Determinación de anticuerpos neutralizantes contra el Virus

TRABAJOS ORIGINALES
Determinación de anticuerpos neutralizantes contra el Virus
Linfotrópico de Células T Humanas tipo 1 (HTLV-1) por un ensayo de
inhibición de la formación de sincicios
L. Gomez1, M. Balangero1, A. Mangeaud2, G. Morón3, F. Britos1, E. Maturano1, S. Gallego1.
1 Laboratorio de Virus Linfotrópicos Humanos- Instituto de Virología "Dr. J. M. Vanella"- Facultad de Ciencias
Médicas (FCM)- Ciudad Universitaria. Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. 2 Cátedra de Estadística y
Biometría, Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Universidad Nacional de Córdoba. Córdoba, Argentina.
3 Departamento de Bioquímica Clínica, Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBIC),
Resumen
Se conoce que los retrovirus humanos al infectar inducen fusión celular, lo que lleva a la formación de sincicios en una
gran cantidad de líneas celulares. El ensayo de inhibición de sincicios se fundamenta en las propiedades fusogénicas
de las proteínas de envoltura de los retrovirus humanos. En este trabajo se implementó y estandarizó una técnica de
inhibición de formación de sincicios para la detección y cuantificación de anticuerpos neutralizantes contra el virus
HTLV-1 en 3 grupos de individuos infectados (N=47) caracterizados como: Asintomáticos (ASS), Oligosintomáticos
(OLIGO) y con enfermedad neurológica establecida (TSP/HAM), analizando diferencias significativas entre los
mismos. Un alto porcentaje de estas muestras (55.4%; N=26) tenía altos títulos de anticuerpos con actividad
neutralizante (entre 500-1000). No se encontraron diferencias significativas en los títulos de anticuerpos entre los
grupos estudiados, ni correlación entre dichos títulos y el número de signos/síntomas piramidales. Estos resultados
corroboran que los anticuerpos con propiedades neutralizantes generados in vivo no serian protectivos para el
desarrollo de TSP/HAM. La técnica de inhibición de formación de sincicios implementada en este trabajo resulta una
herramienta muy útil que podrá ser utilizada en futuros estudios de patogénesis, tropismo viral y desarrollo de
anticuerpos neutralizante contra el virus HTLV-1.
Palabras Claves: HTLV-1, anticuerpos neutralizantes, TSP/HAM, ensayos de fusión.
Abstract
Anti-Human T-Lymphotropic Virus type 1 (HTLV-1) neutralizing antibodies by inhibition syncytium formation assay.
It is known that human retroviruses induce cell fusion, leading to the formation of syncytia in a large number of cell
lines. The syncytium inhibition assay is based on the fusogenic properties of envelope proteins of human retroviruses.
We implemented and standardized an inhibition syncytium formation assay for detection and quantification of
neutralizing antibodies against HTLV-1 in three groups of infected people (N=47) characterized as: Asymptomatic
(ASS), Oligosymptomatic (OLIGO) and patients with neurological disease (TSP/HAM), and differences between them
were analyzed. A high percentage of these samples (% 55.4, N=26) had high titers of neutralizing antibodies (between
500-1000). There were no significant differences in antibody titers between groups and no correlation between these
titers and the number of pyramidal signs/symptoms. These results confirm that in vivo neutralizing antibodies would
not be protective for the development of TSP/HAM. The inhibition syncytium formation assay implemented is a very
useful tool that can be used in future studies of pathogenesis, viral tropism and the development of neutralizing
antibodies against HTLV-1.
Key Words: HTLV-1, neutralizing antibodies, TSP/HAM, fusion assay
Correspondencia
Bioq. Lucía del Pilar Gomez
Laboratorio Virus Linfotrópicos Humanos- Instituto de Virología "Dr. J. M. Vanella"Facultad de Ciencias Médicas (FCM)-UNC
Enfermera Gordillo Gómez S/N- Ciudad Universitaria CP (5016).
Teléfono: (0351)- (152268985)- (4334022)
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NEUTRALIZACIÓN DEL VIRUS HTLV-1
origen humano) obtenida por transfección con un
plásmido LTR-Lac Z (pMA 175), en el cual el gen
bacteriano ß-galactosidasa está bajo control del
fragmento Sca I-Hind III de la secuencia LTR de HIV.
Introducción
El virus linfotrópico humano de las células T (HTLV1) es el agente etiológico de la leucemia a células T del
adulto (ATL) y de una enfermedad crónica progresiva
neurodegenerativa llamada Paraparesia Espástica
Tropical o Mielopatía asociada al HTLV-1 (TSP/HAM)
(1). El virus HTLV-1 se transmite eficientemente entre
individuos a través de células infectadas, entra a células
permisivas uniéndose a un receptor de la membrana
celular. La unión de la glicoproteína de envoltura viral
gp46 al receptor celular es un pre-requisito para la fusión
y la infección de la célula blanco (2). Se conoce que los
retrovirus humanos al infectar inducen fusión, lo que
lleva a la formación de sincicios en una gran cantidad de
líneas celulares (3). Así, los ensayos de inhibición de
sincicios son herramientas muy útiles para los estudios
de fisiopatogenia y tropismo viral, como para el estudio
de ciertas mutaciones en la glicoproteína de envoltura
del virus HTLV (3, 4, 5, 6).
Para los ensayos de aplicación de la técnica se
utilizaron 47 muestras de suero de individuos infectados
con el virus HTLV-1, con manifestaciones clínicas y
asintomáticos provenientes de la provincia de Jujuy,
Argentina, obtenidas con el correspondiente
consentimiento informado.
Las muestras fueron clasificadas según las
características clínicas de los individuos infectados en 3
grupos:
A) 17 muestras de Asintomáticos (ASS), individuos
infectados que no presentaban síntomas en el momento
de la toma de la muestra.
B) 10 muestras TSP/HAM, aquellos que presentaban 4 o
más signos/síntomas piramidales, definidos como (11):
1)Debilidad proximal de miembros inferiores MMII.
2)Disturbio vesical.
3)Impotencia.
4)Hiperreflexia, clonus o Babinsky (MMII).
5)Hiperreflexia en miembros superiores (MMSS),
signos de Hoffman y Trömner.
6)Abolición del reflejo cutáneo-abdominal.
C) 20 muestras de Oligosintomáticos (OLIGO), aquellos
pacientes que presentaban 3 o menos signos/síntomas de
síndrome piramidal.
Si bien existen varios métodos adecuados para
realizar el diagnóstico de la infección por HTLV-1, no se
cuenta con ensayos que permitan discriminar entre
portadores asintomáticos y pacientes TSP/HAM (7). En
este trabajo se ha implementado y estandarizado un
sistema in vitro de neutralización del virus HTLV-1, un
ensayo de inhibición de formación de sincicios. El
mismo, permite caracterizar la respuesta inmune
humoral de los individuos infectados con el virus HTLV1, siendo posible cuantificar los anticuerpos
neutralizantes presentes en muestras de suero.
Las muestras de suero fueron previamente
inactivadas por calor. La presencia de anticuerpos anti
HTLV-1 totales se determinó por la técnica de
aglutinación de partículas de gelatina Serodia HTLV-1
(Fujirebo Inc, Tokyo, Japón), siguiendo estrictamente las
instrucciones del fabricante.
La técnica implementada se utilizó para determinar
el título de anticuerpos neutralizantes en 3 grupos de
individuos infectados con el virus HTLV-1 y
caracterizados
como:
Asintomáticos
(ASS),
Oligosintomáticos (OLIGO) y con enfermedad
neurológica establecida (TSP/HAM), analizando si
existían diferencias significativas entre los mismos.
Otras técnicas, con similares fundamentos, han sido
utilizadas previamente para caracterizar la respuesta
inmune de individuos infectados con HTLV-1 (8, 9, 10).
Para la implementación del ensayo de inhibición de
la formación de sincicios se utilizó el protocolo
descripto previamente (12) al que se incorporaron
algunas modificaciones. El sistema utiliza células
productivamente infectadas con HTLV-1 (MT-2), células
transfectadas con el gen LacZ bajo el control de la
secuencia LTR del virus HIV (Hela CD4+ LTR Lac Z) y
líneas celulares transfectadas con el gen tat del virus
HIV (Dunni-tat o Cos-tat o RD-tat).
Materiales y métodos
Se utilizaron las siguientes líneas celulares: MT-2
(línea linfoblástica T humana persistentemente infectada
con el virus HTLV-1, como inductora de la formación de
sincicios), Dunni-tat y RD-tat (fibroblastos humanos
están transfectadas con el gen tat del virus HIV y son
portadoras del gen de resistencia a neomicina) y Hela
CD4+ LTR LacZ (P4.2) (de carcinoma cervical de
Cuando se co-cultivan los tres tipos celulares hay
formación de sincicios y color, mientras que si de alguna
manera las proteínas virales son bloqueadas
(neutralizadas) en las células MT-2, se observa
inhibición en la formación de sincicios con ausencia de
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Experiencia Médica - Vol 28 - Nº 1 - 2010
Los títulos de anticuerpos neutralizantes contra el
virus HTLV-1 en los grupos evaluados se encontraron en
un rango entre 1/50 y 1/4000. Sin embargo, en los tres
grupos de individuos infectados estudiados los títulos de
anticuerpos no se diferenciaron significativamente, ya
que la mayoría (55.4%) de los individuos presentaban
títulos en el rango de 1/500 - 1/1000 sin diferencias entre
sus medianas (H=3,68; p=0,1384), ni entre sus
variabilidades (F=2.78; p=0,0723) (Tabla I).
color. Se estandarizaron las condiciones del ensayo,
variando la cantidad de células infectadas e indicadoras
utilizadas, tiempos de incubación y de revelado de la
reacción.
Se consideró un sincicio a los focos azules formados
por 2 o más núcleos celulares en microscopio (bajo
objetivo de 40x). Cada foco de color se nombró como
Unidad Formadora de Sincicio (UFS). El título de
anticuerpos neutralizantes Inhibidores de la Formación
de sincicios, TI50 (Título de Inhibición), se definió
como la recíproca de la dilución del suero que producía
una reducción de formación de sincicios del 50% o más
respecto del control positivo.
No se observó una correlación entre el número de
signos piramidales y el título de anticuerpos
neutralizantes (r=0,050; p=0,81) en el grupo de los
pacientes OLIGO. Resultados similares se obtuvieron al
analizar el grupo de los TSP/HAM en los cuales
tampoco se observó correlación entre el número de
signos y el título de anticuerpos neutralizantes (r=0,048;
p=0,88).
Una vez estandarizado el ensayo, se evaluó la
utilidad de la técnica implementada para detectar y
cuantificar los anticuerpos neutralizantes presentes en
muestras de suero/plasma de individuos infectados con
el virus HTLV-1, correspondientes a diferentes
categorías clínicas. Las muestras de suero se ensayaron
en diluciones 1/50, 1/100, 1/500, 1/1000, 1/2000 y
1/4000.
Discusión
En este trabajo se implementó y estandarizó una
técnica de inhibición de formación de sincicios para la
detección y cuantificación de anticuerpos neutralizantes
contra el virus HTLV-1. El ensayo se fundamenta en las
propiedades fusogénicas de las proteínas de envoltura de
los retrovirus humanos (15). La técnica implementada se
utilizó para determinar los títulos de anticuerpos
neutralizantes contra HTLV-1 en individuos de
Argentina infectados, correspondientes a diferentes
categorías clínicas (N=47). De los resultados obtenidos
surge que un alto porcentaje de estas muestras (55.4%;
N=26) tenía altos títulos de anticuerpos con actividad
neutralizante (entre 500-1000). Sin embargo, en el
análisis realizado entre los diferentes grupos estudiados
no se encontraron diferencias significativas en los títulos
de anticuerpos, ni correlación entre dichos títulos y el
número de signos/síntomas piramidales (Tabla I). Estos
resultados difieren de lo descrito por otros autores que
describieron diferencias significativas en los títulos de
anticuerpos neutralizantes en pacientes de Japón,
Jamaica, Colombia, Chile, Canadá, Brasil, Caribe con
TSP/HAM comparados con individuos ASS (8, 9, 10).
Las diferencias en los títulos de anticuerpos
neutralizantes en los individuos de las diferentes
categorías clínicas se analizaron mediante la Prueba de
Kruskal-Wallis que determina diferencias entre
medianas (13) y la variabilidad en los diferentes grupos
se analizó mediante la prueba de homogeneidad de
varianzas de Levene (14). También se realizó la
asociación entre título de anticuerpos neutralizantes y
número de signos piramidales en el grupo de
OLIGOSINTOMATICOS y TSP/HAM, para lo cual se
realizó un gráfico de dispersión entre ambas variables y
un análisis de correlación de Spearman. En todos los
casos se trabajó con un nivel de significación de 5%.
Resultados
Se logró estandarizar las condiciones para la
realización de esta técnica: El número óptimo a utilizar
de células MT-2 es 2,5x104 y de las células indicadoras
es 5x104 (monocapa confluente, sincicios coloreados;
N=100); el tiempo de incubación de la prueba es de 24
hs (minimiza tiempo total y facilita el recuento de los
sincicios) y el tiempo de revelado con X-gal se
estableció en 3 hs (mejor intensidad de color y número
de sincicios coloreados).
El rol de los anticuerpos neutralizantes en la
infección por HTLV-1 no está aún esclarecido al igual
que la patogénesis del TSP/HAM. Así, los resultados
obtenidos en este trabajo y las discordancias con lo
descrito por otros autores en otras poblaciones
estudiadas, son interesantes, ya que se conoce que las
características genéticas del huésped tendrían un rol
fundamental en la evolución de la infección hacia el
desarrollo del cuadro neurológico (16) y los anticuerpos
con propiedades neutralizantes generados in vivo no
serian protectivos para el desarrollo de TSP/HAM. La
Utilizando esta técnica hemos logrado poner en
evidencia anticuerpos capaces de neutralizar al virus e
inhibir la fusión celular, utilizando sueros policlonales
de individuos infectados con HTLV-1 (Figura 1).
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NEUTRALIZACIÓN DEL VIRUS HTLV-1
muy útil que podrá ser utilizada en futuros estudios de
patogénesis, tropismo viral y desarrollo de anticuerpos
neutralizante contra el virus HTLV-1.
respuesta inmune generada por el huésped parece ser el
factor principal determinante en el desarrollo de TSP
(16, 17).
La técnica de inhibición de formación de sincicios
implementada en este trabajo resulta una herramienta
Figura 1 (A y B): Ensayo de inhibición de la formación de sincicios. A- Control positivo. Se observan los
sincicios coloreados con X-gal. B- Reacción de Neutralización con un suero policlonal humano positivo para
anticuerpos contra HTLV-1. No se observan sincicios coloreados.
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Experiencia Médica - Vol 28 - Nº 1 - 2010
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