimiento de las plantas “adversarias” (Ridenour y Callaway 2001). Estos metabolitos liberados provocan cambios físico-químicos en el medio, efectos en los microorganismos del suelo, intervienen en la resistencia a herbívoros, estimulan el establecimiento de simbiosis, e indirectamente la inhibición del crecimiento de las especies con la que la planta donadora compite; a su vez, la alelopatía es un estrés biótico más que, junto con el resto de factores bióticos y abióticos, son motor de evolución y fuentes de biodiversidad (Pedrol et al. 2006). Una explicación al éxito de las plantas invasoras es el desarrollo de una mayor capacidad competitiva a través de fenómenos alelopáticos. Plantas y cultivos exóticos encuentran en su composición química natural un arsenal de armas de lucha contra cultivos y especies silvestres locales con las que no han coevolucionado. Numerosos estudios se centran en la capacidad que tiene la flora arvense para invadir un terreno causando pérdidas en los cultivos, y cómo la alelopatía actúa como mecanismo de lucha en estas plantas (Singh et al. 2003). Consideramos, pues, que la diversidad vegetal puede ser un verdadero “laboratorio natural” y ser, entonces, una fuente ideal en la búsqueda de plantas con cierta actividad fitotóxica, tan efectiva o más que la de los herbicidas sintéticos. El fenómeno de la alelopatía es muy común en los agroecosistemas (Kohli et al. 1998; Kohli et al. 2006; Singh et al. 2001; Weston y Duke 2003). De hecho, los primeros indicios documentados sobre alelopatía se observaron en cultivos, p. ej., en garbanzo (Theophrastus, 300 A.C.). Se ha observado que un número considerable de cultivos exhiben efectos alelopáticos sobre otros cultivos y malas hierbas (Batish et al. 2001; De Alburquerque et al. 2011; Tesio y Ferrero 2010). Los residuos de los cultivos precedentes también afectan el comportamiento de otros cultivos debido a la liberación de aleloquímicos (Batish et al. 2001; Singh et al. 2001). Se liberan una gran variedad de compuestos solubles e insolubles en agua y fitotoxinas volátiles de los cultivos y sus residuos de cosecha, que se acumulan en el suelo y afectan la germinación de propágulos de otros cultivos vecinos, con serias repercusiones en la calidad y cantidad de las cosechas (Batish et al. 2001). Por esta razón, ciertas prácticas tradicionales como los cultivos de cobertera, cultivos acompañantes, policultivos y abonos verdes, etc., necesitan ser profundamente revisados. Se requiere aún mucha investigación sobre el manejo adecuado y la naturaleza alelopática de especies herbicidas, la duración del efecto, el momento de aplicación, etc. Hasta la fecha, los métodos principales de control de malezas en AE continúan siendo mecánicos y preventivos, mientras que todavía estamos muy lejos de generalizar el uso de la alelopatía en los agroecosistemas ecológicos y sostenibles. Durante la última década se han publicado muchos estudios científicos sobre los efectos alelopáticos. Sin embargo, ’la utilización de la alelopatía en una práctica agrícola normal todavía está en desarrollo y requiere más investigación’ (Conclusiones Proyecto FP5 FATEALLCHEM, “Fate and toxicity of allelochemicals (natural plant toxins) in relation to environment and consumer”). La International Allelopathy Society reúne a numerosos científicos cuyo tema central de investigación es el papel de la alelopatía en el control de malas hierbas (http://www- ias.uca.es/research.html), aunque en la mayoría de los casos se centran en cultivos concretos, en aislamiento e identificación de nuevos compuestos, o en aplicaciones complementarias a la agricultura convencional o sostenible, pero no concretamente a la AE. El objeto de nuestro trabajo trata de esto y mucho más; de especies vegetales que nos rodean y están a nuestro alcance, de especies que en un principio entorpecen nuestras producciones agrícolas pero que luego podemos usar para protegerlas, de la búsqueda de compuestos fitotóxicos naturales que permanecen sólo el tiempo necesario para cumplir su función y luego son fácilmente metabolizados. Por tanto, nuestra hipótesis de partida es que el material vegetal y extractos crudos de nuevas especies con capacidad fitotóxica demostrada tras una prospección inicial intensa, podrían ser utilizados como cócteles naturales de aleloquímicos con efecto bioherbicida que, bajo determinadas condiciones y debidamente dosificados, al ser aportados al suelo como abonos verdes o aplicados sobre las malas hierbas controlasen su germinación y/o crecimiento. La utilización racional y programada en AE de una o más de estas especies potencialmente alelopáticas, aunque no erradique todas las malezas, puede permitir el mantenimiento natural, sostenible y rentable del equilibrio mala hierba / cultivo a favor de este último. Para alcanzar este objetivo, nuestro grupo de trabajo pretende optimizar el manejo de especies vegetales alelopáticas para el control de malas hierbas en AE, usando tanto sus extractos acuosos como el propio material vegetal incorporado como abono verde. También, profundizar en el conocimiento de su potencial bioherbicida a través de distintas tareas de investigación secuenciales, utilizando un amplio abanico de materiales y métodos en alelopatía, agronomía y ecofisiología vegetal, los cuales se explican a continuación. Metodología Nuestro método de trabajo se divide en 3 etapas graduales, las cuales se pueden ilustrar mediante una pirámide Campo 3 invertida (Figura 1). La primera etapa consiste en ensayos de laboratorio a pequeña escala, es decir, in vitro, donde el “ecosistema” del ensayo se restringe a semillas y placas Petri, 2 1 Invernadero In vitro y se realiza bajo condiciones determinadas y totalmente controladas. Estos bioensayos representan una herramienta muy poderosa, Figura 1. al margen de ser sencillos y de bajo coste. Si los resultados obtenidos en este primer paso son prometedores, se avanza a la etapa o nivel siguiente. A medida que subimos en la pirámide, el volumen del “ecosistema” aumenta, así como la duración de los ensayos y los factores bióticos y abióticos a tener en cuenta. Con este orden se consigue economizar recursos y tiempo, ya que si una especie vegetal no muestra potencial alelopático en la primera etapa, directamente se descarta como posible herramienta para el control de malas hierbas en etapas posteriores. ¿Por dónde empezar? Ante la gran diversidad vegetal que nos rodea, lo primero que nos planteamos es realizar una prospección inicial de especies potencialmente útiles para el control de malas hierbas por su naturaleza alelopática, y seleccionadas en función de los siguientes criterios: (i) plantas que hayan sido utilizadas tradicionalmente en climas similares al nuestro pero de las que no se dispone de referencias bibliográficas acerca de su naturaleza alelopática, (ii) especies silvestres emparentadas taxonómicamente con cultivos alelopáticos ya estudiados de familias especialmente ricas en aleloquímicos fitotóxicos, (iii) especies de las que se han aislado aleloquímicos que no reproducen su capacidad alelopática observada en el campo (p. ej. el eucalipto), (iv) especies silvestres o cultivadas destinadas a fines medicinales con propiedades fungicidas, bactericidas, etc., que no hayan sido evaluadas como bioherbicidas, y (v) especies invasivas cuya actividad radica en la liberación al medio de metabolitos secundarios. Además de estos criterios, también se tienen en cuenta la disponibilidad en el agroecosistema y facilidad de recolección de las especies a estudiar, con el fin de que sea factible el uso de las mismas a la hora de aplicarlas en el campo. El estado de madurez de la planta en el momento de la recolección también es un factor importante a considerar. Muchos estudios sugieren que el periodo de tiempo requerido para que las sustancias tóxicas se formen está afectado por el estado de madurez de la planta. Si el material vegetal que se quiere incorporar en el suelo se encuentra en un estado joven, las fitotoxinas se liberarán de forma rápida en la descomposición de los residuos, pero también se degradarán con la misma rapidez. Sin embargo, cuando los residuos vegetales son maduros, se necesitará un periodo de descomposición más largo para la liberación de las fitotoxinas, pero el efecto fitotóxico perdurará más tiempo en el suelo (Khalid et al. 2002). Esto es interesante ya que las semillas silvestres de un banco de malas hierbas no están sincronizadas, sino que germinan gradualmente a lo largo del establecimiento del cultivo. Por esta razón, consideramos apropiado el uso de especies vegetales en floración, cuando la planta se encuentra en un estado fenológico adultoy con mayor cantidad y variedad de metabolitos secundarios potencialmente útiles para el control de malas hierbas. 1ª etapa: ensayos de laboratorio (in vitro) La valoración del potencial herbicida de las especies seleccionadas se lleva a cabo mediante bioensayos de germinación y crecimiento sobre papel de filtro en placa Petri. Son utilizados para realizar una selección previa en laboratorio de aquellos productos con mayor actividad, que son luego escalados al nivel de invernadero y de campo. Para ello, se preparan extractos acuosos dejando macerar material fresco a T ambiente y oscuridad (para evitar la fotodegradación de compuestos) en agua destilada (para reproducir de la forma más realista posible las condiciones de liberación de aleloquímicos en condiciones naturales) durante 24 h. Los extractos vegetales acuosos se ensayan sobre especies diana modelo, como Lactuca sativa L. cv. Grandes Lagos y Agrostis stolonifera L. cv. Pencross. Ambas especies son ampliamente utilizadas como dicotiledónea y monocotiledónea modelo, respectivamente, en estudios alelopáticos debido a su rápida germinación, uniformidad genética y a su alta sensibilidad a la acción de los aleloquímicos (Dayan y Duke 2006). Esto permite una comparación universal de los resultados de los bioensayos para muchos extractos o compuestos diferentes (Macías et al. 2000). El efecto fitotóxico se cuantifica mediante la comparación de los resultados de germinación y elongación de primordios de raíz y tallo de las semillas que sufren el tratamiento frente a un control, el cual se diferencia del tratamiento únicamente en la ausencia del material ensayado. Estos dos parámetros se verán afectados cuando también lo estén otros fenómenos fisiológicos más concretos, por lo que se cubre así un rango más amplio de efectos. En el caso de A. stolonifera, se aplica el método de Dayan et al. (2000) para ensayos miniaturizados con plantas de semilla pequeña, donde el efecto fitotóxico sobre la germinación y el crecimiento es estimado visualmente, y basado en una valoración con escala de 0 a 5, significando 0 la ausencia de efecto (crecimiento máximo) y 5 la inhibición completa de crecimiento, tomando como referencia de valor 0 el control negativo (agua destilada) (Figura 2.). Figura 2. Bioensayo miniaturizado del crecimiento de A. stolonifera en placas de 24 pocillos con los distintos extractos naturales como tratamientos. En función de los resultados obtenidos en estos primeros ensayos, se caracterizarán aquellos extractos acuosos con mayor poder herbicida frente a herbicidas comerciales, mediante la obtención de pautas dosis/respuesta y concentraciones IC50 e IC80 (dosis que inhibe la germinación o reduce el crecimiento de radícula en torno al 50% y 80% del control, respectivamente), mediante bioensayos simultáneos en placa Petri sobre las especies modelo, especies de cultivo y especies de malas hierbas mono- y dicotiledóneas. La determinación de ciertos parámetros críticos y universales como el IC50 e IC80 es importante ya que constituye una fuente de información rápida y permite establecer un marco de referencia para los ensayos siguientes (Dayan et al. 2000). Dichos parámetros se determinan mediante el ajuste matemático de curvas dosis-respuesta. Si el modelo es aceptable puede ser utilizado para describir la tendencia o la respuesta a la concentración de los extractos, o para calcular concentraciones de interés basadas en el modelo (como los índices de inhibición). 2ª etapa: ensayos de invernadero Existe abundante bibliografía sobre el potencial bioherbicida de extractos acuosos o aceites esenciales basados en bioensayos in vitro. Sin embargo, en la naturaleza el suelo juega un papel esencial en el destino de los compuestos liberados por parte de la planta, de modo que muchos de estos compuestos considerados como aleloquímicos por los resultados de laboratorio tendrían en la naturaleza poca o nula actividad biológica sobre plantas, debido a su inestabilidad, rápida degradación o cambio continuo por la presencia de microorganismos, u otras interacciones con el suelo (Duke 2010). Por este motivo, es imprescendible añadir el factor suelo en estudios alelopáticos. Los bioensayos alelopáticos a nivel de invernadero se llevan a cabo generalmente usando recipientes de material inerte (macetas u otros contenedores) donde se hacen crecer plantas testigos hasta estado adulto. De esta forma se pueden realizar ensayos no sólo de germinación y crecimiento de plántulas, sino también de respuesta de las especies receptoras en distintas etapas de todo su ciclo vital, o al menos durante el crecimiento temprano en cultivos y especies arvenses de gran porte. Además, pueden medirse otros parámetros más específicos y con distinto significado ecofisiológico: variables medibles in vivo utilizando técnicas de intercambio de gases y fluorescencia de clorofilas (tasa de fotosíntesis, eficiencia fotosintética o estado de estrés), y multitud de parámetros post-cosecha (área específica foliar, proteínas, pigmentos, azúcares, metabolitos del estrés, análisis elemental, biomasa), sin olvidar las ráices. Los ensayos de invernadero permiten la valoración del potencial herbicida de la especie en estudio como material incorporado al suelo a diferentes dosis y a distintos tiempos de siembra de malas hierbas y cultivos, con el fin de optimizar dosis y momento de aplicación. Siguiendo esta línea de investigación, nuestro grupo de trabajo lleva a cabo ensayos en maceta, donde se evalúa 1) el efecto del material vegetal incorporado en el suelo sobre el establecimiento de cultivos con un banco de semillas de las principales malas hierbas asociadas al cultivo, y 2) la duración y dinámica de su efecto fitotóxico sobre la germinación y crecimiento del cultivo y las especies arvenses competidoras del cultivo. Para ambos ensayos, se parte de concentraciones de material vegetal fresco incorporado al suelo igual a las dosis IC50 e IC80 obtenidas en los ensayos previos con extractos acuosos sobre las especies diana. Se utilizan como control negativo macetas con suelo agrícola sin tratamiento, y como control positivo, macetas con suelo tratado con un herbicida sintético de preemergenciaa la dosis de campo recomendada. En nuestro trabajo, la utilización del herbicida comercial resulta ser muy útil para establecer comparaciones. Un ejemplo de ensayo del primer tipo se puede consultar en Puig et al. (2012a). En este caso también se evaluó el efecto de la especie vegetal potencialmente alelopática a concentraciones menores, con el propósito de optimizar las dosis suficientes requeridas para el control de malas hierbas en campo. Dada la duración de este ensayo, 4 semanas, los controles se acondicionaron añadiendo pajitas de plástico para bebida cortadas en porciones de 1 cm, mimetizando así el efecto ahuecante del mismo volumen de material vegetal incorporado, pero con un aditivo inerte (Wuest et al. 2000). Se evitan así efectos no deseados de la mayor compactación del suelo en ausencia de material vegetal. A los 30 días tras la siembra, se contó el número de plántulas vivas emergidas de malas hierbas y cultivo. A continuación, las plantas se cortaron a nivel del suelo y se secaron a 70 ºC durante 72 h para obtener la biomasa aérea en peso seco de cada especie. Se calculó el rendimiento del cultivo según la fórmula “rendimiento (%) = [biomasa aérea de cultivo / (biomasa aérea cultivo + biomasa aérea de malas hierbas)] x 100. En un ensayo del segundo tipo, con el fin de estudiar la duración y dinámica del material vegetal enterrado en el suelo, Puig et al. (2012a) prepararon todas las macetas, para 10 tiempos de siembra y 4 réplicas por tratamiento en el mismo día, e inmediatamente sembraron aquellas macetas correspondientes al tiempo 1. Cada tres días se realizó una nueva siembra, hasta 10 en total, con una duración del ensayo de un mes (Figura 3). En cada tiempo de siembra, se removió superficialmente el suelo de las macetas correspondientes, simulando la preparación de un lecho de siembra. Diez días después de cada siembra, se realizaron conteos de germinación y se midieron variables de crecimiento. Las macetas de ambos ensayos se mantuvieron en invernadero en condiciones de Tª y humedad controladas (luz natural y Tª ≤26 ºC); se controló la humedad del sustrato mediante gravimetría, próxima a la capacidad de campo pero evitando la percolación. Una vez realizada la cosecha, en cada maceta se midió la conductividad eléctrica del suelo y el pH. Figura 3. Vista de 3 macetas del ensayo de duración y dinámica de efectos fitotóxicos correspondientes a 3 tiempos consecutivos de siembra. Siguiendo esta metodología en invernadero, los autores valoraron 1) el efecto de filodios de Eucalyptus globulus Labill. enterrados en el suelo sobre el establecimiento de maíz forrajero (Zea mays L. cv. Anjou 387) y de un banco de semillas de malas hierbas más representativas del cultivo, y 2) la duración y dinámica del efecto fitotóxico del eucalipto sobre la germinación y crecimiento temprano de maíz y 2 de las especies arvenses más problemáticas, Amaranthus retroflexus L. y Echinochloa crus-galli (L.) P. Beauv. Los filodios de eucalipto pudieron controlar especies de malas hierbas como A. retroflexus, Solanum nigrum, E. crus-galli y Digitaria sanguinalis. Un modelo de dos fases, una inhibitoria y otra estimulatoria, podría explicar la dinámica del efecto fitotóxico del eucalipto sobre el crecimiento del maíz, estableciendo un periodo de seguridad para el cultivo de entre 12 y 15 días tras la incorporación del material vegetal al suelo. Con los resultados obtenidos en los ensayos de invernadero, se puede establecer una aproximación metodológica para la siguiente etapa: el campo. Por supuesto, la transferencia completa al campo requiere de información extra aportada por más estudios de invernadero, donde se podría valorar el potencial de inhibición del material vegetal enterrado sobre los microorganismos del suelo, la variación de los efectos dependiendo de la estación de recogida o estado fenológico del material, o el destino de las fitotoxinas una vez liberadas al suelo, entre otros. 3ª etapa: campo Como reflejo final de los resultados obtenidos de los ensayos de laboratorio e invernadero, se emplean ensayos de campo, donde se añade a la rutina de producción de un cultivo determinado la metodología previamente establecida para el control de malas hierbas. De esta forma, y bajo condiciones reales, se ensayan las dosis, formas y momentos de incorporación del material vegetal potencialmente alelopático, y se tiene en cuenta los plazos de siembra de aquellos cultivos sensibles a los aleloquímicos. En este caso, se describen los efectos sobre la diversidad y abundancia de la flora arvense mediante la realización de distintos muestreos a corto, medio y largo plazo dentro del ensayo, y sobre parámetros agronómicos del cultivo, siendo el rendimiento agrícola sin duda uno de los más importantes. Existe abundante bibliografía que respalda el uso potencial de plantas alelopáticas como cultivos de cobertera, o aplicadas al suelo como abonos verdes o mulch para el control de la flora arvense (Bhowmik y Inderjit 2003; De Albuquerque et al. 2011; Tesio y Ferrero 2010; Xuan et al. 2005), siendo los cereales de invierno y las leguminosas aquellas especies vegetales que han recibido más atención por parte de los científicos (Cherr et al. 2006; Kruidhof et al. 2009). Nosotros rompemos una lanza en favor del uso de plantas silvestres, o de la abundante biomasa de otros cultivos, como es el caso de los residuos de tala de eucalipto (Puig et al. 2012b). Creemos que este uso alternativo de los cultivos forestales y la reutilización de la biomasa de la abundante y accesible flora arvense puede convertirse en una herramienta sencilla y económica de control de la flora arvense. El uso de nuevas alternativas investigadas para el servicio de los productores, contribuirá sin duda a la sostenibilidad de los agroecosistemas y a la concienciación general de que la Agricultura Ecológica es posible, rentable, y, probablemente, la única alternativa de producción socialmente justa y ambientalmente correcta. Conclusiones La combinación de ensayos in vitro con experimentos de maceta sobre los efectos fitotóxicos de una especie vegetal, es muy útil para valorar su uso potencial para el control de malas hierbas en el campo. En nuestro trabajo, se establece una metodología adecuada y novedosa de bioensayos de invernadero en maceta para el estudio del potencial bioherbicida de cultivos y plantas silvestres. La Alelopatía representa una alternativa real a los herbicidas convencionales de síntesis, como herramientas complementarias a otras prácticas ecológicas para una producción agrícola ecológica de calidad, sostenible, saludable, y respetuosa con el medio ambiente. Aún así, debido a la compleja naturaleza de este fenómeno, el estudio de la dinámica o duración, o los mecanismos de acción de los aleloquímicos en un contexto ecológico es complicado y requiere todavía mucho esfuerzo de investigación al servicio de la Agricultura Ecológica. Referencias bibliográficas Batish DR, Singh HP, Kohli RK, Kaur S. 2001. Crop allelopathy and its role in ecological agriculture. Journal of Crop Production 4: 121-161. Bhowmik PC, Inderjit. 2003. Challenges and opportunities in implementing allelopathy for natural weed management. Crop Protection 22: 661-671. Cherr CM, Scholberg JMS, McSorley R. 2006. Green manure approaches to crop production: A synthesis. Agronomy Journal 98: 302-319. 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