Genotipificación del Virus Papiloma Humano (HPV) por PCR

Genotipificación del Virus Papiloma Humano (HPV)
por PCR-RFLP en alteraciones cervicales
Deluca, Gerardo D. - Alonso, José M. - Lucero, Raúl H.
Martín de Civetta, María T. - Zibelman de Gorodner, Ofelia L.
Area de Biología Molecular - Instituto de Medicina Regional - UNNE.
Av. Las Heras 727 - (3500) Resistencia - Chaco - Argentina.
Tel./Fax: +54 (03722) 428213 / 422793
E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
Los virus papiloma humanos (HPV) son virus a ADN capaces de generar lesiones verrugosas mediante la inducción de
la proliferación celular, durante el curso de una infección productiva .
El cáncer de cérvix es la segunda o tercer causa más común de cáncer en las mujeres en todo el mundo. En Argentina
no se cuenta con suficientes datos epidemiológicos para evaluar con exactitud la situación global de esta patología, pero
los estudios regionales realizados hasta el momento muestran una amplia variación en la incidencia que va desde 1-3
casos por cada 100.000 mujeres residentes en áreas metropolitanas, hasta 4 casos por cada 1000 mujeres en la región
Nordeste del país. Además, está perfectamente reconocida la asociación entre esta patología y la infección persistente
por ciertos genotipos de HPV.
El HPV infecta las células germinales de los epitelios, a las cuales llega a través de microlesiones o abrasiones,
pudiendo la infección ser transitoria o persistente. Las primeras se caracterizan por ser autolimitadas y en un lapso de
tiempo que depende de las condiciones inmunológicas del hospedador remiten espontáneamente; en tanto que en las
segundas el sistema de control inmunológico no responde adecuadamente y el virus no es depurado del organismo,
convirtiéndose en un factor favorecedor para el desarrollo de cáncer cervical, particularmente si la infección es causada
por un genotipo de alto riesgo. Se ha podido observar que en todos los cánceres cervicales hay integración del genoma
viral en células neoplásicas, por lo que se piensa que esto es una condición necesaria para su desarrollo.
Se han identificado hasta el presente alrededor de 80 genotipos virales de HPV, de los cuales más de 30 infectan la
región anogenital y al menos 10 de ellos están asociados con el cáncer cervical. De esto resulta que la asociación entre
la infección por HPV y las lesiones anogenitales es un fenómeno más complicado de lo esperado.
Los genotipos HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59 y –68 son considerados de “alto riesgo”
porque fueron identificados en pacientes que desarrollaron neoplasias cervicales; los genotipos HPV-6, -11, -40, -42, 43, -44 y –55 son considerados de “bajo riesgo”2 y a los HPV –6, -11 y -42 se los relaciona a las verrugas genitales
(condilomas).
En el Nordeste Argentino, a pesar de ser una zona de alta prevalencia de cáncer cervical, se realizaron pocos estudios
epidemiológicos y en la mayoría de ellos sólo se evaluó la presencia de los genotipos más comunes, es decir el 6, 11,
16 y 18. Sin embargo, es necesario estudiar la presencia de otros genotipos de HPV también asociados con el cáncer
cervical, debido a que se han encontrado diferencias geográficas en la prevalencia de los distintos tipos virales.
El objetivo del presente trabajo fue determinar los genotipos circulantes de HPV, presentes en mujeres con alteraciones
ginecológicas compatibles con infección por este virus en el Nordeste de Argentina.
MATERIAL Y METODOS
La detección y tipificación del virus papiloma humano en células o tejidos se efectuó mediante amplificación por PCR
de un fragmento genómico y posterior análisis por restricción enzimática (RFLP)
Productos utilizados en la presente técnica:
•
•
•
Primers consenso My09 y My11.
Enzimas de restricción Bam HI, DdeI, Hae III, HinfI, PstI y RsaI
Control positivo: DNA de la línea celular CaSki que contiene integrado genoma de HPV-16
Material de muestra
Los materiales de estudio consistieron en:
• Células obtenidas por cepillado cervico-vaginal de las lesiones observadas en el tracto genital.
• Tejido fresco de biopsia obtenido para estudios histológicos.
Fuentes del material estudiado
•
•
Material recibido del Servicio de Ginecología del Hospital Vidal de la ciudad de Corrientes.
Material cedido por distintos centros ginecológicos privados de las ciudades de Resistencia y Corrientes.
Pacientes
Se estudiaron un total de 60 mujeres, con edades comprendidas entre los 18 y 60 años de edad y distribuidas de la
siguiente manera: 39 que presentaban lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (LG-SIL), 6 de alto grado (HGSIL), 3 que presentaban células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS), y 12 mujeres que
presentaban cáncer cervical en distintos estadíos, de acuerdo a la clasificación de Bethesda.
RESULTADOS
En las 60 mujeres estudiadas, se encontró en 37 la presencia de ADN viral (62%), con una distribución según el tipo de
alteración citológica que se presenta en la Tabla 1.
Los distintos genotipos de HPV identificados y su distribución según los patrones histopatológicos se presenta en la
Tabla 2.
Se encontraron 5 casos de infecciones virales producidas por más de un genotipo viral. Tabla 3
Tabla 1: Resultados de detección del virus papiloma humano (HPV) en función del diagnóstico citohistológico.
ASCUS
LSIL
HSIL
CANCER
TOTALES
Positivos
2 (66%)
20 (51%)
5 (83%)
10 (83%)
37 (62%)
Negativos
1 (34%)
19 (49%)
1 (17)
2 (17%)
23 (38%)
TOTALES
3
39
6
12
60
Tabla 2: Genotipos de HPV identificados y su relación con los patrones histopatológicos
Genotipos
ASCUS
LSIL
HSIL
CANCER
Totales (%)
N = 37
6
2
16
3
18
2
2 (5,4)
33
1
1 (2,7)
45
1
52
1
1 (2,7)
53
1
1 (2,7)
54
1
1 (2,7)
56
1
1 (2,7)
58
2
66
1
1 (2,7)
MM4
1
1 (2,7)
LVX100
1
No determinados*
1
Indeterminados
* RFLP no realizada
2 (5,4)
3
6
1
1
2
12 (32,4)
2 (5,4)
5 (13,5)
1 (2,7)
3
1
3
1
1
6 (16,2)
4 (10,8)
Tabla 3: Genotipos de virus papiloma humano (HPV) identificados y patrones histopatológicos correspondientes a
casos de infecciones mixtas.
Genotipos
LSIL
58 – 45
1
6 – 33
1
HSIL
1
16 – 58
16 – 66
1
Indeterminado
1
DISCUSION
La alta frecuencia de infección por HPV reportada en el Norte Argentino en publicaciones previas, es comparable con la
importante prevalencia de casos de cáncer de cérvix que se presentan en la región. En este trabajo se analizaron
muestras provenientes de pacientes con evidentes alteraciones citológicas que hacían prever la posible infección por
HPV, hallándose efectivamente una alta incidencia, particularmente entre los HSIL y entre los casos de cáncer, mientras
que en los LSIL la presencia del ADN viral fue confirmada sólo en el 51% de los casos. Presumimos que esto puede
estar directamente relacionado con el número de casos estudiados por lo que se podría tener una mejor estimación si se
considerase un mayor número de pacientes con LSIL.
La técnica de PCR-RFLP tiene la característica de poder determinar más de 30 genotipos virales anogenitales con una
única reacción de amplificación y ésta es su mayor ventaja frente las metodologías que emplean primers específicos,
pero su mayor desventaja es justamente no poder definir en ciertos casos los genotipos asociados cuando se presentan
infecciones mixtas que frecuentemente producen patrones de restricción confusos. En estos casos se puede optar por
otras metodologías moleculares de identificación como son la PCR con posterior hibridación por dot blot, PCR con
primers específicos, o la secuenciación.
En este estudio se presentaron 5 muestras con infecciones virales mixtas y en 4 de ellas se pudieron identificar los virus
coinfectantes en base a la restricción enzimática. En la muestra restante se deberá optar por otra metodología de
identificación molecular según lo dicho en el párrafo anterior.
Seis muestras positivas no pudieron someterse a la restricción enzimática debido a la escasa cantidad de material
amplificado, insuficiente para generar un patrón de bandas claro para ser analizado. Suponemos que estos casos pueden
corresponder a aquellos en los que la cantidad inicial de material genómico viral en la muestra obtenida se encuentra en
el límite de la sensibilidad de la técnica.
También pudo verse que 4 muestras presentaron patrones que no pudieron ser asociados con ninguno de los HPVs
identificables por la metodología empleada. Será entonces necesario realizar la secuenciación de estos DNAs virales
amplificados para verificar si se trata de variantes intratípicas, subtipos o nuevos genotipos de HPV.
En esta serie el HPV-16 fue el genotipo más frecuente. Sin embargo, resulta importante la presencia del HPV-58 como
segundo genotipo de mayor frecuencia, debido a que gran parte de las referencias bibliográficas describen al –18, al –
45, al –31 y al -33 como los genotipos más prevalentes, luego del HPV-16. No obstante, la existencia de divergencias
epidemiológicas en cuanto a la frecuencia de los HPVs circulantes en distintas regiones del mundo es ya un hecho
conocido.
CONCLUSIONES
Podemos concluir que en el Nordeste Argentino están presentes los genotipos virales epidemiológicamente más
importantes y los resultados del presente estudio demuestran que además de los HPV-16 y –18, que son los de mayor
prevalencia a nivel mundial, se debe prestar atención a otros genotipos que pudieran ser de importancia epidemiológica
local, como ser el HPV-58.
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