informe técnico de proyecto - Universidad Latina de Panamá

INFORME TÉCNICO DE PROYECTO
Organismo ejecutor:
Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudios en Salud
Nombre del proyecto:
DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE TOXINAS EN
ENVENENAMIENTOS POR ESPECIES DE OFIDIOS Y ALACRANES
PANAMEÑOS
FID10-026
Código del proyecto:
Nombre del investigador
principal:
Cirilo R. Lyons G.
Dirección y datos de
contacto:
Lic. Josué Young Á.
Arraiján, Vista Alegre, Casa A-111, 3444306, 64115999
[email protected], [email protected]
www.gorgas.gob.pa
Instituciones: Universidad Latina de Panamá, Serpentario
Maravillas Tropicales
Co-investigadores: Omar Dupuy, PhD; Lic. Josué Young, Lic. Thiago
Vial, Lic. Mario Urriola, John Cox, MSc., Lic. Johanna Juliao, Lic.
Marlon Nuñez
Colaboradores:
Fecha de entrega de este
informe:
09, 03, 2012
Etapa del proyecto:
Etapa 1
Período cubierto en este
informe:
Marzo-Febrero
Tiempo de ejecución del
proyecto:
36 meses
Monto total del proyecto:
B/. 50,000.00
Monto asignado a la etapa
en curso:
B/. 12,500.00
1
Contenido
Sección
Resumen
Página
2
Abstract
2
Antecedentes
3
Beneficios y principales beneficiarios
4
Impacto esperado
4
Objetivos del proyecto
5
Colaboradores del proyecto
6
Metodología
8
Productos
14
Estrategia de divulgación del proyecto
26
Conclusiones y recomendaciones
27
Bibliografía
28
Anexos
29
Agradecimientos
Agradecemos a la Secretaria Nacional de Ciencia y Tecnología por financiar este proyecto. De igual
forma a los estudiantes de la carrera de biotecnología de la Universidad Latina de Panamá por su
colaboración en algunos ensayos de laboratorio.
2
Título del proyecto:
DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE TOXINAS EN
ENVENENAMIENTOS POR ESPECIES DE OFIDIOS Y ALACRANES PANAMEÑOS
Palabras claves: Biotecnología, Toxinas, serpientes, escorpiones, in vitro, ELISA, Bothrops asper,
Micrurus sp., Tityus sp.
Resumen
Los envenenamientos por serpientes y escorpiones representan un problema de salud pública.
Hasta este momento no se cuenta con un método diagnóstico para identificar el animal causante
del envenenamiento. Por lo cual nos propusimos diseñar un método diferencial para identificación
de los diferentes venenos. Primeramente realizamos giras de colectas 1 en Punta Soropta, Bocas
del Toro y 4 en El Valle de Antón, Coclé. En estas giras se colectaron 10 Bothrops asper, 4 Micrurus
sp., 9 Bothriechis schlegelii, 5 Porthidium lansbergii y 9 Tityus cerroazul. Luego de lo cual se realizó
la extracción del veneno y este fue preservado a -20°C. Una vez en el laboratorio se diseñó un
esquema de inmunización de ratones Balb/c utilizando veneno de B. asper, P. lansbergii y Tityus
cerroazul. Se tomaron muestras de sangre semanalmente y se separó el suero centrifugando, para
luego preservarlo a -20°C. Se realizaron pruebas de hemólisis con los venenos de B. asper y P.
lansbergii para evaluar la actividad hemolítica. Se realizaron pruebas de ELISA para determinar la
especificidad de los sueros generados con los esquemas de inmunización. Utilizando los sueros
producidos inmunizando ratones se logró identificar el veneno utilizado para generarlos.
Abstract
Poisonings by snakes and scorpions are a public health problem. So far there is no diagnostic
method to identify the animal causing the poisoning. Therefore we designed a method for
differential identification of the different poisons. First, we carry out collecting field trips 1 on
Bocas del Toro and 4 in El Valle de Anton. In these field trips we collected 10 Bothrops asper, 4
Micrurus sp., 9 Bothriechis schlegelii, 5 Porthidium lansbergii and 9 Tityus cerroazul. Following that,
we performed venom extraction and preserve at -20°C. Once in laboratory, we designed an
immunization scheme of Balb/c mice using B. asper, P. lansbergii and Tityus cerroazul venom.
Blood samples were taken weekly and serum was separated by centrifuging, then preserving them
at -20°C. Hemolysis tests were performed with the venom of B. asper and P. lansbergii to evaluate
hemolytic activity. We realized ELISA tests to determine the specificity of the generated sera with
our immunization schemes. Using these same serums we achieve to identify which venom was
used to generate them.
3
Antecedentes
El accidente ofídico en nuestra región centroamericana representa un aspecto importante a
considerar en los sistemas de salud, especialmente aquellos situados en áreas rurales con mayor
probabilidad de que se presenten. Uno de los centros de investigación fundados con el fin de
solventar este problema fue el Instituto Clodomiro Picado en Costa Rica. Los cuales ya en 1984
(Gutiérrez JM, et al 1984) presentaron el aislamiento de una de las tantas toxinas que componen
el veneno de serpiente, en este caso de la serpiente con mayor incidencia de casos reportados de
envenenamientos en toda la región, nos referimos a la Bothrops asper comúnmente llamada en
nuestro país como “X” o barba amarilla. Este aislamiento se dio mediante cromatografía de
intercambio iónico y a la vez se ensayo su efecto en músculo esquelético. Ya para 1988 Lomonte B.
y Kahan L lograron producir anticuerpos monoclonales dirigidos a bloquear la actividad de esta
miotoxina de B. asper. Estas y otras investigaciones iban dirigidas a mejorar la calidad de
antiveneno producido hasta entonces debido a que ya se habían reportado diferencias en la
efectividad de antivenenos provenientes de otros lugares por la diversidad en la composición del
veneno de la misma serpiente en distintas regiones.
Hoy en día existen una infinidad de pruebas que utilizan como fundamento la interacción
anticuerpo-antígeno, para dar un resultado indicativo ya sea de una enfermedad, intoxicación,
presencia de un microrganismo, entre otros. La idea de una prueba de detección de toxinas
basada en la interacción anticuerpos-toxinas tiene el mismo principio y podría permitir el
reconocimiento del agente causal de un envenenamiento tanto por serpiente como por escorpión.
Esto se ha logrado con éxito en un dispositivo australiano cuya investigación estuvo a cargo de Cox
y col. en 1992. Dicho dispositivo es capaz de dar un resultado diferencial para el envenenamiento
de diversas especies de serpientes con las que se cuenta en esa región. Dado que en esa región se
cuenta hasta con cinco tipos de serpientes (que difieren considerablemente en la composición de
su veneno) al igual que antivenenos neutralizantes para cada una de ellas. Este kit es de gran
ayuda a los médicos para determinar con rapidez el tratamiento más eficaz en virtud de la
utilización del suero antiofídico (SAO) más apropiado, evitando mayores riesgos para los pacientes.
Este kit funciona como un ELISA solo que la diferencia en tiempo para el diagnóstico se logra
debido a que el conjugado esta liofilizado en cada pocillo junto con los anticuerpos-antiveneno de
las distintas serpientes, una vez que se añade la muestra de fluido, se arma el “sándwich” de
anticuerpo, veneno, conjugado y ocurre el cambio de color en uno de los pocillos gracias al
sustrato.
Aparte de la prueba diagnóstica que existe en Australia no se tienen reportes de alguna otra
prueba que permita identificar de qué tipo de envenenamiento se trata ya fuera por serpiente o
escorpión. Nuestra idea no sólo se limita a un diagnóstico que podría diferenciar entre especies de
serpientes y escorpiones, sino también procurar que arroje resultados semicuantitativos de cuánto
veneno fue inoculado y relacionarlo con la dosis de SAO necesaria para contrarrestar el efecto del
veneno, es decir la relación entre cantidad de veneno inoculado y la cantidad de suero
neutralizante necesaria. Esto, entre otras cosas, ayudaría al uso adecuado del SAO en cada
paciente evitando así sobredosis que pueden tener efectos adversos en el paciente como
enfermedad del suero, choque anafiláctico entre otros (Instituto Clodomiro Picado). Aunque se
cuentan con pruebas hoy en día como ELISAs y otras inmunológicas en nuestra región
centroamericana, más no en Panamá, estas toman mucho tiempo que podría ser utilizado en el
tratamiento indicado para el paciente.
4
Beneficios y principales beneficiarios
Entre los beneficios que brindaría sería el proveer a los medios de salud de una herramienta con la
capacidad de realizar la identificación del agente causal de manera rápida y además brindando una
cantidad aproximada de viales o ampollas que deben ser suministradas, facilitando así la labor del
encargado de atender al paciente. Otro beneficio para los encargados de salud sería la utilización
precisa de viales de sueros neutralizantes evitando así malgastar fondos estatales por la aplicación
excesiva de ampollas.
Se puede mencionar también que con esta herramienta se podría llevar una estadística más
precisa de la cantidad de casos reportados, agente causal, grado de envenenamiento en relación a
la cantidad de veneno inoculado, tiempo de progreso y restablecimiento del paciente, en fin, sería
de gran utilidad también con fines investigativos posteriores y para reportes epidemiológicos.
Como beneficiarios se podría mencionar a las personas que trabajan en el campo diariamente los
cuales son más propensos a este tipo de encuentros con estos animales ponzoñosos; ellos
recibirían una atención más rápida minimizando así riesgos de lesiones permanentes o incluso la
muerte, ya fuera por la no aplicación del suero, por la demora en la misma, por falta en la cantidad
de viales o por la aplicación de demasiados de ellos causándole reacciones adversas. Aparte todas
las demás personas, que aunque no realicen trabajos con mayor peligro de estos accidentes, se
ven involucradas en casos también.
Una vez diseñado y ensayado dicho dispositivo se adaptaría para extender su alcance a toda
nuestra región centroamericana, ya que compartimos muchas de las especies causantes de
envenenamientos ya sea por ofidios o escorpiones, siendo de suma importancia Bothrops asper o
Equis.
Impacto esperado
Este proyecto se vislumbra como una herramienta novedosa en el tratamiento médico de los
envenenamientos por animales. Dándole al personal de salud, la facilidad de elección rápida de
qué antiveneno suministrar al paciente y poder dar seguimiento a su progreso clínico. Para esto,
sería de utilidad que la prueba fuese por lo menos semicuantitativa para determinar los diferentes
grados de envenenamientos extrapolándolos a los parámetros actuales pues se pretende
determinar semicuantitativamente el nivel de toxinas en algún fluido corporal (ej. sangre), lo que
permitiría dar seguimiento en tiempo real a la recuperación del paciente, más allá de los síntomas
y todas las pruebas bioquímicas que se utilizan actualmente. Esta prueba podría complementar o
incluso remplazar, según sea el caso, el conjunto de pruebas de laboratorio que se utilizan para
darle seguimiento al paciente.
Desde un punto de vista comercial, de lograrse el diseño de este dispositivo se procuraría la
producción del mismo en conjunto con alguna empresa que trabaje con este tipo de métodos
5
diagnósticos. Para la exportación del mismo a distintos países de Centroamérica, realizando los
respectivos ajustes de ofidios/escorpiones presenten en sus respectivas regiones. Para ello
primeramente se tiene contemplado la protección intelectual de dicho dispositivo mediante una
patente de acuerdo con lo contemplado con las disposiciones legales panameñas y de la región.
Objetivos del proyecto
Objetivo general
Determinar los niveles de toxinas en casos por envenenamiento por especie de ofidios y alacranes.
Objetivos específicos





Ensayar técnicas de adhesión de anticuerpos contra toxinas de Bothrops asper, Micrurus sp.,
Tityus pachyurus y T. parvulus a un soporte sólido.
Determinar de los niveles de toxinas de Bothrops asper, Micrurus sp, Tityus pachyurus y T.
parvulus en un modelo animal.
Estandarizar la cantidad de antisuero neutralizante a utilizar, determinando los niveles séricos
de las toxinas de Bothrops asper, Micrurus sp, Tityus pachyurus y T. parvulus en el modelo
animal.
Identificar agente causal del envenenamiento en muestras de sangre provenientes de
hospitales nuestro país.
Relacionar los niveles de toxinas presentes en muestras sanguíneas de pacientes con la dosis
suministrada para su tratamiento.
Objetivos de esta etapa

Ensayar técnicas de adhesión de anticuerpos contra toxinas de Bothrops asper, Micrurus
sp., Tityus pachyurus y T. parvulus a un soporte sólido.
Colaboradores del proyecto
6
La presente investigación es llevada a cabo por parte de investigadores del Instituto
Conmemorativo Gorgas de Estudios en Salud y de la Universidad Latina de Panamá. El trabajo de
laboratorio se ha realizado en el Instituto de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biomédicas
de la Universidad Latina de Panamá. Las extracciones de veneno fueron realizadas en el
Serpentario Maravillas Tropicales en el Valle de Antón.
Contacto Principal
Lic. Josué Young
Investigadores
Cirilo Lyons, MSc
Omar Dupuy Loo,
MD, PhD
Lic. Thiago Vial
Campis
John Cooper Cox,
MSc
Lic. Mario Urriola
Hernández
Correo electrónico
[email protected]
Teléfono
64115999
Entidad
Instituto
Conmemorativo
Gorgas
[email protected],
[email protected]
67176720
[email protected]
67110916
Instituto
Conmemorativo
Gorgas
Universidad Latina
de Panamá
[email protected]
68398057
[email protected]
(03)5428 9354
[email protected]
65692676
Lic. Johanna Juliao [email protected]
62374288
Amaya
[email protected] 69692431
Lic. Marlon Nuñez
Serpentario
Maravillas
Tropicales
Universidad Latina
de Panamá
Universidad Latina
de Panamá
7
INVESTIGADOR
FUNCIONES
% DE
DEDICACIÓN
MENSUAL
Estuvo encargado de toda la coordinación necesaria para que se pudiera llevar a cabalidad
con lo propuesto. Asignó funciones y papeles dentro del cronograma de actividades con el
fin de agilizar la investigación lo más posible.
MSc. Cirilo R.
Lyons
PhD. Omar
Dupuy
Lic. Josué Young
Ávila
Lic. Thiago Vial
Campis
20%
Se encargó del acondicionamiento y adecuación del laboratorio una vez se compraron los
insumos, equipos y demás cosas. Asesoró a los demás investigadores en las mejores
opciones para cada uno de los experimentos que se realizaron. Ayudó al investigador
principal en la organización de los datos experimentales, esperando generar información
valiosa, capaz de ser publicable en medios científicos reconocidos internacionalmente.
Fue encargado de la recolección de información generada en el proceso de investigación y
la elaboración de los informes científicos necesarios para la presentación ante SENACYT.
Desempeñó funciones administrativas necesarias para el desarrollo del proyecto. En
cuanto al trabajo de laboratorio, estuvo encargado del diseño del ELISA para la detección
de los anticuerpos generados (sueros) a partir de la inoculación de los distintos venenos. A
la vez de la medición de los títulos de anticuerpos producidos por los animales de
experimentación. Fungió como el enlace principal para mantener un contacto activo con
MSc. John C. Cox, el cual actuará como consultor del proyecto.
Se encargó de la comunicación dentro del grupo de investigación. Participó de giras de
colecta de especies de ofidios y alacranes en Punta Soropta, Bocas del Toro y el Valle de
Antón.
20%
30%
20%
Fungió como consultor del proyecto debido a su experiencia previa en el diseño de este
tipo de dispositivos.
MSc. John C. Cox
10%
8
Lic. Mario
Urriola
Hernández
Lic. Johanna
Juliao Amaya
Dirigió las giras de colecta de ofidios y escorpiones, así como la extracción del veneno de
ambos, debido a sus años de experiencia en el manejo de estos animales peligrosos.
También se encargó del cuidado y mantenimiento de los animales, con todas las medidas
necesarias para evitar enfermedades en los animales; entre estas la temperatura,
humedad, alimentación, etc.
Se encargó de la alimentación y mantenimiento de los ratones necesarios en el proyecto
de investigación. Participó en una de las giras de colecta de ofidios y escorpiones. Además
se encargó de la preservación en frío de los distintos venenos colectados en campo.
Colaboró con el protocolo de investigación requerido por el Comité Nacional de Bioética.
20%
25%
Se encargó de la alimentación y mantenimiento de los ratones necesarios en el proyecto
de investigación. Realizó algunos de los ensayos de ELISA de esta primera fase. Colaboró
con el protocolo de investigación requerido por el Comité Nacional de Bioética
Lic. Marlon
Núñez
15%
Metodología
Materiales y métodos
El presente proyecto de investigación se divide en tres etapas: in vitro, modelos animales y
muestras humanas. Las cuales indican con qué tipo de muestras se estará trabajando en dicha
etapa. El presente informe es de la etapa in vitro.
Se inició con la recolección de serpientes y escorpiones a los cuales se les extrajo veneno crudo el
cual fue conservado para realizar las pruebas posteriores. Una vez se obtuvo el veneno, se produjo
el antisuero mediante la inoculación del veneno en ratones. Luego a dichos ratones se les extrajo
el suero total. Se realizó una prueba de hemólisis para comprobar que el veneno contenía parte
tóxica activa y a la vez ver si los anticuerpos generados inmunizando ratones tenían un efecto
neutralizante contra el mismo. Finalmente, este suero fue utilizado para generar un ensayo tipo
ELISA que pudiera identificar el veneno utilizado para su producción.
9
Actividades desarrolladas
1. Compra de insumos y equipos
El proceso de compra de equipos, reactivos y otros insumos se realizó de conformidad con las
normas establecidas por SENACYT.
2. Giras de colecta
Se realizaron giras de colecta para la captura de ejemplares de ofidios y escorpiones.
Fecha
2 de septiembre de 2011
Participantes
Lic. Mario Urriola,
Lugar
Especies Colectadas
Valle de Antón, Coclé
5 Bothrops asper
Punta Soropta, Bocas
del Toro
1 Bothrops asper
Valle de Antón, Coclé
2 Bothrops asper
Lic. Thiago Vial,
Lic. Josué Young
19 al 23 de septiembre de Lic. Mario Urriola,
2011
Lic. Thiago Vial,
10 Bothriechis schlegelii
Lic. Josué Young
16 de octubre de 2011
Lic. Mario Urriola,
Lic. Thiago Vial,
2 Porthidium lansbergii
Lic. Josué Young
20 de noviembre de 2011
Lic. Mario Urriola,
Valle de Antón, Coclé
Lic. Thiago Vial
12 al 14 de diciembre de Lic. Mario Urriola,
2011
Lic. Johanna Juliao,
2 Bothrops asper
3 Porthidium lansbergii
Valle de Antón, Coclé
2 Micrurus nigrocinctus
9 Tityus cerroazul
Lic. Josué Young
Los especímenes colectados se mantienen en cautiverio en terrarios acondicionados según las
necesidades tanto de las serpientes como de los escorpiones con la colaboración de Lic. Mario
Urriola el cual está altamente relacionado con la colecta de ofidios y de alacranes. Esta
ambientación incluye temperatura adecuada, así como la medición de la misma diariamente. Se
10
cuenta con un bebedero para cada una. Son alimentadas de acuerdo a las preferencias según
especies.
3. Obtención de veneno
Se realizó la extracción de veneno de las serpientes: Bothrops asper, Porthidium lansbergii,
Micrurus nigrocinctus, y de escorpiones: Tityus cerroazul.
Para la extracción del veneno de las serpientes se utilizó el método tradicional de ordeño, el cual
consiste en poner a la serpiente a morder un guante que cubre un envase y se exprimen
manualmente sus glándulas y finalmente recoger el veneno. Para la extracción del veneno de los
escorpiones se usó un método similar sosteniendo el aguijón contra un envase de menor tamaño.
Una vez extraído todo se mantuvo congelado a -20°C para evitar alteraciones en la composición
química de los mismos.
Se asignó un código para cada uno de los venenos preservados en el laboratorio, el cual es el
siguiente:
B.A.  Bothrops asper
P.L.  Porthidium lansbergii
V.A.  El Valle de Antón, Coclé
B.T.  Punta Soropta, Bocas del Toro
Especie # de espécimen
fecha de extracción
Ejemplo: B.A.-B.T.-73-1/16-03-2012
Lugar de colecta # de ordeño
Lista de venenos
B.A.-V.A. 1-1/2-9-11
B.A.-V.A. 7-1/16-10-11
B.A.-V.A. 11-2/14-12-11
B.A.-V.A. 2-1/2-9-11
P.L.-V.A. 8-1/16-10-11
P.L.-V.A. 12-1/20-11-11
B.A.-V.A. 3-1/2-9-11
P.L.-V.A. 9-1/16-10-11
P.L.-V.A. 13-1/20-11-11
B.A.-V.A. 4-1/2-9-11
B.A.-V.A. 10-1/20-11-11
P.L.-V.A. 14-1/20-11-11
B.A.-V.A. 5-1/2-9-11
B.A.-V.A. 10-2/14-12-11
M.C.-V.A. 15-1/14-12-11
B.A.-V.A. 6-1/16-10-11
B.A.-V.A. 11-1/20-11-11
M.C.-V.A. 16-1 /14-12-11
11
T.C.-V.A. 17-1 /14-12-11
T.C.-V.A. 20-1 /14-12-11
T.C.-V.A. 18-1 /14-12-11
T.C.-V.A. 21-1 /14-12-11
T.C.-V.A. 19-1 /14-12-11
T.C.-V.A. 22-1 /14-12-11
T.C.-V.A. 23-1 /14-12-11
4. Producción de Antisuero
Se utilizaron ratones BALB/c de entre 5-8 semanas de edad, los cuales fueron mantenidos en
condiciones ambientales estándares. Los animales fueron alimentados con una dieta de “pellet”
estándar y agua ad libitum.
Se diseñó un esquema de inmunización con veneno crudo de Bothrops asper, el cual consistió en
lo siguiente:
Día
Cantidad Veneno (uL)
Adyuvante (uL)
0
0.5
99.5 Adyuvante Completo
7
1.0
99 Adyuvante Incompleto
14
1.0
99 Adyuvante Incompleto
26
1.5
98.5 Adyuvante Incompleto
33
1.5
98.5 Adyuvante Incompleto
También se diseñó un esquema de inmunización con veneno crudo de Porthidium lansbergii, el
cual consistió en lo siguiente:
Día
Cantidad Veneno (uL)
Adyuvante (uL)
0
0.5
99.5 Adyuvante Completo
7
1.0
99 Adyuvante Incompleto
19
1.0
99 Adyuvante Incompleto
26
1.5
98.5 Adyuvante Incompleto
37
1.5
98.5 Adyuvante Incompleto
12
Adicionalmente se diseñó un esquema de inmunización con veneno crudo de Tityus cerroazul,
consistiendo en lo siguiente:
Día
Cantidad Veneno (uL)
Adyuvante (uL)
0
0.5
99.5 Adyuvante Completo
7
1.0
99 Adyuvante Incompleto
14
1.0
99 Adyuvante Incompleto
21
1.5
98.5 Adyuvante Incompleto
28
1.5
98.5 Adyuvante Incompleto
Se utilizaron 5 ratones a inmunizar y 5 ratones control por grupo de inmunización. Cada semana se
realizó extracción sanguínea retro orbitalmente desde el día 0 hasta el último día de inmunización.
La sangre una vez extraída se centrifugó a 14,000 rpm por 10 minutos para separar el plasma de
los eritrocitos. Se congelaron a -20°C.
5. Ensayo de Hemólisis
Se realizó una prueba de hemólisis utilizando veneno crudo de Bothrops asper y de Porthidium
lansbergii. Se vertió 1.25uL de veneno crudo y 2.5uL de sueros de ratón a ensayar. Esta mezcla se
incubó a temperatura ambiente por 2 horas. Luego de la incubación se añadió 121.25uL de PBS.
Esta mezcla se centrifugó por 5 minutos a máxima velocidad. Se pasó 109uL del sobrenadante a
otro tubo. Se extrajo sangre venosa humana en tubos heparinizados. Se diluyó 1mL de esta sangre
en 3mL de PBS. Se realizaron 3 lavados con PBS a 2000 rpm por 5 minutos. Finalmente se
suspendieron los eritrocitos en 3mL de PBS. De estos eritrocitos se agregó 11uL en cada tubo. Se
incluyeron controles con agua destilada, PBS y veneno. Se incubaron por 2 horas a temperatura
ambiente. Luego de la incubación se centrifugó por 5 minutos a 2000 rpm. Se extrajo 100uL del
sobrenadante y se agregó al respectivo pocillo en un plato de 96 pocillos (Costar® 3595, EEUU). Se
leyó el plato a 492nm usando un lector de platos de ELISA (HumaReader HS, Alemania).
6. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima
Se diluyó 0.5uL del veneno crudo de Bothrops asper en 49.5uL de buffer de recubrimiento
(Carbonate-Bicarbonate Buffer, Sigma, EE.UU) por pocillo, y se incubó toda la noche a 4C. Los
platos fueron lavados cuatro veces con buffer de salina fosfato pH 7.4 (PBS, Sigma, EE.UU) que
13
contiene Tween 20 al 0.1% (Tween 20, AppliChem, Alemania). Luego los platos fueron cubiertos
con PBS que contiene 5% de leche en polvo y se incubaron durante 1 hora a 37C. Posteriormente
los platos se lavaron cuatro veces con PBS-Tween y se le añadió 100 l de muestra de suero
diluido 1:50 en PBS que contenía leche descremada al 5% a cada pocillo. Se incubaron durante 1
hora a 37C y se lavaron con PBS-Tween. Luego de esto, se agregó 100 l de anticuerpos marcados
con peroxidasa (Anti-Mouse IgG, Jackson ImmunoResearch, EE.UU), diluida 1:5000 veces en PBS
que contiene 5% de leche en polvo a cada pocillo, y se incubaron los platos durante 1 hora a 37C.
Los platos serán lavados con PBS-Tween y se agregó 100 l de una solución de o-fenilenediamina
(o-phenylenediamine dihydrochloride, Sigma, EE.UU) a 2 mg/ml en buffer fosfato de potasio al
0.01 M, pH 7.3 (Citrate-Phosphate Buffer, Sigma, EE.UU) en presencia de peróxido de hidrógeno
(Hydrogen Peroxide, Fischer Scientific, EE.UU) al 0.06%.
La reacción se desarrolló durante 10 min a 37°C en oscuridad. Luego de lo cual se detuvo
añadiendo HCl al 1 M por pocillo y se leyó la densidad óptica a 492 nm con un lector de platos de
microtitulación (HumaReader HS, Alemania).
Esta prueba se realizó también utilizando veneno crudo de Porthidium lansbergii y de igual forma
se realizó otro para determinar si los sueros generados mediante la inmunización de ratones
presentaban reacción cruzada uno con los otros.
7. Análisis estadístico
Se analizaron los resultados promediando las absorbancias y calculando la desviación estándar y
se expresaron de igual. Los valores fueron considerados significativos si P  0.05.
8. Elaboración de informes y publicaciones
Se elaboraron los informes administrativos, económicos y científicos siguiendo las disposiciones
establecidas por SENACYT.
9. Informe de Etapa I (revisión por parte de SENACYT)
Se envía este documento para revisión por parte de SENACYT.
14
Productos
1. Compra de insumos y equipos: Todos los insumos comprados por los fondos de este
proyecto se encuentran en el Instituto de Investigación en Biotecnología y Ciencias
Biomédicas, Facultad de Medicina, en la Universidad Latina de Panamá. El equipo para
captura y manejo de serpientes se encuentra en el Serpentario Maravillas Tropicales, el
Valle de Antón, Coclé.
Lista de Insumos
Nombre
Tween 20
Buffer CarbonatoBicarbonato en
cápsulas
Buffer FosfatoCitrato en tabletas
Glicerol
Peróxido de
hidrógeno
Sulfato de Amonio
Tiras de ELISA de
16 pocillos
Pipetas Pasteur de
borosilicato de 5 ¾
Pipeta de volumen
variable, rango de
100 a 1000 µL.
Bolsa de puntas
para micropipetas
de 1000uL
Microtubos de
polipropileno de
1.5 ml
Tubos cónicos con
tapa de 15 ml
PBS (Buffer fosfato
salino),
presentación en
sobre.
Gancho
Herpetológico
Cantidad
1 Frasco de 500ml
1 Frasco de 50
cápsulas
1 Frasco de 50
tabletas
1 Frasco de
500mL
1 Frasco de
500mL
1 Frasco de 500g
2 Paquetes de
320
3 Cajas de 250
1
4 Bolsas de 1000
2 Bolsas de 1000
1 Paquete de 50
1 Caja de 50
sobres
15
Guante y manga
protectora
Enzima peroxidasa
Polvo liofilizado
Suero
Antialacránico
Adyuvante
completo de
Freund
Dihidrocloruro de
o-fenilendiamina
Adyuvante
incompleto de
Freund
Solución de
glutaraldehído al
50%
Presentación de
500 mg
10 ampollas de
5ml
2 frascos de 10mL
1 Caja de 50
Tabletas de 30mg
2 frascos de 10mL
1 Frasco de 1L
2. Giras de Colecta:
Lista de especímenes colectados
Nombre común
Víbora de
pestaña
Nombre común
Equis
Coral verdadera
Patoca
Escorpión
Nombre científico
Bothriechis
schlegelii
Nombre científico
Bothrops asper
Micrurus
nigrocinctus
Porthidium
lansbergii
Tityus cerroazul
3. Obtención de Veneno: Todas las muestras de veneno se mantienen preservadas a -20°C
en las instalaciones del Instituto de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biomédicas,
Facultad de Medicina, en la Universidad Latina de Panamá.
16
Muestra de
veneno
Preservado a
-20°C
4. Antisuero: Todas las muestras de sueros producidas inmunizando ratones se mantienen
preservadas a -20°C en las instalaciones del Instituto de Investigación en Biotecnología y
Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, en la Universidad Latina de Panamá.
Muestra de
Suero de ratón
Preservado a
-20°C
5. Ensayo de hemólisis:
Protocolo para prueba de actividad hemolítica de venenos











Realizar una mezcla de 1.25µl de veneno crudo a ensayar y 2.5µl de suero de ratón a
ensayar. Esta mezcla se incuba a temperatura ambiente por 2 horas.
Luego de la incubación se añadir 121.25µl de PBS y mezclar gentilmente.
Centrifugar por 5 min a máxima velocidad.
Luego pasar 109µl del sobrenadante, a otro tubo en donde se procederá añadir los
eritrocitos.
Extraer sangre venosa en tubo con EDTA y/o heparina cuidando de no producir hemolisis,
la sangre debe utilizarse dentro de un plazo no mayor de 4 horas después de su
extracción.
Diluir 1 ml de sangre en 3ml de PBS. Realizar 3 lavados con PBS a 2000 rpm por 5 minutos
y re suspender los eritrocitos en 3ml de PBS.
Agregar 11µl de eritrocitos en cada tubo a ensayar.
Incluir controles con agua destilada y PBS.
Incubar por 2 horas todos los tubos a temperatura ambiente.
Luego de la incubación centrifugar por 5 minutos a 2000rpm. Sacar luego 100µl del
sobrenadante y agregarlos a los pocillos de un plato de cultivo de 96 pocillos.
Leer absorbancia a 492nm en un lector de platos de ELISA.
17
6. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima:
Protocolo para identificación de venenos mediante técnica de ELISA

Diluir 0.5uL de veneno crudo en 49.5uL de buffer de recubrimiento (CarbonateBicarbonate Buffer, Sigma, EE.UU) por pocillo, e incubar toda la noche a 4C.

Lavar los platos cuatro veces con buffer de salina fosfato pH 7.4 (PBS, Sigma, EE.UU) que
contenga Tween 20 al 0.1% (Tween 20, AppliChem, Alemania).

Bloquear los pocillos con PBS que contenga 5% de leche en polvo e incubar durante 1 hora
a 37C.

Posteriormente, lavar los platos cuatro veces con PBS-Tween y añadir 100 l de muestra
de suero diluido 1:50 en PBS que contenga leche descremada al 5% a cada pocillo e
incubar durante 1 hora a 37C

Lavar cuatro veces con PBS-Tween y agregar 100 l de anticuerpos marcados con
peroxidasa (Anti-Mouse IgG, Jackson ImmunoResearch, EE.UU), diluida 1:5000 veces en
PBS que contenga 5% de leche en polvo a cada pocillo, e incubar los platos durante 1 hora
a 37C.

Lavar los platos cuatro veces con PBS-Tween y agregar 100 l de una solución de ofenilenediamina (o-phenylenediamine dihydrochloride, Sigma, EE.UU) a 2 mg/ml en buffer
fosfato de potasio al 0.01 M, pH 7.3 (Citrate-Phosphate Buffer, Sigma, EE.UU) en presencia
de peróxido de hidrógeno (Hydrogen Peroxide, Fischer Scientific, EE.UU) al 0.06%.

Desarrollar la reacción durante 10 minutos a 37°C en oscuridad.

Detener la reacción añadiendo HCl al 1 M por pocillo y leer absorbancia a 492 nm con un
lector de platos de microtitulación (HumaReader HS, Alemania).
7. Análisis estadístico:
Prueba de Hemólisis con veneno crudo de B. asper
18
vacío
Agua
PBS
Veneno
solo
Suero -
Suero 2
Suero 5
SAO
0.039
0.517
0.115
0.207
0.15
0.01
0.126
0.129
0.039
0.686
0.143
0.241
0.161
0.012
0.169
0.132
Promedio
0.039
0.6015
0.129
0.224
0.1555
0.011
0.1475
0.1305
SD
0
0.1195
0.01980
0.0240
0.0078
0.0014
0.0304
0.0021
Tabla 1. Resultados de prueba de hemólisis con veneno crudo de B. asper. Los datos presentados son las
absorbancias a 492nm. Estos datos se promediaron y se calculó la desviación estándar.
Agua
PBS
Veneno
solo
Suero -
Suero 2
Suero 5
SAO
% de Hemólisis
85.95
19.12
34.41
24.94
1.66
20.95
21.45
% de Hemólisis
114.05
23.77
40.07
26.77
2.00
28.10
21.95
Promedio
100.00
21.45
37.24
25.85
1.83
24.52
21.70
SD
19.87
3.29
4.00
1.29
0.24
5.05
0.35
Tabla 2. Se presenta el porcentaje de hemólisis de cada muestra. El mismo se calculó dividiendo
cada absorbancia de la tabla anterior entre el promedio de las absorbancias del control con agua
por 100. De igual forma se calculó el promedio y la desviación estándar. Ver en anexos el Gráfico 1.
Prueba de Hemólisis con veneno crudo de P. lansbergii
19
Promedio
SD
Agua
0.351
0.368
0.3595
0.012
PBS
0.137
0.161
0.149
0.017
Veneno
0.124
0.147
0.1355
0.016
Ratón 1
0.167
0.192
0.1795
0.018
Ratón 2
0.149
0.145
0.147
0.003
Ratón -1
0.01
0.011
0.0105
0.001
Ratón -2
0.12
0.138
0.129
0.013
Tabla 3. Resultados de absorbancias del ensayo de hemólisis con
veneno crudo de P. lansbergii. No se pudo apreciar un efecto
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima con veneno de B. asper
hemolítico claro de este veneno, ni efecto neutralizante de los
sueros de ratones inmunizados.
Controles Negativos
Sueros de ratones inmunizados
Vacío
Ratón 3 -
Ratón 5 -
Ratón 1
Ratón 2
Ratón 3
Ratón 4
Ratón 5
0.08
0.44
1.17
2.83
3.33
2.99
2.87
3.08
0.08
0.32
1.80
2.77
3.07
2.99
2.93
3.14
Promedio
0.08
0.38
1.48
2.80
3.20
2.99
2.90
3.11
SD
0.00
0.08
0.45
0.04
0.19
0.00
0.04
0.04
Tabla 4. Se muestran las absorbancias obtenidas utilizando dos sueros de ratones controles y
cinco sueros de ratones inmunizados con veneno crudo de B. asper luego de 40 días. Se observa
una elevada reacción en los ratones inmunizados lo que se relaciona con los títulos de anticuerpos
contra el veneno. Se observó una elevada reacción con el suero control negativo 5, por lo que se
decidió repetir el ensayo con todos los sueros ensayos y controles de todos los días muestreados.
Ver en anexos Gráfico 2.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima con veneno de B. asper (Día 0 al 40)
Día 0
Día 7
Día 14
Día 26
Día 33
Día 40
Ratones
control
negativo
Ratones
inmunizados
20
0.24
0.28
0.02
0.29
0.35
0.25
0.22
0.24
0.32
0.28
1.38
1.90
1.33
2.08
1.21
0.24
0.29
0.28
0.29
0.27
2.58
2.52
2.29
2.50
2.45
0.23
0.29
0.30
0.26
0.25
2.53
2.48
2.31
2.50
2.61
0.27
0.27
0.28
0.25
0.26
2.62
2.61
0.02
2.76
2.72
0.27
0.28
0.33
0.30
0.30
2.40
2.63
2.57
2.60
2.57
0.28
0.28
0.32
0.27
0.28
Tabla 5. Promedio de las absorbancias obtenidas utilizando sueros de ratones
inmunizados con veneno de B. asper. Se extrajo una muestra de sangre cada día que se
muestra. Grupo en rojo fueron los ratones inmunizados y el grupo control en azul. Se
aprecia un incremento en la absorbancia desde el día 7 del grupo de ratones inmunizados
no así en los controles. Ver en anexos Gráfico 3.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima con veneno de P. lansbergii (Día 0 al 37)
Ratones
inmunizados
Día 0
0.29
0.32
0.31
0.03
0.02
Día 7
0.42
0.39
0.42
0.40
0.34
Día 19
0.98
0.96
1.32
0.59
1.11
Día 26
0.37
1.53
1.80
1.65
1.12
Día 37
1.71
1.97
1.89
1.73
1.77
Controles
Negativos
0.28
0.28
0.33
0.38
Tabla 6. Promedio de las absorbancias obtenidas utilizando sueros de ratones
inmunizados con veneno de P. lansbergii. Se extrajo una muestra de sangre cada día que
se muestra. Grupo en rojo fueron los ratones inmunizados y el grupo control en gris. Se
aprecia un claro incremento en la absorbancia desde el día 19 del grupo de ratones
inmunizados. Debido a que se ensayaron los sueros de ratones control negativo de todos
los días para B. asper y no se observó cambio alguno, para P. lansbergii solo se utilizaron
los correspondientes a la última toma de muestra sanguínea. Ver en anexos Gráfico 4.
21
Estrategia de divulgación del proyecto
En este punto se han generado afiches informativos del proyecto los cuales fueron distribuidos en
la comunidad del Valle de Antón para comunicar a las personas del propósito del proyecto en
cuestión y a la vez solicitar su apoyo de encontrar algún espécimen requerido por el proyecto. Este
afiche fue diseñado y distribuido por el Lic. Mario Urriola Hernández quien funge como coinvestigador de este proyecto.
Además de esto se han incluido algunos estudiantes de la carrera de biotecnología de la
Universidad Latina de Panamá para que adquirieran práctica en la técnica de ELISA y a su vez se les
expuso el proyecto y lo que este busca aportar a la salud de nuestro país.
Con los datos obtenidos de esta primera fase, se tiene contemplado participar este año en
congresos científicos y de ser posible publicar dichos resultados en una revista científica
internacional y/o nacional.
Conclusiones y recomendaciones
De esta primera etapa del estudio realizada entre las fechas de febrero de 2011, hasta marzo del
presente año, concluimos que:
Los ratones BALB/c de entre 5-8 semanas producen altos títulos de anticuerpo a partir de la
segunda semana de inmunización para con el veneno de Porthidium lansbergii (Patoca).
Los ratones BALB/c de entre 5-8 semanas producen altos títulos de anticuerpo a partir de la
primera semana de inmunización para con el veneno de Bothrops asper (Equis).
El veneno de Bothrops asper (Equis), de los animales colectados mostro un moderado nivel de
daño a células rojas durante los ensayos de hemolisis y este moderado efecto hemolítico fue
neutralizado por los anticuerpos presentes en el suero, demostrando así, que los mismos tienen la
capacidad de captura de las toxinas del veneno que estimulo su producción en los ratones.
Los títulos de anticuerpo de Bothrops asper (Equis), presentan una leve reacción cruzada contra el
veneno al levantar bajos niveles de títulos de anticuerpo en un ensayo ELISA, fijando como
antígeno veneno de Porthidium lansbergii (Patoca) y en el caso contrario levanto muy pobre
títulos de anticuerpos.
En las próximas etapas a seguir, invertiremos el orden del sándwich del ensayo de ELISA, para
ahora determinar cuán sensibles son los anticuerpos que obtuvimos de los ratones BALB/c
22
inmunizados contra diferentes concentraciones de veneno y también observaremos su
especificidad al colocarlos en ensayo cruzados con otros venenos.
Recomendamos para estudios posteriores, o paralelos a éste, se investigue que respuestas
inmunológicas promueven que los niveles de títulos de anticuerpo sean obtenidos de una forma
más rápida entre una especie y otra de serpiente, en cuánto a la composición tóxica de su veneno.
Recomendamos se investigue cuál es el componente tóxico en común que debe estar presente en
el veneno de Porthidium lansbergii (Patoca), que también está presente pero en menor cantidad
en Bothrops asper (Equis).
Bibliografía
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antibodies to Bothrops asper (Terciopelo) myotoxin. Toxicon Vol. 26, No. 7, pp. 675-689.
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sandwich EIA and its application to the identification of snake venoms. J. Immunol
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Instituto Clodomiro Picado. Envenenamientos por ofidios: Medidas de prevención y
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Centroamérica: Fisiopatología y tratamiento. Instituto Clodomiro Picado. San José, Costa
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23
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Patiño H., Valderrama O., Alegría S., Pérez C., Rujano F., Perdomo A. 2003-2004
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
Avraméas S, Temynck T, 1971. Peroxidase-labeled antibody and Fab conjugate with
enhanced intra cellular penetration. Immunochemistry 8: 1175–1179.
Anexos
Hemólisis
Gráfico 1. Resultados con los porcentajes de hemólisis utilizando veneno
crudo de B. asper. Se observa un mayor porcentaje de hemólisis en la prueba
utilizando veneno solo en comparación del control con PBS. Sueros Día 40.
ELISA veneno B. asper
24
Gráfico 2. Resultados de las absorbancias registradas en el primer ensayo de ELISA
utilizando sueros de ratones inmunizados para detectar el veneno de B. asper. Se
utilizaron 2 sueros de ratones control negativo y 5 ratones ensayo. Sueros 1:100,
Conjugado 1:5000, Sustrato OPD 2mg/mL, H2O2 0.06%. Sueros Día 40.
ELISA veneno B. asper (Sueros día 0 al 40)
Gráfico 3. Promedio de las absorbancias registradas por cada día desde 0 hasta el 40.
Desde el día 7 se observa un incremento en la absorbancia registrada de los ratones
inmunizados con veneno de B. asper a diferencia de los ratones controles los cuales
se mantuvieron a lo largo del tiempo. Sueros 1:100, Conjugado 1:5000, Sustrato OPD
2mg/mL, H2O2 0.06%.
ELISA veneno P. lansbergii (Sueros día 0 al 40)
25
Gráfico 4. Promedio de las absorbancias registradas por cada día desde 0 hasta el
37. Desde el día 19 se observa un incremento en la absorbancia registrada de los
ratones inmunizados con veneno de P. lansbergii a diferencia de los ratones
controles del último día. Sueros 1:100, Conjugado 1:5000, Sustrato OPD 2mg/mL,
H2O2 0.06%.ELISA para determinar reacción cruzada de sueros
Gráfico 5. Para este ensayo se utilizaron ambos venenos (B. asper y P. lansbergii) fijado al plato. Encima
se añadieron sueros de ratones inmunizados con veneno igual y contrario. Se incluyó el control
negativo de cada veneno fijado al plato. Se observó una reacción ligeramente mayor al exponer el
suero de ratones inmunizados con veneno de Equis contra el veneno de Patoca. De igual forma el caso
contrario. Hecho que es de esperarse ya que ambas serpientes pertenecen a la misma familia por lo
cual comparten componentes en la mezcla que es su veneno.