Segregación de la apomixis en Paspalum notatum a partir de

Resumen: A-008
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Segregación de la apomixis en Paspalum notatum a partir de cruzamientos
entre una planta sexual autotetraploide inducida y un padre apomíctico
Fortes, Nidia B. - Tcach, Mauricio - Acuña, Carlos A. - Martínez, Eric J. - Quarin, Camilo L.
Cátedra de Genética y Fitotecnia, FCA-UNNE, IBONE-CONICET
Sargento Cabral 2131. C.C. 209. (3400) Corrientes, Argentina
E-mail: [email protected] TE: +54-3783-426218
ANTECEDENTES
La apomixis es una forma de reproducción asexual por medio de semillas. El proceso se caracteriza por la ausencia o
no funcionalidad de la meiosis y por originar embriones sin unión de gametos (partenogénesis). La progenie de una
planta apomíctica es genéticamente idéntica a la planta madre (Nogler 1984; Asker y Jerling 1992). La apomixis tiene
gran interés para la agricultura debido a que su posible introducción en las especies de importancia económica como el
maíz, sorgo, girasol, etc., permitiría mantener, por tiempo indeterminado y por medio de verdaderas semillas, la
estabilidad genética de híbridos y de variedades superiores (Hanna y Bashaw 1987; Savidan y Dujardin 1992;
Koltunow 1993; Vielle-Calzada y col. 1996).
Paspalum es un género de gramíneas con más de 400 especies, perteneciente a la tribu de las Paniceae (Chase 1929).
Posee especies diploides de reproducción sexual y poliploides sexuales o apomícticos (Quarin y Norrmann 1987;
Quarin 1992). La apomixis en Paspalum ha comenzado a ser caracterizada en los últimos años. Se han identificado
marcadores moleculares ligados al carácter, tanto en P. notatum (Martínez y col. 2003) como en P. simplex (Pupilli y
col. 2001) y P. malacophyllum (Pupilli y col. 2004).
La influencia que el progenitor sexual podría tener sobre la segregación de la apomixis es un factor que todavía no ha
sido evaluado en Paspalum. En los estudios sobre herencia de la apomixis llevados a cabo en gramíneas apospóricas
tales como Panicum (Savidan 1982) y Brachiaria (Valle y col. 1994), se utilizaron como madre genotipos
autotetraploides, obtenidos por duplicación cromosómica con colchicina de las correspondientes contrapartes diploides.
En ambos trabajos siempre se observaron segregaciones de 1:1 (sex:apo), indicando que el carácter apomixis segrega
normalmente como un factor Mendeliano simple. Sin embargo, en estudios llevados a cabo en P. notatum, utilizando
los mismos parentales, se observó una segregación distorsionada en favor de las plantas sexuales (Martínez y col. 2001;
Stein y col. 2004). La planta utilizada como madre fue un genotipo sexual de origen híbrido. En una primera población
de 213 individuos F1 se obtuvo una segregación de 2,8:1 (sex:apo) (Martínez y col. 2001); mientras que en otra
progenie de 113 F1 fue de 6,5:1 (Stein y col. 2004). El logro de una planta autotetraploide sexual de P. notatum, a partir
de la duplicación de los cromosomas de una raza diploide sexual de la misma especie (Quarin y col. 2001), nos
permitió evaluar si el genotipo sexual materno influye en la segregación.
El objetivo de este trabajo fue analizar la segregación de la apomixis apospórica en Paspalum notatum, a partir de la
utilización de una madre sexual autotetraploide inducida, obtenida mediante duplicación cromosómica de un diploide.
MATERIALES Y MÉTODOS
La especie que se utilizó fue Paspalum notatum tetraploide (2n=4x=40). Se realizaron cruzamientos controlados, de
acuerdo a la técnica descrita por Burton (1948), entre un genotipo autotetraploide inducido 100% sexual (Q4260) como
madre y otro tetraploide natural apomíctico obligado (Q4117) como donador de polen. El padre apomíctico Q4117 fue
el mismo utilizado en estudios previos sobre herencia de la apomixis donde se lo cruzó con plantas tetraploides
sexuales de origen híbrido (Martínez y col. 2001; Stein y col. 2004). Los cariopses obtenidos fueron sembrados en
terrinas bajo invernáculo y los plantines obtenidos fueron transplantados en macetas y luego llevados a campo.
La determinación del sistema reproductivo de la progenie F1 se llevó a cabo empleando métodos embriológicos y
moleculares. El análisis embriológico consistió en la observación de sacos embrionarios de unos 50 a 60 ovarios en
antesis, a partir de la técnica de clarificado de ovarios de Herr (1971). Por su parte, el análisis molecular consistió en la
utilización de dos marcadores moleculares de RAPD (Random amplified polymorphism DNA) 100% ligados a la
apomixis (Martínez y col. 2003). La metodología utilizada para la obtención de los RAPDs fue la misma descripta por
Martínez y col. (2003). Los individuos de la progenie fueron clasificados en sexuales o apomícticos de acuerdo al tipo
de saco embrionario observado y a la presencia o no de los marcadores moleculares. Se consideraron sexuales todos
aquellos individuos que no mostraron sacos embrionarios apospóricos y que a su vez no amplificaron ninguno de los
dos marcadores de RAPD ligados a apomixis. Por el contrario, aquellos individuos que mostraron sacos apospóricos y
a su vez amplificaron ambos marcadores fueron clasificados como apomícticos. A partir de la relación observada entre
plantas sexuales y apomícticas se determinó el tipo de segregación genética existente.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se obtuvieron en total 85 individuos F1 a partir de cruzamientos llevados a cabo durante dos períodos de floración. Una
primera progenie de 44 individuos fue obtenida en el año 2002-2003, mientras que en el año 2003-2004 se amplió la
población con 41 individuos adicionales. Todos los individuos logrados en 2002-2003 ya fueron analizados, tanto
embriológica como molecularmente. Sin embargo, los 41 individuos del período 2003-2004 sólo pudieron ser
evaluados molecularmente, debido a que las plantas fueron llevadas a campo al final del período de floración, con lo
cual sólo algunas llegaron a florecer. No obstante, los datos obtenidos con los individuos del período 2002-2003
indican que los marcadores moleculares utilizados son totalmente confiables para poder lograr una exacta clasificación
desde el punto de vista reproductivo.
En la Tabla 1 se resumen los resultados obtenidos a partir del análisis embriológico llevado a cabo en la población
obtenida en el año 2002-2003.
Tabla 1. Clasificación de una progenie F1 obtenida por cruzamiento de una planta sexual (Q4260) y
otra apomíctica (Q4117) de Paspalum notatum en el año 2002-2003.
Porcentaje de óvulos con
Progenie
SEM
SEI
SEa
SEM + SEA
SEA
79,9
4,6
15,5
0
0
15,5 - 100
0 - 33,3
0 - 81
0
0
33,1
4,6
51,5
2,6
8,2
6,5 - 93,5
1 - 10
35,4 – 89,7
0 - 11
1 – 18,7
F1 Sexual (36 individuos)
Promedio
rango
F1 Apomíctica (8 individuos)
Promedio
rango
SEM = Saco embrionario meiótico
SEI = Saco embrionario inmaduro
SEa = Saco embrionario ausente o abortado
SEA = Saco embrionario apospórico
El análisis embriológico llevado a cabo en la población 2002-2003 determinó que sobre un total de 44 plantas, 36 no
forman sacos embrionarios apospóricos y por lo tanto son de exclusiva reproducción sexual. En los 8 individuos
restantes se observaron óvulos en los cuales se formaban sacos apospóricos, en proporción variable, y por lo tanto se
considera que todos ellos heredaron la capacidad de reproducción apomíctica (Tabla 1). Estas 8 plantas, clasificadas
como apomícticas, mostraron un muy bajo nivel de expresión del carácter. Esto queda reflejado en los valores promedio
de sacos embrionarios apospóricos (SEA) y de sacos meióticos más apospóricos (SEM + SEA) observados (Tabla 1).
Sin embargo, las mismas plantas presentan un elevado porcentaje de sacos embrionarios ausentes o abortados (SEa), lo
cual es poco común en la mayoría de las plantas silvestres que son de reproducción apomíctica. Esta alta esterilidad
femenina pudo haber sido heredado de la madre sexual Q4260 la cual posee un alto nivel de SEa (datos inéditos). Por su
parte, las plantas clasificadas como sexuales mostraron porcentajes bajos (promedios) de SEa a pesar que en el rango se
observa que hubo una planta que llegó al 81% (Tabla 1).
Tabla 2. Segregación del sistema reproductivo en progenies F1 de Paspalum notatum (Q4260 X Q4117)
obtenidas a partir del uso de marcadores moleculares completamente ligados a la apomixis.
Año
Nº Plantas
Analizadas
Número de plantas con
UBC243-377
(1)
UBC259-1157
Número de plantas
(1)
Sexuales Apomícticas
Proporción
Sex : Apo
2002 - 2003
44
8
8
36
8
4,5
2003 - 2004
41
8
8
33
8
4,1
Total
85
16
16
69
16
4,3
(1) Marcadores de RAPD 100 % ligados a la apomixis en Paspalum notatum (Martínez y col. 2003)
El análisis molecular se llevó a cabo en los 85 individuos de la población híbrida (Tabla 2). Un total de 16 plantas
amplificaron ambos marcadores de RAPD ligados a la apomixis; mientras que 69 no amplificaron ninguno de los dos
marcadores. Las 8 plantas de la población 2002-2003 que amplificaron ambos marcadores son exactamente las mismas
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que según el análisis embriológico mostraron capacidad para formar sacos embrionarios apospóricos. En la Figura 1
podemos observar la co-segregación de los marcadores moleculares y el carácter apomixis. La proporción obtenida,
entre plantas sexuales y apomícticas, fue de 4,3:1 (Tabla 2). Si consideramos individualmente cada población
observamos que las proporciones obtenidas son idénticas desde el punto de vista estadístico (Tabla 2). Por otra parte,
los resultados moleculares observados en la población obtenida en 2002-2003 coinciden perfectamente con los
obtenidos en el análisis embriológico. Por ambas metodologías se determinó que 36 plantas fueron sexuales y 8
apomícticas (Tabla 1 y 2). Esto confirma una vez más la utilidad de que tienen estos dos marcadores de RAPD en la
clasificación reproductiva en P. notatum.
La segregación genética de la aposporia fue anteriormente explicada mediante un modelo genético de herencia
Mendeliana simple, con dominancia de la aposporia sobre reproducción sexual exclusiva, pero con una fuerte distorsión
en la segregación (Martínez y col. 2001). Esta distorsión provoca que los valores observados (4,3:1) se desvíen
significativamente de los esperados (1:1 o 13:15), considerando que el padre apomíctico es de genotipo simplexo
(Aaaa). La distorsión observada puede deberse a un efecto pleiotrópico letal del propio alelo de la apomixis o a otros
genes que se encuentren ligados a la región genómica responsable del carácter. Por otro lado, la distorsión ha resultado
variable, ya que la segregación observada por Martínez y col. (2001) fue de 2,8:1 (sex:apo), la observada por Stein y
col. (2004) fue de 6,5:1 y la observada en este estudio es de 4,3:1, cuando usamos una madre sexual diferente. Estos
resultados indican que el grado de distorsión no sería una influencia de la madre, sino más bien que el efecto de
letalidad tendría una penetrancia variable.
CONCLUSIONES
Los resultados confirman que la apomixis en P. notatum segrega en forma distorsionada, probablemente debido a algún
mecanismo de letalidad con penetrancia incompleta. El uso de una madre sexual autotetraploide inducida no eliminó la
distorsión. La causa de la distorsión no depende de la madre usada y habrá que idear otro tipo de experimentación para
demostrar cual es el determinante genético involucrado.
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Resumen: A-008
(B)
100 bp
(A)
100 bp
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
M P A
S
A A S S A A S
M P A
S
A A S S A A S
(C)
λ
M P
A
S
A
S
S
S
S A
S
Figura 1. Patrón de amplificación de los primers de RAPD UBC243 (A) y UBC259 (B y C)
en individuos F1 de Paspalum notatum, obtenidos por cruzamiento entre Q4260 y Q4117 en
el año 2002-2003 (A y B) y 2003-2004 (C). Las flechas indican los fragmentos ligadas a
apomixis, UBC243-377 (A) y UBC259-1157 (B y C), co-segregando con el carácter. 100 bp
= marcador de peso molecular, λ = marcador de peso molecular Lambda EcoRI/HindIII, M =
madre sexual Q4260, P = padre apomíctico Q4117, S = F1 sexual, A = F1 apomíctico