1. OBJETIVO Describir la metodología para la determinación de

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DETERMINACIÓN DE CARBAMATOS EN AGUAS POR HPLC CON INYECCIÓN DIRECTA,
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1.
OBJETIVO
Describir la metodología para la determinación de siete compuestos derivados de NMetilcarbamiloximas y N-Metil carbamatos en agua natural, residual y sedimentos por
HPLC con derivatización postcolumna y detección por fluorescencia12
2.
2.1.
ALCANCE
Analitos y matrices
Este protocolo describe un procedimiento para la identificación y la determinación de los
siguientes plaguicidas: Aldicarb, Aldicarb sulfona, Aldicarb sulfóxido, Propoxur, Carbaril,
Carbofuran, 3-HidroxiCarbofuran, Metiocarb, Metomil, Oxamil en matrices ambientales
como aguas naturales, aguas residuales y sedimentos.
2.2.
Referencias
La metodología analítica se basa en las referencias documentadas en la bibliografía. El
método EPA 531.1 tiene como alcance la aplicación en aguas potables y naturales y el
Standard Methods 6610 A y B que considera matrices de aguas naturales y residuales.
2.3.
Selección de la metodología
Según el Standard Methods 6610 A., los pesticidas Carbamatos son sensibles y lábiles al
calor por lo que es inconveniente analizarlos por cromatografía de gases. El método
adecuado se basa en la separación compuestos carbámicos y productos derivados, por
HPLC, seguido de una hidrólisis alcalina postcolumna para obtener un producto fluoróforo
que se mide en detector de fluorescencia. La medición por método UV es inadecuada
cuando las muestras no han sido concentradas, debido a su baja sensibilidad.
La tabla Tabla 1 resume varios de las metodologías más utilizadas en la determinación de
plaguicidas carbámicos.
1
Munch J.W., Measurement of N-Methylcarbamoyloximes and N-Methyl-carbamates in water by
direct aqueous injection HPLC with post column derivatization. Rev 3.1. 1995. Environmental
Monitoring Systems Laboratory. U.S. EPA 531.1
2
Pesticidas Carbamatos. Standard Methods 6610 A y B. Edición 20. 1999
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Tabla 1. Metodologías para el análisis de plaguicidas carbámicos
ORGANISMO
IDENTIFICACIÓN DEL
MÉTODO
Método 531.1
Método 531.2
EPA
Método 531.1 Rev 3.1
Método 815-B-01
Standard Methods
Método 6610 B
AWWA
Método 6610 B
ASTM
Método D5315-92 (1998)
2.4.
CARACTERÍSTICAS
Carbamatos en agua por HPLC
con derivatización post
columna
N-metilcarbamoiloximas y Nmetilcarbamatos en agua por
HPLC con derivatización post
columna
N-metilcarbamoiloximas y Nmetilcarbamatos en agua por
HPLC con derivatización post
columna
N-metilcarbamoiloximas y Nmetilcarbamatos en agua por
inyección directa en HPLC con
derivatización post columna
Plaguicidas en agua por HPLC
con derivatización postcolumna
Plaguicidas carbámicos por
HPLC
N-metilcarbamoiloximas y Nmetilcarbamatos en agua por
inyección directa en HPLC y
derivatización post columna
Idoneidad del analista
El método debe ser realizado por profesionales del área química con experiencia analítica
en la extracción y manejo de cromatografía líquida. Los analistas sin experiencia deben
tener la supervisión del profesional de mayor experiencia en la ejecución de este tipo de
análisis. Todo analista debe demostrar la capacidad para aplicar la metodología y obtener
resultados confiables.
3.
CARACTERÍSTICAS DE LOS ANALITOS3
Los plaguicidas carbámicos son ésteres monometílicos, derivados del ácido carbámico
(H2N-COOH). Su estructura está relacionada con
la fisostigmina4. Se utilizan
3
WHO. United Nations Environment Program. International Program on Chemical Safety IPCS
Health
and
safety
guide.
Consultado
en
http://www.inchem.org/documents/hsg/hsg/hsg051.htm#SectionNumber:1.2. 2007/04/18 9:05
4
Ladrón de Guevara J, Moya Pueyo V. Toxicología Médica. Interamericana McGraw Hill. Madrid.
1995. P486
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principalmente como insecticidas y nematocidas, son estables en general; tienen una
presión de vapor baja y son poco solubles en agua, sin embargo, se evaporan y subliman
lentamente a temperatura ambiente. Existen otros derivados carbámicos utilizados como
herbicidas, cuyas cadenas carbonadas pueden ser alifáticas o aromáticas y los fungicidas
clasificados como derivado del benzimidazol.
Algunos carbamatos pueden ser descompuestos fácilmente mientras que otros se pueden
fijar al suelo por adsorción. Lixivian fácilmente alcanzando las aguas subterráneas. En
estos procesos son determinantes la solubilidad, el tipo de suelo y de agua,
comportamiento que se aplica adicionalmente a los metabolitos de descomposición.
Las condiciones ambientales que favorecen el crecimiento y la actividad de
microorganismos también favorecen la degradación de los carbamatos.
Aldicarb (EHC 121, 1991). Cristales incoloros de punto de fusión y descomposición a
100°C. Solubilidad a 20°C e en agua (6 g/L) en acetona (40%), en cloroformo (35%) y
tolueno (10%). Sensible el calor, estable en medio ácido pero descompone rápidamente
en medio alcalino. No corrosivo al metal, no inflamable. Frente a agentes oxidantes se
convierte rápidamente a sulfóxido y lentamente a sulfona.
Propoxur. Sólido cristalino blanco, funde 91,5°C. Soluble en agua a 30°C (1,860 g/L), en
metanol, acetona, 2-propanol, diclorometano, tolueno. Ligeramente soluble en
hidrocarburos fríos. Se descompone a altas temperaturas formando isocianato de metilo.
Es inestable a pH alcalino.
Carbaril (EHC 153, 1994). Sólido blanco, cristalino funde a 142°C. Soluble en agua a
30°C (40 mg/L). El carbaril es soluble en algunos solventes y en aceite de maíz. Es un
compuesto lipofílico
Carbofuran. Sólido incoloro cristalino, funde a 153-154°C. Soluble en agua a 25°C (0,07
g/100mL).
Metiocarb. Polvo cristalino blanco, funde a 119°C. Soluble en agua a 20°C (27 mg/L) en
diclorometano, propanol, tolueno,y hexano. Se hidroliza en medio alcalino.
Metomil (EHC 178, 1996). Sólido cristalino blanco, funde a 77°C. Soluble en agua (54,7
g/L), tolueno (30 g/L) , isopropanol (220 g/L), etanol (420 g/L), acetona (720 g/L), metanol
(1000 g/L). Es estable en agua estéril a pH neutro pero se degrada a pH mayores.
Oxamil. Sólido cristalino, olor a azufre. Punto de fusión 100-102ºC. Solubilidad en agua a
25ºC 280 g/L, soluble en acetona, 2-propanol, etanol, metanol, tolueno. Las formulaciones
sólidas son estables, las soluciones acuosas se descomponen lentamente, la velocidad de
descomposición aumenta en presencia de aire, luz solar, medio alcalino y temperatura
elevada.
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4.
5
FUNDAMENTO DE LA METODOLOGÍA
La cromatografía líquida es una cromatografía de elución, caracterizada por su
versatilidad, en la cual la fase móvil es un disolvente líquido que contiene la muestra como
mezcla de solutos. Los tipos de HPLC se clasifican según el mecanismo de separación o
el tipo de fase estacionaria.
En la metodología descrita, los compuestos carbámicos se separan en una columna
cromatográfica, de fase reversa, con elución en gradiente, utilizando la muestra
previamente filtrada. La detección se realiza por fluorescencia del derivado obtenido por
reacción postcolumna en la cual los analitos son hidrolizados en medio alcalino con
hidróxido de sodio. Los derivados metilamino formados durante la hidrólisis reaccionan
posteriormente con el o-ftalaldehido- (OPA) y 2-mercaptoetanol para formar el derivado
isoindólico fluoróforo que se evidencia a una longitud de onda de 230 nm para excitación y
mayor a 418 nm para emisión.
5.
5.1.
CONSIDERACIONES PARA EL MANEJO DE MUESTRAS
Recomendaciones para la recolección de las muestras
Recolecte una muestra de 60 mL de agua aplicando los procedimientos de recolección
aprobados y de acuerdo a la práctica convencional, utilizando los materiales exigidos para
el muestreo y almacénela en botellas de vidrio tipo (Pierce 103075, Pierce 12722 o
equivalente).
NOTAS:
Tanto el Standard Methods (6610-B) como EPA 6610 recomiendan que
durante el muestreo las botellas se llenen de manera que se deje el espacio
necesario para la expansión en los casos en que se congele.
Para muestras que puedan contener cloro residual, adicione tiosulfato de
sodio en las botellas antes de tomar las muestras, en cantidad que permita
alcanzar una concentración de 80 mg/L.
Antes de la toma de muestra prevea la adición del buffer para garantizar el
pH de la muestra recolectada y prevenga la degradación de los analitos
susceptibles. Una vez colectada la muestra en la botella que contiene el
buffer, deberá agite vigorosamente durante 1 minuto. (Tenga en cuenta la
estabilidad de los analitos, numeral 5.4)
5
Skoog D., West D., Holler J., Crouch S. Fundamentos de Química Analítica.8 edición. Thomson
editores. 2005, p959.
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5.2.
Preservación de las muestras
Refrigere las muestras a 4 ± 1 ºC desde el momento del muestreo hasta su ingreso al
laboratorio, principalmente si se tiene en cuenta la estabilidad de los analitos en agua a
temperatura ambiente.
Ajuste las muestras neutras o alcalinas a pH menor o igual a 3 por adición de 1,5 - 1,8 mL
de buffer de ácido monocloroacético por cada 50 mL de muestra. Para una máxima
protección de los analitos susceptibles, coloque el buffer en las botellas antes de tomar las
muestras.
5.3.
Almacenamiento de la muestra
Almacene las muestras a temperatura de refrigeración (4 ± 1 °C), protegidas de la luz
desde el momento de la colección hasta el análisis en el laboratorio. Aunque los
resultados de la conservación de las muestras muestran que los analitos pueden superar
los 28 días a pH menor o igual a 3 y temperatura de almacenamiento de 4ºC en muestras
de agua, los analitos pueden ser afectados por la matriz. Sin embargo, el analista deberá
verificar que la técnica de conservación es aplicable para las muestras en estudio.
5.4.
Estabilidad de los analitos
El oxamil, 3-hidroxicarbofurano, aldicarb sulfóxido y el carbarilo pueden degradarse
rápidamente en aguas con pH neutro o básico a temperatura ambiente. Este tiempo tan
corto de degradación es crítico para el envío de las muestras, y su permanencia en el auto
muesteador durante el análisis. Para minimizar la degradación de estos analitos, conserve
la muestra ajustando el pH menor o igual 3, con buffer ácido monocloroacético a la botella
de muestreo de 60 mL de capacidad en el sitio de muestreo o en el laboratorio antes de
enviar los frascos al sitio de toma de muestra.
5.5.
Responsabilidad del analista
Es responsabilidad del analista revisar que las muestras sean aptas para el análisis de los
carbamatos, verificando el cumplimiento de las consideraciones descritas para su manejo
adecuado desde el momento de la recolección hasta la aplicación del análisis.
6.
6.1.
EQUIPOS, INSUMOS, REACTIVOS Y ESTÁNDARES
Equipos
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6.1.1. Balanza analítica con precisión de pesada 0,0001g
6.1.2. Potenciómetro con capacidad de lectura de 0,01 unidades de pH.
6.1.3. Equipo cromatográfico.
 Cromatógrafo líquido de alta eficiencia HPLC, capacidad de inyección de 200 a 400
microlitros y bomba para corrida isocrática o por gradiente que permita mantener el
flujo en 0,5 mL/min.
 Horno para la columna cromatográfica
 Columnas: Tanto el método EPA 531.1 como el Standard Methods 6610-B
recomiendan las siguientes columnas:
o Columna 1. NovaPack C18 de 4 micras, 150 mm de longitud x 3.9 mm de
diámetro interno en acero inoxidable, estabilizada con metanol:agua 10:90
durante 2 minutos, y luego se programa un gradiente lineal hasta metanol: agua
80:20 en 25 minutos
o
Columna 2 (alternativa). Ultrasphere ODS Beckman de 5 micras, 250mm de
longitud x 4.6 mm de diámetro interno, en acero inoxidable, estabilizada con fase
móvil a 1.0 mL/min con gradiente lineal de metanol:agua 15:85 a 100% metanol
en 32 minutos.
o Columna 3 (alternativa). Supelco LC-1 de 5 micras, de 250 mm de longitud x 4,6
mm de diámetro interno, en acero inoxidable, estabilizada con fase móvil a 1,0
mL/min con gradiente lineal de metanol: agua 15:85 a 100% metanol en 32
minutos.
 Detector de fluorescencia capaz de monitorear la señal a la longitud de onda de
excitación 330 nm y de emisión mayor de 418 nm.
 Sistema de inyección automático o manual con capacidad para inyectar hasta 400 µL.
 Equipo para derivatización postcolumna (EDP), con bomba que permita dispensar y
mezclar los reactivos de derivatización en la fase móvil en flujo entre 0,1-1,0 mL/min.
El material de fabricación de las tuberías es PTFE, termostatado a 95ºC
 Sistema de adquisición, manejo y registro de datos, que permita obtener como
mínimo los datos de tiempos de retención y áreas de los picos.
6.1.4. Bombas y equipo básico para extracción en fase sólida.
6.2.
Insumos
6.2.1. Insumos para la toma de muestras simples o compuestas
 Recipientes de vidrio ámbar o polipropileno, capacidad 60 mL, tapa rosca con
cubierta interna de teflón.
 Botellas en vidrio ámbar de 10 - 15 mL de capacidad con tapa de TFEfluorocarbono, para almacenamiento de soluciones
 Limpieza de los recipientes para la recolección de la muestra: lave con agua
corriente, enjuague con agua desionizada y seque. Se busca minimizar la
contaminación de las muestras utilizando este proceso de lavado.
6.2.2. Vidriería general del laboratorio: Balones volumétricos de capacidad de 10mL, 100
mL y 1000 mL.
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6.2.3. Viales para el inyector automático, de capacidad 3,7 mL con tapa cubierta
internamente de teflón; o manual con jeringa de vidrio para inyectar 400 µL.
6.2.4. Jeringas hipodérmicas de vidrio de capacidad 10mL, con agujas para jeringas de 7
– 10 cm de longitud punta roma.
6.2.5. Microjeringas de varios tamaños
6.2.6. Helio para desgasificación de soluciones y solventes
6.2.7. Sistema de macrofiltración para fase móvil y soluciones de derivatización, con
membrana de 47 mm x 0,45 micras ( Millipore tipo HA o equivalente) para el agua
y de 0,5 micras (Millipore tipo FH o equivalente) para los extractos orgánicos
6.2.8. Sistema de microfiltración para las muestras antes de ser analizadas: utilice
portafiltros de 13 mm, (Millipore stainless steel XX300/200 o equivalente) y filtros
de poliéster de 13 mm de diámetro x 0,2 micras, (Nuclepore 180406 o
equivalente).
6.3.
Reactivos
6.3.1. Lista de reactivos










Agua de calidad HPLC (Agua Tipo I según ASTM)
Metanol calidad HPLC
Tiosulfato de sodio ACS granular o equivalente.
Ácido monocloroacético
Hidróxido de sodio
2-Mercaptoetanol
Acetonitrilo
Borato de sodio
Acetato de potasio
o-Ftalaldehído (OPA)
6.3.2. Preparación de soluciones

Buffer ácido monocloroacético (pH 3): prepárelo por mezcla de 156 mL de
ácidomonocloroacético 2,5 M y 100mL de Acetato de potasio 2,5 M.
 Agua HPLC bufferizada: prepárela por adición de 10mL de buffer ácido
monocloroacético 1,0 M a 1 L de agua reactivo.
 Soluciones para derivatización post columna:
o Solución de NaOH 0,05N. Disuelva 2,0 g de NaOH en agua grado reactivo.
Diluya a 1,0 L con agua grado reactivo. Filtre y desgasifique con corriente de He.
o Solución de 2-mercaptoetanol (1+1): mezcle 10,0 mL de 2-mercaptoetanol y 10,0
mL de acetonitrilo. Prepare, tape y almacene en campana de extracción. (Olor
característico fuerte)
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Solución de borato de sodio 0,05 N: disuelva 19,1 g de Na2B4O710H2O en 1 L de
agua HPLC. Prepare el borato de sodio el día anterior a su uso para que se
disuelva completamente y manténgalo a temperatura ambiente para evitar su
cristalización.
o Solución de OPA: disuelva 100 ± 10 mg de o-ftalaldehído (PF 55 – 58 °C) en 10
mL de metanol. Adicione a 1 L de solución de borato 0,05 N. Mezcle y filtre a
través de membrana de 0,45 micras y desgasifique. Adicione 100 µL de 2mercaptoetanol (1+1), mezcle. No se requiere preparar la solución diariamente si
se encuentra protegida del oxígeno atmosférico. Almacene la solución en frascos
de vidrio, bajo condiciones atmosféricas a 4°C hasta por dos semanas sin
aumento considerable de la señal de fondo en el detector de fluorescencia; o
almacénela en atmósfera de nitrógeno por tiempo indefinido.
 Fase móvil: Agua grado HPLC (Agua Tipo I según ASTM) y metanol grado HPLC
filtrados y desgasificados con corriente de He.
o
6.4.
Estándares
Los estándares de los plaguicidas carbámicos y algunos productos de degradación se
muestran en la Tabla 2, identificados con el número de identificación del Chemical
Abstract Service CAS.
6.4.1. Solución concentrada de productos carbámicos
Preparar una solución de concentración de 1,00 microgramo / microlitro para cada analito
pesando 0,0100 g del material certificado para disolverlo en metanol y completar a un
volumen de 10mL. Pueden usarse diluciones mayores dependiendo de las necesidades
del método. Aplicar la corrección en los cálculos de la concentración con base en la
pureza declarada en el certificado del estándar. Puede usarse soluciones de estándares
preparados comercialmente si son certificados por el fabricante o un ente independiente.
Transferir la solución estándar a un vial de TFE-fluorocarbono debidamente cerrado.
Estas soluciones deben reemplazarse después de 2 meses o en el momento en que los
resultados de comparación con los blancos fortificados o las muestras de control indiquen
que presentan problemas.
Tabla 2. Lista de estándares certificados
Número de registro
Analito
CAS
Aldicarb
116-06-3
Aldicarb sulfona *
1646-88-4
Aldicarb sulfóxido *
1646-87-3
Propoxur
114-26-1
Carbaril
63-25-2
Carbofuran
1563-66-2
3-HidroxiCarbofuran **
16655-82-6
Metiocarb
2032-65-7
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Metomil
Oxamil
16752-65-7
23135-22-0
Fuente: EPA 531.1-1995.
* productos derivados del Aldicarb ** derivado del Carbofurano
6.4.2. Solución de estándar interno.
Prepare una solución de 4-bromo-3,5-dimetilfenil N-metilcarbamato (BDMC, 98% de
pureza para utilizarlo como estándar interno (Aldrich Chemical Co o equivalente) pesando
0,0010 g del compuesto puro, disolviéndolo en metanol y aforándolo a 10mL. Transfiera a
un vial de TFE-fluorocarbono debidamente cerrado y almacénlo a temperatura ambiente.
Adicione 5 µL de solución de estándar interno de fortificación a 50 mL de muestra para
tener una concentración final de estándar interno de 10 µg/L.
6.4.3. Solución concentrada de verificación del laboratorio.
Prepare una solución concentrada colocando en un balón aforado de 10mL:
 20 µL de solución estándar de 3-hidroxicarbofuran
 1,0 mL de solución estándar de aldicarb sulfóxido
 200 µL de solución estándar de metiocarb
 1 mL de solución de estándar interno
complete a volumen con metanol y agite vigorosamente la solución.
Para preparar la solución de verificación, coloque 100 µL de la solución concentrada en
un balón aforado de 100 mL, diluya a volumen con agua grado reactivo bufferizada.
Transfiera a una botella de cierre adecuada de TFE fluorocarbono y almacene a
temperatura ambiente.
7.
CONTROL Y ASEGURAMIENTO DE CALIDAD DEL MÉTODO
El laboratorio debe demostrar la competencia técnica para aplicar la metodología en el
análisis de plaguicidas y otros contaminantes ambientales con el fin de asegurar y
demostrar la obtención de resultados confiables. El laboratorio deberá implementar,
mantener, soportar y aplicar las buenas prácticas de laboratorio, que son la base para las
demás estrategias de demostración de la competencia.
7.1.
Limpieza del material de vidrio:
El material de vidrio debe limpiarse de acuerdo al siguiente protocolo para asegurar su
limpieza:
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




7.2.
Enjuague todo material de vidrio con el último solvente utilizado tan pronto como
sea posible.
Lave con detergente, enjuague con agua caliente, agua potable y agua destilada,
en este orden.
Escurra el agua.
Seque en horno por algunas horas antes del uso. En este caso a 400°C.
Enfríe y almacene en ambiente limpio para prevenir la acumulación de polvo u
otros contaminantes.
Residuos de analitos
Prevenga la ocurrencia de interferencias potenciales como la contaminación debida a
residuos de analitos dejados en los materiales provenientes de estándares o muestras
contaminadas.
7.3.
Demostración de la capacidad inicial del laboratorio
Para demostrar la capacidad inicial del laboratorio se deberá conocer el porcentaje de
recuperación (%R) de cada analito, la desviación estándar relativa (DER) y el límite de
detección (LD), de los datos obtenidos en las corridas de las muestras, blancos de
laboratorio fortificados (BLF).
Es recomendable que periódicamente el laboratorio determine y documente sus límites de
detección y capacidad para los analitos de interés en cada proceso analítico.
7.3.1.

Determinación del porcentaje de recuperación del analito.
Con blanco de laboratorio fortificado (BLF).
El criterio de aceptación o rechazo consiste en que la recuperación del analito con que se
fortificó el agua deberá ser de ± 20% de la concentración adicionada y la desviación
estándar relativa de la medición (DER) ≤ 20%. Una vez que se ha demostrado la
capacidad del laboratorio se podrá repetir esta verificación utilizando solamente 4
alícuotas. En las Tabla 3 y Tabla 5, se ilustran los resultados obtenidos en la
determinación del %R con BLF de varias tipos de agua.
La manera de proceder es la siguiente:
o Seleccione una concentración representativa de al menos 10 veces el LD o una
concentración intermedia del estándar de calibración para cada analito.
o Prepare una dilución primaria del estándar en metanol que contenga 1000 veces la
concentración seleccionada.
o Con una jeringa adicione 50 µL de la solución concentrada a un seriado de 4 a 7
alícuotas de 50 mL de agua grado reactivo.
o Analice cada alícuota de acuerdo al procedimiento establecido.
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Calcule el porcentaje de recuperación (%R) determinado para los diferentes analitos, el
cual podrá variar en un rango de ±30% del valor indicado en las Tabla 3 y Tabla 5 para las
últimas 3 de 4 muestras consecutivas y la RSD de las mediciones deberá ser menor del
30% de los valores de recuperación descritos para el método normalizado de referencia,
Con este criterio se determina si la eficiencia es satisfactoria, caso en el cual se prosigue
con el análisis de las muestras.

Con matriz de laboratorio fortificada (MLF)
Adicione una concentración conocida al menos al 5% de las muestras de rutina o una
muestra por serie si estas son muy grandes. La concentración seleccionada no podrá ser
menor que la respuesta de corrida de la muestra que se selecciona para fortificar. En
condiciones ideales, la concentración para fortificar a matriz deberá ser la misma que para
preparar el BLF.
Calcule el porcentaje de recuperación (%R) para cada analito en función de la
concentración adicionada, una vez se haya aplicado la corrección del resultado analítico,
siendo X la concentración obtenida para la muestra fortificada y b la medida en la muestra
sin fortificar
%R 
( X  b)
*100
concentrac ión de fortificac ión
Compare estos resultados con los límites de control obtenidos en agua HPLC fortificada
(BLF) utilizada en el mismo proceso analítico. El valor para %R debe estar entre 65-135%
de la cantidad fortificada.
Si la recuperación de cada uno de los analitos cae por fuera del rango asignado, y el
laboratorio tiene demostrada que la capacidad analítica esta dentro de control, el
resultado obtenido para la muestra no fortificada se informará como sospechoso con por
efectos de matriz y no del proceso analítico.
Tabla 3. Precisión y exactitud para agua grado reactivo y aguas residuales preparadas en
el laboratorio (sintéticas)a.
Aldicarb
Aldicarb sulfona
Aldicarb sulfóxido
Propoxur
Carbaril
Carbofuran
3-HidroxiCarbofuran
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CF1
Agua grado
reactivo
Agua
sintética 1d
μg /L
5,0
10
10
5,0
10
7,5
10
Rb
115
101
97
106
97
102
102
R
106
98
105
96
94
102
98
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SRc
3,5
4,0
4,9
3,2
5,8
5,1
4,1
SR
3,2
3,9
4,2
4,8
4,7
3,1
4,9
Aprobado por:
Fecha:
Agua
sintética 2e
R
102
95
94
97
104
100
101
SR
8,2
9,5
10,3
5,8
10,4
7,0
10,1
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Metiocarb
Metomil
Oxamil
20
2,5
10
94
105
100
1,9
4,2
4,0
1
102
98
97
4,1
3,9
2,9
112
105
102
3,4
9,5
10,2
a
Fuente: EPA 531.1. CF concentración de fortificación; Datos corregidos para la cantidad
b
detectada en blanco y representa la media de 7 de 8 muestras; Porcentaje promedio de
c
d
recuperación; Desviación estándar del porcentaje de recuperación; Cantidad corregida por la
e
cantidad encontrada en el blanco 1; Cantidad corregida para la cantidad corregida en el blanco
2
7.3.2.
Determinación del límite de detección (LD)
Para la determinación del límite de detección analice al menos 7 blancos de laboratorio
fortificados (BLF) preparados a una concentración baja de los diferentes analitos como
recomienda el método en la Tabla 5.
Otra opción es utilizar un punto de calibración calculado de manera que genere una
respuesta que sea 5 veces la señal de ruido. Una vez analizados los 7 blancos se
procederá a calcular la exactitud media y la desviación estándar (DE) para cada analito.
Con estos resultados calcule el LD según la ecuación:
LD  S * t( n 1 y 99%)
7.4.
Control de calidad
Una vez demostrada la capacidad del laboratorio para aplicar la metodología, el
laboratorio puede iniciar el análisis de muestras desconocidas. En este caso debe
planear el lote de corrida el cual estará compuesto por:






Soluciones para la verificación de la eficiencia del sistema cromatográfico, tal como
se desarrolla en el numeral 7.4.1.
Preparación, análisis y evaluación de los blancos de solventes, de reactivos, de
campo y de laboratorio fortificado de acuerdo a lo indicado en el numeral 7.4.2.
Demostración de la ausencia de interferencias potenciales tal como se indica en el
numeral 7.4.3.
Preparación, análisis y evaluación de réplicas de laboratorio tal como se indica en el
numeral 7.4.4.
Preparación, análisis y evaluación de las soluciones de calibración, estándar interno,
y en caso de que aplique el compuesto sucedáneo (surrogate) de acuerdo a lo
indicado en el numeral 7.4.5., la preparación de las soluciones de calibración se
desarrolla en el numeral 7.4.5.1., de las soluciones de estándar interno se encuentran
en los numerales 7.4.5.2.
Preparación, análisis y evaluación de muestras de control de calidad internas o de
origen externo de acuerdo a lo indicado en el numeral 7.4.6.
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7.4.1. Uso de Solución de Verificación de Eficiencia (SVL)
La eficiencia del laboratorio deberá ser monitoreada mediante la aplicación diaria del
análisis de una SVL, la cual contiene compuestos designados para evaluar la sensibilidad
del instrumento en función de la detección del analito, relación señal/ruido (S/N)>5. La
eficiencia del sistema cromatográfico en función del factor Gaussiano del pico (PGF) y la
eficiencia de la columna cromatográfica en función de la resolución como se ilustra en la
Tabla 4,

El Factor Gaussiano del Pico (PGF) se calcula mediante la ecuación:
PGF 
1,83 * W(1 / 2)
W(1 / 10)
donde:
W(1/2) = anchura de pico a la mitad de la altura en segundos.
W(1/10) = anchura de pico a la décima parte de la altura en segundos.

La Resolución entre picos está definida por la ecuación
R
t
W
donde: t es la diferencia del tiempo de elución entre dos picos
W es el promedio de la altura de pico a la línea base de los dos picos.
En caso que la respuesta del instrumento no satisfaga las especificaciones dadas es
necesario revisar las condiciones del equipo e insumos involucrados en la determinación
analítica. Los requerimientos de sensibilidad se basan en los LD dados para el método
normalizado. Las concentraciones de los estándares utilizados como SVL pueden
ajustarse de manera que sean compatibles con el LD determinado por el laboratorio.
Tabla 4. Requerimientos para evaluar la eficiencia del laboratorio usando soluciones de
verificación
Ensayo
Analito
Concentración
μg/mL
Requerimientos
Sensibilidad
3- Hidroxicarbofurano
2
Detección del analito;
S/N>3
Eficiencia
cromatográfica
Aldicarb sulfóxido
100
0,90<PGF<1,1a
Eficiencia de la
columna
Metiocarb
4-Bromo-3,5-Dimetilfenil
N-Metilcarbamida (BDMC)
20
a
Resolución >1,0b
10
b
Fuente EPA531.1.1995. PGF Factor Gussiano del pico. Resolución entre dos picos.
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7.4.2. Uso de blancos
Uno de los requisitos de obligatorio cumplimiento para el control y aseguramiento de la
calidad, incluido en BPL o dentro de un sistema de gestión de calidad desarrollado bajo
cualquier normativa o legislación, es el análisis de blancos con cada lote de corrida que
demuestre que la determinación cualitativa y cuantitativa del analito es confiable y no
corresponde a respuestas generadas por el agua utilizada en el laboratorio, reactivos,
solventes o interferentes causados durante las etapas de recolección, tratamiento,
extracción y limpieza de la muestra. Los siguientes tipos de blancos se describen para la
aplicación en esta metodología:
7.4.2.1.
Blanco de solventes BS
Prepare y analice un blanco de solvente, para cada nueva botella de solvente antes de ser
utilizada para la extracción en las muestras. Mida un volumen de solvente igual al utilizado
para la extracción de las muestras y sométalo a las mismas etapas de concentración.
Inyecte un volumen igual al definido para las muestras y verifique la respuesta
cromatográfica. No se debe presentar respuesta en la ventana de detección o tiempo de
retención de los analitos. En caso de que esto ocurra utilice una nueva botella de reactivo
e informe al proveedor sobre el hallazgo, previa verificación del material de laboratorio,
para eliminar una posible interferencia debido a los elementos de laboratorio utilizados.
7.4.2.2.
Blanco de reactivos BR
Prepárelo con el agua grado reactivo utilizada en el laboratorio. Se utiliza para demostrar
que los materiales de vidrio o de plástico no aportan interferentes y que, los reactivos y
solventes utilizados durante el análisis no presentan respuesta analítica que pueda
interferir con la del analito. Procéselo antes que las muestras. Prepare un nuevo blanco de
reactivos cada vez que se cambie algún reactivo, incluso durante la corrida de un lote de
trabajo.

Uso y evaluación de blanco de reactivos (BR)
Corra blanco de reactivos al menos en los siguientes casos:
o Antes de comenzar el proceso analítico,
o Cada vez que se cambie algún reactivo,
o Cada vez que se inicie una nueva muestra,
o En caso que el BR produzca alguna señal en la ventana de tiempo de retención de
cualquiera de los analitos de interés
o Una vez se haya eliminado la fuente de cualquier contaminación o interferente
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7.4.2.3.
Blanco de campo BC
Obtenga un blanco de campo a partir de una muestra de agua de laboratorio, llevada al
sitio de recolección, la cual es tratada como una muestra desconocida. Exponga esta
muestra a las condiciones del sitio de muestreo, conservación y todos los demás
procedimientos analíticos. Su finalidad es demostrar si los analitos u otros interferentes
están presentes en el ambiente del sitio de muestreo.
7.4.2.4.
Blanco de laboratorio fortificado BLF
Se prepara a partir de una muestra de agua HPLC (Agua Tipo I según ASTM), a la cual se
adiciona una alícuota del analito de concentración conocida. Fortifique con
concentraciones 10 veces mayores al LD. Analice como una muestra rutinaria. Procese
por lo menos un BLF por lote de corrida (ó en 24 horas de análisis). Su propósito es
determinar que el método está bajo control y el cumplimiento de los parámetros de
desempeño de la metodología.

Uso y evaluación de blanco de laboratorio fortificado BLF
Analice por lo menos un BLF cada 20 muestras o una por lote de corrida (conformado por
las muestras corridas en 24 horas). La fortificación debe ser preferiblemente 10 veces el
LD. Calcule la exactitud como porcentaje de recuperación, la cual se debe encontrar
dentro de las especificaciones descritas en el numeral 7.3.1. Cuando no se cumplen las
especificaciones de las muestras fortificadas y de control, analice las causas,
documéntelas y tome las acciones correctivas y las preventivas necesarias que eviten la
repetición de datos fuera de control.
Establezca los límites máximo y mínimo de la carta control, si no se cuenta con datos
suficientes para establecer estos valores, utilice los criterios establecidos en el numeral
7.3.1. Cuando se disponga de datos suficientes, (20 a 30 análisis) establezca sus propios
límites de control, para lo cual realice las estimaciones aplicando las siguientes
ecuaciones:
Límite de control superior = R + 3*DE (desviación estándar)
Límite de control inferior = X – 3*DE
Ajuste estos límites de control después de cada 10 nuevas mediciones de la recuperación,
usando los últimos 20 a 30 datos para su estimación sin que se excedan las
especificaciones dadas para la metodología.
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7.4.3. Interferencias potenciales
7.4.3.1.
Interferencias del método
La presencia de aminas primarias puede generar interferencia en la determinación de los
carbamatos, ya que forman derivados fluorescentes en la derivatización post columna y
afectan los resultados dependiendo del tiempo de elución o de la intensidad de la
fluorescencia.
7.4.3.2.
Interferencias de matriz
Verifique que no se presente contaminación durante la recolección, almacenamiento y
transporte de las muestras. Analice blancos de muestra para demostrar que no se
presenta este tipo de contaminación y proporcionar validez a los resultados.
Tenga en cuenta que dependiendo del origen de las muestras, se pueden presentar
interferencias por efecto de matriz. Es ideal que disponga de otras técnicas para confirmar
que la respuesta obtenida es debida al analito y no a una interferente.
Las interferencias de matriz pueden variar considerablemente dependiendo de la fuente
de las muestras y su diversidad. Para matrices de agua no se tiene evidencia de
interferencias.
Tome a una distancia adecuada, las muestras de aguas crudas tratadas con cloro, antes
del sitio de cloración, ya que la presencia de concentraciones excesivas de este
componente induce la pérdida de algunos constituyentes de la muestra.
Dependiendo de la fuente de la cual sea tomada la muestra se pueden presentar
interferencias, principalmente si son de corrientes de desecho, filtrados de suelo
(lixiviados) o agua de vertimiento. En estos casos se requiere la aplicación de análisis
confirmatorio para incrementar la confiabilidad de la identificación y cuantificación de
compuestos determinados por el método aplicado.
7.4.4. Réplicas
7.4.4.1.
Réplicas de Laboratorio (RL)
Trabaje a partir de dos alícuotas de la muestra analítica, identificadas como RL1 y RL2 (RL:
Réplica de laboratorio), analizadas separadamente, aplicando el procedimiento en
idénticas condiciones. Tiene como finalidad determinar la precisión asociada con el
procedimiento en el laboratorio o repetibilidad. Estas réplicas no permiten conocer el
efecto del muestreo, conservación y almacenamiento de muestras.
7.4.4.2.
Réplicas de Campo (RC)
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Obténgalas por recolección en el mismo tiempo y lugar, bajo condiciones iguales de dos
muestras independientes (RC1 y RC2), las cuales se tratan de manera igual durante la
recolección, transporte y almacenamiento, es decir en campo y en el laboratorio. Tienen
como objeto determinar la precisión (Reproducibilidad) asociada con el muestreo,
recolección, conservación, almacenamiento y el procedimiento en el laboratorio.
Evaluación de las réplicas: si los resultados de las réplicas no se encuentran dentro de los
límites especificados en cada protocolo analítico en particular, reprocese otras muestras
de réplicas, si nuevamente se encuentran fuera de especificaciones suspenda el lote de
corrida, busque la causa del problema, tome las acciones correctivas y documéntelas.
7.4.5. Soluciones para calibración
7.4.5.1.
Estándares de calibración
Son las soluciones preparadas a partir de la solución concentrada de los estándares
certificados de los analitos, y que contienen estándar interno. Se utilizan para preparar la
curva de calibración y verificar la respuesta instrumental frente al analito. La preparación
de los estándares de calibración se desarrolla en el numeral 8
7.4.5.2.
Uso de estándar Interno (EI)
Monitoree la respuesta (área o altura del pico cromatográfico) en todas las muestras
corridas durante cada día de análisis, cuando aplique el procedimiento de calibración con
estándar interno. La respuesta del EI en los cromatograma de cada muestra no podrá
presentar una desviación superior al 30 % en ningún caso.
En caso que la respuesta de una de las muestras sea >30%, optimice las condiciones del
instrumento e inyecte una segunda alícuota. El criterio de toma de decisión es el
siguiente:



Si la segunda alícuota produce una señal aceptable del EI, informe el resultado para
la muestra.
En caso que la desviación sea ≥30%, analice nuevamente la muestra, utilizando
preferiblemente réplicas de ésta. Si no, informe el resultado como SOSPECHOSO.
Si se sigue presentando respuesta del EI por fuera de especificación proceda con la
verificación de un estándar de calibración y el criterio para la toma de decisión es el
siguiente:
o Si el estándar de verificación genera una respuesta para el EI cuya desviación esté
dentro del 20% del valor esperado, entonces siga el procedimiento aplicando una
segunda inyección en cada muestra que incumpla los requerimientos de respuesta
del EI.
o En caso que la respuesta del EI se desvíe en más del 20% del valor esperado
entonces recalibre siguiendo todo el procedimiento descrito para calibración
(numeral 8.1).
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7.4.6. Muestras para control de calidad MCC
Se obtienen a partir de una muestra de una matriz la cual puede contener los analitos del
método en niveles conocidos o una muestra de matriz (si se trata de agua es preferible
obtenerla de una fuente externa al laboratorio), la cual es fortificada con una alícuota de
los analitos en un solvente miscible con agua. Tiene como objeto verificar los parámetros
del método con una fuente externa al laboratorio. Se puede trabajar como MLF de la
siguiente manera:
7.4.6.1.

Controles internos
Matriz de laboratorio fortificada MLF
Trabaje a partir de una alícuota de una muestra desconocida, a la cual se le agregan
cantidades conocidas de los analitos y estándar interno. Analícela de igual manera que
las muestras rutinarias. Tiene como finalidad determinar si la matriz contribuye al sesgo
de los resultados analíticos. Determine la concentración de los analitos en la muestra
inicial, antes de enriquecerla, para hacer la corrección en la MLF.
Adicione una concentración conocida al menos al 5% de las muestras de rutina o una
muestra por serie si estas son muy grandes. La concentración seleccionada no podrá ser
menor que la respuesta de corrida de la muestra que se selecciona para fortificar. En
condiciones ideales, la concentración para fortificar a matriz deberá ser la misma que para
preparar el BLF.
Calcule el porcentaje de recuperación (%R) para cada analito en función de la
concentración adicionada, una vez se haya aplicado la corrección del resultado analítico,
siendo X la concentración obtenida para la muestra fortificada y b la medida en la muestra
sin fortificar
%R 

( X  b)
*100
concentrac ión de fortificac ión
Uso de controles de calidad de fuente externa
Analice trimestralmente por lo menos una muestra de control de calidad proveniente de
una fuente externa. Estas muestras pueden provenir del ejercicio de participación en
rondas de comparación interlaboratorios.
Compare estos resultados con los límites de control obtenidos en agua destilada (Agua
Tipo I según ASTM) fortificada (BLF) utilizada en el mismo proceso analítico. El valor para
%R debe estar entre 65-135% de la cantidad fortificada.
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Si la recuperación de cada uno de los analitos cae por fuera del rango asignado, y el
laboratorio tiene demostrada que la capacidad analítica está bajo control, informe el
resultado obtenido para la muestra no fortificada como sospechoso con por efectos de
matriz y no del proceso analítico.
El laboratorio puede adoptar prácticas de control de calidad dependiendo del método, esto
depende las exigencias del laboratorio y la naturaleza de las muestras, se puede analizar
siempre duplicados de muestras de MLF, entre otras.
Se permite la modificación de algunos factores críticos en el análisis, tales como columna,
condiciones cromatográficas o detector; sin embargo, valide la condición cambiada y
evalúe que los nuevos resultados cumplan las especificaciones definidas para el método
original.
Tabla 5. Precisión y exactitud de laboratorio desagregados por nivel de concentración.
Límite de detección del método y límite de detección estimado para analitos de agua
reactivo.
Analitos
CF1 μg/L
Nº
réplicas
%
recuperación
DER
%
Aldicarb
Aldicarb sulfona
Aldicarb sulfóxido
Propoxur ( )
Carbaril
Carbofuran
3-HidroxiCarbofuran
Metiocarb
Metomil
Oxamil
1,0
2,0
2,0
1,0
2,0
1,5
2,0
4,0
0,50
2,0
8
8
8
7
8
7
8
8
7
8
107
83
47
101
97
90
108
82
102
82
7
20
21
32
23
12
29
19
18
17
1
a
LDM
μg/L
0,22
1,0
0,59
1,0
1,3
0,52
1,9
1,9
0,29
0,86
b
LDE
μg/L
1,0
2,0
2,0
1,0
2,0
1,5
2,0
4,0
0,50
2,0
a
Fuente:: Método 531-1 EPA. 1990. CF concentración de fortificación; LDM límite de
detección dado para el método normalizado, calculado para un valor t Student para 99% de
b
confianza y n-1 grados de libertad, usando desviación estándar de réplicas. LDE límite de
detección estimado como igual al LDM o calculado como  5 veces la relación señal /
ruido.
8. CALIBRACIÓN
Establezca los parámetros de operación del HPLC de acuerdo con los equipos e insumos
descritos en el numeral 6. El sistema cromatográfico puede calibrase utilizando la técnica
de estándar interno o de estándar externo, dependiendo de la columna seleccionada,
tomando como referencia los tiempos de retención para cada una de las tres alternativas,
ilustradas en la Tabla 6.
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Tabla 6. Tiempos de retención para los compuestos carbámicos con tres columnas
cromatográficas diferentes. a Waters NovaPack C18, b Beckman Ultrasphere ODS, c
Supelco LC-1
Analitos
Aldicarb
Aldicarb sulfona
Aldicarb sulfóxido
Propoxur
Carbaril
Carbofuran
3-HidroxiCarbofuran
Tiempo de retención en minutos
b
c
Alternativa 1
Alternativa 2
Alternativa 3
6,80
15,0
17,5
7,77
15,2
12,2
8,20
17,4
14,6
8,94
18,4
14,8
13,65
23,3
19
16,35
27,0
21,4
18,86
29,3
24,4
a
Continuación Tabla 7. Tiempos de retención para los compuestos carbámicos con tres
columnas cromatográficas diferentes. a Waters NovaPack C18, b Beckman Ultrasphere
ODS, c Supelco LC-1
Analitos
Metiocarb
Metomil
Oxamil
BDMC
Tiempo de retención en minutos
b
c
Alternativa 1
Alternativa 2
Alternativa 3
19,17
29,6
23,4
20,29
30,8
25,4
24,74
34,9
28,6
25,28
35,5
a
Fuente: EPA 531.1 y SM 610-B
8.1.
Calibración con Estándar Interno.
Seleccione uno o más estándares internos de comportamiento analítico similar a los
analitos de interés y demuestre que la medición obtenida para el estándar interno no se ve
afectada por el método o por interferencias de matriz. Para este caso el BDMC se
comporta de manera conveniente.
 Prepare el estándar interno de calibración (EICAL) según recomendaciones de EPA
531.1 entre 3 y 5 niveles de concentración para cada analito de interés por adición de
volúmenes de una o más de las soluciones concentrada de estándares en un balón
volumétrico.
 Prepare un mínimo de 3 estándares de calibración para calibrar un rango de
concentración con un factor de 20; para un factor de 50 se deben utilizar al menos 4
estándares y para un factor de 100 al menos 5.
 El estándar más bajo deberá representar la concentración más cercana pero superior
al límite de detección del método.
 Utilice el estándar sobrante para evaluar el rango esperado de concentración del
analito en la muestra o para definir el rango de trabajo del detector.
 Adicione una cantidad conocida de uno más estándares internos, para cada uno de los
estándares de calibración y diluya a volumen con agua grado reactivo bufferizada. El
rango de trabajo recomendado según el Standard Methods 6610-B, para la
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preparación de la curva de calibración es 2, 10, 40 y 100 µg/L de cada analito y 10
µg/L de estándar interno BDMC.
 Analice cada uno de los EICAL de acuerdo al procedimiento establecido en el numeral
9.4. y tabule los resultados utilizando la respuesta en área o altura de los picos frente a
la concentración dada para cada compuesto y estándar interno. Calcule el factor de
respuesta (FR) para cada analito y compuestos similares utilizando la ecuación:
:
FR 
( Aa )(Cei )
( Aei )(Ca)
Donde:
Aa = respuesta para el analito utilizado
Aei= respuesta para el estándar interno
Ca = concentración del analito utilizado en µg/L
Cei= concentración del estándar interno en µg/L
 Si el valor del factor de respuesta sobre el rango de trabajo es constante (20% de la
DER o menor), puede usarse para los cálculos. Alternativamente los resultados
pueden usarse para trazar una curva de calibración de relación de respuesta (Aa/Aei)
vs concentración del analito a medir (Ca)
 Verifique en cada día de trabajo, el factor de respuesta o la curva de calibración con
que se trabaje o como mínimo verifique dos estándares de calibración, uno al iniciar y
otro al terminar los análisis diarios. Estos estándares de chequeo deberán ser de
diferente concentración para permitir la verificación de la curva de concentración. Para
períodos de análisis mayores de 8 horas, es necesario que los estándares se
verifiquen de manera intercalada con una frecuencia regular de las muestras de
análisis durante el período de trabajo. Si la respuesta para cualquier analito supera la
variación de ± 20%, repita con estándar de calibración fresco. Si este resultado no es
adecuado genere una nueva curva de calibración.
8.2.
Calibración con Estándar Externo
 Prepare el estándar de calibración de la misma forma que se indicó en el numeral 8.1.
omitiendo el uso del un estándar interno.
 Comience con el estándar de calibración más bajo y analice cada uno de los
estándares aplicando el procedimiento establecido en el numeral 9.4 y tabule la
respuesta en área o altura del pico del analito, contra las concentraciones inyectadas
en el estándar en µg/L.
 Utilice los resultados para construir la curva de calibración de cada componente.
 Si el cociente de respuesta a la concentración (Factor de calibración) es una constante
sobre el rango de trabajo (DER < 20%), asuma linealidad por el origen y el promedio
del cociente o Factor de calibración puede utilizarse en lugar de la curva de
calibración.
 Verifique en cada día de trabajo tanto la curva de calibración como el Factor de
calibración, como se aplica con el EI.
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Verifique periódicamente los estándares de calibración, al menos cada trimestre mediante
un estándar preparado con un material de referencia obtenido externamente. Los
resultados de estos análisis deberán encontrarse dentro de los límites usados en la
verificación rutinaria de calibración.
9. PROCEDIMIENTO
9.1.
Tratamiento de la muestra
Adicione conservante si no se aplicó antes a cada muestra, BLF, BR y estándares de
calibración (EICAL, EECAL).

Ajuste del pH y filtración de la muestra
o Ajuste el pH de las muestras o los estándares a 3 ± 0,2 por adición de 1,5 mL de
ácido monocloroacético 2,5 M bufferizado por cada 50 mL de muestra. Este paso
puede obviarse si el pH de la muestra fue ajustado como precaución durante la
recolección o conservación.
o Afore un balón volumétrico de 50 mL con la muestra y adicione 5 µL de estándar
interno de fortificación y mezcle varias veces por inversión.
9.2.

Limpieza de la muestra
Para aguas naturales
o Coloque el filtro limpio en el portafiltro y utilice una pera de tres vías o una jeringa
de 10 mL lavada con agua grado reactivo.
o Humedezca el filtro por paso de 5 mL de agua grado reactivo a través de él,
verificando que no haya escapes.
o Purgue el filtro pasando a través de él 10 mL de la muestra.
o Tome nuevamente 10 mL de muestra y pásela por el filtro recuperando los últimos
5 mL para el análisis.
o Lave la jeringa con agua grado reactivo y descarte el filtro.

Para aguas residuales
Extraiga las muestras acuosas con diclorometano y las muestras sólidas con acetonitrilo.
Concentre el extracto con etilenglicol para sustituir el disolvente. Diluya los extractos
concentrados con metanol y purifíquelos con cartuchos C186.
6
Gómez Ariza J.L. Director grupo de trabajo
(FQM 141) “Análisis Medioambiental”.
Contaminación de suelos por compuestos orgánicos. Consejería de Medio Ambiente de la Junta de
Andalucía
y
Universidad
de
Huelva.
España.
Enero
2003.
Disponible
en
http://www.juntadeandalucia.es/medioambiente/residuos/organicos.pdf 2007/07/16 11:09
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El método EPA 8318 indica que para aguas, aguas de desecho doméstico, aguas de
desechos industriales y lixiviados se utilice el siguiente procedimiento:
o Midar 100 mL de agua en un embudo de separación de 250 mL y extraiga con 30
mL de cloruro de metileno por agitación vigorosa durante 2 minutos. Repita la
extracción dos veces más y combine los extractos orgánicos.
o Para la limpieza mida 20,0 mL del extracto en un vial de 20 mL que contenga 100
µL de etilenglicol. Caliente en bloque de calentamiento a 50°C y evapore
suavemente el extracto con corriente de nitrógeno en campana de extracción,
hasta que quede únicamente la capa de etilenglicol (beeper). Disuelva el residuo
que queda en el etilenglicol en 2 mL de metanol, pase el extracto por un cartucho
C18 acondicionado, eluya con metanol y recolecte el eluato en un balón
volumétrico de 5 mL hasta llevar a volumen. Filtre por filtro 0,45 µm y pase al vial
del automuestreador del cromatógrafo para análisis por HPLC.
Para muestras de origen doméstico, desechos industriales acuosos y lixiviados proceder
así:
o Mida 10,0 mL del extracto en un vial de vidrio de 10 mL que contenga 100 µL de
etilenglicol.
o Coloque el vial en un bloque de calentamiento a 50°C y evapore el extracto bajo
corriente de nitrógeno, en una campana de extracción hasta que se observe
únicamente el remanente con etilenglicol.
o Agregue metanol al residuo de etilenglicol gota a gota hasta obtener un volumen
final de 1,0 mL
o Filtre por membrana de 0,45 µm en un vial del automuestreador
o Proceda al análisis por HPLC

Para sedimentos
Examine la muestra, extraiga los plaguicidas teniendo en cuenta las limitaciones de
solubilidad, estabilidad y recuperación antes de proceder con la solución como una
muestra acuosa. Extraiga las muestras acuosas con diclorometano y las muestras sólidas
con acetonitrilo. Concentre el extracto con etilenglicol para sustituir el disolvente. Diluya
los extractos concentrados con metanol y purifíquelos con cartuchos C18.
El método EPA 8318 describe la siguiente metodología para suelos, muestras sólidas,
lodos y suspensiones acuosas pesadas.
Determine el porcentaje de peso seco de la muestra para lo cual debe determinar la
humedad en un horno de laboratorio. Pese 5 – 10 g de la muestra y pase a un crisol
tarado, caliente a 105°C por una noche, enfríe en desecador y pese, halle el % de
muestra seca:
% de muestra seca = g de muestra seca * 100 / g de la muestra.
Para la extracción seguir el siguiente procedimiento:
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o Pese 20 ± 0,1 g de la muestra en un erlenmeyer de 250 mL con tapa cubierta con
teflón
o Agregue 50 mL de acetonitrilo
o Agite por 2 horas en un agitador tipo reciprocante o similar
o Repose por 5 a 10 minutos
o Decante el extracto en un tubo de centrífuga de 250 mL
o Repita la extracción dos veces más con 20 mL de acetonitrilo dejando 1 hora de
agitación en cada extracción
o Combine los tres extractos de solvente
o Centrifugue a 200 rpm por 10 minutos
o Decante cuidadosamente el sobrenadante en un balón volumétrico de 100 mL y
diluya a volumen con acetonitrilo (factor de dilución 5).
o Realice la limpieza por columna de fase reversa C18, de igual manera a las aguas.
Obtenga el extracto final y pase a HPLC.

En el caso de suelos muy contaminados con sustancias no acuosas como aceites,
realice el siguiente procedimiento:
o Determine el porcentaje de peso seco como en el caso anterior y continúe como
en el caso anterior:
o Pese 20 ± 0,1 g de la muestra en un erlenmeyer de 250 mL con tapa cubierta con
teflón
o Agregue 60 mL de hexano
o Agite por 2 horas en un agitador reciprocante o similar
o Agregue 50 mL de acetonitrilo
o Agite por 3 horas en un agitador reciprocante o similar
o Repose por 5 a 10 minutos
o Decante las dos capas de solvente en embudo separador de 250 mL
o Drene el acetonitrilo (capa inferior) y filtre por papel en un balón volumétrico de 100
mL
o Agregue 60 mL de hexano y 50 mL de acetonitrilo al erlenmeyer que contiene la
muestra y agite por 1 hora
o Repose y decante la muestra en el embudo de separación que contiene el hexano
de la primera extracción
o Agite el embudo de separación por dos minutos, espere para la separación de las
fases
o Drene el acetonitrilo en el balón volumétrico filtrando por papel previamente y
diluya a volumen con acetonitrilo (factor de dilución 5).

Para muestras de suelos, residuos sólidos, lodos, suspensiones acuosas muy
contaminadas y líquidas no acuosas, proceder de la siguiente manera:
o Eluya 15 mL del extracto de acetonitrilo por un cartucho de fase reversa C18,
previamente acondicionado con 5 mL de acetonitrilo.
o Descarte los primeros 2 mL del eluato y recolecte el resto.
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DERIVATIZACIÓN POSTCOLUMNA Y DETECCIÓN POR FLUORESCENCIA
o Mida 10,0 mL del extracto limpio en un vial de vidrio que contiene 100 µL de
etilenglicol.
o Coloque el vial en un bloque de calentamiento a 50°C y evapore el extracto bajo
corriente de nitrógeno, en una campana de extracción hasta que se observe
únicamente el remanente con etilenglicol.
o Agregue metanol al residuo de etilenglicol gota a gota hasta obtener un volumen
final de 1,0 mL
o Filtre por membrana de 0,45 µm en un vial del automuestreador
o Proceda al análisis por HPLC
9.3.
Sistema Cromatográfico

El sistema cromatográfico y las condiciones de operación para la separación y
análisis de los carbamatos según el protocolo tomado de la EPA 531.1 y del Standard
methods 6610-B se resume en la Tabla 8. Así mismo, los tiempos de retención de
cada uno de los analitos en función del tipo de columna utilizada como se ilustró en la
Tabla 6.

Calibre o verifique diariamente las condiciones del sistema. Los estándares y
muestras deberán estar ajustados a pH 3 con agua bufferizada.
9.4.
Análisis

Inyecte 400 µL de la muestra y ajuste la unidad de manejo de datos para que sean
registrados: el volumen inyectado y el tamaño de los picos en unidades de área.
 Si la respuesta obtenida para el pico excede el rango de trabajo del sistema, diluiya la
muestra con agua HPLC bufferizada a pH 3 y reanalícela. (Controlar la interferencia
por residuos del analito en la muestra de mayor concentración)
Tabla 8. Cuadro resumen del sistema cromatográfico
Parámetro
Columna 1
Columna 2
(alternativa)
Columna 3.
(Confirmatoria)
EPA 531.1
NovaPack C18 de 4 micras, 150mm de longitud
x3.9mm de diámetro interno en acero inoxidable,
estabilizada con metanol:agua 10:90 durante 2
minutos, y luego se programa un gradiente lineal
hasta metanol:agua 80:20 en 25 minutos
Ultrasphere ODS Beckman de 5micras, 250mm
de longitud x 4.6mm de diámetro interno, en
acero inoxidable, estabilizada con fase móvil a
1.0ml/min con gradiente lineal de metanol:agua
15:85 a 100%metanol en 32 minutos.
Supelco LC-1 de 5 micras, de 250mm de
longitud x 4.6mm de diámetro interno, en acero
inoxidable, estabilizada con fase móvil a
1.0ml/min con gradiente lineal de metanol:agua
15:85 a 100%metanol en 32 minutos.
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STANDARD METHODS 6610B
NovaPack C18 de 4 micras,
150mm de longitud x3.9mm de
diámetro interno en acero
inoxidable,
Ultrasphere ODS Beckman de
5micras, 250mm de longitud x
4.6mm de diámetro interno, en
acero inoxidable,
Supelco LC-1 de 5 micras, de
250mm de longitud x 4.6mm de
diámetro interno, en acero
inoxidable. Es de sílica trimetil
silil enlazada.
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Fase móvil
Flujo
Volumen de
inyección
Modo de
elución
Fase móvil: Agua grado HPLC y Metanol grado
HPLC filtrado y desgasificado con corriente de
He.
constante
constante
400 microlitros
500 microlitros
gradiente Lineal binario
gradiente Lineal binario
Continuación Tabla 9. Cuadro resumen del sistema cromatográfico
Parámetro
EPA 531.1
Derivatización
postcolumna
Detector
9.5.
Longitud de onda de excitación 330nm
Longitud de onda de emisión 418 nm
STANDARD METHODS 6610B
Flujo para el hidróxido de sodio
0,5 ml/min
Flujo para la solución OPA 0,5
ml/min
Longitud de onda de excitación
de 340 nm
Longitud de onda de emisión
418 nm
Identificación de analitos
 Compare los tiempos de retención con los tiempos de retención del cromatograma de
referencia para la identificación de los analitos
 Considere la identificación como positiva, si el tiempo de retención del pico del analito
en la muestra se encuentra dentro de las especificaciones definidas en el protocolo
 Estime el ancho de ventana del tiempo de retención con base en la respuesta de los
estándares de calibración analizados durante el día.
 Calcule el tamaño de ventana para cada compuesto 3DE a partir del tiempo de
retención del compuesto.
 La interpretación del cromatograma requiere de experiencia cuando:
o los componentes de la muestra no se resuelven cromatográficamente.
o los picos representan más de un componente de la muestra (picos ensanchados,
con hombros, con valles entre dos o más máximos).
o existe duda sobre la identificación de un pico en un cromatograma
NOTA: En caso que ocurran estas situaciones se requiere disponer de técnicas
alternativas apropiadas que ayuden a confirmar la identificación de los picos.
Generalmente se acude al uso de otro tipo de detector que responda a un principio
físico o químico diferente del original, o la aplicación de una técnica de separación
diferente a la inicial.
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10. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
10.1.
Cálculos
10.1.1. Determine la concentración del analito por comparación directa en la curva de
calibración de estándares utilizando la ecuación generada por ella, no así la
que se usa para verificación permanente.
10.1.2. Determine la concentración de los compuestos individuales en la muestra
utilizando la siguiente ecuación:
Cx 
( Ax )(Cs )
( As )( FR )
donde: Cx = concentración del analito en µg/L
Ax = respuesta del analito de la muestra
As = respuesta del estándar (externo o interno) en unidades consistentes con las
unidades utilizadas para la respuesta del analito.
FR = factor de respuesta (con un estándar externo RF=1 porque el estándar es el
mismo compuesto medido como analito; con un estándar interno RF es un valor
desconocido)
Cs = Concentración del estándar interno o externo que produce una señal As en
µg/L.
10.2.
Reporte de resultados
Reporte los resultados en µg/L sin hacer corrección de los resultados por la recuperación.
11. OBSERVACIONES
11.1.
Seguridad y riesgo
Tenga cuidado en el manejo de los reactivos y estándares utilizados en el análisis debido
a que su toxicidad o carcinogenicidad no han sido evaluadas en forma definitiva.
Considere cada compuesto manipulado como potencialmente peligroso para la salud y
minimice su exposición.
Mantenga las fichas de seguridad de las sustancias utilizadas en la aplicación de esta
metodología, las cuales deben ser conocidas por los analistas o técnicos que manejan
estas sustancias.
11.2.
Manejo ambiental
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La metodología empleada, utiliza volúmenes pequeños de solventes teniendo en cuenta
que los sistemas de extracción y limpieza se aplican a pequeña escala, lo cual ayuda a
minimizar la contaminación ambiental y el riesgo ocupacional. Algunos reactivos tóxicos
como metanol, conllevan a un riesgo menor debido al uso de volúmenes bajos.
11.3.
Disposición de residuos
El laboratorio debe cumplir la normatividad vigente en el país, sobre disposición de
residuos sólidos, líquidos y emisiones en general provenientes de actividades analíticas.
12. VALIDACIÓN
Para realizar la validación parcial o total de los parámetros de desempeño de la
metodología, Evalúe previamente al menos los siguientes aspectos



Verifique la calibración y el mantenimiento de los instrumentos utilizados en las
metodologías, balanza analítica, HPLC
Verifique el cumplimiento de las especificaciones para los instrumentos de
medición.
Verifique las condiciones ambientales en las que se desarrollan las metodologías.
12.1.
Verificación de la idoneidad del sistema cromatográfico
Evalúe la idoneidad del sistema cromatográfico estableciendo el número de platos
teóricos, el factor de asimetría, la resolución, el factor de separación alfa, el factor de
capacidad y la desviación estándar relativa de la réplica del estándar, al inicio del estudio
y con cada lote de muestras analizadas.
12.2.
Determinación de los parámetros de desempeño de la metodología:
Determine los siguientes parámetros de desempeño que comprenden el diseño
metodológico para la validación de métodos cuantitativos:
o
o
o
o
o
o
o
Especificidad /Selectividad (Incluye la determinación de las posibles Interferencias)
Linealidad (rango lineal)
Precisión: evaluada a través de la repetibilidad y la precisión intermedia
(reproducibilidad)
Límite de detección y de cuantificación
Exactitud
Robustez
Cálculo de la Incertidumbre

Especificidad
Para la determinación de este parámetroevalúe muestras de blanco de reactivos y
blancos de diferentes matrices.
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
Linealidad
Determine la relación entre las variables dependiente e independiente (X, Y), a través del
análisis de una curva de calibración obtenida por lo menos con 6 niveles en el rango de
trabajo teórico, con 10 replicas por nivel. Analice blancos de reactivos y de matriz
conjuntamente.

Precisión
Determine este parámetro en los niveles de Repetitividad (o repetibilidad) y precisión
intermedia o reproducibilidad.
Repetibilidad: determínela aplicando el método a muestras con al menos 6 réplicas y con
niveles del analito en el rango de trabajo; realizados el mismo día, por el mismo analista.
Precisión intermedia: determínela aplicando el método a 6 – 10 muestras, con niveles
del analito en el rango de trabajo; realizados en diferente día.

Límites de detección y cuantificación.
Evalúelos con base en la respuesta promedio del blanco y su desviación estándar. Analice
10 réplicas de blancos de reactivos para su determinación.
Límite de detección = promedio del blanco + 3*Desviación estándar
Límite de cuantificación = promedio del blanco + 10*Desviación estándar

Exactitud.
Se estimará por medio de la recuperación del analito

Robustez.
Se aplicará el método de Youden para la evaluación de la robustez. Se seleccionarán 7
parámetros de cada metodología, a los cuales se les harán modificaciones ligeras y se
observará la respuesta analítica.

Incertidumbre.
Se determina con base en la guía Eurachem /CITAC 20007
7
Eurachem. Uncertainty Manager; Guide Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement
Eurachem 2000; Disponible en www.uncertaintymanager.com
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