Caracterización y análisis funcional de las histonas H2A y H2B de

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Caracterización y análisis funcional
de las histonas H2A y H2B de
Toxoplasma gondii
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Agradecimientos
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iii
Indice
Agradecimientos ....................................................................................................................... ii
Indice............................................................................................................................................ 1
Publicaciones ............................................................................................................................. 4
Abreviaturas y palabras tomadas del inglés ....................................................................... 5
Resumen ...................................................................................................................................... 7
Capítulo 1:
1. Toxoplasma gondii .............................................................................................................. 10
1.1. Caracterísitcas generales ....................................................................................... 10
1.2. Genotipos existentes .............................................................................................. 10
1.3. Ciclo de vida del parásito ........................................................................................ 11
1.4. Interconversión taquizoito-bradizoito ....................................................................... 13
1.5. Regulación de la transcripción ................................................................................ 17
2. HISTONAS ............................................................................................................................... 18
2.1. Características generales ....................................................................................... 18
2.2. El lenguaje de las modificaciones covalentes de las histonas ................................. 19
2.2. Variantes y canónicas ............................................................................................. 21
2.4. Variantes de H2A .................................................................................................... 22
3. Lenguaje de las histonas en Toxoplasma....................................................................... 25
3.1. Evidencias de la presencia de mecanismos epigenéticos ....................................... 25
OBJETIVOS: ................................................................................................................................ 29
General: ......................................................................................................................... 29
Específicos: ................................................................................................................... 29
Capítulo 2: !"
2. 1. Introducción ..................................................................................................................... 31
2. 2. Resultados ......................................................................................................................... 33
2. 2. 1. Identificación y clonado ...................................................................................... 33
2. 2. 2. Análisis filogenético ........................................................................................... 36
2. 2. 3. Antigenicidad de H2Bv en pacientes con toxoplasmosis .................................... 37
2. 2. 4. Obtención de anticuerpos específicos................................................................ 37
2. 2. 5. Inmunodetección de las H2Bs............................................................................ 38
2. 2. 6. Análisis de histonas purificadas ......................................................................... 40
1
2. 2. 7. Expresión de las histonas H2Bs de T. gondii ..................................................... 41
2. 3. Discusión ............................................................................................................................ 44
Capítulo 3: #$
#%&
3.1. Introducción ...................................................................................................................... 47
3.2. Resultados .......................................................................................................................... 49
3. 2. 1. Identificación, clonado y análisis de secuencia .................................................. 49
3. 2. 2. Obtención de anticuerpos específicos................................................................ 53
3. 2. 3. Inmunodetección de las histonas de la familia H2A ........................................... 55
3. 2. 4. Perfiles de expresión de las histonas de la familia H2A ..................................... 57
3. 2. 5. H2AX y daño del ADN en taquizoitos ................................................................. 59
3.2.6. La sobreexpresión de H2AX y su papel en la replicación del parásito.................. 62
3.1. Discusión ............................................................................................................................. 64
Capítulo 4: '
&(
4.1. Introducción ...................................................................................................................... 69
4.2. Resultados .......................................................................................................................... 71
4.2.1 Interacciones entre las histonas H2As y H2Bs ...................................................... 71
4.2.2 H2As y H2Bv: acetilación y asociación con histonas acetiladas ............................ 73
4.2.2 Asociación diferencial de H2A y H2B variantes a genes activos e inactivos.......... 75
4.2.4 H2AX se encuentra asociada a TgIRE, un elemento repetitivo al extremo de los
cromosomas .................................................................................................................. 75
4.3 Discusión .............................................................................................................................. 78
Capítulo 5: )(
Capítulo 6: *(&
6.1. Cultivo de parásitos ................................................................................................ 87
6.2. Análisis de secuencia ............................................................................................. 88
6.3. Análisis de Neighbor-joining.................................................................................... 88
6.4. Amplificación y clonado de las diferentes histonas.................................................. 89
6.5. Análisis de expresión .............................................................................................. 90
6.6. Expresión y purificación de las histonas recombinantes.......................................... 92
6.7. Producción de anticuerpos...................................................................................... 93
6.8. Purificación de histonas .......................................................................................... 93
6.9. Análisis de histonas purificadas por TAU-PAGE y MALDI-TOF-TOF. ..................... 94
2
6.10. Análisis de Western Blot ....................................................................................... 94
6.11. Inmunofluorescencia indirecta (IFI) ....................................................................... 96
6.12. Determinación de la especificidad de los anticuerpos ........................................... 97
6.13. Coinmunoprecipitación.......................................................................................... 98
6.14. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ............................................................. 99
6.15. Tratamiento con peróxido de hidrógeno .............................................................. 101
6.16. Construcción de plásmidos de expresión en Toxoplasma ................................... 102
6.17. Transfección de parásitos ................................................................................... 102
6.18. Ensayo de replicación. ........................................................................................ 103
Bibliografía............................................................................................................................... 104
3
+,
Publicaciones
Parte de los resultados de esta tesis han sido presentados en:
Publicaciones
“Toxoplasma H2A Variants Reveal Novel Insights into Nucleosome Composition and
Functions for this Histone Family”. Maria C. Dalmasso, David O. Onyango,
Arunasalam Naguleswaran, William J. Sullivan Jr. and Sergio O. Angel. Journal of
Molecular Biology (2009) 392(1):33-47.
“Toxoplasma gondii has two lineages of histones 2b (H2B) with different expression
profiles”. María C. Dalmasso, Pablo C. Echeverria, María P. Zappia, Ulf Hellman,
Jean François Dubremetz and Sergio O. Angel. Mol Biochem Parasitol (2006)
148(1):103.
Presentaciones a congresos
“Toxoplasma gondii histones H2A: novel features about H2AX”. Dalmasso MC, Sullivan
WJ and Angel SO. XXIII Reunión Annual de la Sociedad Argentina de
Protozoología -SAP- Rosario, Argentina (Noviembre, 2008).
“Análisis de las interacciones y modificaciones postraduccionales de las histonas H2A y
H2B de Toxoplasma gondii”. Dalmasso MC, Sullivan WJ and Angel SO. XXII
Reunión Annual de la Sociedad Argentina de Protozoología -SAPChascomús, Argentina (Noviembre, 2007).
“Toxoplasma gondii histone H2Bv interacts with H2A.Z but not with H2A.X”. Dalmasso MC
and Angel SO. Ninth International Congress of Toxoplasmosis. Montana USA (Junio-Julio, 2007).
“Caracterización de las histones H2A de Toxoplasma gondii”. Dalmasso MC, Echeverria
P and Angel SO. XXI reunión anual de la Sociedad Argentina de
Protozoología. Huerta grande, Córdoba (Octubre 2006).
“Cloning and caracterization of Toxoplasma gondii histones 2A”. Dalmasso MC,
Echeverria P, Hellman U, Dubremetz JF and Angel SO. Eighth International
Congress on Toxoplasmosis. Corsica - France (Mayo 2005).
4
,
Abreviaturas y palabras tomadas del inglés
aa.: aminoácidos
AN: número de acceso del gen en el GeneBank. Del inglés “Accession Number”.
AcH3: histona H3 acetilada.
AcLys: lisina acetilada.
ADN: ácido desoxiribonucleico.
ADNc: ácido desoxiribonucleico copia del ARN.
ADNg: ácido desoxiribonucleico genómico.
ARN: ácido ribonucleico.
ATM: kinasa ataxia telangiectasia mutada.
ATR: kinasa ATM relacionada a Rad3.
BAG1: antígeno de bradizoito. Del inglés “Bradyzoite Antigen 1”.
BSA: albúmina sérica bovina. Del inglés “ Bovine Serum Albumin”
CDS: secuencia codificante. Del inglés “ CoDing Sequence”.
CT: número de ciclo de la PCR en el cual la cantidad de producto amplificado cruza el
umbral establecido. Del inglés “ Cycle Threshold”.
ChIP: inmunoprecipitación de cromatina. Del inglés: “Chromatin Immuno Precipitation”.
DBL: lectina de Dolichos biflorus. Del inglés “Dolichos biflorus lectin”. Tiene la capacidad
de unirse a la pared del quiste.
DNA-PK: ADN protein kinasa.
dNTP: deoxi nucleótidos trifosfatos.
DAPI: 4,6-diamidino 2-fenil indol. Marcador de núcleo (fluorescente)
DSB: daño en el ADN generado por quiebre de las dos hebras. Del inglés “Double Strand
Brakes”.
ELISA: Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas. Del inglés
"Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay".
EST: marcador de secuencia expresada. Del inglés “Expressed Sequence Tag”.
FTG: Factores de Transcripción Generales.
GST: glutatión tio-transferasa.
γH2AX: histona H2AX fosforilada.
HAT: Histona Acetil Transferasa.
HDAC: Histona Desacetilasa.
H4K20me1: Histona H4 monometilada en la lisina 20.
5
,
hxgprt: hipoxantina xantina guanina fosforibosil transferasa. Del inglés “hypoxanthinexanthine-guanine phosphoribosyl transferase”.
IFI: Inmunofluorescencia Indirecta.
IP: inmunoprecipitación.
IPTG: Isopropil ȕ-D-1-tiogalactopiranósido.
KO: mutante nula. Del inglés “knock out”.
kDa: kilodalton
LB: Medio de cultivo para bacterias Luria-Bertoni.
LDH2: Lactato Deshidrogenasa 2. Este gen es específico de bradyzoitos.
OD(λλ=600): densidad óptica medida a una longitud de onda de 600 nm. Del inglés
“optic density”.
oligo(dT)12-18: oligonucleótido compuesto por 12 a 18 timidinas.
o.n.: toda la noche. Del inglés “ over night”.
pb: pares de bases.
PBS: solución tampón de fosfato salino. Del inglés “ Phosphate Buffer Saline”.
PCR: reacción en cadena de la polimerasa. Del inglés “ Polimerase Chain Reaction”.
pI: punto Isoeléctrico.
qPCR: análisis de cuantificación absoluta por PCR en tiempo real. Del inglés “quantitative
PCR”.
qRT-PCR: análisis comparativo por PCR en tiempo real. Del inglés “quantitative retrotranscription - PCR”.
MMS: metano sulfonato de metilo. Del inglés “Methyl Methane Sulfonate”.
MNasa: endocucleasa micrococcal.
RT-PCR: transcripción reversa del RNA seguida de reacción en cadena de la polimerasa.
Del inglés “ retro-transcription – PCR”.
SAG 1: antígeno de superficie. Del inglés “ Surface Antigen 1”. Es un gen específico de
taquizoito.
SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida conteniendo dodecil sulfato sódico.
Del inglés “Sodium Dodecyl Sulfate – Poly Acrylamide Gel Electrophoresis”.
SNP: Polimorfismo de un solo nucleótido. Del inglés “Single Nucleotid Polimorfism”.
TAU-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida conteniendo Triton, ácido acético y
urea. Del inglés “ Tritón-Acetic-Urea – PAGE”.
TBS: solución tampón Tris-salino. Del inglés “ Tris Buffer Saline”.
TEMED: N,N,N’,N’ tetrametil etilen diamina.
TSS: sitio de inicio de la transcripción. Del inglés “Transcriptional Start Site”.
WT: cepa salvaje. Del inglés: “ Wild Type”.
6
-
Resumen
Toxoplasma gondii posee la capacidad de diferenciarse entre la forma de replicación
rápida (el taquizoito), y la de replicación lenta o nula (el bradizoito), que forma quistes. Esta
interconversión regula que se establezca una infección crónica y la reaparición de la
enfermedad. Si bien este proceso se encuentra regulado a nivel transcripcional, no se
conocen los mecanismos que regulan la transcripción en el parásito. Varios trabajos han
demostrado que los mecanismos epigenéticos, como la acetilación y metilación de histonas
H3 y H4, se encuentran conservados en T. gondii. Nuestra hipótesis de trabajo fue que las
histonas H2A y H2B estarían involucradas en la regulación de la transcripción y
diferenciación del parásito. Con el objetivo de esclarecer esta idea, se identificaron y
caracterizaron los miembros de las histonas H2A y H2B de T. gondii.
Se detectaron tres H2B en el genoma de T. gondii: H2Bv, H2Ba y H2Bb. Un análisis
de Neighbor-Joining, incluyendo las secuencias de H2B de otros Apicomplexas, mostró que
éstas se agrupan en dos clados diferentes, uno que contiene a la H2Bv y el otro a H2Ba y
H2Bb. A diferencia de otros organismos todos los parásitos Apicomplexas analizados
presentan una H2B variante. Por ensayos de RT-PCR semicuantitativa, se observó que sólo
se expresan h2bv y h2ba, siendo h2bv la mayoritaria. A su vez, los niveles de transcripto de
H2Ba disminuyen en bradizoitos, mientras que los de H2Bv son iguales en taquizoitos y
bradizoitos; confirmando la calidad de histonas canónica y variante, respectivamente. Se
desarrolló un anticuerpo específico para H2Bv. Los ensayos de Western blot e
Inmunofluorescencia indirecta mostraron que los niveles de proteína de esta histona en
taquizoitos y/o bradizoitos son iguales y que en ambos estadios se encuentra en el núcleo.
Un estudio de histonas purificadas por MALDI-TOF y microsecuenciación, reveló la
presencia de las histonas H2A, H3, H4 y H2Bv en las bandas analizadas, mientras que
H2Ba no pudo ser identificada. Estos resultados estarían confirmando que la histona
variante es la H2B mayoritaria.
Por otro lado, se encontraron tres H2A en el genoma de T. gondii: H2A1, H2AX y
H2AZ. Se obtuvieron anticuerpos específicos para cada una. Estos se utilizaron en ensayos
de Western blot de histonas purificadas, revelando que las tres H2As se encuentran
presentes en taquizoitos y que H2AZ es la minoritaria. El estudio de los niveles de
transcripto en taquizoitos y bradizoitos in vitro por RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR)
mostró un aumento de h2a1 y h2aX en bradizoitos, mientras que h2aZ permanece
constante. Sin embargo, cuando se analizan en bradizoitos in vivo, solo se observa la
7
-
expresión de h2aX y h2aZ. Como la mayoría de los bradizoitos in vitro se encuentran
arrestados en S tardía-G2/M, mientras que los in vivo en G0, podemos concluir que H2A1
es una histona canónica. Por otro lado, h2aZ y h2aX mantienen los mismos perfiles de
expresión en ambos tipos de bradizoitos, confirmando su calidad de variantes. A través de
la utilización de un anticuerpo comercial que reconoce la H2AX fosforilada (γH2AX), fue
posible determinar que la H2AX de T. gondii se encuentra fosforilada en taquizoitos y que
los niveles de γH2AX aumentan en parásitos tratados con H2O2. Además, se observó por
qRT-PCR que este daño oxidativo estimula la transcripción de h2a1 y h2aX. Con el fin de
obtener mayor información a cerca de la función de H2AX, se obtuvieron parásitos que
sobreexpresan esta histona variante. Los experimentos preliminares indicaron que H2AX
estaría involucrada en la replicación del parásito.
Se
analizó
la
composición
de
los
nucleosomas
mediante
ensayos
de
coinmunoprecipitación (coIP) con los anticuerpos específicos para H2AX, H2AZ y H2Bv. En
taquizoitos H2Bv se encuentra formando dímeros con H2AZ pero no con H2AX. A su vez,
H2AZ y H2AX no se encuentran en el mismo nucleosoma. Por lo tanto, H2Bv-H2AZ y H2AX
se encuentran en nucleosomas diferentes. Finalmente, se analizó la asociación de las
variantes H2AX, H2AZ y H2Bv con histonas acetiladas y su localización genómica por
ensayos de coIP e inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Las variantes H2AZ y H2Bv
están acetiladas y/o asociadas a otras histonas acetiladas y se encuentran enriquecidas en
regiones transcripcionalmente activas. Por el contrario, H2AX se asocia muy levemente con
histonas acetiladas y se encuentra enriquecida en regiones promotoras inactivas o silentes.
Todos estos resultados fuertemente sugieren que las histonas H2A y H2B variantes forman
parte de diferentes mecanismos epigenéticos que se encontrarían regulando diversos
procesos celulares en T. gondii.
8
Capítulo
1
)#$.
1. Toxoplasma gondii
1.1. Características generales
Toxoplasma gondii es uno de los parásitos mayormente distribuidos, tanto a nivel
de variedad de hospedador como de distribución geográfica. Es capaz de infectar a casi
todos los animales homeotermos.
Este parásito pertenece al phylum Apicomplexa, el cual es un amplio grupo de
protistas intracelulares. La mayoría de ellos presentan una organela particular
denominada apicoplasto y un complejo apical involucrado en la invasión a las células
hospedadoras. Este grupo presenta una gran diversidad, incluyendo patógenos de
humanos como ser los pertenecientes al género Plasmodium (causante de la malaria) y
Cryptosporidium, así como también patógenos de animales, entre ellos los pertenecientes
al género Eimeria y Sarcocystis.
La población infectada en el Reino Unido y Estados Unidos de Norteamérica se
estima entre 16-40%; mientras que en América del Sur, Central y Europa entre 59-80%;
por lo que presenta gran importancia socio-económica (Hill et al. 2005). En Argentina, la
prevalencia de anticuerpos es elevada, aunque habría diferencias a nivel geográfico (Ej.:
23.8% en Chaco y 51.7% en Buenos Aires) (Durlach et al. 2008).
Es interesante destacar que dada la facilidad que presenta T. gondii para ser
cultivado in vitro y para ser estudiado mediante el uso de técnicas de genética molecular,
este parásito se ha convertido en los últimos tiempos en un organismo modelo para el
estudio dentro del phylum Apicomplexa.
1.2. Genotipos existentes
Toxoplasma presenta una población clonal compuesta por tres linajes, designados
Tipo I, Tipo II y Tipo III. Estos linajes clonales emergieron de eventos de recombinación
meiótica de un ancestro común (Grigg and Suzuki 2003). Se han descripto varias
características biológicas relacionadas con el linaje. La más reconocida es la virulencia
en ratones. Las cepas de Tipo I son virulentas, provocan una diseminación generalizada
del parásito y la muerte de los ratones en menos de 10 días luego de la inoculación con
una dosis menor a 10 taquizoitos. En cambio las de Tipo II y III son avirulentas. Los
ratones sobreviven a la infección con cepas de Tipo II (Dosis letal del 50% (DL50) > 103
taquizoitos) y la diseminación del parásitos es mucho menos extensiva. Mientras que, si
10
)#$.
bien se considera a las cepas de Tipo III como avirulentas, pueden provocar un deterioro
progresivo y muerte de los ratones, semanas o meses después de la inoculación. Cabe
destacar que la virulencia varía entre los distintos hospedadores intermediarios, por
ejemplo: los parásitos Tipo I no son patogénicos en ratas (Saeij et al. 2005).
En cultivos in vitro las cepas Tipo I crecen más rápido que las Tipo II y III y
presentan una tasa de interconversión de taquizoitos a bradizoitos mucho menor. La
mayor tasa de crecimiento de los parásitos Tipo I se debe a un aumento de la invasión
más que a un acortamiento del tiempo de replicación (Weiss and Kim 2007).
1.3. Ciclo de vida del parásito
T. gondii posee un ciclo de vida complejo (Figura 1.1.2). Presenta un ciclo sexual
que se desarrolla únicamente en el intestino del gato, el cual es el hospedador definitivo y
un ciclo asexual que puede ocurrir en cualquier hospedador intermediario: mamíferos
(incluyendo a los felinos) y aves. Estos dos ciclos teóricamente pueden coexistir
independientemente (Boothroyd et al. 1998). Existen cuatro formas invasivas de T. gondii:
taquizoito, bradizoito, merozoito y esporozoito. Los dos primeros están asociados con el
hospedador intermediario y los últimos dos con el hospedador definitivo.
Ciclo de vida en el hospedador definitivo
El ciclo comienza cuando un miembro de la familia felina ingiere un ooquiste
maduro del medio ambiente o tejidos con quistes tisulares. Las paredes de los mismos
son disueltas por las enzimas digestivas liberando esporozoitos o bradizoitos,
respectivamente, que infectan a las células epiteliales del intestino delgado. El ciclo de
vida en el hospedador definitivo se encuentra limitado a estas células. En todos los
estadios, los parásitos se encuentran dentro de una vacuola parasitófora ajustada de
membrana muy fina. El desarrollo asexual se produce mediante un proceso denominado
endopoligenia (Figura 1.1.1). Este involucra el crecimiento del parásito y repetidas
divisiones nucleares, dando origen a una célula multinucleada llamada meronte o
esquizonte. Luego, ocurre la división de las organelas y formación de tantas células hijas
como núcleos presentes (de 4 a 20), denominadas merozoitos (Ferguson et al. 1974).
Estos merozoitos son liberados al lumen del intestino donde pueden reinvadir otros
enterocitos. Morfológicamente, los merozoitos son similares a los taquizoitos pero se
distinguen en que pueden diferenciarse en gametas.
Luego de un número desconocido de ciclos asexuales, ocurre el ciclo sexual del
parásito, donde los merozoitos dan origen a microgametas (gameta masculina) y
11
)#$.
macrogametas (gameta femenina). El merozoito invade un enterocito, se vuelve más
esférico y pierde la mayoría de sus organelas apicales. Este estadio, trofozoito, a través
de un proceso denominado microgametogonia forma múltiples (15-30) microgametas. A
través del proceso de macrogametogonia, el trofozoito da origen a una macrogameta, la
cual presenta la pared impermeable y resistente de los ooquistes. Se supone que la
fusión de ambas gametas da origen a un cigoto, sin embargo ésto nunca se ha
visualizado. Los ooquistes son liberados al medio ambiente en las heces del felino, donde
ocurre la esporulación. Esta finalmente resulta en la formación de dos esporoquistes,
cada uno con 4 esporozoitos haploides altamente infectivos, pudiendo sobrevivir en el
ambiente por varios meses y posiblemente hasta años.
Figura 1.1.1. Tipos de
división en T. gondii.
Endodiogenia, donde de un
parásito se forman dos.
Endopoligenia, donde se
forman tantos parásitos
como
núcleos
existan.
Fuente: The Morrissett Lab
(www.morrissettelab.bio.uci.
edu).
Ciclo de vida en el hospedador intermediario
En los hospedadores intermediarios sólo ocurre el ciclo asexual, luego de la
ingestión de ooquistes o tejidos con quistes. En este caso los parásitos invaden las
células epiteliales y/o linfocitos y se diferencian en taquizoitos. Dentro de la vacuola
parasitófora, los taquizoitos se replican rápidamente por un proceso denominado
endodiogenia (Figura 1.1.1), el cual es similar a endopoligenia salvo que cada taquizoito
da origen a dos taquizoitos. Esto ocurre repetidas veces hasta que se produce la lisis de
la célula hospedadora. Los taquizoitos liberados al medio extracelular son capaces de
infectar a cualquier célula nucleada que encuentren, replicarse y lisar a la célula
hospedadora repitiendo el ciclo lítico. Este estadio coincide con la fase aguda de la
toxoplasmosis o reactivaciones. Si la infección no es controlada por el sistema inmune,
12
)#$.
los parásitos pueden dispersarse muy rápidamente hacia otros tejidos causando una
toxoplasmosis generalizada cuyos efectos son siempre fatales (Frenkel 1967).
La respuesta del sistema inmune frente a la infección provoca que los taquizoitos
intracelulares se diferencien a bradizoitos, los cuales se replican de manera lenta o nula y
forman una pared dando origen a los quistes titulares. De este modo permanecen
invisibles ante el sistema inmune gracias a que la pared quistídica está compuesta
principalmente por productos derivados de la célula huésped. Estos quistes aparecen a
los 12-15 días postinfección y definen el estadio crónico de la toxoplasmosis (Weiss and
Kim 2000). Estos se presentan como una importante fuente de infección para el próximo
hospedador susceptible, al ser ingeridos mediante el consumo de carne cruda o mal
cocida.
Ooquistes
No esporulados
Ingestión
Hospedador definitivo
Felinos
(esquizonte, merozoitos,macro y
Quistes tisulares
microgametas)
(bradizoitos)
Ooquistes
Esporulados
(esporozoitos)
Contaminación de
agua o alimentos
Ingestión
Hospedador
intermediario
Mamíferos y aves
(taquizoitos)
Ingestión
Figura 1.1.2. Diagrama del ciclo de vida de T. gondii. Los componentes sexuales y asexuales
del ciclo de vida son potencialmente independientes (Boothroyd, Hehl et al. 1998). En particular, la
fase asexual puede teóricamente ciclar entre hospedadores intermediarios ad infinitum.
1.4. Interconversión taquizoito-bradizoito
La infección toxoplásmica presenta una fase aguda generada por los taquizoitos y
una fase crónica dada por la presencia de bradizoitos. El paso de una fase a la otra,
determinada por el cambio de estadio del parásito, se debe a la presencia del sistema
13
)#$.
inmune. Si éste falla, los bradizoitos pueden volver a convertirse en taquizoitos y de este
modo reactivar la enfermedad. Por lo tanto, esta interconversión es crítica en la patogenia
del parásito y el control de la infección. La infección con Toxoplasma en humanos puede
resultar en encefalitis en pacientes inmunocomprometidos, coriorrenitis en pacientes
inmuncompetentes o fetopatías y/o aborto a través de una transmisión congénita si la
mujer embarazada es seronegativo al momento de la infección. Además, se ha estimado
que en pacientes con VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana) sin tratamiento
antirretroviral, el riesgo de manifestar síntomas por toxoplasmosis es mayor al 30%
(Weiss and Kim 2007).
La diferenciación de taquizoitos a bradizoitos requiere de la progresión en el ciclo
celular, ya que ésta no ocurre si el crecimiento de los taquizoitos se encuentra bloqueado
(Radke et al. 2001). El ciclo celular de los taquizoitos consiste en la fase G1 (con un
contenido de ADN de 1N), la fase S (con un contenido de ADN de 1,8N), una mitosis [M]
(con un contenido de ADN de 2N) que ocurre inmediatamente luego de la duplicación del
ADN y finaliza con una citoquinesis [C]
(Figura 1.1.3A y (Radke et al. 2001)). La
población con un contenido de ADN de 2N es muy baja, indicando que no habría una
fase G2. Esta característica del ciclo celular de taquizoitos cambia frente a la presencia
de un estrés, cuando los ciclos de división del parásito se enlentecen y el desarrollo de
bradizoitos se hace evidente. En estos parásitos en diferenciación aparece una nueva
subpoblación con un contenido de ADN nuclear de 1,8-2N, que no sintetizan ADN
activamente ni entran en mitosis; indicando la presencia de una fase S-tardía/G2 (Radke
et al. 2003). La detección de marcadores de taquizoitos y bradizoitos en relación al
contenido de ADN, reveló que el 85% de la población S-tardía/G2 presenta ambos
marcadores. Esto sugiere que los parásitos en esta fase se encuentran en un estadio
intermediario en la diferenciación a bradizoitos, ya que los parásitos extraídos de quistes
tisulares in vivo se encuentran arrestados en G0 (toda la población contiene 1N de ADN)
(Figura 1.3.1B).
14
)#$.
Figura 1.1.3. Ciclo celular en taquizoitos y bradizoitos. A. Fases del ciclo celular en
taquizoitos: G1 (crecimiento), S (síntesis), M (mitosis) y C (citoquinesis) y la representación gráfica
de la morfología del parásito en cada una. Se observa el porcentaje de células en cada fase y el
contenido de ADN: 1N en G1; 1,8N en S y 2N en M (Radke J.R. et al 2001). B. Modelo propuesto
del ciclo celular en la diferenciación. En el pasaje a bradizoitos, aparece una fase S tardía-G2 con
un contenido de ADN de 1.8N, donde se cree que se sintetiza lo necesario para la pared del
quiste; mientras que los bradizoitos y esporozoitos maduros se encuentran arrestados en G0.
Durante la recrudescencia, bradizoitos y esporozoitos primero se diferencian a taquizoitos (SAG1
+) y luego entran al ciclo celular (Radke J.R. et al 2003).
Estudios in vitro revelaron que si los parásitos se cultivan en condiciones
estándares (37°C y CO2 5%) crecen como taquizoitos; donde ocurren repetidos ciclos
líticos en cualquier línea celular. Si estos parásitos son sometidos a estrés, se diferencian
a bradizoitos. Si se anula el estrés ejercido, los bradizoitos vuelven a diferenciarse a
taquizoitos imitando a lo que ocurre in vivo si falla el sistema inmune. Por lo tanto, la
interconversión in vitro es una buena aproximación para el estudio de la diferenciación en
T. gondii (Figura 1.3.2). Durante el pasaje de taquizoitos a bradizoitos, muchos genes se
apagan y otros se encienden, permitiendo la fácil identificación de cada estadio (Figura
1.1.4); por ejemplo: SAG1 (antígeno de superficie) es específica de taquizoitos, mientras
que BAG1 (antígeno de bradizoito) y LDH2 (lactato deshidrogenasa 2) son específicas de
bradizoitos. Otra característica del pasaje a bradizoito es la formación de la pared
quística, la cuál se
puede evidenciar mediante el empleo de la lectina de Dolichos
biflorus (DBL) la cual se une en la pared de los quistes (Figura 1.3.2).
15
)#$.
Figura 1.1.4. Ciclo de vida en el hospedador intermediario (in vivo) y la diferenciación
obtenida in vitro. En la fase aguda de la infección, el parásito se encuentra en estadio de
taquizoito; mientras que en la fase crónica en bradizoito. El cámbio de estadio del parásito se debe
a la presencia del sistema inmune in vivo y a diversos estrés in vitro. Los bradizoitos pueden volver
a convertirse en taquizoitos si falla el sistema inmune o frente a la ausencia del estrés. Es posible
identificar taquizoitos y bradizoitos debido a la expresión de proteínas específicas como SAG1 en
taquizoitos y la pared del quiste (detectada con la lectina de Dolichos biflorus, DBL) en bradizoitos.
Como se mencionó arriba, el pasaje de taquizoitos a bradizoitos in vitro ha sido
asociado a cambios de temperatura, pH y otros inductores de estrés. Sin embargo, los
mecanismos que utiliza el parásito para regular esta transición no se comprenden con
claridad (para una revisión leer (Lyons et al. 2002). El conocimiento de estos mecanismos
es de importancia central para establecer el control de la enfermedad. Varios estudios
indican que el desarrollo iniciado tanto por esporozoitos como por bradizoitos para formar
quistes es similar y pareciera ser la consecuencia de un programa genético unificado
(Radke et al. 2003). Por otro lado, se obtuvieron mutantes químicas incapaces de
diferenciar a bradizoitos, cuyo análisis genético reveló un orden jerárquico en la expresión
de genes (Singh et al. 2002). En conjunto, estos resultados indican que el desarrollo del
parásito se encuentra regulado a nivel transcripcional.
16
)#$.
1.5. Regulación de la transcripción
Con el objetivo de definir la expresión de genes en T. gondii, Jerome y
colaboradores desarrollaron el “Análisis Serial de la Expresión de Genes (SAGE)”
(Jerome et al. 1998). Del análisis de estos experimentos se desprenden diversas
conclusiones. Muchos transcriptos que codifican para proteínas del metabolismo basal y
estructuras subcelulares parecen transcribirse sólo cuando se necesitan durante el
crecimiento y desarrollo del parásito. Esto es consistente con el concepto de justo-atiempo descripto en Plamodium (Llinas and DeRisi 2004). Los genes específicos de
desarrollo se encuentran distribuidos en todos los cromosomas. La organización de
genes en clusters raramente ocurre y en esos casos, la expresión de los mismos no se
encuentra influenciada por su proximidad física (Weiss and Kim 2007).
El complejo basal de transcripción (clase II) que controla la expresión de genes
codificantes en la mayoría de los organismos eucariotas es la ARN polimerasa II y los
factores de transcripción generales (FTGs) asociados a ella. En Apicomplexas los FTGs
se encuentran menos conservados que en eucariotas superiores. Sin embargo, estos
parásitos presentan gran parte de la maquinaria basal de transcripción y de los factores
remodeladores de cromatina requeridos para el control de este proceso (Meissner and
Soldati 2005, Weiss and Kim 2007). Además, se observó que las regiones flanqueantes a
las secuencias codificantes (CDS) actúan de forma autónoma. Esta propiedad, no solo le
confiere una fuerza de expresión característica a cada CDS, sino que también, en ciertas
situaciones le otorga una especificidad asociada al desarrollo; confirmando los principios
básicos de una transcripción monocistrónica (Weiss and Kim 2007). Sin embargo, en
ninguno de estos casos se logró definir claramente las secuencias que actúa en cis.
Recientemente, Benhke y colaboradores (Behnke et al. 2008) identificaron dos elementos
que actúan en cis en los promotores BAG1 y B-NTPasa, específicos de bradizoitos. En
cada promotor se identificó un elemento diferente, al cual se unen proteínas diferentes.
Dichos elementos fueron capaces de convertir un promotor constitutivo en uno cuya
inducción se ve restringida a condiciones de cultivo de bradizoitos. A su vez, mediante un
análisis in sílico, encontraron secuencias similares en regiones genómicas cercanas a
genes importantes para la inducción a bradizoitos (LDH2, SAG4.2 y proteína de la pared
del quiste de 65 kDa). Estos resultados confirman que la iniciación de la transcripción es
el mecanismo principal que controla el desarrollo del parásito.
Actualmente, se acepta que los factores de transcripción se unen y reclutan
remodeladores de cromatina que descondensan la cromatina y facilitan el ensamblaje del
complejo de preiniciación en las secuencias promotoras (revisado en (Li et al. 2004)).
17
)#$.
Esto lleva a un nuevo enfoque de la regulación de la transcripción en la cual entra la
dinámica de la cromatina y los mecanismos epigenéticos, en los cuales la pieza central
son las histonas.
2. HISTONAS
2.1. Características generales
Las histonas son el principal componente de la cromatina. Conforman una familia
de proteínas básicas, de baja masa molecular, muy conservadas evolutivamente entre los
eucariotas. Las cinco histonas mayoritarias, denominadas H1, H2A, H2B, H3 y H4, son
proteínas ricas en aminoácidos (aa.) básicos cargados positivamente, los cuales son
capaces de interaccionar con los grupos fosfatos del ADN, los cuales se encuentran
cargados negativamente.
Las cuatro histonas core o nucleosomales (H2A, H2B, H3 y H4) forman un
octámero alrededor del cual se enrollan 146 pb. Este octámero se ensambla a partir de
un tetrámero formado por dos histonas H3 y dos H4, al cual se agregan dos
heterodímeros H2A-H2B (Figura 1.2.1). La histona externa o linker (H1) interacciona con
el ADN internucleosomal. El conjunto del ADN enrollado alrededor del octámero de
histonas, junto con la histona H1 y una cierta longitud de ADN internucleosomal
constituye lo que se conoce como nucleosoma.
Las histonas presentan un motivo estructural muy importante, denominado histone
fold o pliegue de histonas. Consiste en una α-hélice corta, un giro o loop 1, una α-hélice
larga, otro giro o loop 2 y otra α-hélice corta. Este motivo es el que permite que
interaccionen entre si y formen el nucleosoma, desempeñando de este modo un papel
decisivo en el primer nivel del empaquetamiento del ADN dentro del núcleo. Es
importante resaltar que las regiones amino terminales (N-terminales) de las histonas
quedan por fuera del nucleosoma y no presentan ninguna estructura determinada, por lo
que reciben la denominación corriente de “cola” de la histona.
Por muchos años se pensó que los nucleosomas eran partículas estáticas y que
su función era meramente estructural. Ahora se sabe que los nucleosomas juegan un rol
importante en la regulación de la transcripción y son capaces de transmitir información
epigenética de una generación celular a la siguiente (Turner 2002). Se ha observado que
si el nucleosoma se encuentra inmovilizado, previene la transcripción (Gottesfeld et al.
18
)#$.
2002). Además, que los nucleosomas presentan una actividad dinámica, la cual es
dependiente de la secuencia del ADN y es facilitada por las modificaciones covalentes de
las histonas.
H2A
H4
H2B
H3
Dímero
H2A-H2B
Dímero
H3-H4
Octámero
de histonas
Figura 1.2.1. Ensamblaje
del octámero de histonas.
Se forman dímeros H3-H4 y
H2A-H2B. Dos dímeros H3H4 se unen para formar un
tetrámero, el cual es base
para la unión de dos
dímeros H2A-H2B. Las
regiones amino terminales
de todas las histonas
protruyen por fuera del
octámero de histonas. ©
2002 by Bruce Alberts,
Alexander Johnson, Julian
Lewis, Martin Raff, Keith
Roberts, and Peter Walter.
Tetrámero H3-H4
2.2. El lenguaje de las modificaciones covalentes de las histonas
En el año 2000, Allis et al (Strahl and Allis 2000) propone la existencia de un
lenguaje bioquímico capaz de modular la expresión de genes, al cual denomina código de
histonas. Esta hipótesis fue creciendo para incluir la totalidad de los procesos que afectan
la cromatina. Propone que (1) las diversas modificaciones postraducionales que ocurren
en determinadas colas de las histonas pueden ser leídas por otras proteínas asociadas a
cromatina, sirviendo como una plataforma para reclutar factores nucleares específicos,
(2) distintas modificaciones en la cola de la misma u otra histona son interdependientes,
originando varias combinaciones de distintas modificaciones en los mismos nucleosomas
y (3) los distintos estados ordenados de la cromatina, como eucromatina y
19
)#$.
heterocromatina, son dependientes de la concentración y combinación de nucleosomas
diferencialmente modificados, generando un código epigenético (Escargueil et al. 2008).
Las modificaciones postraduccionales de las histonas ocurren principalmente en
las regiones N-terminales de las cuatro histonas nucleosomales, las cuales son flexibles y
protruyen por fuera del nucleosoma. Estas incluyen acetilación, metilación, fosforilación,
monoubiquitinación, citrulinación y ADP-ribosilación. Si bien es probable que la
acetilación de las lisinas al neutralizar las cargas positivas y la fosforilación al agregar
cargas negativas estén provocando la descondensación de la cromatina, el código de
histonas es un mecanismo mucho más complejo.
Se acepta que las histonas hiperacetiladas se encuentran mayormente asociadas
a regiones genómicas activas; mientras que la desacetilación principalmente resulta en
represión y silenciamiento. Por otro lado, la metilación presenta múltiples efectos en la
función de la cromatina. Los residuos de lisina pueden ser mono-, di- o trimetilados,
mientras los de arginina pueden ser mono- o dimetilados, ampliando el espectro de
respuestas celulares posibles. Por ejemplo la metilación de H3 en lisina 9 (K9) está
involucrada en silenciamiento y represión en muchas especies; mientras que la metilación
de H3 en K4 se encuentra asociada con regiones de la cromatina activa. Además, la
acetilación y la metilación pueden actuar de forma diferencial sobre la transcripción,
dependiendo del residuo modificado. Por ejemplo, como ya vimos la metilación de H3 en
K9 está asociada a silenciamiento, mientras que la acetilación del mismo residuo está
asociado a transcripción activa (Fischle et al. 2003).
Estas modificaciones pueden ser “leídas” por proteínas asociadas a cromatina, las
cuales son las responsables de cumplir la función codificada por las histonas. Por
ejemplo, las proteínas que presentan bromodominios son capaces de unir histonas
acetiladas, promoviendo la activación de la transcripción. Estos bromodominios se
encuentran en una amplia diversidad de proteínas como ser complejos remodeladores de
cromatina y el factor de transcripción general TAF250. Otro ejemplo sería H3K9, que es
capaz de ser reconocida por una proteína denominada HP1, encargada de mantener los
dominios de heterocromatina. Por el contrario, ciertas modificaciones parecieran prevenir
la unión de proteínas; como se observó en el caso de de metilación de H3 en K4, lo cual
estaría inhibiendo el reclutamiento de HP1. Esto podría explicar en parte el sinergismo o
antagonismo entre las distintas modificaciones. Probablemente las enzimas que
modifican el mismo sitio se ven influenciadas por el estado de modificaciones que
presenta la histona sustrato (Fischle et al. 2003).
A diferencia de las histonas H3 y H4, las modificaciones postraduccionales de las
histonas H2A y H2B prácticamente no se han estudiado. Probablemente debido a que los
20
)#$.
dímeros de histonas H2A y H2B presentan una asociación más débil con el ADN
nucleosomal y son frecuentemente desplazados de los nucleosomas; dando origen a la
idea de que las modificaciones postraduccionales de estas histonas no serían tan
importantes. Sin embargo, dos estudios realizados en levaduras, a las cuales se les
deleciona la región N-terminal de H2A (Parra and Wyrick 2007) y de H2B (Parra et al.
2006), indican que éstas estarían reprimiendo la transcripción; ya que las mutantes
presentan un gran aumento en la cantidad de genes encendidos. Esto es diferente a lo
que ocurre con H3 y H4, cuyas regiones N-terminales afectan a la activación y represión
de genes de forma balanceada. Esta comparación sugiere que los dominios de las
histonas H2A y H2B poseen un rol mucho más importante en la regulación de la
transcripción del que se les había otorgado previamente (Wyrick and Parra 2008).
Otro nivel en el lenguaje de las histonas es la existencia de histonas variantes, las
cuales son intercambiadas por histonas canónicas y se localizan de forma específica en
los cromosomas.
2.2. Variantes y canónicas
Las histonas variantes son formas no alélicas de las histonas convencionales. Se
encuentran presentes en las células en muy baja cantidad comparada con los niveles de
las histonas canónicas (Wu and Bonner 1981).
La biosíntesis de las histonas canónicas, en eucariotas superiores, se encuentra
restringida a la fase S, lo cual significa que ocurre simultáneamente con la síntesis de
ADN y la replicación de los cromosomas. Mientras que las histonas variantes presentan
una expresión independiente del ciclo celular.
Mientras que H2A y H3 presentan numerosas variantes, H4 y H2B no presentan
ninguna. Se ha observado que cada variante se encuentra involucrada en un proceso
celular específico; indicando que el intercambio de histonas canónicas por variantes es
uno de los mecanismos epigenéticos empleados para regular diferentes estados de la
cromatina.
La mayoría de los organismos eucariotas expresan una variante de H3 específica
de centrómeros (cenH3), la cual se encuentra evolutivamente muy conservada en su
parte globular, pero no en su región N-terminal (Malik and Henikoff 2003). Es esencial
para la supervivencia de las células ya que presenta un rol fundamental en las funciones
del centrómero durante la mitosis. La otra variante de H3 ampliamente distribuida en la
naturaleza es la H3.3, la cual está asociada con la activación transcripcional. Las plantas,
moscas, ranas y aves presentan además una H3.2 y sólo los mamíferos poseen aparte
21
)#$.
una H3.1. Sin embargo estas últimas son expresadas e incorporadas en la cromatina de
forma dependiente de la replicación (para mayor revisión ver (Hake and Allis 2006)).
Por otro lado, la familia de las histonas H2A es la que presenta mayor número de
variantes: H2AX, H2AZ, macroH2A y H2ABbd, las cuales se describen a continuación.
2.4. Variantes de H2A
Las variantes de H2A difieren entre las especies: H2AZ y H2AX se encuentran
prácticamente conservadas en todos los eucariotas, mientras que H2A-Bbd y macroH2A
sólo se encuentran en vertebrados (Malik and Henikoff 2003, Kamakaka and Biggins
2005). H2AZ presenta menor divergencia evolutiva que el grupo de las H2A principal
(Thatcher and Gorovsky 1994) y en parásitos presenta una región N-terminal más larga
(Sullivan et al. 2006). Por otro lado, levaduras, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica y
Trichomonas vaginalis parecen haber reemplazado la H2A canónica por H2AX. Mientras
que varios Apicomplexas, incluyendo Plasmodium ssp., no tienen H2AX, al igual que los
Tripanosomátidos (Alsford and Horn 2004, Miao et al. 2006).
H2ABbd presenta un 48% de identidad con la H2A canónica y es más corta.
Recibe este nombre ya que se encuentra ausente en el cromosoma X inactivo (Barr body
deficient). Además se encuentra asociada a la forma acetilada de H4 (Chadwick and
Willard 2001) y los nucleosomas que contienen esta variante son menos estables que los
que contienen la H2A canónica (Gautier et al. 2004); todo esto sugiere un posible rol en
activación de la cromatina.
Por el contrario MacroH2A se encuentra enriquecida en el cromosoma X inactivo
en mamíferos de sexo femenino y en el corpúsculo XY transcripcionalmente silenciado en
mamíferos de sexo masculino durante la meiosis. Estas también se encuentran en aves,
las cuales presentan cromosomas sexuales diferentes que no experimentan inactivación
del X. Recientemente, un análisis basado en microarreglos en células pluripotenciales
humanas reveló que macroH2A se encuentra asociada a genes que codifican para
reguladores que son claves para el desarrollo y el destino de esas células (Buschbeck et
al. 2009).
H2A.Z es esencial en la mayoría de los eucariotas superiores estudiados, salvo en
levaduras. Su principal función ha sido otorgada a la activación de la transcripción, sin
embargo se han descripto diversos mecanismos: (1) evitando la propagación de la
heterocromatina en la eucromatina vecina (Meneghini et al. 2003) y (2) reclutando la ARN
polimerasa II (Adam et al. 2001). Por otro lado, su región N-terminal es capaz de
interaccionar con la proteína que une heterocromatina pericéntrica (INCENP), la cual es
22
)#$.
crítica para la correcta segregación de los cromosomas (Rangasamy et al. 2003).
Recientemente, se ha observado que también estaría cumpliendo una función en la
reparación del ADN (Kalocsay et al. 2009). Como conclusión esta histona variante estaría
involucrada en múltiples funciones, probablemente basadas en su capacidad para unirse
a diversas proteínas reguladoras de diversos procesos nucleares.
H2AX presenta gran homología con H2A canónica y se caracteriza por presentar
el motivo carboxilo terminal (C-terminal) SQ(E/D)Ɏ, donde Ɏ es un aminoácido
hidrofóbico. Esta variante juega un papel fundamental en la reparación del ADN frente a
un quiebre de la doble hebra (DSB, del inglés double strands break); el cual se basa en la
fosforilación de la S del motivo característico (Rogakou et al. 1998). El DSB es generado
por agentes que dañan el ADN, pero también ocurre en varios mecanismos endógenos
de la célula como meiosis y recombinación V(D)J. Si bien la fosforilación de esta histona
se encuentra involucrada en todos estos procesos, es esencial sólo para la reparación del
DSB. Brevemente, el daño del ADN recluta el complejo MRN compuesto por las proteínas
Mre11-Rad50 y Nbs1 (Xrs2 en levaduras, por lo que el complejo se denomina MRX). Este
es esencial para la activación de la kinasa ATM (ataxia telangiectasia mutada); la cual
activa el arresto de la célula mediante la fosforilación de Chk2 (del inglés checkpoint
kinase 2) y estimula la reparación mediante la fosforilación de H2AX. Sin embargo, las
quinasas ATR (ATM relacionada a Rad3) y/o DNA-PK (ADN protein kinasa) también son
capaces de fosforilar H2AX (Stiff et al. 2004). Existen dos mecanismos de reparación, la
recombinación homóloga (RH) y la recombinación no homóloga (RNH). La H2AX
fosforilada (γH2AX) participa en ambos tipos de reparación. Actúa como sitio de anclaje
de varias proteínas, como los complejos INO80 y SWR1 a través de su unión a las
subunidades Nhp10 y Arp4 de los mismos. En S. cerevisiae el complejo INO80 produce
el desalojo de los nucleosomas que rodean el sitio de quiebre de la doble hebra,
incluyendo nucleosomas que contienen γH2AX y H2AZ; ya que la presencia de
nucleosomas en el sitio de reparación impide la asociación de las proteínas que facilitan
el proceso. La figura 1.2.2 representa un esquema del modelo propuesto en levaduras.
23
)#$.
Firura 1.2.2. Modelo de
reparación del ADN en
levaduras. El complejo Ku
(formado por Ku70 y Ku80)
y
el
complejo
MRX
(formado por Mre11, Rad50
y Xrs2) – MRN en humanos
– se unen a los extremos
del ADN. MRX recluta a las
kinasas Mec1 (ATM) y Tel1
(ATR), las cuales fosforlilan
a la H2AX cercana. La
H2AX forforilada recluta a
los
complejos
remodeladores SWR1 e
INO80. SWR1 facilita la
unión de Ku80, lo cual
podría
estimular
la
reparación por RNH (cuyas
siglas en inglés son NHEJ);
mientras que INO80 facilita
la unión de MRX, lo cual
estinularía la reparación por
HR. INO80 remueve las
histonas y
facilita la
reparación. Esto a su vez
estimula el arresto de la
célula
hasta
que
la
reparación sea resuelta
(van Attikum H 2009).
En ratones haploinsuficientes (H2AX
(H2AX
+/-
) o que carecen de una H2AX funcional
-/-
), la eficiencia en la reparación de DSB se encuentra dramáticamente
disminuida, el arresto G2/M inducido por daño fracasa y se observan numerosas
anormalidades morfológicas, incluyendo defectos cromosómicos y mitóticos que
provocan la infertilidad en machos (Bassing et al. 2002, Celeste et al. 2002, FernandezCapetillo et al. 2002). Recientemente, se ha mostrado que H2AX funciona, de forma
dependiente de la dosis, como supresor de translocaciones oncogénicas y tumores en
ratones (Bassing et al. 2003), mientras que en humanos es un marcador de regiones
citogenéticas frecuentemente alteradas en diversos cánceres. Todos estos resultados,
demuestran que H2AX presenta un rol vital en la identificación y reparación de genomas
dañados. Por esto se la propone como la histona guardián del genoma (FernandezCapetillo et al. 2004).
24
)#$.
3. Lenguaje de las histonas en Toxoplasma
3.1. Evidencias de la presencia de mecanismos epigenéticos
La epigenética (del griego epi, en o sobre) hace referencia, en un sentido amplio, al
estudio de todos aquellos factores no genéticos que intervienen en el desarrollo de un
organismo (ontogenia). Diversos estudios revelan que existen varios mecanismos
diferentes para organizar y transmitir la información epigenética: interacciones entre el
ADN y el nucleosoma, las cuales pueden ser moduladas por modificaciones
postraducionales de las histonas dadas por enzimas específicas, intercambio de histonas
canónicas por variantes, actividad de complejos remodeladores de cromatina los cuales
requieren energía en forma de ATP, metilación o glucosilación de bases del ADN y
localización subnuclear (Figura 1.3.1).
Figura 1.3.1. Mecanismos epigenéticos (Epigenetic mechanisms). Sullivan et al (Sullivan 2006).
Durante el desarrollo de esta tesis surgieron diferentes estudios que comenzaron
a dilucidar la importancia de este mecanismo en el desarrollo de T. gondii. En el genoma
del parásito, como en diversos parásitos protozoarios, se encontraron homólogos de casi
todas las proteínas involucradas en estos mecanismos (Meissner and Soldati 2005,
Sullivan and Hakimi 2006, Sullivan et al. 2006).
25
)#$.
Al mismo tiempo se observó que en T. gondii, las regiones río arriba de genes
expresados constitutivamente se encuentran enriquecidos en histonas H3 y H4 acetiladas
tanto en taquizoitos y bradizoitos. En contraste, los genes específicos de bradizoitos se
encuentran hipoacetilados en taquizoitos y se acetilan en condiciones de diferenciación in
vitro. Del mismo modo, los genes específicos de taquizoitos se encuentran
hiperacetilados en taquizoitos y este nivel de acetilación disminuye bajo condiciones de
diferenciación a bradizoitos. Otra modificación postraduccional estudiada es la metilación
de H3 en K4. Esta puede estar di- y/o trimetilada; la dimetilación se encontró en genes
activos e inactivos, mientras que la trimetilación está presente exclusivamente en genes
activos (Saksouk et al. 2005).
La acetilación y metilación de las histonas del parásito se correlaciona con la
expresión de genes específicos de estadio. En taquizoitos, un complejo de histonas
desacetilasas (HDAC) denominado TgCRC opera en promotores específicos de
bradizoitos, mientras que la histona acetil transferasa (HAT) denominada TgGCN5, lo
hace en promotores específicos de taquizoitos (Saksouk et al. 2005). TgGCN5 presenta
una preferencia por la lisina 18 de la histona H3. En humanos esta modificación se
encuentra mediada por la HAT denominada p300, la cual recluta una arginina metilasa,
CARM1, para activar la transcripción. En Toxoplasma se caracterizó el complejo
TgCARM1, el cual metila la arginina 17 y actúa en concierto con la acetilasa de histonas
TgGCN5; por lo que la histona H3 se encuentra metilada en R17 y acetilada en la K18 en
el mismo loci. Consecuentemente, la transcripción estaría siendo regulada mediante la
asociación de HDAC y HAT y la subsecuente acetilación y desacetilación de histonas en
genes específicos de estadio. A su vez, la inhibición de CARM1 por un inhibidor
específico induce la diferenciación de taquizoitos a bradizoitos, indicando que el ciclo de
vida del parásito puede ser manipulado interfiriendo en la maquinaria epigenética
(Saksouk et al. 2005).
Figura 1.3.2. Modelo del control de
la
expresión
génica
en
la
interconversión.
Tachyzoite
(taquizoito), Bradyzoite (bradizoito),
ON (encendido), OFF (apagado), Ac
(acetilación), Me (metilación). Fuente:
Saksouk N et al 2005.
26
)#$.
Apoyando estos resultados, Gissot y colaboradores encontraron que las regiones
5’ de todos los genes predichos del cromosoma Ib, están enriquecidas con las siguientes
modificaciones postraduccionales: AcH4 (H4 acetilada), H3K9ac (H3 acetilada en K9) y
H3K4me3
(H3
trimetilada
en
K4).
Dichos
enriquecimientos
comprenden
aproximadamente 700 nucleótidos. La distancia entre el pico de AcH4 y H3K9ac y el
codón de inicio es menor a 1.000 pb en más del 85% de los genes y es menor a 1.500 pb
para más del 90%. De modo similar, el pico de H3 dimetilada en R17 termina
aproximadamente a 1.000 pb del codón de iniciación; aunque el enriquecimiento de esta
modificación se encontró sólo en el 4,5% de los genes analizados. Es importante resaltar
que el pico de H3K4me3 se encuentra desplazado hacia el codón de inicio en
comparación con AcH4; permitiendo predecir la dirección de transcripción de los
promotores en T. gondii (Gissot et al. 2007).
Figura 1.3.3. Distribución genómica de modificaciones postraduccionales. Esquema que
representa una región del cromosoma Ib. En celeste se encuentran indicados los CDS; en azul
los picos de AcH4 y en rojo los enriquecimientos observados para H3K4me3. La línea punteada
indica el final del pico de H3K4me3 con respecto al CDS. Fuente: Gissot et al (2007).
Por otro lado, en Toxoplasma y P. falciparum se describió la presencia de la
histona metil transferasa (HMT), Set8, la cual tiene la capacidad de mono-, di-, y trimetilar
la K20 de la histona H4; a diferencia de su ortólogo en humanos que sólo es capaz de
monometilar K20. Esta enzima se encuentra regulada a nivel del ciclo celular y se
encuentra enriquecida en la heterocromatina pericéntrica y telomérica en ambos
parásitos, al igual que sus productos (la histona H4 mono- y dimetilada en K20) y la
histona H3 trimetilada en K9 (marcador de heterocromatina en todos los eucariotas
superiores estudiados) (Sautel et al. 2007).
Con respecto a la presencia de histonas variantes, solo se describió la presencia
de una H3 variante, la H3.3. Esta presenta solo cuatro aminoácidos diferentes con
respecto a la H3 canónica (Sullivan 2003).
Como se puede observar, la mayoría de los mecanismos epigenéticos se
encuentran conservados en T. gondii; sin embargo, todos los estudiados hasta el
momento tienen a las histonas H3 y H4 como protagonistas. Las histonas H2A y H2B
27
)#$.
también están involucradas en diversos procesos celulares y las variantes de H2A varían
en las distintas especies. Por lo que nuestra hipótesis es que Toxoplasma presenta
histonas H2A y H2B características, involucradas en diversos mecanismos epigenéticos.
28
)#$.
OBJETIVOS:
General:
El objetivo general de esta tesis es conocer en mayor detalle los mecanismos
epigenéticos que involucran a las histona H2A y H2B en T. gondii. Esto permitirá conocer
las vías que utiliza el parásito para regular su crecimiento y diferenciación a otros
estadios.
Específicos:
1. Identificar las histonas H2B de T .gondii, describir similitudes y diferencias entre ellas,
identificar la presencia de variantes y analizar su expresión en los estadios de
taquizoito y bradizoito.
2. Identificar las histonas H2A de T .gondii, describir similitudes y diferencias entre ellas,
identificar la presencia de variantes y analizar su expresión en los estadios de
taquizoito y bradizoito.
3. Estudiar la composición de los nucleosomas a través de la interacción de las histonas
H2A y H2B. El estado de acetilación y/o su proximidad a histonas acetiladas; como
también su localización en el genoma.
29
Capítulo
2
)#$
2. 1. Introducción
En mamíferos las histonas H2B pertenecen a una familia multigénica (Albig et al.
1999). Presenta dos linajes: uno que incluye un inmenso número de copias de H2Bs
canónicas y otro que contiene dos histonas particulares: hTSH2B (Zalensky et al. 2002) y
H2BFWT (Boulard et al. 2006). Estas últimas, son tejido específicas, las cuales se
encuentran en gametas y no se conocen sus funciones. Por lo tanto, se asume que esta
familia, al igual que la familia de las histonas H4 no posee variantes (Malik and Henikoff
2003).
Las H2Bs poseen una hélice Į en la región C-terminal además del plegamiento
característico de histonas. Esta Į-hélice de cada H2B presente en un nucleosoma se
ubica en los planos exteriores del mismo y podría interaccionar con otras unidades
nucleosomales generando una estructura de orden superior. A su vez, las histonas H2Bs
poseen una cola N-terminal, la cual se determinó que es crucial para la ensamblado de
los cromosomas mitóticos (de la Barre et al. 2000, de la Barre et al. 2001).
Dentro de las células, estas histonas se encuentran formando dímeros con
histonas de la familia H2A como componentes de los nucleosomas. Sin embargo, existe
un grupo de dímeros solubles, los cuales pueden ser intercambiados con los que están
en la cromatina por complejos modeladores de cromatina. El intercambio de dímeros
H2AZ-H2B por el complejo SWI/SNF es el caso más estudiado (Mizuguchi et al. 2004).
Estudios in vitro demostraron que este complejo también es capaz de desalojar y/o
incorporar tanto la H2B canónica como las variantes hTSH2B y H2BFWT (Boulard et al.
2006).
Si bien el código de histonas de las H2Bs se encuentra poco caracterizado, se
han descripto modificaciones postraduccionales características y particulares. En
levaduras, la histona H2B es capaz de mono-ubiquitinarse en la K123 (K120 en
humanos), promoviendo dos funciones diferentes. Por un lado reclutaría metiltransferasas
(como Dot1 y Set1 en levaduras) promoviendo la trimetilación de histonas H3 (en K4 y
K79 en levaduras) durante la elongación en el proceso de transcripción (Xiao et al. 2005).
Por otro lado, estaría reclutando el complejo SAGA mediante su unión a Ubp8 (proteasa
específica de ubiquitina que forma parte del complejo SAGA). Este última deubiquitina las
H2B, lo cual es requerido para el inicio de la transcripción; al menos de los genes
regulados por este complejo (Henry et al. 2003, Daniel et al. 2004).
Parra y colaboradores encontraron que la deleción de la región N-terminal de H2B
en S. cerevisiae estimula la expresión de una inmensa cantidad de genes, indicando un
31
)#$
mayor aporte de esta región al proceso de silenciamiento (Parra et al. 2006).
Recientemente se había descripto que H2B era capaz de sumoilarse en los residuos
K6/K7 y K16/K17, lo cual es requerido para el silenciamiento en los telómeros y algunos
genes localizados en eucromatina (Nathan et al. 2006). Sin embargo, solo la deleción de
los residuos 30 a 37 es la responsable del fenotipo observado previamente; por lo que se
lo denominó dominio represor de la histona H2B: “dominio HBR” (del inglés “histone H2B
repressive”). Éste es requerido para la represión del 8,6% del genoma de levaduras,
incluyendo genes involucrados en el metabolismo de vitaminas y carbohidratos
localizados en regiones teloméricas y subteloméricas (Parra et al. 2006).
Otra modificación postraduccional característica, es la fosforilación de la H2B S10
en levaduras (S14 en mamíferos). Esta ocurre durante la compactación de la cromatina
en el proceso de apoptosis (Ahn et al. 2005). Resulta muy interesante el hecho de que
esta fosforilación, mediada por la kinasa Ste20, se encuentra regulada por el estado de
acetilación de la lisina vecina. La inducción de la apoptosis promueve la desacetilación de
H2B K11 por Hos3, lo cual permite la fosforilación de H2B S10 y la condensación de la
cromatina (Ahn et al. 2006). La mutación de todas las lisinas de la región N-terminal
demostró que las acetilaciones de H2B en levaduras tienen un rol en la activación de la
transcripción (Parra et al. 2006).
Al momento de inicio de este trabajo, no se conocía mucho a cerca de las
histonas de T. gondii. Se habían identificado dos histonas H3 (H3 y H3.3) las cuales
muestran algunas características peculiares a nivel de secuencia (Sullivan 2003) y se
había clonado un gen de la familia h2b, el cual fue utilizado para estudiar la división
nuclear de los parásitos in vivo al ser fusionado a la proteína fluorescente amarilla (Hu et
al. 2004). En T. brucei y P. falciparum se habían determinado que los niveles de ARNm
de las H2Bs se encontraban regulados de forma diferente a lo largo del ciclo celular como
también de los distintos estadios de diferenciación (Garcia-Salcedo et al. 1999, Lobo and
Kumar 1999). Basados en estos antecedentes decidimos identificar las histonas H2B de
T .gondii, describir similitudes y diferencias entre ellas, identificar la presencia de
variantes y analizar su expresión en los estadios de taquizoito y bradizoito.
32
)#$
2. 2. Resultados
2. 2. 1. Identificación y clonado
Haciendo uso de la información y programas presentes en las bases de datos del
National Center for Biotechnology Iinformation (NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y de
la base de datos de T. gondii (ToxoDB: http://toxodb.org), se identificaron 3 histonas H2B
putativas en este parásito. Estas fueron denominadas H2Bv, H2Ba y H2Bb en base al
estudio filogenético explicado a continuación (ver sección 2.2.2). Se clonaron mediante la
técnica de PCR utilizando ADNc y ADNg como templado. La secuencia codificante (CDS)
de H2Bv codifica para una proteína de 124 aa con una masa molecular predicha de 13,7
kDa y punto isoeléctrico pI= 10,5 (AN: AF406555). La CDS de H2Ba codifica para una
proteína de 117 aa con masa molecular de 12,6 kDa y pI=10,1(AN: DQ118972). Mientras
que la CDS de H2Bb codifica para una proteína de 115 aa con una masa molecular de
12,5 kDa y pI=10.
Mediante la utilización del programa ToxoDB Genome Browser (http://toxodb.org)
se pudo observar que las tres cepas de parásitos secuenciadas, tipo I (GT1), tipo II
(Me49) y tipo III (VEG), poseen las tres histonas H2B. A su vez, cada una se encuentra
en
sintenia:
H2Bv
se
localizada
en
el
cromosoma
Ib
(TGGT1_022960,
TGME49_009910, TGVEG_038620), H2Ba en el cromosoma IX (TGGT1_042340,
TGME49_105160, TGVEG_106580) y H2Bb en el cromosoma XII (TGGT1_103250,
TGME49_051870, TGVEG_000470).
También se analizó la presencia de Polimorfismo de un solo nucleótido (SNPs)
para cada una de estas histonas en cepas de los tres tipos. Se pudo observar que los
cambios en la secuencia de H2Bv ocurren solo en regiones no codificantes, dando de
este modo una densidad de SNPs a lo largo de la secuencia codificante nula (Tabla
2.2.1). En los casos de las histonas H2B canónicas se observa polimorfismo de una base
en la secuencia codificante, aunque en muy baja densidad: H2Ba contiene 1 SNP y H2Ba
contiene 2. Además, estos cambios son sinónimos, no alterando de este modo la
composición ni la función de la proteína (Tabla 2.2.1). La ausencia de SNPs estaría
indicando una selección purificadora del gen, lo cual está relacionado con la importancia
de conservar estas proteínas.
33
)#$
Tabla 2.2.1. Análisis de SNPs.
Cepas
Densidad SNPs SNPs
Gen
comparadas
en CDS
Totales
No
sinónimos
Sinónimos
No
codificante
H2Bv
ME49 vs RH
ME49 vs VEG
GT1 vs ME49
0
0
0
5
5
3
0
0
0
0
0
0
5
5
3
H2Ba
GT1 vs ME49
GT1 vs VEG
2,85
2,85
1
1
0
0
1
1
0
0
H2Bb
GT1 vs ME49
GT1 vs VEG
5,75
5,75
2
2
0
0
2
2
0
0
La composición aminoacídica
de las 3 H2Bs fue analizada mediante un
alineamiento de la secuencia de proteína y un análisis de la estructura secundaria de las
mismas (Figura 2.2.1). La secuencia de aa de H2Ba y H2Bb presentan un 94% de
homología entre ellas; mientras que H2Bv presenta un 68% de identidad (82% similitud)
con H2Ba y H2Bb. La mayor homología de secuencia se observa en la región que
comprende de la α-hélice 1 a la 3, la cual corresponde al histone fold o pliegue de
histonas. En la región carboxilo terminal (C-terminal) se encuentra una α-helix (αC)
característica de las histonas H2B, la cual contiene un lisina (Lys; K) conservada
susceptible a ser monoubiquitinada (Luger et al. 1997).
1 MSGKGPAQKSQAAKKTAGKSLGPRYRRRKRTESFALYIYKVLKQVHPETGVSKKSMSIMN
1 MVAKKSA-KS-AKPKASGKS-GK--GKKKRAESYSSYIFKVLKQVHPETGISKKSMMIMT
1 MVAKKSA-KV-AKSKDSGKK-GK--GKK-RAESYSSYIFKVLKQVHPETGISKKSMMIMT
* .* .* ** * *::*** *
::**:**:: **:***********:***** **.
H2Bv
H2Ba
H2Bb
L1
α1
Ub
71 SFINDIFDRLADEAVRLIRYNKKRTLSSREIQTAVRLLLPGELSKHAVSEGTKAVTKYTTSGA
66 SFIADTFDKIASEAGKLCKYNKKDTLSSREIQTAVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTGK
65 SFIADTFDKIATEAGKLCKYNKKDTLSSREIQTAVRLVLPGELAKHAVSEGTKAVTKYTGK
*** * **::*.** :* :**** *************:*****:*************** .
H2Bv
H2Ba
H2Bb
L2
α2
α3
αC
Figura 2.2.1 Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las H2B de Toxoplasma. Los
aminoácidos idénticos están marcados con (*) y sombra gris; los aminoácidos homólogos se
encuentran marcados con (:) o (.) dependiendo de cuán cercanos sean y aminoácidos heterólogos
se encuentran marcados con un espacio en blanco. Debajo, se encuentra una representación
esquemática de la estructura secundaria donde α y L significan α-hélice y loop, respectivamente.
34
)#$
Por otro lado, la mayor divergencia se encuentran principalmente en la región Nterminal.
Esta
región
se
caracteriza
por
ser
susceptible
a
modificaciones
postraduccionales como acetilación (Ac), metilación (Me) y fosforilación (P). Tal como
puede verse en la figura 2.2.2, estas histonas poseen varios residuos K, arginina (R) y
serina (S), los cuales podrían ser modificados postraduccionalmente. H2Ba y H2Bb
poseen mayor número de residuos K que H2Bv. Por el contrario, H2Bv posee varios
residuos de argininas (R24, R26, R27 and R28) que están ausentes en H2Ba y H2Bb.
Todas presentan varios residuos S: H2Bv presenta cuatro (S1, S10, S20 y S33) mientras
que H2Ba presenta siete (S6, S9, S15, S18, S28, S30 and S31). Se han descripto varias
modificaciones postraduccionales en la región N-terminal de S. cerevisiae (ScH2B) y
humanas (HuH2B). Sin embargo, resulta difícil deducir los residuos de las histonas H2B
de Toxoplasma que estarían modificados, debido a la divergencia existente entre éstas
especialmente en la región N-terminal (Figura 2.2.2). Plasmodium spp. también posee
una H2B canónica y una H2Bv (Figura 2.2.3 y (Miao et al. 2006)) Recientemente se
describieron modificaciones postraduccionales para las histonas H2B de P. falciparum
(PfH2B y PfH2Bv) (Trelle et al. 2009). En este caso observaron que la histona PfH2Bv
posee múltiples acetilaciones en la región N-terminal, mientras que en la canónica solo
encontraron la ubiquitinación en la región C-terminal. Todos los residuos acetilables de
PfH2Bv se encuentran en TgH2Bv (Figura 2.2.2), por lo que se podría pensar que en
Toxoplasma podría ocurrir lo mismo.
En S. cerevisiae se describió un dominio HBR, el cual es requerido para la
represión del 8,6% de su genoma. Este se encuentra subrayado en la Figura 2.2.2. Se
determinó que los aa. requeridos para esta función son la lisina en posición 34 (K34) y
una lisina flanqueante (K30 o K37) (Parra et al. 2006). Si bien, por homología de
secuencia, se observó que este dominio se encuentra conservado en varias especies
(Parra et al. 2006), no se encuentra conservado en ninguna de las H2B de T. gondii. Sin
embargo, H2Ba y H2Bb contienen en esa región varios residuos de lisina, los cuales
tendrían otra lisina ubicada a 3 o 5 aa. río arriba; mientras que H2Bv no tiene ninguna de
ellas (Figura 2.2.2).
35
)#$
M
Fosforilación
TgH2Ba
TgH2Bb
PfH2B
HuH2B
ScH2B
M
Acetilación
α1
MVA---KKSAK---------SAKPKA-----SGKSGKGKKKRAESYSS
MVA---KKSAK---------VAKSKD-----SGKKGKGKK-RAESYSS
MVS---KKPAK---------AKKTGTGP---DGKK-KRKKSRYDSYGL
MPEPAKSAPAPKK------GSKKAVTKAQKKDGKK--RKRSRKESYSV
MSSAAEKKPASKAPAEKKPAAKKTSTSV---DGKK--RSKARKETYSS
YIFKVLKQVHPETGI
YIFKVLKQVHPETGI
YIFKVLKQVHPDTGI
YVYKVLKQVHPDTGI
YIYKVLKQTHPDTGI
dominio HBR
α1
TgH2Bv
PfH2Bv
ScH2B
MS--------GKGPAQKSQAAKKTAGKSLGPRYRRRKRTESFAL
MS--------GKGPAQKSQAAKKTAGKSLGPRXRRKXRTESFSL
MSSAAEKKPASKAPAEKKPAAKKTS-TSVDGKKRSKARKETYSS
YIYKVLKQVHPETGV
YIYKVLKQVHPETGV
YIYKVLKQTHPDTGI
dominio HBR
Figura 2.2.2. Alineamiento de la región N-terminal de las H2B. En el esquema superior
comparan las H2B canónicas de Toxoplasma (H2Ba y H2Bb) y P. falsiparum (PfH2B), la
secuencia consenso de las H2B humanas (HuH2B) y la H2B de S. cerevisiae (ScH2B); mientras
que en el esquema inferior se comparan las H2B variantes de Toxoplasma (H2Bv) y P.
falsiparum (PfH2B) y la H2B de S. cerevisiae (ScH2B). Los aminoácidos modificados posttraduccionalmente se encuentran sombreados; el color de la sombra denota la modificación de
acuerdo a lo establecido en la parte superior del esquema. HBR domain: dominio represor de
histona H2B. Las flechas indican las lisinas importantes del dominio HBR. El cilindro indica los
aa correspondientes a la hélice α1.
2. 2. 2. Análisis filogenético
Dado que T. gondii presenta varias H2B, se buscaron secuencias de H2Bs de los
parásitos del phylum Apicomplexa presentes en las bases de datos y se las comparó por
análisis de Neighbor joining (NJ), incluyendo las secuencias de humanos. Los resultados
muestran claramente que existen dos clados diferentes de H2B en cada una de las
especies analizadas (Figura 2.2.3). En uno de los grupos se encuentra TgH2Bv y en el
otro TgH2Ba y TgH2Bb. En paralelo a nuestro trabajo, se caracterizaron las histonas H2B
de P. falciparum (Miao et al. 2006) y se las nombró como PfH2B (mayor homología con
HuH2B) y PfH2B variante (PfH2Bv). Basados en esta nomenclatura se denominaron
como H2B variantes a todas las histonas que se agrupan con PfH2Bv. Las secuencias de
las H2B del grupo de las variantes muestra mayor homología entre ellas que las del
grupo de las canónicas. Las diferencias se encuentran principalmente en la región Nterminal.
36
)#$
Figura 2.2.3. Árbol de NJ construido con de
secuencias de H2B de varios miembros del
filum Apicomplexa. Tg: T. gondii (H2Bv1:
AF406555, H2Ba: DQ118972, H2Bb:
TGME49_051870),
Pf:
Plasmodium
falciparum
(H2Bv:
BU497652,
H2B:
U14734), Pv: Plasmodium vivax (H2B:
CAA76839) Et: Eimeria tenella (H2Bv1:
CD345163; H2B: CD569058), Nc: Neospora
caninun
(H2Bv1:
CF598462;
H2B:
CF937965), Sn: Sarcocystis neuron (H2Bv1:
H2B:
CV194457),
Ch:
CV193312;
Cryptosporidium
hominis
(H2Bv1:
XP_666723, H2B: XP_666188). hTSH2B:
human
testis/sperm
specific
H2B:
AP397301. Hu: human (H2B: secuencia
consenso).
2. 2. 3. Antigenicidad de H2Bv en pacientes con toxoplasmosis
Las histonas H2Bs fueron caracterizadas en Plasmodium debido a su valor
antigénico, ya que los pacientes infectados presentan serología positiva para esta histona
(Rawat et al. 2004). Por lo tanto, se analizó el valor antigénico de la H2Bv de T. gondii.
Para ello, se evaluó la reactividad de sueros humanos de individuos seronegativos y
seropositivos con infección crónica y aguda por ELISA utilizando placas sensibilizadas
con H2Bv recombinante (rH2Bv). Esta proteína se obtuvo mediante la expresión en
bacterias y purificación con columna de niquel (Figura 2.2.4A). Ninguno de los sueros fue
reactivo para esta histona (datos no mostrados).
2. 2. 4. Obtención de anticuerpos específicos
Tanto H2Bv como H2Ba fueron expresadas como proteínas recombinantes
(rH2Bv y rH2Ba, respectivamente). Ambas fueron clonadas en vectores de expresión en
bacterias, expresadas mediante la inducción con IPTG y purificadas en columnas de
niquel como se describe en el capítulo 6. Ambas proteínas recombinantes se expresaron
de forma soluble, las cuales migraron con una masa molecular aparente de
aproximadamente 17 kDa en SDS-PAGE 15% (Figura 2.2.4A). Con el fin de obtener
anticuerpos específicos para cada una de estas histonas, se inmunizaron dos ratones con
rH2Ba y un conejo con rH2Bv. Sin embargo, solo se obtuvo suero policlonal reactivo para
rH2Bv (α-H2Bv). La especificidad de este anticuerpo fue determinada por Western blot,
37
)#$
donde se observa que es muy específico para rH2Bv y presenta una débil reacción
cruzada con rH2Ba (Figura 2.2.4B). Al analizar la afinidad de este anticuerpo por las dos
H2Bs recombinantes mediante ELISA competitivo, se observó que α-H2Bv pierde la
capacidad de unirse a rH2Bv inmovilizada, cuando es preincubado con la misma
proteína, incluso a concentraciones muy bajas como 0,1 μg/ml. Mientras que preincubar
el anticuerpo con rH2Ba o rROP2 (proteína recombinante de T. gondii no relacionada con
histonas) no afectan significativamente la interacción entre α-H2Bv y la rH2Bv
inmovilizada, incluso a concentraciones 5 μg/ml (Figura 2.2.4C y datos no mostrados).
Figura 2.2.4. Anticuerpo antiH2Bv. A. Las proteínas
recombinantes H2Ba y H2Bv
purificadas y analizadas por
SDS-PAGE 15%, utilizadas
para
la
obtención
de
anticuerpos.
B.
La
especificidad
y
reacción
cruzada de α-H2Bv examinada
por Western blot, utilizando
rH2Ba y rH2Bv. La membrana
teñida con Ponceau, permite
visualizar la cantidad presente
de cada pretína recombinante.
C. ELISA competitivo que
muestra la afinidad de α-H2Bv
por
distintas
proteínas
recombinantes. Se evaluó la
capacidad
de
α-H2Bv
(1/10.000) preincubado con 0;
0,1; 0,5 y 1 μg/ml de rH2Bv
(), rH2Ba (ƒ) y rROP2 (•)
de reconocer la proteína
inmobilizada (rH2Bv).
2. 2. 5. Inmunodetección de las H2Bs
Con el objetivo de caracterizar las histonas H2B de Toxoplasma a nivel de
proteína, se realizó un Western blot con α-H2Bv de extracto total de taquizoitos y
bradizoitos obtenidos in vitro y células hospedadoras (HFF) como control. Se detectaron
dos bandas de masas moleculares aparentes de aproximadamente 15 y 17 kDa (Figura
2.2.5). Las cuales no se observan en el extracto total de células control, indicando que
38
)#$
son bandas específicas de H2B del parásito. El suero preinmune fue no reactivo en todos
los casos (datos no mostrados). Estas dos bandas podrían ser dos estados
postraduccionales diferentes de H2Bv. Sin embargo, no se puede descartar la posibilidad
de que exista algo de reacción cruzada con H2Ba y las dos bandas corresponden a las
dos histonas H2B.
Además, se comparó la intensidad de las bandas detectadas con α-H2Bv en
ambos estadios (Figura 2.2.5). La cantidad de proteína correspondiente a cada estadio
fue evaluada mediante Western Blot con anti-actina de cantidades decrecientes (20, 15,
10 and 5 μl) de cada muestra. En la Figura 2.2.5 se muestra el Western Blot
correspondiente a 5 μl de cada muestra, donde la reacción de color no se encuentra
saturada. Se podría concluir que los niveles de H2B son iguales en ambos estadios.
Figura 2.2.5. Identificación de H2Bs en
taquizoitos (Tz) y bradizoitos (Bz) por
Western blot (WB).
Se extrajeron las
proteínas correspondientes a taquizoitos (Tz),
bradizoitos (Bz) in vitro y células hospedadoras
(HFF) utilizando TRIZOL (Invitrogen). El
porcentaje de diferenciación a Bz fue de 87%,
analizado mediante la detección de la pared del
quiste con la lectina de Dolicos biflorus
fluorescente. 20 μl de cada muestra fue
separada por electroforesis en SDS-PAGE 18%
y analizada por WB con α-H2Bv; mientras que
5 μl fueron analizados con anti-actina (α-Actin)
para cuantificar la cantidad de proteína
utilizada.
Por otro lado, se determinó la localización de esta proteína dentro del parásito por
inmunofluorescencia indirecta (IFI). Esta se llevó a cabo en parásitos intracelulares,
crecidos en condiciones de taquizoito y bradizoito in vitro, fijados con paraformaldheído y
permeabilizados con 0,2% Tritón X-100. Se detectó señal sólo en el núcleo, excluyendo
el nucléolo, en ambos estadios (Figura 2.2.6).
39
)#$
Figura 2.2.6. Inmunofluorescen
ncia Indirecta. Se realizó en taquizoitos (Tz) y bra
adizoitos (Bz) in
vitro. Con el fin de identificar los distintos
d
estadios se utilizó anti-SAG1 (α-SAG1) com
mo marcador de
taquizoitos y anti-p21 (α-p21) com
mo marcador de bradizoitos. La presencia de H2Bv en
e el núcleos se
analizó superponiendo su marca con DAPI. Se seleccionaron dos zonas para ser o
observadas con
mayor aumento, las cuales se mu
uestran en el centro de la figura. Una de las zonas ccorresponde a la
señal observada con α-H2Bv en Tz
T y la otra en Bz (cuadrados blancos). Las flechas blancas indican
la ausencia de señal en los nucleo
olos.
2. 2. 6. Análisis de his
stonas purificadas
Las histonas de Toxo
oplasma se purificaron mediante una extracción con ácido
sulfúrico y luego precipitadas por toda noche con acetona en frío. Estas fuerron separadas
por SDS-PAGE 15% y analiz
zadas por Western blot con α-H2Bv. Dos ban
ndas de masa
molecular aparente menor a H2AX (variante de la histona H2A, utilizada como
c
control)
2.7A).
fueron detectadas (Figura 2.2
Para obtener una mejor
m
resolución, las histonas purificadas fueron luego
separadas por relación ca
arga/masa en electroforesis en geles de poliacrilamida
conteniendo tritón-ácido acéttico y urea (TAU-PAGE). Para identificar cada histona, se
cortaron varias bandas, las cu
uales fueron enviadas para su análisis por espe
ectrometría de
masa. Se identificaron las cu
uatro histonas encargadas de formar el nucleo
osoma (Figura
2.2.7B). Varias bandas fue
eron identificadas como H4, basados en el patrón que
40
)#$
presentan, podría pensarse que se deben a versiones modificadas postraduccionalmente
de esta histona. Sólo una banda fue identificada como H3. Si bien se detectaron tres
bandas correspondientes a H2A, no fue posible identificar cada una debido a que los
péptidos obtenidos eran iguales en todos los casos. Finalmente, se identificaron dos
bandas H2B, ambas correspondientes a H2Bv (Figura 2.2.7B). Un ensayo de Western
blot con α-H2Bv de histonas extraídas y separadas en las mismas condiciones, reveló
dos bandas; las cuales coinciden con las dos bandas identificadas por MALDI-TOF. En
base a estos resultados nos inclinamos a pensar que las dos bandas corresponden a
H2Bv y que ésta sería la histona H2B mayoritaria, dado que H2Ba no fue identificada en
ninguna de las bandas analizadas por espectrometría de masa.
Figura 2.2.7. Análisis de histonas
purificadas. A. Histonas separadas
por SDS-PAGE 15% y transferidas.
La membrana fue teñida con
Ponceau para visualizar las bandas y
dividida a la mitad. Ambas fueron
analizadas por WB, una con α-H2Bv
y la otra con α-H2AX como control.
B. Histonas purificadas analizadas
por TAU-PAGE. Una muestra fue
teñida con Coomassie blue y las
bandas marcadas con números
fueron cortadas y analizadas por
espectrometría
de
masa.
La
identidad de las bandas se encuentra
indicada al lado de cada número.
Otra muestra fue transferida y
analizada por Western blot (WB)
utilizando α-H2Bv.
2. 2. 7. Expresión de las histonas H2Bs de T. gondii
Con el objetivo de estudiar la expresión de las tres histonas H2Bs, se realizaron
ensayos de PCR con oligonucleótidos específicos para cada una de ellas utilizando como
templado ADNg y ADNc de taquizoitos y bradizoitos. Todas fueron correctamente
amplificadas de ADNg, corroborando de este modo la presencia de ellas en el genoma
del parásito (Figura 2.2.8). Cuando se determinaron los niveles de transcripto de estas
histonas, se observó que h2bv y h2ba
se expresan tanto en taquizoitos como en
bradizoitos, mientras que h2bb no se transcribe en estos estadios o lo hace en muy baja
cantidad, ya que no pudo ser
amplificada por esta metodología (Figura 2.2.8). Este
último resultado se encuentra avalado por la ausencia de ESTs correspondientes a h2bb
en la base de datos ToxoDB.
41
)#$
ARNm
Tz
Bz
ADNg
Figura 2.2.8. Amplificación de las CDS de h2bb, h2ba y
h2bv por PCR utilizando como templado ADNg y ADNc
obtenido de taquizoitos (Tz) y bradizoitos (Bz). La
visualización de las mismas se llevó a cabo por
electroforesis en gel de agarosa 1% y tinción con bromuro
de etidio.
h2bb
h2ba
h2bv
Dado que h2bv y h2ba son las dos histonas H2B presentes en los estadios
analizados y basados en que las histonas variantes por lo general son las histonas
minoritarias, nos propusimos comparar la cantidad de transcripto correspondiente a cada
una de ellas en el estadio taquizoito. Para ello, se compararon las eficiencias de las
reacciones de PCR utilizadas para amplificar cada histona utilizando ADNg como
templado, ya que estos genes son de copia única. Se observó que ambas curvas
coincidían, indicando que las eficiencias de amplificación de ambas PCRs son muy
similares (Figura 2.2.9B). A continuación se llevaron a cabo ensayos de RT-PCR
semicuantitativa, utilizando ADNc de taquizoitos como templado. De este modo, se
comprobó que los niveles de expresión de h2bv son significativamente mayores que los
de h2ba (Figura 2.2.9A).
Figura 2.2.9. Niveles de transcripto de H2B en taquizoito. A. PCR semicuantitativa
utilizando ADNc como templado. B. PCR semicuantitativa utilizando ADNg como templado. En
la parte superior de la figura se obserban los productos de amplificación para cada número de
ciclo en un gel de agarosa 1%. En la parte inferior, se encuentra el gráfico de la densidad
óptica integrada (IOD) de cada una de las bandas con respecto al número de ciclos.
42
)#$
A su vez, se comparó la expresión de estas dos histonas en los estadios
taquizoito y bradizoito in vivo. Los taquizoitos son altamente replicativos, mientras que los
bradizoitos de quistes de cerebro de ratón se encuentran mayoritariamente arrestados en
la fase G0. Como las histonas canónicas se transcriben en la fase S del ciclo celular
(Harris et al. 1991) y las histonas variantes lo hacen de forma independiente, al comparar
estos estadios estaríamos comparando, de forma indirecta, la expresión de las histonas
con el ciclo celular. Los niveles de transcripto de h2bv y h2ba se determinaron por RTPCR semicuantitativa con ADNc de taquizoitos y bradizoitos in vivo. Como control de
carga se utilizó la amplificación del gen de α-tubulina. En estas condiciones, los niveles
de transcripto de h2ba se encuentran disminuidos en bradizoitos con respecto a
taquizoitos; mientras que los de h2bv se mantienen constantes en ambos estadios
(Figure 2.2.10).
Tz
Tz
Q
Q
h2bv
h2ba
α -tub
0
5
10
3
IOD (x10 )
Figure 2.2.10. Niveles de expresión
de h2bs en taquizoitos (Tz) y
bradizoitos (Bz). A la izquierda se
observan las bandas amplificadas
por RT-PCR semicuantitativa de los
genes h2bv, h2ba y α-tubulina (αtub) separadas en gel de agarosa
1%. A la derecha se encuentran
graficadas las intensidades de las
bandas, dadas por la densidad óptica
integrada (IOD) de las mismas. Estos
obtenidos
de
tres
15 resultados
experimentos independientes.
Por lo tanto, podríamos decir que la expresión de h2ba se encuentra regulada a nivel del
ciclo celular, mientras que la de h2bv es independiente del ciclo celular. De forma similar,
en P. falciparum se observó que la expresión de PfH2B acompaña al ciclo celular,
mientras que la expresión de PfH2Bv, al igual que H2Bv de Toxoplasma, es
independiente del ciclo celular; probablemente indicando una función particular de esta
histona variante (Miao et al. 2006)
43
)#$
2. 3. Discusión
Se identificaron tres H2Bs al realizar una búsqueda en la base de datos ToxoDB
(http://toxodb.org): H2Ba, H2Bb y H2Bv. El estudio filogenético mostró dos linajes de H2B
en el phylum Apicomplexa, uno que comprende a las histonas H2B variantes y otro a las
canónicas. Las secuencias de las H2B del grupo de las variantes muestra mayor
homología entre ellas que las del grupo de las canónicas. Estos datos sugieren que el
evento de duplicación de las H2B ocurrió previamente a la divergencia del phylum
Apicomplexa. Además, las H2B variantes parecen ser más conservadas que las H2B
canónicas, indicando diferentes tasas de evolución de estos genes. Probablemente, los
genes H2B han sufrido diferentes cambios adaptativos de acuerdo con su rol y la
importancia de esta histona en el ciclo celular y la regulación de la cromatina en los
diferentes parásitos Apicomplexas.
La mayor diferencia de secuencia entre ellas se hallan en la región N-terminal, la
cual es susceptible de ser modificada postraduccionalmente. Recientemente se
describieron modificaciones postraduccionales para PfH2B y PfH2Bv (Trelle et al. 2009),
donde la H2B variante posee múltiples acetilaciones en la región N-terminal, mientras que
en la canónica solo encontraron la ubiquitinación en la región C-terminal. Todos los
residuos acetilables de PfH2Bv se encuentran en TgH2Bv, por lo que se podría pensar
que en Toxoplasma podría ocurrir lo mismo. En ese caso, se podría sugerir un papel
específico a esta variante, quizás asociado a regiones de cromatina activa (ver capítulo
4).
Las tres H2Bs fueron clonadas y secuenciadas utilizando ADNg y ADNc como
templado. H2Bb no pudo ser amplificada de ADNc de taquizoito ni bradizoito, indicando
que no es un gen transcripcionalmente activo en estos estadios. Mientras que H2Bv y
H2Ba se expresan en ambos estadios con diferentes perfiles de expresión. Los niveles de
transcripto de H2Ba son menores que los de H2Bv en taquizoitos y estos niveles
disminuyen aún más en el estadio de bradizoito; indicando que es una histona canónica.
En cambio, los niveles de expresión de H2Bv permanecen constantes en los dos
estadios, o sea en los distintos estados replicativos, confirmando la calidad de variante de
esta histona. En paralelo a nuestros estudios se encontraron variantes de H2B en P.
falciparum (Miao et al. 2006) y T. brucei (Lowell et al. 2005). Cabe destacar que PfH2Bv
también mantiene los niveles de transcripto en los diferentes estadios. En el caso de la
H2Bv de T. brucei, esta no estaría relacionada filogenéticamente con la H2Bv de
Apicomplexas. Estos fueron los primeros trabajos que describieron la presencia de una
44
)#$
histona H2B variante en la naturaleza. En los siguientes capítulos de abordará el estudio
y la discusión de la presencia de H2Bv en protozoos.
Por otra parte, se generó un anticuerpo anti-H2Bv (α-H2Bv), el cual resultó ser
altamente específico y de muy baja reacción cruzada con H2Ba. Esto nos permitió
estudiar esta histona a nivel de proteína. Tanto en taquizoitos como en bradizoitos esta
histona se encuentra presente en el núcleo, excluyendo al nucléolo. α-H2Bv es capaz de
detectar dos bandas por Western blot en ambos estadios. La intensidad de cada una de
ellas fue igual tanto en taquizoitos como en bradizoitos. Así mismo, cuando se purificaron
histonas de taquizoitos, se separaron por SDS-PAGE y/o TAU-PAGE y se analizaron por
Western blot, también se detectaron dos bandas. Con el fin de identificar cada una de las
histonas, se realizó una extracción ácida y las histonas purificadas fueron analizadas por
MALDI-TOF y microsecuenciación. Esto reveló que las bandas detectadas por el
anticuerpo corresponden a H2Bv y que ninguna de las bandas analizadas contenía H2Ba.
La aparición de dos bandas probablemente se deba a dos estados postraduccionales
diferentes de la misma histona. Todos estos resultados indican que H2Bv es la histona
H2B mayoritaria en Toxoplasma. Esta conclusión es de carácter particular y
sorprendente, ya que las histonas variantes se caracterizan por ser las histonas
minoritarias.
45
Capítulo
3
#
$#
)#$!
3.1. Introducción
La familia de histonas H2A es la que posee mayor número de variantes no alélicas
y estas variantes difieren entre especies: H2AZ y H2AX, se encuentran en prácticamente
todos los organismos eucariotas (Redon et al. 2002) mientras que H2ABbd y macroH2A,
parecen ser específicas de vertebrados (Pehrson and Fried 1992, Chadwick and Willard
2001). Las diferentes histonas H2A contribuyen a la regulación de la transcripción,
silenciamiento, segregación de cromosomas, mantenimiento de los telómeros y
reparación del ADN.
Las histonas H2As presentan una α-hélice en la región N-terminal y otra en la
región C-terminal, además del plegamiento característico de las histonas. La cola Nterminal parece intercalarse entre las dos vueltas del ADN nucleosomal, mientras que la
cola C-terminal contacta de forma extensa con el dímero H3-H4. La interacción entre las
dos H2As del nucleosoma ocurre a través de sus dominios Loop1 (Malik and Henikoff
2003).
La variante H2AZ es en general la histona H2A minoritaria. Sin embargo mostró
ser esencial en todos los organismos eucariotas superiores, desde Tetrahymena a
mamíferos (Liu and Gorovsky 1996, Faast et al. 2001), menos en levaduras, en las cuales
la deleción génica solo produjo un crecimiento más lento de las mismas (Carr et al. 1994).
Esta variante presenta en su región C-terminal un parche acídico, denominado docking
domain (dominio de acoplamiento) que no se encuentra en las otras H2As (Suto et al.
2000) y pareciera ser el responsable de llevar a cabo su función esencial (Clarkson et al.
1999). Mediante la técnica de RNAi, se observó que es importante para la formación de
heterocromatina, la correcta segregación de los cromosomas y la mitosis (Rangasamy et
al. 2003). Además, es necesaria para el reclutamiento de la RNA polimerasa II (Adam et
al. 2001) y se propone que tendría la capacidad de proteger a la cromatina
transcripcionalmente activa del silenciamiento (Meneghini et al. 2003).
La variante H2AX representa del 2 al 25% del pool de histonas H2As en
mamíferos. Se caracteriza por presentar en el C-terminal la secuencia consenso
SQ(E/D)Φ, donde Φ representa un aminoácido hidrofóbico. La ruptura de la doble hebra
del ADN (DSB, del inglés double strands break) estimula la rápida fosforilación de la
serina del motivo por la quinasa ATM (Rogakou et al. 1998); aunque también puede ser
fosforilada por ATR y DNA-PK (Stiff et al. 2004). La exposición de las células a distintos
fuentes de radiación ionizante, rayos X, radiación γ, partículas Į y metales pesados
directamente inducen DSB. Los tratamientos con agentes citotóxicos como inhibidores de
47
)#$!
la síntesis de ADN, agentes alquilantes del ADN, inhibidores de las topoisomerasas I y II,
bleomicina y peróxido de hidrógeno, también llevan a la formación de DSB y la formación
de H2AX fosforilada (γH2AX) (Dickey et al. 2009). Independientemente de cuál sea el
origen, en los sitios donde hay DSB, se encuentra γH2AX. Además de participar en la
reparación del ADN, γH2AX contribuye con el control del arresto celular luego de que
ocurre el daño. Hasta que éste no sea reparado, el ciclo celular no progresa (FernandezCapetillo et al. 2002). Además del daño generado por agentes externos, γH2AX se
encuentra asociada a los procesos celulares normales que involucran DSB, como la
recombinación meiótica, la apoptosis, los rearreglos V(D)J y formación de la horquilla de
replicación (Chen et al. 2000, Rogakou et al. 2000, Mahadevaiah et al. 2001, Ward and
Chen 2001). La obtención y el estudio de ratones y células madres mutantes nulas para
H2AX, permitió determinar que esta histona variante no es esencial para el arresto celular
luego del daño del ADN, ni para la fidelidad de la recombinación V(D)J. Sin embargo, los
ratones H2AX
-/-
presentaron retardo en el crecimiento, inmunodeficiencias, gran
sensibilidad a la radiación y los machos fueron infértiles. Esto estaría indicando que esta
histona es esencial en la reparación del ADN y la estabilidad genómica en mamíferos
(Bassing et al. 2002, Celeste et al. 2002).
Como se puede observar, las variantes de las histonas H2A son responsables del
correcto funcionamiento de diversos procesos celulares. Hasta el momento de realizado
este trabajo, no se habían caracterizado o estudiado las histonas de la familia H2A en
Toxoplasma, como tampoco en ningún Apicomplexa. Por este motivo nos propusimos
identificar las histonas H2A de T .gondii, describir similitudes y diferencias entre ellas,
identificar la presencia de variantes y analizar su expresión en los estadios de taquizoito y
bradizoito.
48
)#$!
3.2. Resultados
3. 2. 1. Identificación, clonado y análisis de secuencia
Haciendo uso de la información y programas presentes en las bases de datos del
National Center for Biotechnology Information (NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y de la
base de datos de T. gondii (ToxoDB: http://toxodb.org), se identificaron 3 histonas H2A
putativas en este parásito. Estas fueron denominadas H2A1, H2AX y H2AZ en base la
homología que presentaban sus secuencias con las ya identificadas H2As de humanos.
Se clonaron mediante la técnica de PCR utilizando ADNc y ADNg como templado. La
CDS de H2A1 codifica para una proteína de 128 aa con una masa molecular predicha de
13,6 kDa y punto isoeléctrico pI= 10,63 (AN: AY573602). La CDS de H2AX codifica para
una proteína de 135 aa con masa molecular predicha de 14,5 kDa y pI=10,58 (AN:
AY631392). Mientras que la CDS de H2AZ codifica para una proteína de 155 aa con una
masa molecular predicha de 15,91 kDa y pI=10,64 (AN: AF502246).
Mediante la utilización del programa ToxoDB Genome Browser (http://toxodb.org)
se pudo observar que las tres cepas de parásitos secuenciadas, tipo I (GT1), tipo II
(Me49) y tipo III (VEG), poseen las tres histonas H2A y éstas se encuentran en sintenia.
H2A1 y H2AX muestran gran homología entre ellas (88% de identidad y 92% de similitud)
y ambas se localizan en el cromosoma VIIb (H2A1: TGME49_061250; TGGT1_chrVIIb
entre las posiciones 1811408 a 1811794 y TGVEG_chrVIIb entre las posiciones 18003841800743; H2AX: TGME49_061580, TGGT1_008650 y TGVEG_073130). H2AZ presenta
mayor divergencia que las otras dos H2As, se encuentra localizada en el cromosoma XII
y
es
la
única
que
presenta
intrones
(TGME49_100200,
TGGT1_095100
y
TGVEG_007580). En la Figura 3.2.1 se muestra un alineamiento de estas tres histonas
H2A. Todas tienen conservada la lisina 120, susceptible de ser ubiquitinada en otras
especies y presentan las α-hélices en la región N- y C-terminal características de la
familia de las H2A. Se puede observar que H2AX presenta el motivo C-terminal
característico SQ(E/D)Ɏ, que en este caso es SQEF. Resulta interesante que H2A1
posee una versión truncada del motivo que define a la H2AX, por lo que no se puede
descartar que esta histona posea funciones que se han visto asociadas a H2AX. H2AZ
presenta una región N-terminal larga, como se ha observado en otros protozoos (Sullivan
et al. 2006) y presenta varias diferencias con respecto a las otras H2As de T. gondii; la
mayoría de las cuales se encuentran en las regiones N- y C- terminales.
49
)#$!
1 ------------------MSAKGKGGRAKKS-GKSS----SKSAKAGLQFPVGRIGRYLKKGRYAK-RVGAGAPVYMAAV
1 ------------------MSAKGAGGRKKTSSGKKV----SRSAKAGLQFPVSRIGRYLKKGRYAK-RVGVGAPVYLAAV
1 MDGAGKVGGKVGGKVGGKVGGMGKGGKGKSGSGKGKKAPLSRAARAGLQFPVGRVHRMLKSRISSEGRVGSTAAVYASAI
L1
αΝ
H2A1
H2AX
H2AZ
L2
α1
α2
Ub
59 LEYLCAEILELAGNAARDHKKTRIIPRHIQLAVRNDEELSKFLGGVTIASGGVMPNVHSVLLPK--KSKGKK--SQ
59 LEYLCAEILELAGNAARDHKKTRIIPRHIQLAVRNDEELSKFLGGVTIANGGVMPHVHAVLLPKHSKSKGKHGVSQEF
81 LEYLTAEVLELAGNASKDLKVKRITPRHLQLAIRGDEELDTLIK-ATIAGGGVIPHIHKSLMTKGPSTQPMKKAKK
L3
α2
H2A1
H2AX
H2AZ
L4
α3
αC
Figura 3.2.1. Alineamiento de las H2As de T. gondii. Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de
H2A1, H2AX y H2AZ. El sitio predicho de ubiquitinación (Ub) se encuentra sombreado en negro. Debajo
de la secuencia se encuentra una representación esquemática de la estructura secundaria donde α y L
significan α-hélice y loop, respectivamente; creada utilizando el programa Predator (VegaZZ v2.3).
La presencia de Polimorfismo de un solo nucleótido (SNPs) para cada una de
estas histonas en cepas de los tres tipos, se obtuvo de ToxoDB. H2AZ presenta gran
número de SNPs, sin embargo todos ellos se encuentran en regiones no codificantes;
mostrando una densidad nula de SNPs en la región codificante (Tabla 3.2.1). Por el
contrario, H2AX y H2A1 poseen baja densidad de SNPs (1 y 3 respectivamente) en la
región codificante; no obstante todos los cambios son sinónimos (Tabla 2.2.1). Esto
indica una selección purificadora, correlacionada con la importancia de conservar estas
proteínas.
Densidad
SNPs
SNPs en
Totales
CDS
No
sinónimos
No
Sinónimos codificante
s
Gen
Cepas
Comparadas
H2A.Z
145.m00002
ME49 vs VEG
GT1 vs ME49
ME49 vs RH
0
0
0
60
55
5
0
0
0
0
0
0
60
55
5
H2A.X
55.m04942
GT1 vs VEG
GT1 vs ME49
2,45
2,45
1
1
0
0
1
1
0
0
H2A.1
55.m04926
ME49 vs VEG
GT1 vs ME49
GT1 vs VEG
7,75
7,75
0
6
5
3
0
0
0
3
3
0
3
2
3
En concordancia con estos resultados, el análisis de Neighbor Joining muestra
que la H2AZ de T. gondii se agrupa con H2AZ de otros organismos antes que con las
otras H2As del parásito. Esto estaría indicando, como era de esperar, un origen evolutivo
único y anterior a la diversificación de las especies. Por otro lado, H2A1 y H2AX se
50
)#$!
agrupan en un clado que contiene a las H2A canónicas y H2AX de otras especies (Figura
3.2.2 y (Sullivan et al. 2006)).
HuH2A
88
99
XlH2A
96
HuH2AX
96
DmH2A
ScH2A1
64
100
ScH2A2
AtH2A
TgH2A1
86
51
TgH2A2
TgH2AX
57
PfH2A
99
100
PyyH2A
TtH2AZ
AtH2A.F/Z
100
PfH2AZ
96
100
93
PyyH2AZ
TgH2AF/Z
XlH2A.Z
56
HuH2AZ
99
88
DmH2AZ
TtH2A1
100
TtH2A2
GlH2A
100 GlH2AX
Figura 3.2.2. Arbol de
Neighbor joining (NJ). Se
realizó con la secuencia de
aminoácidos de las H2As de
los siguientes organismos.
En el recuadro se encuentra
la subfamilia de las H2AZ.
At, Arabidopsis thaliana
y
(ANs:
AAL85051
BAF00012), Dm, Drosophila
melanogaster
(ANs:
AAN11125 y AAF56631),
Gl, Giardia lamblia (AN:
AF139873); Hu, human
(ANs: AAN59958, P16104 y
Pf,
CAG33696),
Plasmodium
falciparum
(ANs: P40282 y CAB39069);
Pyy,
Plasmodium yoelii
yoelii (ANs: CAQ40903 y
Sc,
EAA15833);
Saccharomyces cerevisiae
(ANs: P04909, P04910 y
Q12692), Tg, Toxoplasma
gondii, Tt, Tetrahymena
thermophilus
(ANs:
AAC37292, AAC37291 y
CAA33554), Xl, Xenopus
laevis (ANs: AAA49769,
AAH74188 y AAH74203).
0.1
Las histonas H2A de Toxoplasma presentan un alto grado de divergencia con
respecto a otros organismos, a diferencia de las histonas H3 y H4, las cuales se
encuentran altamente conservadas en la mayoría de los eucariotas (Sullivan 2003,
Sullivan et al. 2006). T. gondii H3 y H4 presentan un 94-98% de homología con las H3 y
H4 de humanos y S. cerevisiae. De modo contrario, TgH2AX muestra solo un 78-83% de
similitud (~69% de identidad) y TgH2AZ un 80-98% de similitud (67-81% de identidad)
con sus homólogas en humanos y S. cerevisiae, respectivamente. A su vez, TgH2A1
comparte un 86% de similitud y un 73% de identidad con la H2A canónica de humanos.
Si bien las modificaciones postraduccionales de las H2As no han sido
ampliamente estudiadas, se supone que ocurren al igual que en el resto de las histonas.
En la Figura 3.2.3 se muestra un alineamiento entre las regiones N-terminales de las tres
histonas H2A de Toxoplasma y las modificaciones postraduccionales descriptas en S.
51
)#$!
cerevisiae (ScH2B) y humanos (HuH2B). Las H2As de Toxoplasma poseen varias lisinas,
argininas y serinas que podrían ser potencialmente acetiladas, metiladas y/o fosforiladas.
La serina en posición dos (S2) capaz de ser fosforilada en la H2A1 de humanos, se
encuentra conservada en TgH2A1, al igual que K6. No obstante, resulta difícil deducir los
residuos de las H2As de Toxoplasma que estarían modificados, debido a la divergencia
existente entre las secuencias, sobre todo en la variante H2AZ (Figura 3.2.3).
Recientemente se describieron las modificaciones postraduccionales para las histonas
H2A de P. falciparum (PfH2A1 y PfH2AZ) (Trelle et al. 2009), observando que PfH2AZ
posee múltiples acetilaciones en su región N-terminal, mientras que en la canónica se
encontraron solo dos lisinas acetiladas (K4 y K6). Si bien en humanos la H2AZ presenta
mayor número de acetilaciones que la canónica, el número total de residuos acetilados es
mucho menor que el observado en Plasmodium. Todos los residuos acetilados en P.
falciparum se encuentran conservados en TgH2A1 y TgH2AZ (Figura 2.2.2), por lo que se
podría pensar que en Toxoplasma estaría ocurriendo lo mismo.
En un trabajo reciente en S. cerevisiae (Parra and Wyrick 2007), se observó que
la región N-terminal de H2A es responsable de la represión de aproximadamente el 4,5%
de su genoma y que el principal responsable es un motivo que denominaron dominio
HAR (dominio represor de H2A, del inglés histone A represive) y comprende la secuencia
“QSRSA”. La búsqueda de este motivo en las histonas H2As de Toxoplasma reveló que
TgH2AX presenta este motivo con mayor grado de conservación (Figura 3.2.3).
MSAKGKGGRAKKSGKSSSK
MSAKGKTGR-KKASKGTSN
MSGRGKQGG-KARAKAKSR
SAKAGLQFPVGRI
SAKAGLQFPVGRI
SSRAGLQFPVGRV
TgH2A1
PfH2A1
HuH2A1
MSAKGAGGRKKTSSGKKVSR SAKAGLQFPVSRI
MSGRGKTG--GKARAKAKSR SSRAGLQFPVGRV
MSG-GKSGGKAAVAKSAQSR SAKAGLAFPVGRV
MSG-GKGGKAGSAAKASQSR SAKAGLTFPVGRV
Dominio HAR
TgH2AX
HuH2AX
ScHTA1
ScHTA2
M Fosforilación
M Acetilación
MDGAGK-VGGKVGGKVGGKVGGMGKGGKGKSGSGKGKKAPLSR
MEVPGKVIGGKVGGKVGGKVLGLGKGGKGKTGSGKTKKAPLSR
----------MAGGKAG-------------KDSGKAKTKAVSR
-------MSGKAHGGKGKS---------GAKDSGSLRS--QSS
AARAGLQFPVGRV
ASRAGLQFPVGRV
SQRAGLQFPVGRI
SARAGLQFPVGRI
TgH2AZ
PfH2AZ
HuH2AZ
ScHTZ1
Figura 3.2.3. Comparación de la secuencia N-terminal de las H2A. Tg: T. gondii histones. Pf:
P. falciparum histones Hu: human histones (ANs: AAN59958, P16104 y CAG33696). Sc: S.
cerevisiae (AN: P04909, P04910 y Q12692). HTA1 y HTA2 son histonas H2AX y HTAZ1 es
H2AZ. El panel muestra las modificaciones postraduccionales identificadas en las H2As de
humanos, levaduras y Plasmodium. Los residuos modificados se encuentran sombreados y el
color indica el tipo de modificiación de acuerdo a lo indicado en el cuadro. El dominio represor de
H2A se encuentra subrayado (dominio HAR). El cilindro indica la α-hélice N-terminal de las H2As.
52
)#$!
3. 2. 2. Obtención de anticuerpos específicos
Las tres H2As de T. gondii fueron expresadas como proteínas recombinantes:
rH2AZ, rH2AX and rH2A1. Todas fueron subclonadas en vectores de expresión en
bacterias, expresadas mediante la inducción con IPTG y purificadas en columnas de
niquel como se describe en el capítulo 6. Las tres proteínas recombinantes migraron con
diferentes masas moleculares aparentes al ser analizadas por SDS-PAGE 15%. Estas se
encuentran entre 18 y 20 kDa (Figura 3.2.4). Además, los 120 aa N-terminales de la
histona H2AZ se expresaron como proteína recombinante fusionados a la proteína
glutation Tio-Transferasa [GST] (denominada GST-Nt). Esta proteína recombinante migró
con una masa molecular aparente de aproximadamente 30 kDa (Figura 3.2.4), mayor que
la observada para GST sola (dato no mostrado).
Figura 3.2.4. Histonas H2A recombinantes. Las
secuencias codificantes de H2AX y H2A1 fueron
subclonadas en el plásmido pRSETA (Invitrogen),
mientras que la de H2AZ en pQE30 (Quiagen). Todas
fueron expresadas como proteínas recombinantes, las
cuales contienen una cola de polihistidinas que
permitió su purificación mediante una columna de
niquel: rH2A1, rH2AX y rH2AZ. Por otro lado, se
expresó la región N-terminal de H2AZ, la cual fue
expresada como proteína recombinante fusionada a
GST (GST-Nt). En la figura se observan las proteínas
purificadas separadas en SDS-PAGE 15% y teñidas
con Coomassei blue.
Con el fin de obtener anticuerpos específicos para cada una de estas histonas,
rH2A1 y GST-Nt fueron utilizadas para inmunizar ratones, mientras que rH2AX y rH2AZ
se emplearon para inmunizar conejos. Se obtuvieron sueros policlonales específicos para
cada una de ellas, lo cual fue analizado por Western blot utilizando las proteínas
recombinantes. De los ratones inmunizados con rH2A1 se obtuvieron dos lotes de
anticuerpo: uno altamente específico α-H2A1 L1 y otro que presenta reacción cruzada
con rH2AX: α-H2A1 L2. El antisuero α-H2AX reconoce de forma específica rH2AX y es
no reactivo frente a rH2A1 ni rH2AZ. Tanto α-H2AZ de conejo, como el antisuero de
ratón α-H2AZ-Nt, son altamente específicos para rH2AZ y no reconocen rH2A1 ni rH2AX.
53
)#$!
Figura 3.2.5. Estudio de la especificidad de los anticuerpos α-H2As por Western blot. En
todos los casos 1,5 μg de cada proteína recombinante (rH2A1, rH2AX y rH2AZ) fueron
separadas por SDS-PAGE15%, transferidas a membrana de nitrocelulosa y teñidas con
Ponceau (fotos en rosa). Esto permite observar las bandas de cada histona recombinante
presente. Luego se realizaron Western blots con los anticuerpos especificados a la izquierda
de cada panel.
Además, se determinó la afinidad de cada anticuerpo por cada H2A recombinante
mediante ELISA competitivo. α-H2AX pierde la capacidad de unirse a rH2AX inmovilizada
cuando es preincubado con esta proteína recombinante. Mientras que la preincubación
del anticuerpo con rH2AZ, rH2A1 o rROP2 no afecta la interacción entre α-H2AX y la
rH2AX inmovilizada, incluso en concentraciones de 10 μg/ml (Figura 3.2.6). De la misma
manera, la unión entre α-H2AZ y rH2AZ inmovilizada solo se ve afectada cuando este
anticuerpo es preincubado con la misma proteína soluble. En concordancia con lo
observado por Western blot, la unión de α-H2A1 L2 a rH2A1 inmovilizada se ve
disminuida al ser preincubado con rH2A1 y rH2AX; aunque rH2AX afecta menos que
rH2A1. La afinidad de α-H2A1 L1 no pudo ser evaluada por no contar con suficiente
cantidad de anticuerpo (Figura 3.2.6).
54
)#$!
Figura 3.2.6. Afinidad de los anticuerpos anti-H2As determinada por ELISA de
competencia. Cada panel corresponde al análisis de la afinidad de un anticuerpo, indicado
como título del mismo, con respecto a la proteína recombinante específica inmobilizada: αH2A1 L2 con respecto a rH2A1; α-H2AX con respecto a rH2AX y α-H2AZ con respecto a
rH2AZ. En todos los casos cada anticuerpo fue preincubado con distintas concentraciones de
rH2A1, rH2AX, rH2AZ y rROP2, cada una indicada con el símbolo y línea indicado en el
recuadro en la parte superior derecha.
3. 2. 3. Inmunodetección de las histonas de la familia H2A
Una vez demostrada la especificidad de los anticuerpos para cada una de las
H2As, se procedió a identificar cada una de las histonas endógenas del parásito. Se
realizó un ensayo de Western blot con extracto total de taquizoitos separados por
NuPAGE 4-12% (Invitrogen). Cada anticuerpo reconoce una única banda; todas con una
masa molecular aparente similar (Figura 3.2.7A). Por lo tanto, se realizó una purificación
de histonas de taquizoitos, las cuales fueron separadas por SDS-PAGE 15%, transferidas
a una membrana de nitrocelulosa y visualizadas mediante tinción con rojo Ponceau.
Luego, cada una de las calles fueron divididas a la mitad y analizadas por Western blot
con dos anticuerpos diferentes. De este modo es posible visualizar diferencias mínimas
en la masa molecular aparente de las mismas. Se compararon las bandas detectadas
55
)#$!
con α-H2AZ-Nt y α-H2A1 L1 con respecto a las bandas reconocidas por α-H2AX. De este
experimento se deduce que cada histona H2A de Toxoplasma posee un masa molecular
aparente diferente. Además, se puede decir que H2AZ es la minoritaria ya que la banda
detectada por α-H2AZ-Nt no puede ser observada con rojo Ponceau en comparación a
las bandas detectadas por α-H2AX y α-H2A1 L1. Sin embargo, no es posible determinar
las cantidades relativas de estas histonas porque otras histonas (como H3) pueden
comigrar con ellas (Figura 3.2.7B).
Figura 3.2.7. Detección de las histonas H2As de T. gondii por Western blot (WB). A.
Extracto de taquizoitos separados por NuPAGE 4-12%. B. Histonas purificadas separadas por
SDS-PAGE 15%. Las histonas se visualizan con rojo Ponceau.
A su vez, se determinó por inmunofluorescencia indirecta que cada una de estas histonas
se encuentra en el núcleo de los taquizoitos, exceptuando el nucléolo (Figura 3.2.8).
56
)#$!
Figura 3.2.8. Localización
subcelular de las H2As. Se
llevó
a
cabo
mediante
inmunofluorescencia indirecta
en taquizoitos con cada uno
de los anticuerpos (indicados
a la izquierda del panel). A su
vez, fueron teñidas con DAPI,
el cual se intercala en el ADN
marcando asi los núcleos.
Luego
se
realizó
una
superposición
de
ambas
señales para ver si hay
colocalización. DAPI también
tiñe el núcleo de las células
huesped (Hu). Las flechas
apuntan a los nucleolos.
3. 2. 4. Perfiles de expresión de las histonas de la familia H2A
Los perfiles de expresión de los genes que codifican las H2As fueron estudiados
en taquizoitos y bradizoitos in vitro. Los taquizoitos RHΔuprt intracelulares fueron
incubados por un lado en condiciones de taquizoitos y por otro lado a pH 8,1 y sin CO2.
La aparición de bradizoitos en este último caso fue analizado por inmunofluorescencia
indirecta observando la aparición de BAG1 y la pared del quiste con la lectina de Dolichos
biflorus fluorescente (Figura 3.2.9A). También se determinó el aumento de los
transcriptos correspondientes a bag1 y ldh2 (genes específicos de bradizoitos) y la
disminución de sag1 (específico de taquizoito) por PCR en tiempo real en un análisis
comparativo (qRT-PCR). Los bradizoitos presentan un aumento significativo de los
niveles de transcripto de h2aX (p<0,0001) y de h2a1 (p‫ ޒ‬0,05) con respecto a sus niveles
en taquizoitos. A diferencia de los niveles de h2aZ, los cuales permanecen constantes en
ambos estadios (Figura 3.2.9B). En todos los casos, los niveles de cada gen fueron
normalizados con respecto a β-tubulina (que no presenta cambios significativos en
bradizoitos in vitro (Weiss et al. 1998)).
57
)#$!
Figura 3.2.10. Expresión de las H2As en taquizoitos (Tz) y bradizoitos (Bz) in vitro. A. La
eficiencia de diferenciación (mayor al 80%) fue determinada por inmunofluorescencia indirecta
realizada con LDB y BAG1. B y C. Se extrajo ARNm de éstos parásitos y de taquizoitos, los cuales
fueron utilizados como templado en una cuantificación relativa por PCR en tiempo real. Los niveles
de transcriptos de cada gen fueron normalizados con respecto a β-tubulina y calibrados con
respecto a taquizoitos. Los niveles de genes específicos de bradizoitos (bag1 y ldh2) y taquizoitos
(sag1) con el fin de confirmar la diferenciación (B) y de cada una de las H2As (C). Se realizaron
tres experimentos independientes. Las diferencias significativas entre Tz y Bz fueron analizados
por test T de Student (GraphPad Prism software): * indica p<0,05 y *** indica p<0,001. En B todos
presentan una p‫ޒ‬0,001. Se graficaron como logaritmo en base 2 de las veces que cambia la
expresión de cada gen en Bz con respecto a Tz.
Estos resultados aumentan las posibilidades de que h2aX y h2a1 estén
involucrados en la diferenciación a bradizoitos, asociados a un estado específico del ciclo
celular o ambos. Como los bradizoitos maduros obtenidos in vivo se encuentran
arrestados en G0 o G1 con un contenido uniforme de ADN correspondiente a 1N (Radke
and White 1998, Radke et al. 2003), se determinaron los perfiles de expresión de los
genes de las histonas H2As en bradizoitos de quistes aislados de cerebro de ratón. Para
ello se realizaron PCRs semicuantitativas utilizando ARNm de quistes extraídos de
ratones, 30 días después de su infección. La figura 3.2.11 muestra que h2a1 no se
expresa en bradizoitos maduros, o lo hace en cantidades indetectables por este método,
mientras que si lo hacen h2aX y h2aZ. Como las histonas canónicas se expresan
exclusivamente durante la fase S del ciclo celular (Harris et al. 1991), se puede deducir
que H2A1 es, por lo tanto, la H2A canónica en Toxoplasma.
58
)#$!
Tz
Quiste de cerebro (Q)
h2a1
h2aX
h2aZ
β -tub
Q
Figura 3.2.11. Expresión de H2As en
taquizoitos (Tz) y bradizoitos de quistes
de cerebro de ratón (Q). Se extrajeron
quistes de cerebros de ratón 30 días
después de su infección, se contaron y
visualizaron por microscopía de contraste de
fases. Se les extrajo ARN, el cual fue
utilizado como templado para analizar la
expresión
de las H2As por
PCR
semicuantitativa. Como control de carga se
amplificó el gen de β-tubulina (β-tub).
3. 2. 5. H2AX y daño del ADN en taquizoitos
La variante H2AX se fosforila rápidamente en su motivo C-terminal SQ(E/D)φ
luego de la ruptura de la doble hebra del ADN (Downs et al. 2000). Se han descripto
numerosos agentes capaces de producir diferentes tipos de daños del ADN e inducir la
fosforilación de esta histona (revisados por (Dickey et al. 2009)). Con el fin de dilucidar si
este mecanismo se encuentra conservado en Toxoplasma, se analizó el efecto de un
agente oxidante (H2O2) y uno alquilante (metano sulfonato de metilo [MMS]) sobre la
fosforilación y expresión de H2AX en taquizoitos.
En un primer experimento se incubaron parásitos extracelulares con 0, 100, 200 y
400 μM de H2O2 por 1 hora a 37°C, se lisaron y analizaron por NuPAGE 4-12% seguido
de Western blot. Se utilizó un anticuerpo monoclonal de ratón capaz de reconocer el
motivo SQEY fosforilado en la serina, denominado α-γH2AX y el anticuerpo α-H2AX
generado en el laboratorio. Ambos anticuerpos reconocen una sola banda con la misma
migración bajo las condiciones descriptas. Como control de la cantidad de proteína
presente se utilizó anti-tubulina (α-Tub). Se cuantificaron las intensidades de las bandas y
se determinaron las cantidades relativas de cada histona con respecto a Tub (R). De este
modo es fácil ver que los niveles de H2AX permanecen constantes, mientras que los de
γH2AX aumentan frente al tratamiento con H2O2 de manera dependiente de la dosis
(Figura 3.2.12).
Si bien se sabe que las variantes de histonas presentan una transcripción
independiente del ciclo celular (Grove and Zweidler 1984), hasta el momento no se han
descripto mecanismos que regulen su expresión. Como el tratamiento con H2O2 induce la
fosforilación de H2AX, este agente podría estar afectando de algún modo su
transcripción. Por lo tanto, se determinaron las expresiones de las tres H2As por qRTPCR en parásitos
59
)#$!
tratados del mismo modo antes descriptos. Los resultados muestran que la
transcripción de h2a1 y h2aX es estimulada por H2O2 de manera dosis-dependiente, pero
no afecta a h2aZ (Figura 3.2.12).
Es posible observar que frente al estrés oxidativo, luego de media hora, se
observa un aumento en los niveles de transcripto de H2AX, el cual no se ve reflejado en
un aumento en los niveles de proteína, pero si en un aumento en la fosforilación de la
misma. Es probable que el tiempo no sea suficiente para que el aumento en los niveles
de ARNm se correlacionen con los de proteína.
A
H2O2 (μ
μ M)
B
0 100 200 400
α -γγ H2AX
R
H2O2 (μ
μ M)
0 100 200 400
α -Tub
α -H2AX
6
Aumento (veces)
α -Tub
H2O2
5
4
3
2
1
0
0 100 200 400 0 100 200 400 0 100 200 400 μ M
h2a1
h2a1
h2aX
h2aX
h2aZ
h2aZ
R
Figura 3.2.12. Efecto de daño oxidativo con H2O2 en taquizoitos. Taquizoitos extracelulares
fueron tratados con 0, 100, 200 y 400 μM de H2O2 por 1 h a 37 °C. A. Western blots realizados
con anti-H2AX en el panel inferior y anti-fosfoH2AX (α-γH2AX) en el panel superior. Ambos fueron
realizados también con anti-tubulina (α-Tub), utilizado como control interno. La intensidad de las
bandas fue cuantificada y se estableció la relación de la intensidad de las histonas con respecto a
tubulina (R). B. Análisis de la expresión de h2a1, h2aX y h2aZ por qRT-PCR normalizada con βtubulina y calibrado con respecto al control sin H2O2. El ráfico representa uno de tres
experimentos independientes.
Los mismos experimentos fueron llevados a cabo con MMS. Ningún cambio fue
observado en los niveles de H2AX, ni en la fosforilación de la misma, ni en los niveles de
transcripto de ninguna de las H2As, incluso a concentraciones mayores, como 800 μM
(Figura 3.2.13). Tampoco se observaron cambios en estos parámetros cuando se trataron
los parásitos con concentraciones de MMS de 50 y 100 μM (datos no mostrados).
60
)#$!
MMS (μ
μ M)
0
200 400 800
α -Tub
α -γγ H2AX
MMS (μ
μ M)
0
200 400 800
α -Tub
B
MMS
6
Aumento (veces)
A
5
4
3
2
1
0
0 200 400 800 0 200 400 800 0 200 400 800 μ M
h2a1
α -H2AX
H2A.1
h2aX
H2A.X
h2aZ
H2A.Z
Figura 3.2.13. Efecto de daño alquilante con MMS en taquizoitos. Taquizoitos extracelulares
fueron tratados con 0, 200, 400 y 800 μM de MMS por 1 h a 37 °C. A. Western blots realizados
con anti-H2AX en el panel inferior y anti-fosfoH2AX (α-γH2AX) en el panel superior. Ambos
fueron realizados también con anti-tubulina (α-Tub), utilizado como control interno. B. Análisis de
la expresión de h2a1, h2aX y h2aZ por qRT-PCR normalizada con β-tubulina y calibrado con
respecto al control sin H2O2. El ráfico representa uno de tres experimentos independientes.
Cabe destacar que los taquizoitos sometidos a estrés térmico, el cual consiste en
2 horas a 42 °C, no presentan ningún aumento en los niveles de transcripto de h2aX
(Figura 3.2.14).
Aumento (veces)
H2AX
1,5
Figura 3.2.14. Expresión de h2aX en
estrés térmico. Se colectaron taquizoitos
extracelulares; la mitad fueron incubados a
42 °C por 2 h, mientras que la otra mitad fue
incubada a 37 °C como control. Se les
extrajo ARN y se determinaron los niveles de
h2aX por qRT-PCR. Los valores se
encuentran normalizados con β-tubulina y
calibrados con respecto al control de 37 °C.
1
0,5
0
37ƒC
42ƒC
Estos datos sugieren que la sobreexpresión de h2aX y h2a1, como el incremento
en la fosforilación de H2AX, se encuentran asociadas al daño oxidativo del ADN y/o
celular.
61
)#$!
3.2.6. La sobreexpresión de H2AX y su papel en la replicación del
parásito
Con el fin de intentar establecer la relación existente entre el aumento de la
expresión de H2AX y diferentes procesos biológicos, se obtuvieron parásitos RH que
sobreexpresan esta histona de forma estable, fusionada a c-myc en la región N-terminal
(denominados RH mycH2AX). Se aislaron tres clones: C2, C3 y C4, los cuales fueron
analizados por Western blot. α-H2AX reconoce una sola banda en los parásitos salvajes
y dos bandas en los clones, siendo la banda extra de mayor masa molecular aparente.
Mientras que α-c-myc reconoce una banda sólo en los clones, cuya masa molecular
aparente coincide con la banda extra observada con α-H2AX (Figura 3.2.15A). Estos
datos confirman la expresión de mycH2AX recombinante en los tres clones. La intensidad
de las bandas reconocidas con α-H2AX (H2AX endógena + mycH2AX) fueron
cuantificadas utilizando el programa Gel Pro Analyzer v. 4.0, en relación con la intensidad
de las bandas detectadas con α-Tub. Todos los clones presentan casi dos veces más
niveles de H2AX que los parásitos salvajes (Figura 3.2.15B).
Figura 3.2.15. Análisis de
los
clones
que
sobreexpresan H2AX. A.
Western blot con α-tubulina
(α-Tub), α-H2AX y α-c-myc
de taquizoitos de los clones
RH mycH2AX C1, C2 y C3 y
de la cepa salvaje (WT). B.
Gráfico de la intensidad de
las bandas detectadas con αH2AX en cada línea celular
con respecto a la detectada
en WT. IOD: densidad óptica
integrada
Además, se realizó una inmunofluorescencia indirecta con α-c-myc en taquizoitos
intracelulares de los tres clones RH mycH2AX, detectándose señal en los núcleos.
Confirmando de este modo la correcta localización de mycH2AX (Figura 3.2.16).
62
)#$!
Figura 3.2.16. Inmunofluorescencia
indirecta (IFI) de RH mycH2AX. Cada
uno de los clones (C2, C3 y C4) fue
analizado con α-c-myc por IFI. Los
núcleos fueron teñidos con DAPI. Luego
se realizó una superposición de estas
dos imágenes corroborando una
colocalización de la señal.
Una vez seleccionados tres clones que sobreexpresan H2AX, la cual presenta la
misma localización que la proteína endógena, se realizó un ensayo preliminar de
replicación con el objetivo de estudiar posibles cambios en el fenotipo. Se comparó el
crecimiento de los clones con respecto a los parásitos salvajes (WT). Los taquizoitos
extracelulares de cada cepa fueron contados, lavados e incubados con células HFF en
frío por 1 h para estimular su invasión. Luego se lavaron todos los parásitos
extracelulares y se incubaron en condiciones de taquizoito o.n. (ver capitulo 6). Al día
siguiente se fijaron los cultivos y se contaron parásitos por vacuola en cada caso. Se
observó que los clones 2 y 3 crecieron más con respecto al clon 4 y el WT, de modo
significativo con P‫ޒ‬0,01; mientras que el crecimiento del clon 4 no fue significativamente
diferente con respecto a la cepa salvaje (Figura 3.2.17). Es importante destacar que este
experimento fue realizado por única vez, por lo que son resultados preliminares.
Figura 3.2.17. Análisis de replicación. Se comparó la velocidad de replicación de los clones
(C2, C3 y C4) con respecto a la cepa salvaje (WT). Para cada uno se detalla el porcentaje de
vacuolas parasitóforas (%VP) conteniendo 1, 2, 4 y 8 taquizoitos (Tz/VP). Los clones 2 y 3
crecieron más que C4 y WT significativamente con P‫ޒ‬0,01 (**).
63
)#$!
3.1. Discusión
Se han descripto numerosas variantes de H2A: H2AX, H2AZ, macroH2A y
H2ABbd. Las últimas dos se han observado solo en vertebrados. Las histonas H2As
difieren entre las distintas especies. Los protozoos Trypanosoma spp no tienen H2AX;
por el contrario las levaduras, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica y Trichomonas
vaginalis
han reemplazado la H2A canónica por H2AX; mientras que Drosophila
melanogaster presenta una variante de H2A (H2AvD), la cual es un híbrido entre H2AX y
H2AZ (van Daal et al. 1988). Al estudiar lo que ocurre en Apicomplexas, se observó que
Toxoplasma es el único que posee H2A canónica y H2AX. Cryptosporidium spp., al igual
que los protistas mencionados anteriormente, parecen haber remplazado la histona H2A
por H2AX. Los otros Apicomplexas analizados no tienen H2AX; sin embargo, sus H2A
canónicas presentan homología parcial con el motivo C-terminal SQ(E/D)Ɏ característico
de las H2AX (Sullivan et al. 2006). Por lo que no se puede descartar que estas H2As
estén cumpliendo el rol de H2AX. Por el contrario, todos los Apicomplexas tienen H2AZ y
presentan una gran homología entre si. H2AZ de T. gondii presenta una región N-terminal
de mayor longitud, con un mayor número de K, que HuH2AZ y ScH2AZ. En P. falciparum,
H2AZ también presenta una región N-terminal larga y se encuentra hiperacetilada (Trelle
et al. 2009). Todos los residuos modificados de PfH2AZ se encuentran conservados en
TgH2AZ (Figura 3.2.3), lo cual sugiere que lo mismo podría ocurrir en Toxoplasma.
El análisis filogenético de las histonas H2As revela que H2AZ de T. gondii se
agrupa con las H2AZ de otros organismos y no con las otras H2As de Toxoplasma. Esto
indica que esta histona presenta un origen evolutivo único, como era de esperar (Malik
and Henikoff 2003), que siempre se mantuvo diferente al de las otras H2As. Por otro lado,
las histonas H2A1 y H2AX de T. gondii se agrupan junto con las H2A canónicas y H2AX
de otros Apicomplexas. La presencia de H2A1 y H2AX varían mucho en los diversos
organismos y se propone que H2AX podría presentar múltiples orígenes evolutivos (Malik
and Henikoff 2003, Li et al. 2005a), aunque también se piensa que las histonas canónicas
podrían haber surgido de la variante H2AX. Los datos de secuencia obtenidos en
Apicomplexas, incluyendo el motivo AQEF (en vez de SQEF) de Plasmodium spp.
(Sullivan et al. 2006), sugiere esta última opción.
La aparición de esta variante podría estar relacionada con alguna característica
particular de la especie. La principal función de esta histona es mantener la estabilidad
genómica. Plasmodium ssp., Trypanosoma ssp. y Leishmania ssp. no tienen H2AX y se
ha descripto que presentan una gran plasticidad genómica, en los cuales los tamaños de
64
)#$!
ciertos cromosomas varían entre diferentes cepas (Hernandez-Rivas 1996, Henriksson J
1995, Cruz AK 1993). P. falciparum presenta una alta fragilidad en las regiones
teloméricas y subteloméricas, lo cual estaría promoviendo la variación en los genes de
virulencia. Por otro lado, Toxoplasma posee H2AX y no se ha observado que presente
inestabilidad genómica (Frenkel JK 1996). Se podría hipotetizar que los parásitos que
tienen genomas más plásticos no poseen H2AX, mientras que los que presentan un
genoma más estable si. Sería necesario un experimento de deleción génica de h2ax de
T. gondii para corroborar esta hipótesis.
Se obtuvieron anticuerpos específicos para cada una de las H2As, lo cual permitió
la identificación selectiva de cada una de ellas, generando las herramientas
fundamentales para su análisis y caracterización. El uso de los mismos en ensayos de
Western blot de histonas purificadas, reveló que las tres H2As se encuentran presentes
en taquizoitos y H2AZ es la minoritaria, acorde con lo observado en otros organismos
(Wu and Bonner 1981).
Consistentemente con lo observado a nivel de proteína, las tres H2As fueron
amplificadas de ADNc de taquizoitos. Cuando se comparan los niveles de transcripto con
los de bradizoitos obtenidos in vitro se observó un aumento de los niveles de h2a1 y
h2aX, mientras que los niveles de h2aZ se mantienen constantes. Cuando se los
compara con los niveles de transcripto de bradizoitos obtenidos in vivo, solo se observa la
expresión de h2aX y h2aZ. Los parásitos inducidos a bradizoitos, se encuentran
arrestados en fase S tardía-G2 del ciclo celular con un contenido de ADN de 1.8N;
mientras que los bradizoitos de quistes maduros se encuentran en fase G0-G1 con un
contenido de ADN de 1N (Radke et al. 2003). Como consecuencia, estos resultados
indican que h2a1 se expresa en las poblaciones de parásitos que pueden entrar en la
fase S del ciclo celular; lo cual indica la calidad de canónica de esta histona. Por otro
lado, h2aZ y h2aX mantienen los mismos perfiles de expresión en ambos tipos de
bradizoitos, confirmando su calidad de variantes.
Como se mencionó arriba, la expresión de h2aX aumenta en bradizoitos in vitro
(arrestados en fase S tardía-G2) e in vivo (arrestados en G0-G1). Los linfocitos que
carecen de H2AX (H2AX-/-) son incapaces de generar el arresto celular en G2-M después
de que se produce daño en el ADN (Fernandez-Capetillo et al. 2002). Este resultado
sugiere que H2AX es necesaria para que el arresto ocurra en ese momento. Podría ser
que el aumento en la expresión de h2aX en bradizoitos se deba a la necesidad de esta
histona para que los parásitos se diferencien, ya que como vimos, el 85% de los parásitos
que se están diferenciando se encuentran arrestados en S tardía-G2. El aumento de la
expresión de h2ax en bradizoitos es completamente novedoso. Podría ser que esta
65
)#$!
histona sea necesaria para la diferenciación y/o que esté jugando un papel importante en
el mantenimiento del estadio de bradizoito (ver también discusión del capítulo 4).
Empleando un anticuerpo comercial pudimos demostrar la presencia de γH2AX en
el parásito. Si bien el análisis por Western blot sugiere que este anticuerpo está
reconociendo solo a H2AX, sería interesante estudiar si el motivo C-terminal truncado
(SQ) de H2A1 también es capaz de ser fosforilado. La fosforilación de la H2AX se ha
descripto en varios organismos y se encuentra asociada a reparación del ADN (Downs et
al. 2000). Esto también ocurre en Toxoplasma, donde la presencia de H2O2 estimula la
formación de γH2AX en taquizoitos, con un aumento dependiente de la dosis. Sin
embargo esta inducción no ocurre en presencia de MMS, lo cual podría deberse a la
ausencia de DBS. Lundin y colaboradores (Lundin et al. 2005) mostraron fuertes
evidencias de que este agente in vivo causaría fragilidad del ADN frente al calor y no
DSB. Es importante destacar que los taquizoitos extracelulares no tratados presentan
cierto nivel de H2AX fosforilada. O sea que γH2AX además de estar mediando la
reparación del daño producido en el ADN, estaría desempeñando otra función en el
estado basal de los taquizoitos. McManus et al (McManus and Hendzel 2005) propone
que en las células de mamíferos existen dos grupos de γH2AX: uno involucrado en la
reparación del ADN, que forma grandes foci que se localizan preferentemente en
eucromatina, capaz de reclutar proteínas involucradas en la reparación. El otro, forma
pequeños foci, localizados de forma similar en eucromatina y heterocromatina, que no
colocaliza con ningún factor de reparación del ADN y su cantidad relativa se encuentra
asociada al ciclo celular, alcanzando el pico máximo durante la mitosis. Sin embargo, la
función de este aumento en la fosforilación de H2AX asociada a mitosis es desconocida.
Resulta interesante que los niveles de transcripto de h2aX y en menor medida los
de h2a1, aumentan en respuesta al tratamiento con H2O2, lo cual no ocurre con cualquier
otro tipo de estrés como el choque térmico. Esto podría deberse a un estímulo generado
por la necesidad de H2AX para la reparación del ADN, por el estado redox presente
dentro de la célula, o que el daño oxidativo se encuentre estimulando la diferenciación a
bradizoitos. Este es el primer reporte acerca de la inducción en la expresión de estas
histonas en respuesta a situaciones de estrés o diferenciación.
Los ratones mutantes nulos para H2AX presentan un retardo en el crecimiento. Al
analizar fibroblastos embrionarios de estos ratones, se observó que crecen muy poco in
vitro y que esto se debe a una disminución en el número de células en división; de hecho,
el índice mitótico fue del 50% con respecto a las células de ratones salvajes (Celeste et
al. 2002). En Tetrahymena thermophila, la fosforilacicón de H2AX es esencial para que la
meiosis y la mitosis sean normales (Song et al. 2007). Nosotros observamos, en un
66
)#$!
ensayo preliminar, que los taquizoitos que sobreexpresan H2AX (dos de tres clones)
tendrían una mayor velocidad de replicación que los parásitos salvajes. Lo cual estaría de
acuerdo con un rol de esta histona en la división celular. De confirmarse una correlación
entre el incremento de H2AX y la tasa de replicación del parásito, se deberá ahondar en
el mecanismo de acción que ésta presenta durante este proceso biológico. Además,
basados en nuestros resultados, resta estudiar si esta sobreexpresión genera un rol
protector frente a daño del ADN y si estos parásitos que sobreexpresan H2AX poseen
mayor capacidad de diferenciación que los de la cepa salvaje. Es necesario un análisis
exhaustivo de estos parásitos mutantes para entender mejor el rol funcional de esta
variante en T. gondii.
67
Capítulo
4
'
)#$%
/$0
4.1. Introducción
El nucleosoma está compuesto por dos copias de cada una de los cuatro tipos de
histonas: H2A, H2B, H3, and H4 (Luger et al. 1997). H2A y H2B forman dímeros, los
cuales se asocian a ambos extremos de un tetrámero H3-H4. Las histonas H2A y H2B
son notablemente diferentes en parásitos protozoarios que en mamíferos; de forma
contraria a lo que ocurre con H3 y H4, las cuales mantienen sus similitudes a nivel de
secuencia y modificaciones postraduccionales (Alsford and Horn 2004, Sullivan et al.
2006). En general, la región N-terminal de H2AZ en protozoos es más extensa
comparada con la H2AZ de mamíferos. Además, como se mencionó en la discusión del
capítulo 3, en P. falciparum ésta mostró estar acetilada en múltiples lisinas (Trelle et al.
2009) al igual que en T. thermophila (Ren and Gorovsky 2001). Estos dos parámetros
claramente diferencian estas H2AZ de la de sus hospedadores humanos. La H2A
canónica de T. brucei se encuentra peculiarmente hiperacetilada en su región C-terminal
(Janzen et al. 2006) y posee una H2AZ que es esencial para la vida del parásito. TbH2AZ
dimeriza con una H2B variante (TbH2Bv) y estos dímeros se encuentran ausentes de las
regiones transcripcionalmente activas. Esta fue la primera documentación de una H2A
capaz de interaccionar con una H2B no canónica (Lowell et al. 2005). La presencia de
una H2B variante se ha descripto en varios protozoos (Lowell et al. 2005, Miao et al.
2006). Toxoplasma presenta un gen h2bv cuya expresión es igual en taquizoitos que en
bradizoitos, mientras que la canónica presenta una expresión asociada al ciclo celular del
parásito (Capítulo 2). De modo similar, P. falciparum, también presenta la variante H2Bv
cuyos niveles de expresión permanecen invariables a lo largo del ciclo celular (Miao et al.
2006). Recientemente, se observó que PfH2Bv se encuentra acetilada, mientras la H2B
canónica no, sugiriendo que estas dos histonas poseen roles diferentes (Trelle et al.
2009).
Los dímeros H2A-H2B son intercambiados por dímeros H2AZ-H2B mediante la
acción de un complejo remodelador de la cromatina ATP-dependiente de la familia
SWI/SNF (Mizuguchi et al. 2004). La localización genómica de H2AZ en levaduras fue
estudiada por varios grupos (Guillemette et al. 2005, Raisner et al. 2005, Zhang et al.
2005). En todos los casos, observaron que se encuentra preferencialmente en las
regiones promotoras inactivas. Raisner y colaboradores (Raisner et al. 2005) examinaron
la localización de H2AZ a una resolución de mononucleosoma y encontraron una fuerte
preferencia de H2AZ por ser incorporada en los nucleosomas que flanquean la “región
libre de nucleosomas” (Nucleosome free región, NFR). Sin embargo, no encontraron
69
)#$%
/$0
correlación entre promotores activos e inactivos. La región NFR usualmente se encuentra
200 pb río arriba del primer codón e incluye el sitio de iniciación de la transcripción de
casi todos los genes (Yuan et al. 2005). Sin embargo, Millar et al. (Millar et al. 2006)
observó que si bien H2AZ se encuentra preferencialmente asociada a genes reprimidos,
su forma acetilada está enriquecida en promotores de genes activos.
Se conocen muy pocas modificaciones postraduccionales de H2AX, ya que su
estudio se ha focalizado en la función de la fosforilación del motivo C-terminal
característico. Sin embargo, recientemente se describió en células humanas que la
radiación ionizante induce la acetilación de H2AX en K5 (mediada por TIP60), lo cual
permite que la misma sea ubiquitinada y liberada de la cromatina dañada (Ikura et al.
2007). Por otro lado, se describió que el complejo FACT (formado por Spt16 y SSRP1)
facilita la incorporación y la disociación de H2AX de los nucleosomas (Heo et al. 2008).
La distribución genómica de H2AX no ha sido estudiada. La creencia general es que esta
variante se encuentra distribuida de manera homogénea dentro del núcleo, formando foci
discretos según se observa por microscopía 4Pi (Bewersdorf et al. 2006).
Toxoplasma posee tres histonas H2A: H2A1, H2AX y H2AZ y dos histonas H2B:
una canónica H2Ba y una variante H2Bv. Por lo tanto nos propusimos estudiar cómo
interaccionan estas H2As y H2Bs para componer los nucleosomas, analizar el estado de
acetilación de las mismas y/o su proximidad a histonas acetiladas; como también su
localización en el genoma.
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4.2. Resultados
4.2.1 Interacciones entre las histonas H2As y H2Bs
Como se describió previamente, Toxoplasma posee una H2B variante, la cual es
la mayoritaria. Como consecuencia, es posible que este parásito presente arreglos de
nucleosomas novedosos. Con el fin de examinar las interacciones entre las histonas H2A
y H2Bv, se realizaron coinmunoprecipitaciones (coIP) seguidas de Western blot con los
anticuerpos específicos generados en el laboratorio.
Figura 4.2.1. Inmunoprecipitaciones de las histonas H2A y H2Bv. Se realizaron coinmunoprecipitaciones con α-H2Bv (A), α-H2AX (B), α-H2A1 L1 (C) y α-H2AZ (D). El material
inmunoprecipitado con los anticuerpos específicos (IP) y sus sueros preinmunes (Preinm), junto
con el 1% del lisado total (Input, IN) y el 1% del lisado no unido al anticuerpo (NU), fueron
analizados por Western blot con el anticuerpo utilizado para realizar la IP, respectivamente. Al
igual que el mismo anticuerpo unido a la proteína A/G plus (PA+Ac). Las flechas indican las
histonas H2Bv (A), H2AX (B), H2A1 (C) y H2AZ (D) de T. gondii.
Primero se establecieron las condiciones óptimas de inmunoprecipitación para
cada anticuerpo. Se analizó la presencia de la histona en el lisado antes (Input) y
71
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/$0
después (no unido) de la incubación con el anticuerpo, así como también en la fracción
inmunoprecipitada (IP) (Figura 4.2.1). Como control, se utilizaron los anticuerpos unidos a
la proteína A y se realizaron inmunoprecipitaciones usando los sueros preinmunes.
Una vez establecidas estas condiciones, se procedió al estudio de las
interacciones entre histonas. Para analizar la interacción entre ellas dentro del
nucleosoma, los taquizoitos fueron permeabilizados con digitonina y luego tratados con
endonucleasa micrococcal (MNasa), con el fin de obtener una solución con > 95% de
mononucleosomas (Figura 4.2.2A). A continuación se llevaron a cabo las IPs con αH2AX, α-H2AZ y α-H2Bv. Cada una se analizó por Western Blot con los otros dos
anticuerpos y con anti-SAG1 como control de contaminación (Figura 4.2.2B). Se encontró
que H2Bv es capaz de formar dímero con H2AZ, pero no con H2AX. Del mismo modo,
H2AZ dimeriza con H2Bv mientras que H2AX no lo hace (Figura 4.2.2B). A su vez, H2AZ
no coinmunoprecipita con H2AX, por lo que los taquizoitos no poseen nucleosomas
donde uno de los dímeros H2A-H2B contenga H2AX y el otro H2AZ (Figura 4.2.2B).
Figura 4.2.2. Interacción entre
variantes de H2A y H2B. A. Los
taquizoitos fueron lisados con MNasa
(L1, L2 y L3). Un 10% de la muestra
fue utilizado para extraer su ADN y
analizarla por gel de agarosa 1,5% y
visualizada con bromuro de etidio. A
la derecha se observa un marcador
de peso molecular (M). B. Se
realizaron inmunoprecipitaciones (IP)
con los anticuerpos detallados en la
parte superior del panel. Luego fueron
analizadas por Western blot (WB) con
los anticuerpos detallados a la
izquierda del panel. El 1% de lisado
(IN) fue analizado en paralelo para
determinar la presencia de la proteína
en
el
lisado
previo
a
la
inmunoprecipitación.
Los mismos experimentos de coIP también se llevaron a cabo utilizando
taquizoitos sonicados. De este modo, se obtienen fragmentos de ADNg entre 100 y 600
pb (Figura 4.2.3A); los cuales contienen desde 1 a 4 nucleosomas. Como consecuencia,
bajo estas condiciones se analiza lo que ocurre en estos pequeños fragmentos de
cromatina. Se observó que H2AX no coinmunoprecipita con H2AZ ni con H2Bv. Del
72
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mismo modo, H2AZ y H2Bv interaccionan entre si, pero ninguna coinmunoprecipita con
H2AX (Figura 4.2.3B). Indicando que los nucleosomas conteniendo H2Bv-H2AZ no se
encuentran adyacentes a los que contienen H2AX.
Además se analizó la asociación de estas histonas con H2A1, utilizando el
anticuerpo específico α-H2A1 L1. En este caso se observó que todas las variantes
coinmunoprecipitaban con H2A1 (Figura 4.2.3B). Por lo que esta histona canónica se
encuentra presente en las zonas donde están H2Bv-H2AZ como H2AX. Por lo tanto,
podríamos pensar que H2A1 presenta una distribución más homogénea.
*
*
*
*
*
*
Figura 4.2.3. Interacciones entre H2As y H2Bs. A. Análisis de los fragmentos de ADNg
obtenidos luego de la sonicación de los parásitos en gel de agarosa 1%. L1, L2 y L3 son tres
lisados utilizados para realizar inmunoprecipitaciones. M es el marcador de peso molecular 1 kb
plus. B. Se realizaron inmunoprecipitaciones (IP) de lisados obtenidos por sonicado con los
anticuerpos detallados a la izquierda del panel. Luego estos fueron analizados por Western blot
(WB) con los anticuerpos detallados en la parte superior del panel; en cada caso se analizó el
material inmunoprecipitado (IP) y el 1% del lisado (IN). Las flechas indican las bandas
detectadas por cada anticuerpo. (*) indica las bandas correspondientes a la cadena liviana del
anticuerpo utilizado para realizar la IP.
4.2.2 H2As y H2Bv: acetilación y asociación con histonas
acetiladas
Se ha descripto exhaustivamente la localización de histonas acetiladas en la
cromatina activa (Berger 2002). Con el objetivo de determinar si las histonas H2A y H2Bv
se encuentran asociadas a comatina activa, se realizaron dos estrategias diferentes
basadas
en inmunoprecipitaciones con
parásitos
sonicados.
Por un
lado
se
inmunoprecipitaron las histonas, H2AX, H2AZ y H2Bv con sus respectivos anticuerpos
policlonales y los inmunocomplejos se analizaron por Western blot con anti-H3 acetilada
(α-AcH3), la cual se sabe que se encuentra asociada a cromatina activa en T. gondii
73
)#$%
(Saksouk
et
al.
2005,
Gissot
et
al.
/$0
2007).
Las
tres
histonas
variantes
coinmunoprecipitaron con AcH3 (Figura 4.2.4A). Por otro lado, se realizó una
inmunoprecipitación con anti-lisina acetilada (α-LysAc) y se evaluó la presencia de las
H2As y H2Bv en los inmunocomplejos por Western blot, utilizando α-AcH3 como control
positivo. H2AZ, H2A1 y H2Bv se detectan con intensidad similar a la observada para
AcH3; mientras que H2AX requiere un tiempo prolongado de exposición para ser apenas
detectada (Figura 4.2.4B). Si se comparan las intensidades de las bandas, se puede
observar que el porcentaje de H2AZ, H2A1 y H2Bv inmunoprecipitado con respecto al 1%
del lisado (IN) es menor, pero similar a lo observado para AcH3; mientras que el
porcentaje de H2AX es más de diez veces menor (datos no mostrados). Como estas
inmunoprecipitaciones fueron realizadas con cromatina sonicada y más de un
nucleosoma es inmunoprecipitado, podemos concluir que si bien H2AX es capaz de
inmunoprecipitar con AcH3, cuando se analiza el conjunto de histonas acetiladas y/o
cercanas a histonas acetiladas es la minoritaria. Por lo tanto, podríamos decir que sólo
H2AZ y H2Bv muestran una clara asociación con histonas acetiladas y/o se encuentran
acetiladas.
Figura 4.2.4. Relación entre las histonas H2As y H2Bv y la acetilación. Se utilizaron lisados
de taquizoitos generados por sonicación para realizar coinmunoprecipitaciones (IP). A. Se
realizaron IPs con los anticuerpos detallados en la parte superior de la figura. Se analizaron por
Western blot (WB) con los mismos anticuerpos como control de que la IP funcionó correctamente
(CTR) y con anti-H3 acetilada (α-AcH3). B. Se realizó una IP con anti-lisina acetilada (α-AcLys) y
se la analizó por WB con los anticuerpos detallados a la izquierda del panel. En cada caso se
analizó en paralelo el 1% del lisado antes de ser inmunoprecipitado (IN).
74
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/$0
4.2.2 Asociación diferencial de H2A y H2B variantes a genes
activos e inactivos
Nuestros datos indican que H2AX y H2AZ/H2Bv se encuentran en nucleosomas
diferentes y que podrían poseer diferentes niveles de acetilación y/o estar próximas a
histonas acetiladas; ambos marcas de cromatina transcripcionalmente activa, entre otros
roles (Kouzarides 2007). Para analizar lo que ocurre con mayor detalle, se realizaron
experimentos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) como se describe en el
capítulo 6, empleando los anticuerpos α-H2AX, α-H2AZ y α-H2Bv seguidos de PCR en
tiempo real, en un análisis cuantitativo (qPCR). En paralelo se realizaron ChIP-qPCR con
α-AcH3 y α-H4K20me1 (histona H4 monometilada en K20) como controles de
eucromatina y heterocromatina, respectivamente (Saksouk et al. 2005, Sautel et al.
2007). Se utilizaron oligonucleótidos que amplifican en la región promotora de un gen
activo constitutivamente (β-tubulin), de un gen de expresión específica en taquizoito
(sag1) y de dos genes específicos de bradizoitos, los cuales se encuentran reprimidos en
el estadio de taquizoito (ldh2 y bag1). Estos oligonucleótidos fueron diseñados para
amplificar secuencias localizadas 500 - 700 pb río arriba del codón de inicio (ver tabla 3
en capítulo 6). Gissot y colaboradores encontraron que a esa distancia del gen se
observa un enriquecimiento de las histonas modificadas postraduccionalmente (Gissot et
al. 2007).
Si bien H2AX, H2AZ y H2Bv coinmuoprecipitan con todas las regiones genómicas
analizadas, estos estudios indican que H2AX y H4K20me1 se encuentran enriquecidas
en los genes reprimidos ldh2 y bag1 en comparación con los genes activos β-tubulin y
sag1. De forma inversa, H2AZ, H2Bv y AcH3 se encuentran enriquecidas en genes
activos en relación con los inactivos (Figura 4.2.5A). Estos datos sugieren que H2AZ y
H2AX podrían estar regulando el estado de la cromatina de forma opuesta.
4.2.4 H2AX se encuentra asociada a TgIRE, un elemento
repetitivo al extremo de los cromosomas
La asociación de H2AX con promotores inactivos promueve la idea de que esta
histona podría contribuir con regiones genómicas transcripcionalmente reprimidas como
ADN silente. Con el objetivo de identificar regiones libres de genes en Toxoplasma, se
utilizaron elementos repetitivos previamente descriptos para realizar una búsqueda en el
genoma del parásito (ToxoDB). Cuando se realizó la búsqueda con los elementos
75
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/$0
repetitivos sat350 y sat680 (Clemente et al. 2004) se encontraron secuencias poco
conservadas o incompletas (datos no mostrados). En cambio, al utilizar TgIRE
(Echeverria et al. 2000) se encontraron secuencias con alta homología presentes en 9 de
los 14 cromosomas (Figura 4.2.5B). El tamaño de este elemento repetitivo varía entre
cromosomas. En la mayoría de los casos es de aproximadamente 1900 pb, excepto en
los cromosomas IV y V, en los cuales presenta una deleción entre las bases 240/270 y
1402 (datos no mostrados). La búsqueda de productos de expresión dentro de TgIRE en
ToxoDB devolvió cuatro ESTs, que se encuentran sólo en 3 cromosomas. Tres de ellos
(TIGR EST Assemblies: N61085, TC35464 and CK736714) se encuentran en los
cromosomas Ia y XI, mientras que el restante (TIGR EST Assemblies: TC39371) en el
cromosoma X. Sin embargo, ninguno de ellos corresponde a un gen o a una proteína
putativa, ni existen evidencias de péptidos por espectrometría de masa. Teniendo en
cuenta estos resultados in sílico, propusimos a TgIRE como una región silenciada del
ADN. De acuerdo con esta idea, H4K20me1 se encuentra enriquecida en esta región,
mientras que AcH3 está completamente ausente cuando se las analiza por ChIP-qPCR.
En correlación con lo observado previamente, H2AX se encuentra enriquecida en TgIRE
mientras que H2AZ y H2Bv no lo están (Figura 4.2.5A). Estos resultados son consistentes
con la idea de que H2AX es una histona variante que se encuentra asociada con genes o
regiones del genoma silenciadas en T. gondii.
76
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/$0
Figura 4.2.5. Distribución genómica de las variantes H2A y H2B. A. Se realizaron ensayos de
Inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) con los anticuerpos α-H2AX, α-H2AZ y α-H2Bv (gráficos
a la izquierda de la figura). Además, se utilizaron los anticuerpos comerciales α-H4K20me1 y α-AcH3
(gráficos a la derecha de la figura) como controles de heterocromatina y eucromatina,
respectivamente. El ADN inmunoprecipitado fue analizado por qPCR amplificando secuencias río
arriba de los promotores de sag1, β-tubulina (tub), bag1 y ldh2 y dos zonas de TgIRE localizadas a
los 100 pb (IRE100) y 600 pb (IRE 600). B. Representación gráfica de la localización de TgIRE
(casillas blancas) en los cromosomas de T. gondii. Los números romanos indentifican el cromosoma,
mientras que los número cardinales indican la posición de TgIRE en cada cromosoma.
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4.3 Discusión
Al analizar la composición de los nucleosomas de T. gondii, se realizó un hallazgo
interesante: la histona H2AX no es capaz de formar dímeros con H2Bv mientras que la
H2AZ si lo hace. Además, estas dos H2A variantes no se encuentran en el mismo
nucleosoma; indicando que las histonas H2AX y H2AZ/H2Bv tendrían diferentes roles en
la dinámica de la cromatina. Se podría pensar que es lo mismo que ocurre en T. brucei,
donde la H2Bv interacciona con H2AZ pero no con H2A (Lowell et al. 2005), ya que este
parásito no posee H2AX. Como los organismos eucariotas superiores no poseen H2B
variantes, es probable que los parásitos protozoarios presenten un mecanismo de
regulación de la cromatina particular basado en la incorporación de H2AZ y H2Bv en los
nucleosomas.
De acuerdo con la idea de que las variantes de histonas H2A y H2B tendrían
características particulares y diferencias en la modulación de la cromatina, se observó por
ChIP-qPCR que H2AZ, H2AX y H2Bv se encuentran en las regiones río arriba de genes
activos e inactivos; sin embargo, el enriquecimiento de cada una de ellas es diferente. La
H2AX se encuentra enriquecida en genes inactivos como también en regiones genómicas
silentes (TgIRE) mientras que la H2AZ y la H2Bv se encuentran enriquecidos en los
promotores de genes activos. Los estudios de localización genómica de H2AZ realizados
hasta el momento en levadura, revelan que ésta se encuentra asociada preferentemente
a promotores inactivos (Guillemette et al. 2005, Li et al. 2005b, Lowell et al. 2005,
Pattenden et al. 2005, Zhang et al. 2005), a excepción de Raisner et al (Raisner et al.
2005), que no encontró correlación entre la expresión de los genes y la presencia de
H2AZ en sus promotores. Sin embargo, recientemente se publicaron tres estudios, uno
en linfocitos T de humanos (Barski et al. 2007), otro en C. elegans (Whittle et al. 2008) y
el tercero en T. brucei (Siegel et al. 2009), en los que encontraron una correlación
positiva entre la presencia de H2AZ en los promotores y la transcripción de esos genes.
En particular, en T. brucei se observó que H2AZ y H2Bv se encuentran en los mismos
nucleosomas, los cuales fueron detectados en los probables sitios de inicio de la
transcripción por la ARN polimerasa II (transcription start sites, TSS). Además,
observaron que estos nucleosomas son menos estables que los que contienen las
correspondientes histonas canónicas, sugiriendo que tanto H2AZ como H2Bv contribuyen
a una estructura de la cromatina más abierta en los TSS. Estos resultados se
correlacionan con los encontrados en Toxoplasma, donde H2AZ y H2Bv se encuentran
en el mismo nucleosoma y se localizan en regiones activas. Una vez más, en
78
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Tripanosomátidos y Apicomplexas, las variantes H2AZ y H2Bv estarían modulando el
estado de la cromatina a través de un mecanismo novedoso.
En este trabajo se observó también que H2AZ y H2Bv coinmunoprecipitan junto
con AcH3. Esto significa que estas variantes se encuentran interaccionando con AcH3 o
en nucleosomas cercanos. Asimismo, estas histonas inmunoprecipitaron con α-AcLys,
indicando que estas misma podrían estar acetiladas, como se vio en H2AZ y H2Bv de P.
falciparum (Trelle et al. 2009) y/o que están estrechamente relacionadas a histonas
acetiladas. Todos estos datos concuerdan a su vez con el hecho de que se encuentran
enriquecidas en promotores activos.
Por el contrario, H2AX es capaz de coinmunoprecipitar con AcH3, pero el hecho
de que durante la inmunoprecipitación con α-AcLys, la presencia de esta histona fue casi
indetectable, indicaría que no está acetilada ni se encuentra estrechamente asociada con
otras histonas acetiladas. Esto concuerda con el hecho de que H2AX está ligada a
regiones silentes del ADN. La histona H3 acetilada que coinmunoprecipita con H2AX
puede representar a la porción de AcH3 que se encuentra en los bordes del ADN
silenciado o que colocaliza con la pequeña fracción de H2AX que es detectada en las
regiones activas por ChIP.
Sin bien nuestros estudios muestran que H2AZ y H2Bv están fuertemente
asociadas a regiones activas de la cromatina y que H2AX está asociada a regiones
silentes, también muestran que las tres variantes de Toxoplasma se encuentran
localizadas en genes activos e inactivos. Una posible explicación sería que las
modificaciones postraduccionales sean los responsables de estos enriquecimientos. Por
ejemplo, que H2AZ se encuentre acetilada en los promotores activos, como observó
Millar et al en levaduras (Millar et al. 2006), siendo esta forma la más abundante;
mientras que la H2AZ que se encuentra en regiones silenciadas esté monoubiquitinada
como en mamíferos (Sarcinella et al. 2007). Sería interesante realizar diversos
experimentos para determinar las modificaciones postraduccionales de las histonas H2A
y H2B en T. gondii y conocer su contribución al estado de la cromatina.
Un hallazgo de este trabajo que consideramos muy importante es la asignación de
un nuevo rol a H2AX, no relacionado con el daño del ADN, sino como posible modulador
de la cromatina activa. Incluso, se puede ligar este hallazgo al hecho de que durante la
diferenciación a bradizoito se observa un aumento en la expresión de esta histona
variante (Capítulo 3), con su asociación a regiones silenciadas, basados en que los
bradizoitos presentan un mayor número de genes reprimidos (Roos D. comunicación
personal). Esto estaría sugiriendo que H2AX, al menos en este parásito, posee una
función asociada al silenciamiento de la cromatina mucho más extensa que lo observado
79
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en mamíferos; donde γH2AX es necesaria para la inactivación de los cromosomas X e Y
durante la meiosis en machos (Fernandez-Capetillo et al. 2003). Recientemente,
Shechter et al (Shechter et al. 2009) encontró que Xenopus laevis tiene dos tipos de
H2AX, una con el motivo C-terminal SQEY (igual que mamíferos), la cual es la
mayoritaria en adultos y otra SQEF (igual que Toxoplasma) que constituye el 50% del
total de H2A en oocitos y embriones tempranos pero es la minoritaria en estadios
maduros. Los autores proponen que esta isoforma estaría involucrada en modular la
respuesta celular frente a la rapidez de los ciclos celulares que ocurren de forma
temprana durante el desarrollo. Es interesante destacar que esta H2AX-SQEF se
encuentra fosforilada en células en activa replicación y que esta fosforilación más que
estar asociada al ciclo celular estaría ligada a rearreglos en la cromatina. Por otro lado,
en mamíferos se observó que la tirosina (Y) de H2AX-SQEY es capaz de ser fosforilada y
estaría regulando la fosforilación de la serina (S) durante la reparación del daño del ADN
(Xiao A 2009). Como la fenilalanina (F) no es un aa. fosforilable, este mecanismo no
puede tener lugar para el caso de H2AX-SQEF. Nos preguntamos si H2AX-SQEY es más
importante en el buen control de la reparación del ADN, mientras que H2AX-SQEF lo es
durante el desarrollo. Si fuera así, hasta podría plantearse que estos dos motivos
funcionan como plataformas alternativas para el ensamblado de una maquinaria
modeladora de cromatina específica para cada contexto; y que en los distintos
organismos H2AX ha evolucionado en base a las necesidades de cada uno. Dado que
todos estos hallazgos son muy recientes, suponemos que en los próximos años se irán
dilucidando estos cuestionamientos, donde esperamos que T. gondii, como modelo
protozoario, pueda aportar datos interesantes al respecto.
En el afán de encontrar regiones silenciadas en T. gondii, analizamos en detalle a
TgIRE, secuencia repetitiva previamente descripta en el laboratorio (Echeverria et al.
2005). Un análisis más exhaustivo mostró que se encuentra formando parte de una
región que comprende entre 10 a 30 kpb, la cual presenta sintenia entre los 9
cromosomas que presentan este elemento. A esta región la denominamos región
conservada en el extremo cromosómico (ChCER, por “chromosome conserved end
region”). Tanto en P. falciparum como en Trypanosoma ssp. se han descripto regiones
subteloméricas, donde se encuentran los genes var y VSG respectivamente, los cuales
son responsables de la variación antigénica de estos parásitos (Van der Ploeg 1991,
Figueiredo et al. 2000). En P. falciparum, se encuentran compuestas por elementos
repetitivos y son las responsables de que los telómeros formen clusters en la región
periférica del núcleo, lo cual favorece los rearreglos entre los genes var (Figueiredo et al.
2002). Por otro lado, en T. brucei se observó que éstas secuencias están enriquecidas en
80
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/$0
una variante específica de la histona H3, H3V (Lowell and Cross 2004). Toxoplasma no
posee genes homólogos a los genes var o VSG; por lo que esta región conservada sólo
en uno de los extremos de ciertos cromosomas es sumamente llamativa y poco común.
Nosotros proponemos que ChCER podría tener arreglos de nucleosomas particulares y
una función importante en el anclaje de estos cromosomas durante algún mecanismo de
regulación celular, como podría ser la replicación del parásito. Actualmente se están
encarando estudios para dar luz a estas preguntas.
81
Capítulo
5
)
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)
El conocimiento acerca de las histonas es esencial para comprender cómo la
transcripción, la replicación y otros procesos celulares operan en T. gondii. Nosotros
estudiamos las histonas H2A y H2B, que no habían sido estudiadas hasta el momento en
este parásito.
5.1. T. gondii tiene una H2B canónica y una H2B variante
Observamos que este parásito contiene tres H2Bs en su genoma: H2Ba, H2Bb y
H2Bv, sin embargo H2Bb no se expresa en taquizoito ni bradizoito. Los niveles de
transcripto de H2Ba son menores que los de H2Bv en taquizoitos y estos niveles
disminuyen aún más en el estadio de bradizoito (arrestado en G0); indicando por esto
último que es una histona canónica. En cambio, los niveles de transcripto como los de
proteína de H2Bv permanecen constantes en los dos estadios, confirmando su calidad de
variante. En correlación con la hipótesis de que H2Bv es la H2B mayoritaria, fue la única
H2B detectada por espectrometría de masa de histonas purificadas. El análisis
filogenético (Neighbor joining) de las histonas H2B muestra que se agrupan en dos linajes
diferentes: uno conteniendo las H2B canónicas y el otro la H2B variante (H2Bv). Estos
dos clados se encuentran en todos los parásitos del phylum Apicomplexa analizados
(también ver (Sullivan et al. 2006)), sugiriendo que la duplicación de este gen ocurrió
previamente a la divergencia del phylum . Además, las H2B variantes parecen ser más
conservadas que las H2B canónicas, indicando diferentes tasas de evolución de estos
genes.
5.2. T. gondii tiene una H2A canónica y dos H2As variantes: H2AX y
H2AZ
Por otro lado, observamos que T. gondii presenta tres H2A en su genoma: H2A1,
H2AZ y H2AX; las cuales se transcriben y traducen en taquizoitos. H2A1 es una histona
canónica con una expresión asociada a la fase S del ciclo celular, ya que sus niveles en
bradizoitos maduros son indetectables. H2AZ es la histona H2A minoritaria y su
expresión a nivel de mRNA no se ve afectada por la diferenciación a bradizoito, ni por la
presencia de estrés oxidativo o alquilante. Los niveles de ARNm de h2aX son mayores en
bradizoitos que en taquizoitos, confirmando su calidad de variante. H2AX se encuentra
fosforilada en el motivo característico C-terminal y la fosforilación se incrementa en
presencia de H2O2. Esto indica que la fosforilación de H2AX frente a daño del ADN se
encuentra conservada en este parásito. Además, su sobreexpresión provoca una mayor
83
)#$1
)
velocidad de replicación, lo cual estaría dando un indicio a cerca de su función en el
parásito; aunque hacen falta mayor número de estudios para esclarecer el rol que
desempeña.
5.3. La expresión de H2AX se incrementa ante estrés oxidativo y
durante la diferenciación
Hasta la fecha no hay datos que muestren que existiría una regulación de la
expresión de h2aX. En T. gondii, esta histona aumenta su expresión en bradizoitos y
frente a estrés oxidativo, pero permanece invariable durante estrés térmico; indicando
que no se sobreexpresa ante cualquier tipo de estrés.
5.4.
Las
variantes
H2Bv,
H2AZ
y
H2AX
componen
distintos
nucleosomas y participan diferencialmente en la modulación de la
cromatina activa
La presencia de variantes H2A y H2B le confiere al parásito la posibilidad de
presentar nucleosomas especializados: H2AZ dimeriza con H2Bv, pero esta última no lo
hace con H2AX, al mismo tiempo que H2AX no está presente en el mismo nucleosoma
que H2AZ. La formación de dímeros H2A-H2B para formar los nucleosomas no es
aleatoria. Toxoplasma estaría regulando ciertos procesos celulares a través de un
mecanismo epigenético basado en la dimerización de H2Bv con H2AZ y no con H2AX,
donde H2Bv y H2AZ se encuentran enriquecidos en los promotores de genes activos. Por
otro lado, H2AX está predominantemente en cromatina silenciada y sus niveles de
transcripto aumentan considerablemente en bradizoitos, los cuales se espera que tengan
mayor número de genes silenciados. Se podría pensar en un mecanismo epigenético
diferente, basado en que H2AX estaría involucrada en el silenciamiento de genes y por lo
tanto en la diferenciación del parásito. Sería muy interesante dilucidar si el aumento de
H2AX estimula el silenciamiento de genes y la diferenciación a bradizoito o si la
diferenciación a bradizoito estimula la sobreexpresión de H2AX para poder silenciar
varios genes.
5.5. Modelo propuesto
Basados en los resultados obtenidos proponemos el siguiente modelo: los
dímeros H2AZ-H2Bv se encuentran regulando de algún modo la transcripción de genes;
84
)#$1
)
están asociadas a AcH3 y es probable que ellas también se encuentren acetiladas. Por
otro lado, H2AX es importante para el silenciamiento de genes; encontrándose
enriquecida en las mismas regiones que H4K20me1. Todas las funciones que se le han
adjudicado a H2AX se encuentran relacionadas con su forma fosforilada, podría ser que
en este caso también se encuentre fosforilada. En todos los casos vimos que si bien hay
un claro enriquecimiento de H2AZ-H2Bv en promotores activos y de H2AX en promotores
inactivos o zonas silenciadas, las tres se encuentran presentes en todas las regiones.
Esto podría estar dado por modificaciones postraduccionales particulares para cada caso,
aún no descriptas.
Figura 5.1. Modelo propuesto. Composición nucleosomal de los promotores en T. gondii.
85
Capítulo
6
*
)#$&
*
6.1. Cultivo de parásitos
T. gondii comprende una población clonal compuesta por tres genotipos diferentes
denominados tipo I, tipo II y tipo III. Estas poseen un alto grado de similitudes
morfológicas, antigénicas y moleculares. Sin embargo, las cepas tipo I (como RH y CT1)
son altamente virulentas, que en baja cantidad inducen la muerte de ratones SwissWebster durante la fase aguda de la infección. Mientras que las cepas tipo II (como ME49
y PRU) y III (como COUG y VEG) poseen una virulencia relativa y permiten que se
establezca una infección crónica.
Los experimentos fueron realizados utilizando tres cepas diferentes de T. gondii:
RHΔuprt, RHΔhxgprt (tipo I) y PK (tipo II). Para la obtención de taquizoitos todas las
cepas fueron cultivados in vitro en condiciones estándar: se infectaron células HFF
(“Human Foreskin Fibroblast”- fibroblastos humanos de prepucio) en monocapa y se
incubaron con medio DMEM (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB)
a 37°C y 5% de CO2.
Los parásitos RHΔhxgprt son deficientes en la enzima hipoxantina xantina guanina
fosforibosil transferasa. Esta enzima permite seleccionar positiva y/o negativamente los
parásitos (ver sección “Sobreexpresión de proteínas en Toxoplasma” y (Donald et al.
1996)).
Para la obtención de bradizoitos se utilizaron dos sistemas diferentes, uno in vitro
y el otro in vivo.
In vitro: Se utilizaron parásitos RH knock-out para la enzima uracil fosfo-ribosil
transferasa (RHΔuprt), la cual normalmente cataliza la formación de UMP (uridina
monofosfato) a partir de uracilo. Esta cepa mutante se obtuvo a partir de parásitos
RHΔhxgprt. Esta enzima no es esencial ya que Toxoplasma contiene la vía de síntesis de
novo de pirimidinas. Sin embargo, como el CO2 es necesario para que esta vía pueda
ocurrir, cuando se los cultiva en ausencia de CO2 presentan un crecimiento más lento y
una frecuencia de diferenciación 3-4 veces mayor (Bohne and Roos 1997). Se infectaron
células HFF en monocapa (1 parásito/célula), se incubaron 10 min en hielo y luego 1 h en
condiciones estándar de cultivo de taquizoitos para facilitar la invasión. A continuación se
incubaron en condiciones de bradizoito: en medio MEM o RPMI (Gibco) suplementado
con 5% de SFB y 25mM HEPES a pH 8,1 en concentraciones de CO2 ambiente (0,03%).
Al cabo de 4 días, se levantó la monocapa y se pasó las suspensión por una aguja 27G
con el fin de romper la pared de los quistes y liberar los bradizoitos. El porcentaje de
bradizoitos fue analizado por inmunofluorescencia indirecta (IFA) utilizando la lectina de
87
)#$&
*
Dolichos biflorus (Boothroyd et al., 1997) que tiñe la pared del quiste y con α-BAG1
(bradizoyte antigen 1) que se encuentra en citoplasma de bradizoitos.
In vivo: Se utilizaron parásitos PK, los cuáles son un clon derivado de la cepa Me49
(tipo II). Se extrajeron cerebros de ratones C3H un mes post-infección via oral y se
homogeneizaron en 1 ml de tampón fosfato (PBS). Mediante una centrifugación a 1800
rpm con Dextran 30% (Sigma) en PBS, se obtuvo una fracción enriquecida en quistes.
Estos fueron visualizados y contados al microscopio óptico.
Los taquizoitos y bradizoitos obtenidos de cultivos in vitro fueron purificados de los
restos celulares al ser pasados por un filtro de 3 mm de poro (Nucleopore).
6.2. Análisis de secuencia
Las búsquedas en base de datos, el análisis de comparación de secuencias y el
análisis de los dominios putativos se realizaron utilizando los programas Blastn, Blastx,
Blast 2 y Blast domain (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast). Las histonas H2A y H2B de
Toxoplasma se identificaron realizando Blast con las secuencias de histonas descriptas
para otros organismos en la base de datos de T. gondii: http://ToxoDB.org. La
localización de las mismas en los cromosomas se analizó con Genome Browser de la
misma base de datos. Los alineamientos y análisis de secuencia se realizaron con el
programa Bioedit. Las estructuras secundarias se determinaron utilizando herramientas
que se encuentran en http://toolkit.tuebingen.mpg.de/sections/secstruct.
6.3. Análisis de Neighbor joining
Se realizó un análisis de Neighbor joining (NJ) de la secuencia aminoacídica
deducida de histonas H2A y H2B de T. gondii y otras histonas previamente descriptas
utilizando el programa MEGA4 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis Software
version 4) como describe Tamura et al (Tamura et al. 2007). El soporte interno de las
ramas se obtuvo mediante la opción bootstrap (búsqueda heurística) usando 1000
repeticiones.
Las secuencias utilizadas para realizar el árbol de NJ de histonas H2B fueron: Pf:
Plasmodium falciparum (AN: BU497652 y U14734), Pv: Plasmodium vivax (AN:
CAA76839) Et: Eimeria tenella (AN: CD345163 y CD569058), Nc: Neospora caninun (AN:
CF598462 y CF937965), Sn: Sarcocystis neuron (AN: CV193312 y CV194457), Ch:
Cryptosporidium hominis (AN: XP_666723 y XP_666188). hTSH2B: human testis/sperm
specific H2B (AN: AP397301).
88
)#$&
*
Por otro lado, las secuencias utilizadas para realizar el árbol de NJ de histonas
H2A fueron: At, Arabidopsis thaliana (AN: AAL85051 y BAF00012), Dm, Drosophila
melanogaster (AN: AAN11125 y AAF56631), Gl, Giardia lamblia (AN: AF139873); Hu,
human (AN: AAN59958, P16104 y CAG33696), Pf, Plasmodium falciparum (AN: P40282
y CAB39069); Pyy, Plasmodium yoelii yoelii (AN: CAQ40903 y EAA15833); Sc,
Saccharomyces cerevisiae (AN: P04909, P04910 y Q12692), Tg, Toxoplasma gondii, Tt,
Tetrahymena thermophilus (AN: AAC37292, AAC37291 y CAA33554), Xl, Xenopus laevis
(AN: AAA49769, AAH74188 y AAH74203).
6.4. Amplificación y clonado de las diferentes histonas
Con el objetivo de amplificar y clonar los genes de las diferentes histonas H2A y
H2B de T. gondii se realizaron ensayos PCR, utilizando como templado ADNg y ADNc.
Para ello se colectaron taquizoitos RH frescos que rápidamente se solubilizaron en
TRIzol (Invitrogen Life Technologies). Siguiendo las instrucciones del fabricante se extrajo
ADNg y ARN. El ADNc se obtuvo mediante transcripción en forma reversa de 2 μg del
ARN utilizando la enzima MMLV (InvitrogenTM, Life Technologies) y oligo(dT)12-18.
La secuencia codificante (CDS) de cada una de las histonas fue amplificada
utilizando oligonucleótidos específicos: H2Ba (H2Ba F- H2Ba R), H2Bb (H2Bb F- H2Bb
R), H2A1 (H2A1 F- H2A1 R), H2AX (H2AX F- H2AX R) y H2AZ (H2AZ F- H2AZ R) (Tabla
1). Cada una de las reacciones se llevó a cabo en un volumen final de 20 μl, conteniendo
0,05 U/μl de Taq DNA polymerasa (Promega), 1,6 mM MgCl2, 200 μM de dNTP, 100 pM
de cada oligonucleótido específico y 1 ȝl de templado. Las condiciones de las PCRs
fueron las siguientes: 1 ciclo de desnaturalización: 5 min a 95ºC, 35 ciclos de
amplificación que incluían: desnaturalización a 94ºC por 35 seg, apareamiento a la
temperatura óptima determinada para cada par de oligonucleótidos (Tabla 1) por 45 seg y
polimerización a 72ºC por 45 seg; seguidos de un último paso de elongación a 72ºC por
10 min. Las amplificaciones resultantes se visualizaron por electroforesis en gel de
agarosa 1% con bromuro de etidio. Los amplicones de tamaño esperado fueron extraídos
del gel con el kit Qiaex II (Qiagen). Cada uno de los productos de PCR purificado fue
clonado en el vector bacteriano pGEM®-T Easy (Promega) siguiendo los protocolos
suministrados. Finalmente, se transformaron bacterias E. coli (XL1-Blue) termocompetentes y se crecieron en placas de LB-Agar conteniendo Ampicilina y X-Gal/IPTG.
Las colonias blancas fueron picadas y crecidas en medio líquido LB/ampicilina. El ADN
plasmídico fue extraído empleando el método de lisis alcalina y posteriormente
secuenciado. Las secuencias obtenidas fueron publicadas en GenBank: H2Ba (AN:
89
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*
DQ118972), H2Bv (AN: AF406555), H2A1 (AY573602), H2AX (AY631392) y H2AZ
(AF502246).
Table1. Oligonucleótidos utilizados en clonado y expresión de las histonas.
Ta (°C) Descripción
Producto
(pb desde el
ATG)
Nombre
Secuencia
H2Ba F
H2Ba R
5’-GGATCCATGGTGGCCAAGAAGTCC
5’-GGTACCGAAGTGTAAACTGCCGAGAC
68
CDS de h2ba
1 a 446
H2Bb F
H2Bb R
5’-GGATCCATGGTGGCCAAGAAGTCC
5’-GGTACCTCCATTGCAAAGCTGCCGAG
56
CDS de h2bb
1 a 407
H2Bv F
H2Bv R
5’-GGATCCATGTCAGGGAAAGGTCCG
5’-GGTACCCTATGCACCAGAAGTCGT
64
CDS de h2bv
1 a 372
H2A1 F
H2A1 R
5’-GGATCCATGTCGGCCAAAGGCAAGG
5’-GGTACCTTACTGAGACTTCTTGCCCTTG
58
CDS de h2a1
1 a 390
H2AX F
H2AX R
5’-GGATCCATGTCCGCCAAAGGTGCAGG
5’-GGTACCCACCAGACAGAATGGCTATCCT
58
CDS de h2aX
1 a 663
H2AZ F
H2AZ R
5’-GGATCCATGGACGGAGCTGCAAAGT
5’-AAGCTTGAGCGACTTCTCGTGGAAAG
64
CDS de h2aZ
1 a 511
αTUB F
αTUB R
5’-GAGCTCTTCTGCCTGGAA
5’-ATTTGGAGCCCACCGTCG
60
CDS de α-tubulina
64 a 223
qRT-H2A1 F
qRT-H2A1 R
5’-AGGACGATGCAGCACACAAC
5’-CCATTAAAAGCCGCTTACGG
3’UTR de h2a1
622 a 715
qRT-H2AX F
qRT-H2AX R
5’-CCCGCCTTTTAGGCTTCACT
5’-TGGTGAATTCGGCTCTTTGG
3’UTR de h2aX
615 a 708
qRT-H2AZ F
qRT-H2AZ R
5’-TCTGGAGGGACAAACATGGG
5’-AAAAAACACGCACCTGACCC
3’UTR de h2aZ
581 a 674
qRT-TUB F
qRT-TUB R
5’-ATGTTCCGTGGTCGCATGT
5’-TGGGAATCCACTGAACGAAGT
CDS de β-tubulina
945 a 1039
CDS de bag1
536 a 630
5’-ACAATGGCCCAGGCATTCT
5’-CAATAAACATATCGTGAAGCCCATA
CDS de ldh2
750 a 844
5’-TTAAGTGAGAACCCGTGGCAG
5’-GCTTTTTGACTCGGCTGGAA
CDS de sag1
696 a 789
qRT-BAG1 F 5’-TGAGCGAGTGTCCGGTTATTT
qRT-BAG1 R 5’-TAGAACGCCGTTGTCCATTG
qRT-LDH2 F
qRT-LDH2 R
qRT-SAG1 F
qRT-SAG1 R
Ta: temperatura de apareamiento. qRT: RT-PCR en tiempo real. F: sentido. R: antisentido.
GGATCC: secuencia reconocida por BamHI. GGTACC: secuencia reconocida por KpnI. AAGCTT:
secuencia reconocida por HindIII.
6.5. Análisis de expresión
H2Bs – La expresión de las 3 histonas H2B en taquizoitos y bradizoitos fue
analizada por ensayos de RT-PCR semicuantitativa. Las reacciones de amplificación por
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*
PCR se llevaron a cabo utilizando ADNg y ADNc de taquizoitos y bradizoitos in vivo como
templado en las mismas condiciones de reacción anteriormente descriptas. Los
oligonucleótidos utilizados fueron: H2Ba F y R, H2Bb F y R y H2Bv F y R (Tabla 1). Se
preparó un tubo de reacción con 120 μl para cada una de las histonas H2B y se los
alicuotó en 6 tubos que fueron tomados a los 22, 25, 27, 28, 30 y 33 ciclos. Por un lado,
se analizó la expresión relativa de cada uno de estos genes en taquizoitos comparando
las curvas de amplificación de ADNc con respecto a ADNg, teniendo en consideración
que existe una única copia de cada uno de estos genes en el genoma. Por otro lado, se
compararon los niveles de ARN mensajero de cada histona en taquizoitos con respecto a
bradizoitos. En este caso se tomaron las muestras a los números de ciclos
correspondientes a la fase lineal de la curva de amplificación en taquizoitos. Para
asegurar que iguales cantidades de ADNc de cada estadio fue comparado, se utilizaron
oligonucleótidos que amplifican α-tubulina de T. gondii (Tabla 1) como control. Todos los
productos de PCR fueron resueltos en un gel de agarosa 1,5 % y teñido sumergiendo el
mismo en una solución de bromuro de etidio 1 %, para eliminar variaciones en el teñido
de los geles. Finalmente, las imágenes fueron capturadas y digitalizadas para analizar la
intensidad de las bandas con el programa “Gel-Pro analyzer” (Media Cybernetics). Estos
experimentos fueron realizados por triplicado. El análisis estadístico fue llevado a cabo
con el programa Prism4 version 3.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Como
control negativo se llevaron a cabo PCRs con cada par de oligonucleótidos utilizando
como templado ADNc de células HFF sin infectar y de cerebro de ratón.
H2As – La expresión de las histonas H2A se analizó y comparó en taquizoitos y
bradizoitos in vivo e in vitro. En el primer caso (in vivo), se realizó mediante ensayos de
RT-PCR semicuantitativa como se describió para H2B, utilizando los oligonucleótidos
H2A1 F y R, H2AX F y R y H2AZ F y R (Tabla 1). Mientras que para taquizoitos y
bradizoitos in vitro, se realizó por PCR en tiempo real (qRT-PCR). En este último caso, el
ARN total de cada uno de los estadios fue extraído utilizando RNAeasy Mini Kit (Qiagen).
El ADNc se obtuvo por transcripción en forma reversa de 2 μg de ARN utilizando
Omniscript RT Kit (Qiagen), siguiendo las indicaciones del fabricante. Las reacciones de
amplificación se llevaron a cabo en un volumen final de 25 μl conteniendo SYBR Green
PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA), 0,5 μM de cada oligonucleótido específico y 1
μl de una dilución 1:10 del ADNc. Los oligonucleótidos utilizados para amplificar las
histonas fueron diseñados en la región 3’ UTR de cada gen para evitar reacción cruzada
entre ellas: H2A1 (qRT-H2A1 F - qRT-H2A1 R), H2AX (qRT-H2AX F- qRT-H2AX R) y
H2AZ (qRT-H2AZ F- qRT-H2AZ R). Como control interno se utilizó β-tubulina (qRT-TUB
91
)#$&
*
F- qRT-TUB R). Como control de la eficiencia de diferenciación se analizaron los niveles
de bag1 (qRT-BAG1 F- qRT-BAG1 R) y ldh2 (qRT-LDH2 F- qRT-LDH2 R) que se
expresan específicamente en bradizoito y sag1 (qRT-SAG1 F- qRT-SAG1 R) que es un
gen específico de taquizoito. La secuencia de cada uno de los oligonucleótidos se
encuentran en la tabla 1. Todas las reacciones se realizaron por triplicado en el ciclador
7500 Real-time PCR system y los datos se analizaron con el programa SDS software
versión 1.2.1 (Applied Biosystems, CA). Los niveles de ARNm de cada gen (medidos
como CT) fueron normalizados a los niveles de β-tubulina y calibrados con respecto a los
niveles en taquizoitos (2-ΔΔCT). Se realizó una curva de disociación para cada par de
oligonucleótidos, confirmando que éstos amplificaban un único producto. Además, las
reacciones de PCR se visualizaron en gel de agarosa 3% corroborando la presencia de
un único amplicon. Se graficó el log2(2-ΔΔCT) para cada uno de los genes amplificados.
6.6. Expresión y purificación de las histonas recombinantes
La secuencia codificante de cada una de las histonas H2A y H2B fueron liberadas
del vector de clonado (pGEM-T) en el cual se encuentran con las enzimas de restricción
incluidas en los oligonucleótidos específicos. Las CDSs de H2Bv y H2AZ se clonaron en
los sitios BamHI/KpnI y BamHI/HindIII del plásmido pQE30 (Qiagen), respectivamente y
se transformaron bacterias E. coli M15. Mientras que las CDSs de H2Ba, H2AX y H2A1
fueron clonadas entre los sitios BamHI y KpnI del vector de expresión PRSET-A
(Invitrogen Life Technologies), con los cuales se transformaron E. coli BL21pLys. Ambos
plásmidos permiten la expresión de proteínas recombinantes fusionadas a una cola de
poli-histidinas en su región N-terminal. Las histonas se expresaron como proteínas
recombinantes mediante el cultivo bacteriano en medio líquido LB (Luria-Bertoni). Cuando
el crecimiento presentó OD(λ=600) = 0,6, se realizó la inducción con IPTG (0,1 mM) en
agitación a 30°C toda la noche (o.n.). Las proteínas fueron purificadas utilizando columna
de niquel (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Por otro lado, se amplificaron por PCR los primeros 120 nucleótidos de la CDS,
correspondientes a la región N-terminal de H2AZ (H2AZ-Nt). Se utilizó el oligonucleótido
sentido H2AZ F (Tabla 1) y el antisentido H2AZ-Nt (5’-GTCGACAAGAGGAGCCTTCTTGCC).
La secuencia resultante fue clonada en los sitios BamHI y SalI del vector pGEX-4T-1
(Invitrogen Life Technologies), río abajo y en fase con la proteína GST (glutatión Stransferasa) de Schistosoma japonicum. La proteína recombinante se expresó en E. coli
BL21pLys del mismo modo antes descripto. Luego fue purificada con una columna de
Glutatión-agarosa (Amersham bioscience) como indican las instrucciones del fabricante.
92
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6.7. Producción de anticuerpos
Con el objeto de obtener anticuerpos específicos para cada una de las histonas
H2A y H2B, se inmunizaron conejos y ratones con las proteínas recombinantes. Las
correspondientes a H2Bv, H2AZ y H2AX (rH2Bv, rH2AZ y rH2AX respectivamente) fueron
utilizadas para inmunizar conejos, mientras que rH2Ba, rH2A1 y rH2AZ-Nt fueron
utilizadas para inmunizar ratones. En todos los casos se tomaron muestras de sangre de
los animales previo a su inmunización, con el fin de obtener los sueros preinmunes.
Los conejos fueron inmunizados con 300 μg de cada proteína recombinante
emulsionada con adyuvante de Freund completo (Sigma). Tres dosis adicionales fueron
administradas cada 15 días con la misma cantidad de proteína recombinante y adyuvante
de Freund incompleto (Sigma).
Los ratones fueron inmunizados con 10 μg de cada proteína recombinante
emulsionada con adyuvante de Freund completo (Sigma). Tres dosis adicionales fueron
administradas cada 15 días con la misma cantidad de proteína recombinante y adyuvante
de Freund incompleto (Sigma). Para el caso de H2AZ-Nt se utilizaron 100 μg, lo cual es
un estimativo correspondiente a 10 μg del péptido, teniendo en cuenta su tamaño en
relación al tamaño de la GST.
Para el caso de H2A1 se obtuvieron dos lotes de anticuerpo: anti-H2A1 L1 (αH2A1 L1) altamente específico y anti-H2A1 L2 (α-H2A1 L2), producto de mayor número
de inmunizaciones, el cual presenta reacción cruzada con H2AX.
6.8. Purificación de histonas
Se colectaron taquizoitos frescos de un T-75 y se lisaron con en una solución que
contenía: Hepes 20 mM, NaCl 100 mM, NaF 50 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 1%,
deoxicolato de sodio 1 % e inhibidores de proteasas, por 10 min en hielo. Se
centrifugaron a 10.000 x g por 10 min. El precipitado se resuspendió en 1 ml de agua y se
agregaron luego 22 μl de H2SO4 concentrado y se incubaron como mínimo 1 hora en
hielo para extraer en forma ácida las histonas. Estas se precipitaron con 10 volúmenes de
acetona y resuspendieron en 60 μl de solución de siembra correspondiente a los geles a
utilizar.
93
)#$&
*
6.9. Análisis de histonas purificadas por TAU-PAGE y MALDITOF-TOF.
Las histonas purificadas fueron separadas por electroforesis en gel de
poliacrilamida conteniendo Triton, ácido acético y urea (TAU-PAGE). Esta técnica separa
proteínas por carga y masa; lo cual permite diferenciar proteínas con pesos moleculares
muy similares y/o modificaciones postraduccionales de las mismas. El gel separador
contiene: acrilamida 12 %, bis-acrilamida 0,32 %, urea 8 M y Triton X-100 10 mM. El gel
de apilamiento contiene: acrilamida 3,9 %, bis-acrilamida 0,2 % y urea 8 M. La
polimerización de los mismos se llevó a cabo con riboflavina y TEMED en presencia de
luz. Las histonas extraídas de taquizoitos crecidos en un frasco T-75 se resuspendieron
en solución de siembra TAU-PAGE (urea 8 M, β-mercaptoetanol 5 %, ácido acético
glacial 6 % y una pizca de Pyronin Y que es un colorante ácido rosado) y se separaron
por TAU-PAGE utilizando como tampón de corrida Glicina 0,1 M y ácido acético glacial 1
M. El gel resultante fue teñido con Coomassie blue y teniendo en cuenta los cuidados
necesarios al realizar espectrometría de masa, se seleccionaron y cortaron diferentes
bandas. Estas fueron digeridas con tripsina y enviadas al laboratorio de Ulf Hellman
(Uppsala University, Suecia) donde fueron analizadas por “ Matrix Assisted Laser
Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry” (MALDI-ToF-MS) utilizando
Ultraflex TOF/TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). La identificación de las
proteínas se realizó con el programa “ProFound search engine” y la base de datos
NCBInr. Cuando se determinó necesario o importante, ciertos péptidos fueron
secuenciados por Post Source Decay (PSD) (Hellman and Bhikhabhai 2002).
Las histonas separadas por TAU-PAGE, también fueron analizadas por ensayos
de Western blot (ver a continuación). En este caso los geles fueron lavados repetidas
veces con agua y luego transferidos como si fueran geles de SDS-PAGE.
6.10. Análisis de Western Blot
Se
utilizaron
ensayos
de
Western
blot
(WB)
para
analizar
proteínas
recombinantes, extractos proteicos de taquizoitos, bradizoitos o células HFF (control
negativo) e histonas purificadas. Las muestras fueron preparadas de la siguiente manera:
Proteínas recombinantes: se cuantificaron por Bradford o absorbancia a λ=280 nm
y se resuspendieron en solución de siembra SDS-PAGE en una concentración final de 1
μg/10 μl.
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*
Parásitos y células: se colectaron y centrifugaron por 10 min a 2000 rpm. Se
lavaron con PBS y se resuspendieron 1x107 parásitos cada 20 μl de solución de siembra
SDS-PAGE. Las muestras se hirvieron por 10 min.
Histonas purificadas: las histonas purificadas por extracción ácida de taquizoitos
provenientes de un T-75, se resuspendieron en 60 μl de solución de siembra SDS-PAGE.
Para ello se utilizó una solución de siembra SDS-PAGE 5x; la cual contiene TrisHCl (pH 6,8) 60 mM, glicerol 25%, SDS 2%, 2β-mercapto etanol 2 ml y azul de
bromofenol 0,1%.
Veinte microlitros de las muestras así preparadas fueron sembradas por calle y
separadas por electroforesis en geles de poliacrilamida conteniendo SDS (SDS-PAGE)
bajo condiciones reductoras, según se describe en (Sambrook and Russell 2001). Luego
fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa o PVDF (poliviniliedeno fluoruro).
Previo a iniciar el ensayo de WB, las membranas fueron teñidas con rojo Ponceau para
corroborar la correcta transferencia de las proteínas. Luego se bloquearon los sitios de
pegado inespecífico incubando las membranas en solución tampón Tris-salino (TBS: 100
mM Tris-HCl, 0,9% NaCl, pH 7,5) suplementado con 0,05% Tween-20 y leche
descremada 5% (TBS-T-L). Posteriormente, las membranas fueron incubadas 1 h a
temperatura ambiente con el anticuerpo policlonal específico diluido en TBS-T-L a las
diluciones establecidas en la Tabla 2. Después de que las membranas fueron lavadas
con TBS-T tres veces por 5 min, se incubaron con los correspondientes anticuerpos
secundarios diluido en TBS-T-L por 1 h a temperatura ambiente. A continuación se
lavaron con TBS-T tres veces por 5 min, procediendo finalmente con el revelado del
mismo. Dos sistemas diferentes fueron utilizados: uno en el que se utilizaron anticuerpos
secundarios de cabra anti-ratón/conejo conjugados con fosfatasa alcalina (Sigma;
1/30.000) y revelados con NBT-BCIP (Promega). Y el otro, en el que los anticuerpos de
cabra anti-ratón/conejo se encontraban conjugados con peroxidasa de rabanito (1/4.000),
que fueron revelados con el sistema de detección ECL (Amersham-GE).
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*
Tabla 2. Anticuerpos utilizados en WB, IFI e IP.
Anticuerpo
(anti-)
Origen
Dilución WB
Dilución IFI
H2Bv
Conejo, generado en el laboratorio
1/5.000
1/500
H2A1 L1
Ratón, generado en el laboratorio
1/300 (o.n.)
1/50
H2A1 L2
Ratón, generado en el laboratorio
1/300 (o.n.)
1/50
H2AX
Conejo, generado en el laboratorio
1/5.000
1/500
H2AZ
Conejo, generado en el laboratorio
1/10.000
1/500
H2AZ-Nt
Ratón, generado en el laboratorio
1/5.000
1/500
tubulina
Conejo, donado por Dr. David Sibley
(Washington University, MO)
1/3.000
actina
Ratón, donado por Dr.
1/500
SAG1
Ratón, donado por Dr. Dubremetz
(Université de Montpellier II, France)
1/3.000
1/500
BAG1
Conejo, generado en el laboratorio
1/1.000
1/300
DBL
Conjugado con FICT,
γH2AX
Conejo, Upstate 05-636
1/4000
AcH3
Conejo, Upstate 17-615
1/1.000
AcLys
Conejo, ImmuneChem ICP0380
1/1.000
c-myc
Ratón, Santa Cruz Biotechnology
9E10
1/1.000
H4K20me1
Conejo, Abcam ab9051
1/1.000
1/100
1/300
6.11. Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Células HFF en monocapa crecidas sobre cubreobjetos fueron infectadas con
taquizoitos. Se cultivaron en condiciones estándar de taquizoitos por 24 horas o bajo
condiciones de bradizoitos por 4 días. Luego, las células conteniendo taquizoitos o
bradizoitos fueron fijadas con paraformaldehido 4% durante 30 min. A continuación, se
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*
las permeabilizó con 0,2% Tritón X-100 en PBS por 10 min y se bloquearon con albúmina
sérica bovina (BSA) 1% por 1 h. Se las incubó con la dilución conveniente del anticuerpo
primario específico en BSA 0,5% (Tabla 2) por 1 hora. Después de varios lavados con
PBS, se incubaron con el correspondiente anticuerpo secundario Alexa fluor generados
en cabra anti-ratón 594 o anti-conejo 488 (1/2000, Invitrogen Life
Technologies).
También se utilizaron los anticuerpos anti-ratón/conejo conjugados con isotiocianato de
rodamina (TRITC) o con
isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1/200, Jackson
ImmunoResearchLaboratories, Inc.). Luego de varios lavados con PBS, se incubaron con
Hoescht 33342 o DAPI (4,6-diamidino 2-fenil indol) por 2 min para marcar los núcleos. Se
lavaron nuevamente y se montaron en medio de montaje Fluoromont G (Southern
Biotechnology Associates). Los preparados fueron analizados por microscopía de
epifluorescencia (Nikon Eclipse E600). Los colores emergentes de cada filtro fueron
registrados separadamente y luego mezclados usando el programa Adobe Photoshop 7.0
y/o Image Pro-plus 5.1.
6.12. Determinación de la especificidad de los anticuerpos
Una vez obtenidos los anticuerpos, se evaluó la especificidad y presencia de
reacción cruzada para cada uno de ellos a través de dos métodos diferentes: i. Western
blot, utilizando las proteínas recombinantes y ii. ELISAs competitivos.
En el primer caso, 0,15 μg de las distintas proteínas recombinantes se analizaron
por SDS-PAGE 15% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. En todos los casos
también se utilizó rROP2 como control negativo, siendo ésta una proteína recombinante
no relacionada que contiene la cola de poli-histidina. Los Western blots fueron realizados
como se describió previamente. Sin embargo, en cada caso el anticuerpo primario fue
previamente incubado con rROP2 (50 μg/ml) por una hora a 4°C, bloqueando los posibles
anticuerpos generados anti-poli-histidinas. En ningún caso hubo reacción del anti-suero
con rROP2, cuando los Western blots se realizaron de este modo.
Los ELISAs competitivos se realizaron de la siguiente manera. Las proteínas
recombinantes rH2AZ, rH2Bv, rH2AX y rH2A1 fueron inmovilizadas en una placa de
microtitulación (Immuno Plate Maxisorp; Nunc). Para ello cada pocillo fue cubierto con
100 μl de estas proteínas recombinantes diluidas a 1 μg/ml en tampón carbonato (0,05M,
pH 9,7) a 4 °C por toda la noche. Al día siguiente, los pocillos fueron lavados tres veces
con PBS–0.25% Tween-20 (PBS-T) y bloqueados con 200 μl de solución de bloqueo
(PBS-T con 5% de leche) por 1 h a 37 °C. Luego, fueron incubados por 1 h a 37 °C con
100 μl de cada anticuerpo a ser analizado diluido en solución de bloqueo: α-H2AZ
97
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*
(1/5.000), α-H2Bv (1/10.000), α-H2AX (1/30.000) y α-H2A1 L2 (1/150). Cada uno de los
cuales fue preincubado por 1 h a 4 °C con concentraciones crecientes de proteínas
recombinantes: la proteína específica para ese anticuerpo, las proteínas que se desean
evaluar si son reconocidas por reacción cruzada y una proteína no relacionada, que en
todos los casos fue rROP2. A continuación se lavaron los pocillos con PBS-T y se
incubaron 30 min a 37 °C con el anticuerpo secundario conjugados con proxidasa (anticonejo o ratón SIGMA, según correspondía). Los inmunocomplejos fueron lavados con
PBS-T y revelados con orto-fenil etilen diamina (OPD) y peróxido de hidrógeno. Luego de
20 min, la reacción de color fue parada mediante el agregado de ácido sulfúrico 0,2 N. La
absorbancia fue medida a 492 nm con un lector de microplacas automático (Rayto, RT21000). Cada determinación se realizó por duplicado y al menos dos ELISAs se llevaron
a cabo de forma independiente para cada antisuero.
6.13. Coinmunoprecipitación
Las inmunoprecipitaciones fueron realizadas con 5x108 taquizoitos (RHΔuprt y/o
RHΔhxgprt) los cuales fueron lisados utilizando dos métodos diferentes: sonicación y
digestión con endonucleasa micrococcal de Staphylococcus aureus (MNasa – Sigma
N3755). En el primer caso se obtienen fragmentos de cromatina que contienen entre 100
a 600 pb, mientras que en el segundo, una solución de mononucleosomas.
Los parásitos se sonicaron a 30% de amplitud por 15 s, tres veces en solución de
lisis (Tris-HCl (pH8) 50mM, NaCl 150 mM, EDTA 4 mM, NP-40 1%, butirato de sodio
20mM como inhibidor de acetilasas, más inhibidor de proteasas). Se centrifugaron 10 min
a 10.000 x g y el sobrenadante fue utilizado para realizar la inmunoprecipitación. El 10%
fue sometido a extracción del ADN con fenol/cloroformo para analizar el tamaño de los
fragmentos obtenidos. Luego, se precipitaron con etanol absoluto a 4 °C o.n.,
centrifugadas y resuspendidas en agua. Las muestras fueron visualizadas mediante
electroforesis en gel de agarosa 1% y tinción con bromuro de etidio.
El tratamiento con MNasa se llevó a cabo de la siguiente manera. Los parásitos
fueron lavados y resuspendidos en solución de permeabilización (KCl 100 mM; Tris (pH
8.0) 10 mM; EDTA 25 mM; DTT 1 mM) y permeabilizados con digitonina (40μM) por 5 min
a temperatura ambiente. Se lavaron y resuspendieron en 1 ml de solución isotónica fría
(KCl 100 mM; Tris (pH 8) 10 mM; CaCl2 10 mM; glycerol 5%; DTT 1 mM; PMSF 1 mM); al
cual se le agregaron 6 unidades de MNasa y se incubaron por 15 min a 28 °C. La
reacción fue detenida con EGTA (concentración final de 10 mM). Para mejorar la
solubilidad de la cromatina se agregó NP-40 y NaCl en una concentración final de 0,5% y
98
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*
200 mM, respectivamente. Luego de centrifugar a 10.000 x g por 10 min a 4°C, el
sobrenadante fue utilizado para realizar la inmunoprecipitación. La presencia de
mononucleosomas fue evaluada mediante extracción del ADN de una alícuota (5%) con
fenol/cloroformo, precipitación con alcohol y visualización en gel de agarosa 1,5% con
bromuro de etidio.
Tanto los parásitos sonicados como la solución de mononucleosomas, fueron
incubados con 25 μl de los anticuerpos policlonales obtenidos en el laboratorio o 5 μl de
los anticuerpos comerciales, o.n. a 4°C. Al día siguiente se agregó el doble de proteína
A/G plus (Santa Cruz) y se incubó por dos horas más. Luego de 6 lavados con solución
de lisis, los complejos colectados fueron resuspendidos en 60 μl de solución de siembra
para proteínas y hervidas por 10 min. Veinte μl/calle de cada muestra fueron separados
por SDS-PAGE y analizados por WB. Se realizaron inmunoprecipitaciones con el
anticuerpo preinmune como control negativo. La ausencia de proteínas contaminantes se
corroboró mediante WB con anti-SAG1. También se realizó la corrida electroforética del
anticuerpo unido a la proteína A/G en paralelo con cada inmunoprecipitación para
identificar las bandas correspondientes al anticuerpo. Los anticuerpos utilizados se
encuentran listados en la tabla 2.
6.14. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
Para conocer la localización genómica de las histonas, y por lo tanto dilucidar su
rol en la modulación de la cromatina, se realizaron experimentos de inmunoprecipitación
de cromatina (ChIP). Se colectaron taquizoitos RH, se filtraron y fijaron con 1%
paraformaldehido
por 10 min a 37°C. Se centrifugaron, lavaron con PBS y
resuspendieron a 5x107 parásitos/200 μl de tampón de lisis fría (SDS 1%,EDTA 10 mM,
Tris-HCl (pH 8,1) 50 mM, butirato de sodio 20 mM, más inhibidor de proteasas Sigma
P8340). Todos los pasos se realizaron a 4°C a no ser que se indique lo contrario. Se
incubaron por 10 min en hielo y se dividieron en 200 μl por reacción. Cada tubo fue
sonicado y centrifugado a 10.000 x g por 10 min con el fin de obtener fragmentos de
cromatina que contengan entre 1000 y 100 pb. Cada sobrenadante se diluyó 10 veces en
tampón de dilución (SDS 0,01 %, triton X-100 1,1 %, EDTA 1,2 mM, Tris-HCl (pH 8,1)
16,7 mM, NaCl 167 mM y butirato de sodio 20 mM, más cocktail inhibidor de proteasas).
Se reservó el 10 % de las muestras como cantidad total de ADN (input) presente en las
mismas, el resto fue incubado con 80 μl de proteína A agarose con ADN de esperma de
salmón (Upstate) por 30 min con agitación, para eliminar uniones inespecíficas. Luego de
centrifugar 1 min a 1.000 rpm, el sobrenadante se incubó o.n. con: 10 μl de los
99
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anticuerpos generados en el laboratorio (α-H2AX, α-H2AZ o α-H2Bv) o 5 μl de
anticuerpos comerciales (α-AcH3 o α-H4K20me1). Como control negativo se incubó un
tubo con suero preinmune de H2AX. Al día siguiente se agregaron 60 μl de proteína A
agarose con ADN de esperma de salmón y se incubaron por 1 hora con rotación a 4 °C.
Los complejos anticuerpo-proteína-ADN fueron lavados 3 veces con 1 ml de cada una de
las siguientes soluciones: “Tampón de lavado con baja concentración de sal” (SDS 0,1 %,
Triton X-100 1 %, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,1); “Tampón de
lavado con alta concentración de sal” (SDS 0,1 %, Triton-X 100 1 %, EDTA 2 mM, TrisHCl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8,1) y “Tampón de lavado con LiCl” (LiCl 0,25 M, NP-40 1
%, deoxicolato de sodio 1 %, EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,1); y 6 veces con
solución TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). A continuación fueron eluídas con
250 μl de Tampón de Elución (SDS 1%, NaHCO3 0,1 M) a temperatura ambiente por 15
min con agitación, por duplicado. Para revertir la fijación, tanto de los eluatos combinados
como de los Input, se les agregaron 20 μl de NaCl (5M) e incubaron a 65oC o.n. Luego,
fueron tratadas con proteinasa K y el ADN asociado a las histonas analizadas, fue
purificado con el kit “PCR Purification Kit” (Qiagen). Estas muestras de ADN fueron
analizadas por PCR en tiempo real (qPCR). Las reacciones de amplificación se llevaron a
cabo en un volumen final de 15 μl conteniendo SYBR Green PCR Master Mix (Roche) 1
μl de ADN como templado y 0,25 μM de oligonucleótidos sentido y antisentido diseñados
para amplificar las regiones promotoras de ldh2, β-tubulin, sag1 y bag1 y dos regiones
diferentes de TgIRE. Las secuencias de los oligonucleótidos se encuentran listadas en la
Tabla 3. La curva de calibración se obtuvo usando como templado 2%, 25% y 200% del
Input. Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado usando el ciclador Mx3005P
(Stratagene) y se analizaron con el programa MxPro-Mx3005P v 4.01 Build 369 Schema
80 2007 (Stratagene). Se realizó una curva de disociación para cada par de
oligonucleótidos, confirmando que éstos amplificaban un único producto. Además, las
reacciones de PCR se visualizaron en gel de agarosa 3% corroborando la presencia de
un único amplicon.
100
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*
Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados en ChIP.
Descripción
Producto
amplificado
Nombre
Secuencia
q-TUB F
q-TUB R
5’-TCCTTTTCTTCATGCACTCGC
5’-GTCGTTCGAATTCTCTGCCC
Promotor de β-tubulina
- 627 a - 526
q-BAG1 F
q-BAG1 R
5’-TCCTCCCCTGGATCTTCCTCC
5’-TTGCACAAAACTGGCAAAGG
Promotor de bag1
- 739 a - 638
q-LDH2 F
q-LDH2 R
5’-AAGTGTGCACGCTTTGCAAG
5’-CATGCTCCGGGCAGTACCT
Promotor de ldh2
- 505 a - 404
q-TgIRE 100 F
q-TgIRE 100 R
5’-TTCTTCACGGTTCCGGACTT
5’-CAGCAGTAGCCAACCACGT
TgIRE
3 a 96
q-TgIRE 600 F
q-TgIRE 600 R
5’-GTTATGAGTCCACCACACGGG
5’-CATGATGTGCATGAAACGTGC
TgIRE
732 a 825
q-SAG1 F
q-SAG1 R
5’-AACTTCCCACACGAGGCATT
5’-GATCGGCCCCTAATTCAGC
Promotor de sag1
(pb desde el ATG)
- 653 a - 560
q: utilizados para qPCR. F: sentido (del inglés Forward). R: antisentido (del inglés Reverse).
6.15. Tratamiento con peróxido de hidrógeno
Taquizoitos frescos y filtrados fueron tratados con 0, 100, 200 o 400 μM de
peróxido de hidrógeno (H2O2) por 1 h a 37oC con CO2 5 %. Luego los parásitos fueron
colectados a 2.000 x g por 5 min y lavados con PBS. Cada muestra se dividió en dos. A
una fracción se les extrajo rápidamente el ARN, del cual se obtuvo ADNc por
transcripción reversa, como se describe en la sección 6.5 - H2As. Se analizó la expresión
de los genes de las histonas por qRT-PCR. Todas las reacciones se llevaron a cabo por
triplicado usando el ciclador 7500 Real-time PCR system y se analizaron con el programa
SDS software versión 1.2.1 (Applied Biosystems, CA). Los niveles de ARNm de cada gen
(medidos como CT) fueron normalizados a los niveles de β -tubulina y calibrados con
respecto a los niveles en el control de taquizoitos sin H2O2 (2-ΔΔCT). Se realizó una curva
de disociación para cada par de oligonucleótidos, confirmando que éstos amplificaban un
único producto. Además, las reacciones de PCR se visualizaron en gel de agarosa 3%
corroborando la presencia de un único amplicon. Se graficó el log2(2-ΔΔCT) para cada uno
de los genes amplificados.
La otra fracción fue analizada por WB. Para ello, los parásitos fueron sonicados y
los extractos separados en 4-12 % NuPAGE minigels con Tampón de corrida MES
(Invitrogen Life Technologies). Luego fueron transferidos y analizados por WB utilizando
anti-H2AX (α-H2AX), anti-H2AX fosforilada (α-γH2AX) y anti-tubulina como control de
101
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*
carga (Tabla 2). Los Western blots fueron revelados con anticuerpos de cabra antiratón/conejo conjugados con peroxidasa de rabanito (1/4.000) y revelados con el sistema
de detección ECL (Amersham-GE). La intensidad de las bandas fueron cuantificadas
utilizando el programa Gel Pro Analyzer version 4.0 (Media Cybernetics) utilizando el
análisis “gel 1D” y determinando la densidad óptica integrada (IOD).
6.16. Construcción de plásmidos de expresión en Toxoplasma
Con el objetivo de obtener parásitos que sobreexpresen H2AX, se generó la
construcción pTyH2AX.
oligonucleótidos:
5’-
Se amplificó su CDS por PCR utilizando los siguientes
ATGCATATGTCCGCCAAAGGTGCAGG
(sentido)
y
5’-
TTAATTAAAGGATAGCCATTCTGTCTGGTG (antisentido). Los sitios de restricción Nsi I
y Pac I fueron incluidos en los oligonucleótidos sentido y antisentido respectivamente
(secuencia subrayada). El fragmento obtenido se clonó en el vector pGEM-T easy vector
(promega) y se secuenció. A continuación se lo digirió con Nsi I y Pac I y se purificó el
inserto, que fue introducido en el plásmido pTUB8MycGFPPf.myo tailTy-1/HX (cedido
gentilmente por la Dra. D. Soldati, Université de Genéve, Suiza), bajo el promotor de
tubulina de T. gondii y río abajo y en fase con la secuencia que codifica para c-myc. Este
vector contiene cassettes de resistencia a ampicilina (para el clonado en bacterias) y el
gen de selección hxgprt (permite la selección de parásitos RHΔhxgprt transfectados).
6.17. Transfección de parásitos
La construcción pTyH2AX fue utilizada para transfectar por electroporación
parásitos RHΔhxgprt. La electroporación se llevó a cabo como describió Donald et al
(Donald et al. 1996) . Brevemente, se electroporaron 2x107 taquizoitos y 50 μg de la
construcción, todo resuspendido en CYTOMIX (120 mM KCl; 0,15mM CaCl2; 10 mM
K2HPO4/KH2PO4 pH: 7,6; 25 mM HEPES pH: 7,6; 2 mM EDTA pH: 7,6; 5 mM MgCl2; 3
mM ATP; 3 mM Glutatión), en cubetas de 2 mm (BTX). El electroporador empleado fue
BTX EMC 630 con las siguientes condiciones: volts 1,5 kv y resistencia 25 Ω. Los
parásitos electroporados fueron cultivados por tres pasajes utilizando 25 μg/ml de ácido
micofenólico y 50 μg/ml de xantina como drogas de selección. El ácido micofenólico es un
potente inhibidor de la enzima IMP deshidrogenasa y por lo tanto bloquea la síntesis de
novo de guanina a partir de AMP. Mediante la adición de xantina en el medio de cultivo,
solo los parásitos que hayan incorporado el plásmido, conteniendo el gen de selección
hxgprt, serán capaces de sintetizar guanina a partir de xantina (Figura 6.18.1). Una vez
102
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*
obtenida la población estable, se los clonó por dilución múltiple y se aislaron varios
clones. Estos fueron analizados por IFI y WB utilizando α-c-myc y α-H2AX (Tabla 2).
Adenina
AMP
Adenosina
Inosina
Hipoxantina
hxgprt
IMP
hxgprt
Hipoxantina
MPA
hxgprt
XMP
GMP
Xantina
Figura 6.18.1. Vía de
síntesis de
guanosina
monofosfato
(GMP)
y
selección HX. Se utilizan
parásitos KO para hxgprt,
los cuales son capaces de
sintetizar GMP a través de la
interconversión
entre
adenosina
monofosfato
(AMP) y inosina monofosfato
(IMP). Al agregarse ácido
micofenólico
(MPA)
se
bloquea este paso, por lo
que sólo los parásitos que
hayan
incorportado
el
plásmido
que
contiene
hxgprt serán capaces de
sintetizar GMP a través de la
Xantina agregada al medio.
6.18. Ensayo de replicación.
Se utilizaron para comparar el crecimiento de los parásitos que sobreexprersan
H2AX (mycH2AX, clones estables para pTyH2AX) con respecto a los parásitos
RHΔhxgprt. Se infectaron células HFF crecidas en monocapa sobre cubreobjetos con 8 x
105 parásitos por duplicado. Se indujo la invasión de los mismos incubándolos por 10 min
en hielo y luego 1 h a 37°C con CO2 5 %. A continuación se lavaron con PBS
extensivamente para eliminar los parásitos extracelulares y se incubaron en condiciones
estándar de taquizoitos por 16 horas. Las células fueron fijadas con paraformaldehido 4%
durante 30 min y montados con Fluoromont G (Southern Biotechnology Associates). El
número de taquizoitos por vacuola fue contado utilizando el objetivo de 100x. Se contaron
100 vacuolas por duplicado, por muestra. Para realizar el análisis estadístico de los
datos, se determinó el número total de parásitos correspondiente a las 100 vacuolas para
cada caso y se aplicó una Anova simple empleando el método de Holm-Sidak. Los
gráficos y análisis estadísticos se realizaron con el programa Sigma Stat v3.5 acoplado al
Sigma Plot v10.0 (Systat Software, Inc.).
103
,$
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