Incidencias y Mantenimiento en HPLC

Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Traducción Grupo Biomaster 2009
© Crawford Scientific 2007
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
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-1-
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
1
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... - 4 -
2
EL CROMATÓGRAFO LÍQUIDO BÁSICO ....................................................................... - 6 2.1 VOLUMEN EXTRA EN COLUMNA(V0) .......................................................................................... - 9 2.2 CRITERIOS PARA UN MANTENIMIENTO LÓGICO .................................................................... - 11 2.3 REGLAS DE ORO EN EL DIAGNÓSTICO DE AVERÍAS ............................................................... - 12 2.4 PROBLEMAS TÍPICOS EN HPLC ............................................................................................. - 12 -
3
LA FASE MÓVIL .................................................................................................................. - 14 3.1
3.2
3.3
3.4
4
COMPATIBILIDAD DEL DISOLVENTE Y EQUILIBRADO DEL SISTEMA ...................................... - 14 PREPARACION DE LA FASE MOVIL.............................................................................................-19
DESGASIFICACIÓN DE LA FASE MÓVIL .................................................................................. - 33 FILTRACIÓN DE LA FASE MÓVIL ........................................................................................... - 40 -
SISTEMAS DE BOMBEO .................................................................................................... - 46 4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
FUNCIONES DE LA BOMBA .................................................................................................... - 46 BOMBA RECÍPROCA DE PISTÓN SIMPLE ................................................................................ - 47 LA BOMBA RECÍPROCA DE DOBLE PISTÓN ........................................................................... - 49 LA BOMBA BINARIA DE GRADIENTE ..................................................................................... - 50 LA BOMBA CUATERNARIA DE GRADIENTE ........................................................................... - 51 FORMACIÓN DE GRADIENTES Y TIEMPO MUERTO (“DWELL-TIME”) .................................... - 52 INCIDENCIAS DE LA BOMBA .................................................................................................. - 55 -
TUTORIAL 1 ................................................................................................................................... - 61 5 INYECTORES ............................................................................................................................. - 65 5.1
5.2
5.3
COMPONENTES DEL SISTEMA DE INYECCIÓN ........................................................................ - 65 AUTOMUESTREADORES ......................................................................................................... - 71 INCIDENCIAS DEL AUTOMUESTREADOR ................................................................................ - 76 -
6 COLUMNAS ................................................................................................................................ - 86 6.1
LIMPIEZA, PURGA Y ALMACENAMIENTO DE LA COLUMNA ................................................... - 86 -
6.2
INCIDENCIAS DE LA COLUMNA........................................................................................................................-90-
7. PICOS CON COLA .................................................................................................................... - 96 8. PICOS CON FRENTE .............................................................................................................. - 101 TUTORIAL 2 ................................................................................................................................. - 102 9
DETECTORES .................................................................................................................... - 104 9.1
9.2
9.3
9.4
9.5
9.6
EL DETECTOR IDEAL ........................................................................................................... - 104 EL DETECTOR UV/VISIBLE ................................................................................................. - 107 INCIDENCIAS Y MANTENIMIENTO DEL DETECTOR UV/VISIBLE .......................................... - 109 PICOS NEGATIVOS............................................................................................................................................-114EL DETECTOR DE LIGHT SCATTERING EVAPORATIVO ......................................................... - 116 EL DETECTOR ESPECTROMÉTRICO DE MASAS ..................................................................... - 118 -
TUTORIAL 3 ................................................................................................................................. - 125 10.1 LÍNEAS DE BASE ................................................................................................................ - 128 10.1.1 LÍNEAS DE BASE ERRÁTICAS ............................................................................................. - 128 10.1.2
LÍNEA DE BASE CÍCLICA (CORTA FRECUENCIA) ........................................................ - 130 10.1.3
LÍNEA DE BASE CÍCLICA (LARGA FRECUENCIA)........................................................ - 133 10.1.4
LINEAS DE BASES CON DERIVA ................................................................................. - 136 10.1.5
LÍNEAS DE BASE CON RUIDO ..................................................................................... - 138 10.2 FORMAS DE PICO .............................................................................................................. - 140 10.2.1
ENSANCHAMIENTO DE LOS PICOS .............................................................................. - 140 10.2.2
DESDOBLAMIENTO DE PICOS Y HOMBROS ................................................................. - 143 10.2.4
PICOS CON FRENTE .................................................................................................... - 151 10.2.5
EFECTO MEMORIA Y PICOS FANTASMA ..................................................................... - 152 10.2.6
PICOS NEGATIVOS ..................................................................................................... - 154 10.3 TIEMPO DE RETENCIÓN..................................................................................................... - 156 Traducción Grupo Biomaster 2009
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10.3.1
10.3.2
10.3.3
10.4
10.5
TIEMPOS DE RETENCIÓN FLUCTUANTES .................................................................... - 156 DECRECIMIENTO DEL TIEMPO DE RETENCIÓN ........................................................... - 160 AUMENTO DEL TIEMPO DE RETENCIÓN ..................................................................... - 162 INCIDENCIAS CON LA PRESIÓN .................................................................................. - 162 SENSIBILIDAD............................................................................................................ - 166 -
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1
Introducción
El objetivo de esta sección es:
•
•
Proporcionar una visión general
mantenimiento en HPLC.
Detallar el contenido del curso.
del
curso
de
incidencias y
Contenidos del curso
• El Cromatógrafo Líquido Básico
• Criterios para un mantenimiento lógico
• Incidencias y Mantenimiento
Buenas prácticas de mantenimiento para;
Fase Móvil
Bomba
Sistemas de Inyección
Columnas
Detectores
• Diagnóstico desde una perspectiva sintomática
Diagnósticos empleando el cromatograma
parámetros de operación del sistema;
y
observando
los
Apariencia de la línea de base Cromatográfica.
Apariencia de la forma de los picos
Variación de los Tiempos de Retención.
Alteraciones de la presión.
Sensibilidad.
Recuperación.
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2
El Cromatógrafo Líquido Básico
El objetivo de esta sección está destinado a:
•
•
•
•
Ilustrar y describir los fundamentos en cromatografía líquida.
Describir los enfoques para resolver de forma lógica las incidencias en
cromatografía líquida.
Enumerar las "Reglas de Oro" en la resolución de problemas en HPLC.
Describir los problemas típicos en HPLC.
La figura anterior muestra los componentes modulares y el recorrido típico
del flujo en un cromatógrafo líquido. Los módulos del sistema HPLC están
conectados a través de tubos capilares fabricados en material polimérico,
Polieter-eter-cetona (PEEK), o en acero inoxidable.
Para eliminar
volúmenes extra en columna que generen picos cromatográficos anchos, los
módulos deben conectarse entre sí empleando la mínima longitud de tubo
posible.
Botellas de Disolvente
Los disolventes que conforman la fase móvil están contenidos en botellas
que generalmente se encuentran en la parte superior del sistema HPLC.
Dicha disposición mejora su suministro, ya que se consigue un descenso
natural de la fase líquida por efecto sifón bajo influencia de la gravedad.
Las botellas de los disolventes deben estar cerradas herméticamente a fin
de prevenir la pérdida de solventes orgánicos por evaporación, aunque
siempre debe existir una pequeña abertura para evitar la formación de vacío
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que dificulte el cebado de la línea. En un análisis de larga duración, la
pérdida de solventes orgánicos por evaporación en el espacio en cabeza
disminuirá la fuerza efectiva de elución de la fase móvil, lo que provocará
cambios en la retención del analito. Por tanto, debido a efectos por
gradientes en la concentración y evaporación parcial de la fase móvil, se
pueden producir cambios a lo largo del tiempo, que provocarán que las
características de la fase móvil varíen de las inicialmente preparadas. Una
buena práctica consiste en cambiar el disolvente usado por disolvente
fresco, en lugar de extremar su consumo a largos periodos que tiempo hasta
casi agotarlos.
Se debe evitar el empleo de film de laboratorio (Parafilm, etc...) para
cubrir las botellas de los disolventes. El material del film contiene ftalatos
y polímeros, que pueden migrar por extracción con el solvente en el espacio
en cabeza, incrementando el ruido en la línea de base del cromatograma. El
Espectrómetro de Masas es especialmente sensible a este tipo de
contaminantes que generan picos en la línea de base de un espectro de
masas obtenido por LC-MS.
La filtración de los disolventes antes de su uso, especialmente si
estos contienen aditivos como sales tampón y/o reactivos de pares de
iones, asegura la eliminación de material particulado que puede
dañar los componentes del sistema. Además, es recomendable
instalar en las líneas de disolvente un sistema de filtración que
prevenga la entrada de partículas al sistema HPLC. Estos filtros están
hechos a menudo de vidrio; cuando se deba eliminar contaminación
se lavará primero con ácido nítrico concentrado (6M), después se hará
un lavado con H2O, el siguiente lavado se hará con MeOH y después se
hará pasar H2O de nuevo, antes de volver a reinstalar el sistema. Los
filtros no deben sonicarse pues el vidrio sinterizado se podría romper
y astillar, bloqueando los filtros y disminuyendo la eficacia del
sistema.
El reciclado de la fase móvil está limitado únicamente a las separaciones
que trabajen en isocrático, y es más útil en los métodos empleados para
análisis de rutina que contengan bajas concentraciones de muestra, como es
el caso de laboratorios de Control de Calidad (CQ). Los componentes de la
muestra se diluyen en la fase móvil de forma que se requieren largos
periodos de tiempo para apreciar trazas significativas de los compuestos en
el cromatograma. Generalmente esto se evidencia como un aumento en la
Línea de Base y/o Fondo, lo que se traduce en pérdida de sensibilidad para
el analito.
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Desgasificador
La eliminación de gases disueltos en la fase móvil ayuda a prevenir la
formación de burbujas en el sistema HPLC. Burbujas de aire en la bomba
pueden provocar pérdida de eficacia en el cebado de ésta, errores en la
formación de gradientes de disolventes y ruido en la línea de base debido a
fluctuaciones en la presión. Las columnas del HPLC pueden perder
rendimiento si circulan burbujas de aire a través de estas debido a la
formación de “canales” por presión, estos se saturarán rápidamente con
moléculas de analito lo que hará perder capacidad de retención de la
columna por perdida de superficie activa. Las burbujas de aire formadas por
desgasificación en la celda del detector pueden contribuir al ruido de la
línea de base, lo que reduce los límites de detección esperados y/o los
límites de cuantificación.
La figura anterior muestra los efectos por “canalización” de la columna en
la retención del analito.
Los disolventes pueden ser desgasificados fuera de línea antes de su uso, o
como suele ser más frecuente, mediante incorporación de un desgasificador
en línea que permite la desgasificación in situ de los disolventes.
Bomba HPLC
La bomba del HPLC, o sistema de suministro de disolvente, es la responsable
de conseguir una composición exacta de la fase móvil a velocidades de flujo
constantes y proporcionar la fuerza necesaria para el transporte de dicha
fase a través del relleno de la columna. Lo ideal sería que la bomba no
produjese impulsos impredecibles en la presión, por ello la mayoría de los
sistemas acostumbran a estar dotados de un mecanismo integrado de
amortiguación para la presión (Damper) que ayuda a corregir dicho efecto.
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Automuestreador
Es necesario un sistema automatizado que inyecte la muestra en cabeza de
columna del HPLC, sin detener o distorsionar el flujo de la fase móvil.
El muestreador automático debe minimizar el efecto memoria del analito
entre inyecciones, e incrementar la productividad gracias a funciones
adicionales tales como la capacidad de derivatizar la muestra antes de la
columna, adición de soluciones de estándar interno, etc…
Columna
La separación cromatográfica de los componentes de la muestra tiene lugar
a través de la interacción específica entre el analito y la fase estacionaria
de la columna. Para largos periodos de tiempo entre usos, la columna del
HPLC debe almacenarse en condiciones correctas. Las columnas no deben
ser sometidas a excesivo estrés físico, así como a golpes o caídas, que
pueden alterar el relleno de la fase estacionaria empobreciendo su
rendimiento. Para minimizar variaciones en los tiempos de retención
absolutos es habitual termostatizar la columna a fin de evitar los efectos
fluctuantes de la temperatura ambiente.
Detector
Existe una gran variedad de detectores, aunque debido a su costo, robustez,
límites de detección y facilidad de uso, el detector más utilizado es el de
absorbancia UV. Los detectores UV están disponibles en una sola longitud de
onda, múltiples longitudes de onda o en configuración de diodo array, que
por su capacidad de analizar la de pureza de picos y de realizar búsquedas
frente a bibliotecas de espectros UV ha llegado a ser muy popular.
Para análisis que requieran alta sensibilidad y selectividad es preferible el
uso de detectores de fluorescencia, electroquímicos o espectrómetros de
masas. Los detectores de índice de refracción son solo aconsejables si el
resto de detectores no son aplicables o si la concentración del analito es
alta.
2.1 Volumen Extra en Columna(V0)
Una consideración importante en el diseño de un sistema HPLC es el
volumen extra en columna. El volumen extra en columna representa el
volumen total de todos los componentes del sistema y conducciones
capilares que no están directamente involucrados en el proceso de
separación, desde el punto de inyección de la muestra hasta la detección.
Este volumen extra debe ser minimizado a fin de evitar la formación de
picos anchos y una disminución en la eficacia de la columna además de
perder resolución cromatográfica. Por lo tanto;
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
•
•
•
Cada módulo debe ser conectado con la mínima longitud de tubo
capilar y el mínimo diámetro interno posible.
Los sistemas de inyección y los detectores deben ser diseñados para
tener el volumen interno más pequeño posible.
La columna debe tener un relleno lo más uniforme posible con la
distribución de tamaños de partícula más estrecha permisible.
Ancho de Pico provocado por un incremento de Volumen-Extra en
Columna
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2.2 Criterios para un Mantenimiento Lógico
Hay dos enfoques que pueden ser utilizados para identificar problemas en
cromatografía líquida:
Perspectiva desde los Componentes
Tras identificar el problema, cada componente que pueda contribuir a ello o
ser la causa del fallo, se examina de nuevo. Cada componente examinado
se limpia o se reemplaza según convenga y mediante el sistema de chequeo
del HPLC en cada etapa se identifica si el problema ha sido corregido o no.
Este enfoque en la resolución de problemas permite conseguir una
familiarización del analista con el equipamiento del HPLC, aún así, puede
perderse mucho tiempo en localizar y corregir componentes defectuosos.
Este enfoque puede orientarse hacia la búsqueda de pistas visualmente
como fugas o altas presiones y así poder localizar problemas en los
componentes “físicos” del sistema.
Perspectiva Sintomática
Este enfoque en la identificación de problemas se refiere específicamente a
los efectos que el analista puede ver. Generalmente incluye un examen
visual de la línea de base o de la forma y/o apariencia de los picos
cromatográficos a fin de encontrar indicios de problemas en la selectividad
de la separación o en los componentes del sistema.
Variaciones en los tiempos de retención, cambios en la presión del sistema,
perdidas de sensibilidad o en las recuperaciones del analito, se pueden
estudiar a través de ambas perspectivas.
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2.3 Reglas de Oro en el Diagnóstico de Averías
La combinación de ambos diagnósticos, a partir de los componentes y a
partir de los síntomas, nos permite formular una serie de “Reglas de Oro en
el Diagnóstico de Averías” con un carácter empírico:
1.
2.
3.
4.
5.
Hacer sólo un cambio por operación.
Asegurarse de que el problema realmente existe.
Confirmarlo como mínimo dos veces.
Colocar correctamente de nuevo los componentes.
Si no se encontró ningún fallo reinstalar correctamente las partes
reemplazadas durante la sustitución de los componentes,
Desechar los componentes defectuosos.
No almacenar componentes que se sabe son defectuosos; desecharlos
para eliminar toda posibilidad de utilización posterior.
Anotar siempre los componentes reemplazados.
Generar un registro de históricos de reparación y mantenimiento del
sistema HPLC. Esto permite una acción realmente preventiva al
realizar un mantenimiento programado de todo el sistema que
elimina la necesidad de responder sólo ante posibles situaciones de
fallo. Dicho registro, además, ayudará al ingeniero de servicio
técnico cuando tenga que diagnosticar un problema en el sistema.
2.4 Problemas Típicos en HPLC
Existen tres enfoques principales para localizar e identificar problemas en
HPLC, incluyendo:
1.
Examen de los parámetros operativos del sistema. Uno de los
parámetros que más información aporta y que puede ser observado a
través del monitor es la Presión del sistema.
Según varíe la lectura de la presión se puede deducir que:
• Es demasiado alta debido a un bloqueo en el sistema
• Es demasiado baja debido a fugas en el sistema
• Hay fluctuaciones.
2.
Examen visual del sistema HPLC que especificará que componentes
son susceptibles de fallo. Las fugas en las conexiones de accesorios,
al final de la columna, en la celda del detector, en el
automuestreador, en el cabezal de la bomba, etc… pueden ser
debidas a sobrepresión del sistema y ser la causa de una pérdida de
presión del mismo.
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3.
Examen del Cromatograma resultante.
Línea de Base
•
•
•
¿La línea de base cromatográfica es plana, o fluctúa
cíclicamente?
¿La línea de base cromatográfica muestra ruido en exceso?
Examinando la línea de base se puede obtener gran cantidad de
información del estado del sistema HPLC siendo de gran ayuda
en el diagnóstico problemas.
Picos
•
•
•
•
¿La forma de los picos cromatográficos es simétrica, o
presentan colas y/o desdoblamientos apreciables?
¿Los Tiempos de Retención Absolutos de los picos
cromatográficos varían entre inyecciones?
¿La sensibilidad frente al analito ha disminuido?
Monitorizando los cambios en la forma de los picos
cromatográficos y en los tiempos de retención se puede
obtener una considerable información sobre el estado del
sistema HPLC.
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3
La Fase Móvil
El objetivo de esta sección es;
•
•
•
•
•
Explicar la importancia de asegurar la compatibilidad del disolvente.
Describir un protocolo genérico para la preparación de las fases
móviles.
Explicar la importancia de la desgasificación de la fase móvil.
Enumerar y describir los modos en los que la desgasificación de la
fase móvil pueden realizarse.
Explicar la importancia en la filtración de la fase móvil.
3.1 Compatibilidad del Disolvente y Equilibrado
del Sistema
Es importante tener en cuenta la miscibilidad de un disolvente con otro. Los
disolventes que no son miscibles se particionarán en dos fases, dando como
resultado una eliminación incompleta del disolvente original del sistema
HPLC. Componentes del sistema como la válvula de proporción, las cámaras
del pistón del cabezal de la bomba, los poros del relleno de la columna y la
celda del detector continuarán liberando pequeñas gotas del disolvente
anterior incluso después del proceso de purga, lo que hará que éstas migren
a través del sistema creando perturbaciones
en la línea de base
cromatográfica, así como burbujas del disolvente que se comportarán de
manera análoga a burbujas de aire que pasan a través de la celda del
detector. El ruido en la línea de base afectará a la sensibilidad del analito,
así como a los límites de cuantificación o detección que se verán
incrementados dando como resultado:
Ruido en la línea de base causado por la presencia de aire
en la célula de flujo.
.
Una línea de base ruidosa afectará a la sensibilidad frente a los analitos, y
se aumentarán los límites de detección y de cuantificación.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La tabla siguiente muestra la compatibilidad de disolventes. Se debe tener
en cuenta la fuerza de los disolventes que están siendo usados: si hay
grandes desajustes en la fuerza de los disolventes, las sales de las soluciones
tampón o incluso las muestras podrían precipitar en el inyector o en la
columna, provocando un incremento de contrapresión operativa en el
sistema.
La tabla muestra la miscibilidad de los disolventes más comunes en HPLC
El estudio de compatibilidad de varios disolventes para HPLC muestra una
gran variedad de solventes “universales”, como el tetrahidrofurano (THF)
que es miscible con la mayoría del resto de disolventes. El disolvente de uso
más frecuente en limpiezas es con diferencia el isopropanol (IPA) debido a
su miscibilidad con el resto de solventes en todos los rangos de
concentraciones. Ello hace del isopropanol una elección muy popular como
solvente intermedio cuando hay cambio de eluyentes de fase reversa a fase
normal y viceversa.
Un cambio entre solventes que son inmiscibles, o una mala sustitución de la
fase móvil previamente usada por sistema HPLC, hacen que la composición
del eluyente en la columna no sea uniforme. Esto puede provocar
variaciones en los Tiempos de Retención, especialmente durante las
primeras inyecciones de muestras.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Fluctuaciones en los Tiempos de Retención debido a un pobre
equilibrado de la fase móvil o al uso de solventes inmiscibles
También se pueden observar derivas o ruido en la línea de base debido a
variaciones en el detector entre una fase móvil nueva y la anterior:
Ejemplo de una línea de base con deriva (figura superior) y una línea de
base errática (figura inferior) que pueden verse en un sistema no
equilibrado
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Cada vez que se cambie el disolvente es necesario hacer pasar por
todo el sistema un volumen del solvente nuevo equivalente a 10 veces
el volumen de la columna.
Para calcular este volumen
empíricamente hay que determinar antes el volumen vacío efectivo
de la columna. Si las dimensiones de la columna fueran 150 x 4,6 mm
de diámetro interno (DI), el volumen interno se puede calcular
multiplicando el área por la longitud. Como regla general el volumen
vacío de la columna será aproximadamente el 68% del total de esta,
siendo el resto el ocupado por el material de relleno.
Aplicando la siguiente ecuación y estando todas las dimensiones en
milímetros, se obtiene el volumen vacío efectivo de la columna en
microlitros;
Volumen Vacío Columna = πr2 x L x 0.68
Volumen Vacío Columna = π (2.3)2 x 150 x 0.68
Volumen Vacío Columna ≈ 1,700µL (1.7mL)
Por tanto, si el flujo fuera 1.0mL/min, serían necesarios aproximadamente
17 min para haber pasado 10 volúmenes de la columna en el cambio.
Use siempre gradientes para pasar de un disolvente al siguiente. La
siguiente secuencia de intercambio entre solventes es necesaria para
realizar la conversión entre fase reversa y fase normal a fin de eliminar la
posibilidad de inmiscibilidades entre los disolventes, o precipitaciones de la
muestra o las sales tampón;
•
•
•
•
•
•
Fase móvil
Elimina de la columna todos los analitos retenidos.
H2O
Cualquier tampón usado debe ser reemplazado solo con agua, por
ejemplo, en una separación isocrática con 50:50 MeOH:50mM de
KH2PO4, entonces los 50mM de KH2PO4 deben ser intercambiados por
H2O y el sistema deberá ser purgado adecuadamente.
H2O
Retirar la columna del sistema y purgar solo con H2O al 100% para
eliminar todas las posibles trazas de sales tampón.
Isopropanol
Isopropanol:Hexano (u otros disolventes “no localizadores”(*)) 50:50
Elución en Fase Normal
Nota: ¡El Acetonitrilo y el Hexano son INMISCIBLES!
(*) que no tengan la capacidad de interactuar con grupos específicos de la
fase estacionaria)
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Nota: Los métodos que usan reactivos formadores de pares de iones
requieren normalmente tiempos largos de equilibrado. Suele ser necesario
purgar con un mínimo de 20 volúmenes equivalentes al volumen de la
columna.
Protocolo genérico de Arranque para un sistema HPLC
Para evitar los problemas asociados a un mal equilibrado del sistema se
sugiere el protocolo de arranque descrito a continuación:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Encender los módulos del equipo.
Preparar los disolventes, incluyendo filtración y desgasificación.
Cebar las líneas de los solventes y la bomba.
Establecer la composición de la fase móvil y el flujo tal y como lo
especifique el método.
Purgar el sistema sin la columna durante 5 min, chequeando si hay
fugas.
Detener el flujo e instalar la columna.
Purgar el sistema con la columna en su sitio durante un tiempo para
dicho flujo que sea equivalente a mínimo 10 volúmenes de la
columna, chequeando si hay fugas.
Equilibrar el sistema durante 10 min, controlando contrapresiones en
el sistema.
Si procede, purgar el automuestreador y volver a equilibrar durante
10 min
Inyectar la/s muestra/s de chequeo si el sistema está estabilizado
Evaluar para confirmar si el sistema HPLC es “apto para la finalidad
prevista”
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3.2 Preparación de la Fase Móvil
Influencia del pH
El pH de la fase móvil influye directamente sobre el estado de ionización y
en consecuencia sobre el tiempo de retención del analito.
El pH y la capacidad tamponadora de cualquier fase móvil requieren de una
medición y una preparación exacta respectivamente, de lo contrario la
selectividad en la separación variará dando como resultado tiempos de
retención irreproducibles y formas de pico variables.
El cromatograma siguiente muestra la separación de seis analitos de ácido
débil en una fase móvil de pH 5.10. A ese pH los seis componentes quedan
resueltos adecuadamente, con una resolución de 1.50 para el par de picos
críticos 1 y 2 – separación mínima de pico recomendada en análisis
cuantitativos
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Sin embargo, si el pH de la fase móvil se ajusta incorrectamente, o el error
de medida en la calibración del pH es del orden de 0.10 unidades, la
separación cromatográfica de los seis analitos anteriores presentaría el
siguiente cromatograma;
A un pH de 5.20 los seis analitos no se resuelven correctamente, con una
resolución de tan solo 0.58 en la separación de los picos 5 y 6. Dicho valor
es considerablemente menor a 1.50 y por consiguiente el área de cada pico
no puede ser integrada correctamente para la cuantificación.
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Cuando se cromatografían compuestos ionizables es una ventaja mantener
los compuestos en su forma no ionizada. Los compuestos ionizados
representan analitos altamente polares, que en condiciones de fase reversa
eluyen rápidamente de la columna, lo que reduce las posibilidades de
separarlos del resto de analitos ionizados.
Usando soluciones tampón y ajustando el pH para forzar que los compuestos
estén en forma no ionizada, los ácidos y bases débiles pueden separarse
eficientemente en condiciones de fase reversa.
10
9
8
O
R C O
H
7
Weakly Basic
6
5
k’
4
Weakly Acidic
3
2
1
0
2
pH = pK
6
4
O
R C
O
8
pH
El pKa de una molécula puede usarse para determinar a que pH debe
tamponarse la fase móvil para asegurar una buena reproducibilidad en los
tiempos de retención:
•
•
Para ácidos orgánicos el pH se ajusta 2 unidades por debajo de su pKa
Para bases orgánicas el pH se ajusta 2 unidades por encima de su pKa.
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Fuerza Tamponadora
El cromatograma siguiente muestra el efecto de un cambio en la fuerza
tamponadora durante una separación isocrática de seis aditivos
alimentarios; ácido ascórbico, sorbato potásico, benzoato sódico, vainillina,
cumarina y etil-vainillina, picos del 1 al 6 respectivamente.
El primer cromatograma muestra la separación de seis analitos mediante un
tampón de concentración 60mM. La pareja de picos 4 y 5 se separa con una
resolución de 1.65, separación suficiente para poder cuantificarlos.
El segundo cromatograma muestra la separación de los mismos seis analitos
con un tampón de concentración 57 mM. Con tan solo una ligera reducción
en la concentración del tampón, la resolución en la separación de la pareja
de picos 4 y 5 pasa a ser de solo 0.97, separación insuficiente para una
correcta cuantificación.
Un cambio de 3mM en la concentración del tampón tiene efectos notables
en la selectividad del sistema de separación. El resultado es una pareja de
picos inadecuadamente separados y la imposibilidad de su análisis
cuantitativo lo que nos demuestra la importancia de una pesada exacta.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Determinación del Peso y Pesada
Cualquier pesada estará sujeta a errores que deben ser minimizados para
asegurar la menor desviación posible en la cuantificación final obtenida. Se
conseguirán mínimos errores siguiendo los siguientes criterios:
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Uso del equipo de medición adecuado:
• El equipo de medición funciona correctamente, es decir, “es
adecuado para el fin previsto” y está calibrado correctamente de
manera que la fiabilidad de la medida obtenida es alta.
• El procedimiento de medida y de registro utilizado es correcto.
El “Límite Funcional de Exactitud” (FAL, del inglés “Functional Accuracy
Limit”) de cualquier balanza utilizada en el pesaje de sales para la solución
tampón u otros aditivos, está aceptado generalmente como un 0.1%, siendo
este el % de error permitido en la medida.
Es necesario determinar de antemano que tipo de lectura tendrá la balanza
que va a ser utilizada, y por tanto “La Cantidad Mínima Permisible” que
puede ser pesada (MAQ, del inglés “Minimum Allowable Quantity”). La MAQ
para una balanza puede ser determinada del siguiente modo:
MAQ = 100% / FAL (%) x lectura de la balanza.
Es decir, para una balanza de cuatro cifras (de lectura 0.0001g) se tendrá
una MAQ igual a:
MAQ = 100% / 0.1% x 0.0001 = 0.1g (100mg)
Por lo tanto, para determinaciones de peso con precisión para el ejemplo
anterior, el límite inferior serían 100mg para una balanza de cuatro dígitos.
Balanza de 6 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 1mg
Balanza de 4 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 100mg
Balanza de 3 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 1g
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Las tolerancias típicas en el pesaje para los tres modelos de balanzas
descritos son:
Tolerancias Típicas en el Pesaje para los modelos de Balanzas descritos
Modelo de Balanza
Plato de Carga Superior
Semi-micro analítica
Micro analítica
Peso Máximo
Tolerancia
(g)
(mg)
3,200
±10
5,200
±10
8,200
±100
60
±0.015
230
±0.025
2.1
±0.00025
5.1
±0.0010
21
±0.0020
Los sólidos ya pesados deben ser transferidos al vidrio adecuado - matraz
aforado o probeta - y ser disueltos en un agitador magnético y/o
ultrasonidos sin llegar a enrasar. Se deben evitar calentamientos pues
pueden afectar la composición del disolvente.
Elección del Recipiente para el Pesaje
•
•
Es muy importante que el recipiente usado para pesar sea el
apropiado a la muestra o material que están siendo pesados, es decir,
sería inapropiado pesar 0.01g en un recipiente de 1Litro.
Utilizar siempre vidrios limpios y secos – esto es especialmente
importante para los vidrios de reloj, donde las contaminaciones del
material y la adsorción de la muestra por el vidrio pueden causar
errores.
Fuentes de Deriva
La precisión en la medida del peso con la balanza analítica puede sufrir
deriva. Las fuentes de deriva incluyen:
•
•
•
•
•
Avería en el plato de la balanza analítica o en su sensor.
Cambios en los sensores mecánicos o de presión de la balanza debidos
a averías y cambios en la temperatura.
Exposición del mecanismo de la balanza a un exceso de carga estática
Cambios en el calibrado interno del aparato.
Cambios en la presión y temperatura ambiente.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Debido a esta inherente susceptibilidad a la deriva es necesario calibrar
regularmente las balanzas.
Efectos Estáticos
El mecanismo por el que la balanza percibe el peso mediante sensores de
presión y sus sistemas electrónicos internos, pueden alterarse
sustancialmente por la electricidad estática de los envases o recipientes, así
como la carga de las muestras o las sustancias que están siendo pesadas. Los
contenedores de vidrio ó plástico son particularmente susceptibles a este
efecto ya que la densidad de la carga no se elimina fácilmente debido a su
baja conductividad. El látex y los guantes de plástico son también conocidos
transmisores de carga electrostática al plato de las balanzas.
Las balanzas afectadas por electricidad estática presentan generalmente
problemas de lecturas muy inestables o derivas continuas.
Hay varias recomendaciones a seguir para contrarrestar este efecto:
•
•
•
•
Se pueden adquirir balanzas con plato recubierto anti-estáticamente.
Se puede poner un vaso de agua en el compartimento de la balanza
para aumentar la humedad ambiente (Nota: Este método NO es
recomendable si el aumento de la humedad afecta a la muestra por
ser higroscópica (ver sección siguiente).
Se puede adquirir una “pistola ionizante” y colocarla cerca del
compartimento de la balanza a fin de neutralizar mediante iones con
carga opuesta.
Manipular los envases con pinzas o tenazas – usar solo los guantes de
látex cuando se manipulen muestras tóxicas.
Muestras Higroscópicas
•
•
•
•
•
Algunas muestras son particularmente susceptibles atraer o absorber
humedad. El acetato de amonio, un tampón muy usado en LC-MS, es
extremadamente higroscópico.
Un síntoma de muestras higroscópicas es un constante aumento del
peso debido a la absorción de humedad.
Cualquier muestra que se sepa que es higroscópica puede pesarse en
una balanza usando un vaso de precipitados con un tamiz molecular
para reducir la humedad presente o procurando minimizar su
exposición ambiental.
Las huellas dactilares en los envases de las muestras pueden
favorecer la adsorción de la humedad. Por ello es importante que los
envases o los recipientes no se manipulen directamente, sino que se
usen espátulas o pinzas para manipularlos.
Si las muestras o los recipientes requieren enfriamiento previo para
ser pesados, estos deben ser enfriados en un desecador para evitar la
absorción de humedad.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Muestras Volátiles
•
•
•
Esta situación es la opuesta a tener muestras higroscópicas. Las
muestras volátiles tienden a perder peso, obteniéndose una
disminución constante en la lectura del peso. Muchos tampones y
aditivos usados en LC-MS son volátiles, dicha volatilidad ayuda a
prevenir contaminación o suciedad en la fuente de iones.
Es posible pesar muestras en recipientes cerrados con tapa, si esta se
manipula con precaución. Cualquier líquido que condense en la tapa
puede crear alteraciones en pesadas sucesivas. Se deben usar siempre
recipientes tapados cuando se pesen líquidos.
Para todos los pesajes es mejor minimizar el área superficial de la
muestra que está siendo pesada. Este enfoque minimiza la exposición
atmosférica de la muestra, reduciendo la volatilización potencial.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Efectos de la Temperatura
•
Como regla general, la muestra a pesar debe acondicionarse a la
temperatura de la balanza. Es el único modo de evitar errores por
ascensión del aire y desviaciones causadas por corrientes en la
superficie de la muestra. Dado que estos efectos aumentan
proporcionalmente al volumen y a la superficie de la muestra, se
debe asegurar que el tamaño del recipiente seleccionado esté en
proporción adecuada al tamaño de la muestra a pesar, ello ayudará a
minimizar dicho efecto.
En todos los casos las medidas fundamentales son:
•
•
•
•
Obtener tanta información como sea posible de la muestra a pesar.
Evitar
potenciales
efectos
electrostáticos
mencionados
anteriormente.
Equilibrar la temperatura del envase y la muestra con el ambiente de
la balanza.
Minimizar el área superficial de la muestra expuesta a la atmósfera.
El pH Metro y el Ajuste de pH
El pH es uno de los parámetros más comúnmente determinados en
soluciones tanto acuosas como no acuosas. Variaciones en el pH pueden
provocar cambios significativos en la velocidad de reacción así como
cambios en la solubilidad y biodisponibilidad de muchos principios activos
con fines farmacéuticos. Como se ha descrito anteriormente, las
características en la retención de muchas especies de analitos pueden
cambiar por variaciones en el pH de la fase móvil y por tanto contribuir a
formas de picos anormales, es decir, desdoblamientos y colas.
El pH es un parámetro que indica la acidez o alcalinidad de una solución, se
mide en una escala de 0 a 14, donde un valor de pH igual a 0 es muy “ácido”
y un valor de 14 es muy “básico”. El pH mide la concentración, o más
exactamente la actividad del Ion oxonio – H3O+, aunque en la solución el Ion
oxonio está representado como un protón o Ion hidrógeno, H+.
Generalmente se ajusta primero el pH del disolvente de la fase móvil antes
de añadir el volumen de disolvente orgánico necesario. Este enfoque
sistemático asegura exactitud en la concentración del Ion oxonio. Para
asegurar homogeneidad mientras se adiciona el reactivo en el ajuste del pH,
la solución puede ser agitada en una placa magnética, aunque se debe
evitar calentamientos que puedan afectar la composición del disolvente.
El reactivo para ajustar el pH puede añadirse gota a gota usando material
plástico, vidrio o pipetas dispensadoras automáticas.
El empleo de vidrio propicia la introducción de iones metálicos. Los iones
Al3+ y Fe2+ inducirán actividad en los grupos silanol residuales de la columna
analítica. La consecuencia de esto es la observación de colas en los picos
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
cromatográficos, especialmente para aquellas especies de analitos que
tienen grupos funcionales básicos. Los iones aducto Na+ y K+ pueden
predominar en LC-MS, llegando a ser los picos base y más abundantes incluso
que el ion protonado pseudo-molecular. Esto puede influir de manera
considerable en la cuantificación.
Determinación del pH
El sistema de medición del pH consta de tres componentes:
•
•
•
Un electrodo de pH.
Un electrodo de referencia.
Un pH metro de alta impedancia.
En la mayoría de los sistemas para medir el pH los electrodos de pH y de
referencia están montados en el mismo dispositivo, conocido como
“electrodo combinado”.
Electrodo de Referencia
El electrodo de referencia consiste en un cable de plata recubierto en
cloruro de plata, una solución de relleno y una junta permeable
(generalmente fritas de cerámica o membranas), a través del cual la
solución de relleno migra lentamente dentro de la muestra que está siendo
medida. En algunas partes de la frita apenas hay flujo neto de la solución de
relleno, dicha región se llama junta de difusión.
Electrodo de pH
El electrodo de pH está hecho de un vidrio de composición especial, que es
sensible a la concentración de iones hidrógeno. Dicho vidrio está compuesto
generalmente por un metal alcalino que sostiene una reacción de
intercambio de iones con los Iones hidrógeno de la solución test para
generar una diferencia de potencial.
Electrodos de pH Combinados
Los electrodos combinados contienen los dos electrodos descritos
anteriormente en un único cuerpo de vidrio. El potencial generado en la
zona de unión se debe a los iones libres de hidrógeno presentes en la
muestra. El potencial de referencia es generado por un elemento interno
de Ag/AgCl que está en contacto con la solución relleno de referencia. El
electrodo de medida emite un voltaje variable y el electrodo de referencia
un voltaje constante para el medidor.
El sistema funciona de manera análoga a la medida del voltaje de una
batería por un voltímetro. El cable interior del electrodo de pH tiene la
misma finalidad que el primer cable que va desde la batería hasta el
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
voltímetro. El electrodo de referencia equivale al segundo cable que
completa el circuito y permite medir el voltaje. La solución de relleno fluye
del electrodo de referencia hasta la solución test, completándose el
“circuito” con el electrodo de pH.
Electrodo de pH
Combinado ROSS®
Agujero de Relleno: Solución
relleno de KCl
Electrodo de referencia Ag/AgCl
Unión de frita cerámica referencia
Bulbo detector de pH
Para que el electrodo de pH combinado trabaje correctamente es
importante que el bulbo detector se guarde limpio y sin restos de tampones,
de lo contrario los iones libres que fluyan a través del bulbo serán inhibidos
y por tanto las medidas de pH serán incorrectas. Debe asegurarse que la
solución relleno de KCl está en el nivel correcto y que el agujero del relleno
no está tapado mientras se mide el pH.
El pH-metro
El electrodo de pH tiene una resistencia interna muy alta, haciendo muy
difícil la medida de los pocos milivoltios de salida que provocan los cambios
de pH. Un pH-metro es básicamente un amplificador de alta impedancia que
mide con precisión los diminutos cambios de voltaje del electrodo,
mostrando el resultado directamente en unidades de pH o en milivoltios.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Soluciones Tampón y Características del Electrodo de pH
Soluciones Tampón
Los tampones son soluciones que mantienen un valor constante de pH con
capacidad de resistir a los cambios de éste. Se utilizan para calibrar el
electrodo de pH y el pH-metro. Se emplean para compensar las pequeñas
diferencias que se observan entre la señal de producida por diferentes
electrodos, así como los cambios producidos en los electrodos con el paso
del tiempo.
En consecuencia, el sistema debe ser calibrado periódicamente. Los
tampones disponen de un amplio rango de valores del pH, viniendo estos en
forma líquida premezclada o como polvo seco encapsulado según sea
necesaria su preparación. Generalmente una solución tampón específica
calibrará con una tolerancia menor a ±0.02 unidades de pH medido a 20ºC.
La mayoría de los pH-metros requieren calibraciones a varios valores
específicos de pH. Generalmente se realiza una calibración cerca del punto
isopotencial – la señal emitida por un electrodo a pH 7 y a 25ºC son 0mV – y
típicamente se hace una segunda medida a pH 4 o a pH 10. Es bueno elegir
un tampón con un pH tan próximo como sea posible al valor del pH de la
muestra a determinar, pues se asegura la mayor exactitud posible.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Adición del Disolvente
Cuando se prepare una fase móvil mezcla de disolventes acuosos y
orgánicos, el procedimiento correcto será adicionar el volumen de solvente
orgánico necesario al volumen de solvente acuoso necesario.
Si el volumen necesario de la fase móvil se prepara simplemente por adición
de la fase acuosa con el solvente orgánico o viceversa, entonces los errores
en la composición pueden deberse a contracción o expansión del volumen de
la mezcla respecto a los volúmenes individuales de los disolventes. Este
efecto se traducirá en cambios crecientes en los tiempos de retención de la
muestra y en los factores de capacidad.
La tabla siguiente muestra el efecto anterior sobre las características de
retención del tolueno. Muestra que hay una variación significativa en el
tiempo de retención del tolueno entre una fase móvil 60:40 MeOH:H2O
preparada por adición de cada disolvente según haya:
•
•
Suficiente MeOH para 40mL de H2O
o
Suficiente H2O para 60mL de MeOH
en comparación al procedimiento correcto de adición de 60mL MeOH a 40mL
H2O.
En el procedimiento correcto se obtiene una fase móvil de composición y
fuerza de elución intermedia, prueba de ello es el cambio en el tiempo de
retención y el factor de capacidad del tolueno al preparar la fase móvil de
este modo y los otros dos anteriores.
Resultado según la Técnica de Preparación de la Fase Móvil sobre la
Retención del Tolueno
Fracción
MeOH
Volumétrica
del
Tiempo de Retención
Factor de Capacidad
(min)
k'
60
5.40
2.72
62*
4.82
2.32
58**
5.87
3.05
(%)
* 40mL de H2O llevados hasta 100mL con 60mL MeOH, Calculado el k'
** 60mL de MeOH llevados hasta 100mL con 40mL H2O, Calculado el k'
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
3.3 Desgasificación de la Fase Móvil
La eliminación de gases, o desgasificación, es un fenómeno al que se
someten todos los disolventes tanto orgánicos como acuosos usados en
cromatografía. Cuando el HPLC está sometido a altas presiones la
solubilidad de los gases atmosféricos O2 y N2 aumenta. Cuando los
disolventes experimentan una brusca caída de presión, generalmente
durante la mezcla en una válvula de proporción cuaternaria, un mezclador
estático de un sistema binario, o al entrar en la celda del detector, los gases
disueltos se desprenden de la solución formando burbujas.
La generación de dichas burbujas puede ser perjudicial tanto para la
columna como para el proceso cromatográfico.
Los sistemas de bombeo más modernos están centrados en el diseño de
doble pistón. Las burbujas de aire pueden retenerse en las válvulas
antirretorno o en las cámaras de los pistones del cabezal de la bomba. Se
observará una línea de base sinusoidal como resultado de aire retenido en el
cabezal de la bomba:
Línea de Base Sinusoidal generada por aire retenido
en el cabezal de la bomba.
En estos casos es importante eliminar las burbujas de aire antes de que
estas pasen a la columna. La bomba debe purgarse inmediatamente y el
flujo incrementarse a 5ml/min para eliminar el aire del cabezal de la
bomba.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Una burbuja que entra en la columna forzará su recorrido a través del lecho
de relleno de la fase estacionaria, provocando la formación de “canales”.
Dicha canalización disminuye rápidamente el rendimiento de la columna ya
que los analitos son capaces de atravesar la columna por dichos canales, lo
que se traduce en un menor tiempo de retención sobre la fase estacionaria,
saturándose rápidamente dichos huecos por moléculas de analito.
Tal efecto conduce generalmente a la formación de frentes en la forma de
los picos cromatográficos.
Frentes y picos anchos observados en una columna dañada
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
El paso de burbujas de gas al HPLC afectará a la línea de base
cromatográfica generando ruido que se traduce en la presencia de picos
fantasma.
Además, si una burbuja de gas queda atrapada en la celda del detector, se
generará ruido de forma aleatoria en forma de picos en el registro de la
línea de base. El efecto neto será una disminución en la relación señal-ruido
(S/N), con su correspondiente aumento en los límites de detección (LoD) y
los límites de cuantificación (LoQ) del método.
En cuanto la fase móvil entra en la celda de flujo del detector se produce
una caída en la presión. Como resultado de esta caída en la presión, una
pequeña cantidad del aire retenido en la fase móvil puede liberarse en la
celda del detector. Dicha liberación de gas se traduce en un incremento del
ruido en la línea de base:
Incremento del ruido en la línea de base (figura superior) y “Spikes”
(figura inferior) causados por burbujas de aire retenido y liberado en la
celda del detector
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Es una práctica muy común ajustar la contrapresión mediante reguladores a
la salida de la celda del detector a fin de mantener valores altos en la
presión que minimicen la desgasificación hasta que el flujo de la fase móvil
está suficientemente a distancia para prevenir el atrapamiento de las
burbujas de aire formadas. Si el regulador de la presión no es un accesorio
integrado del detector, suele ser suficiente la conexión de un tubo PEEK de
50cm de longitud y 0.17mm de diámetro interno antes del tubo de salida de
desechos.
Además, una pobre desgasificación de la fase móvil se traducirá en un mal
cebado de la bomba y una pobre reproducibilidad de gradientes, lo que
llevará a variaciones en los tiempos de retención del analito.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Métodos de Desgasificación
Hay cuatro modos aceptados para desgasificar la fase móvil:
•
•
•
•
Borboteo por Helio
Desgasificación por Vacío
Ultrasonidos
Reflujo
El filtrado de la fase móvil a vacío es el procedimiento que se emplea
generalmente cuando se elimina materia particulada de una solución antes
de su uso, dicho proceso desgasifica la fase móvil de manera indirecta.
Aunque es una medida necesaria, especialmente cuando se usan soluciones
tampón o fases móviles que contienen reactivos de par de iónico, se debe
tener cuidado en evitar pérdidas selectivas de cualquier solvente orgánico
que pueda conducir a variaciones en el tiempo de retención del analito.
Borboteo por Helio
El Borboteo por Helio elimina aproximadamente el 80% de los gases
disueltos. El mecanismo de borboteo puede construirse simplemente
conectando a un cilindro de helio un tubo de PTFE con una frita al final.
Hay que sumergir la frita dentro de la fase móvil y ajustar el regulador para
liberar una suave corriente de burbujas.
En general, un litro de fase móvil se desgasificará por completo con un litro
de helio. Una excesiva desgasificación con helio puede provocar la pérdida
de la mayoría de los componentes volátiles de la fase móvil, generando
variaciones en los tiempos de retención.
La principal finalidad del borboteo por helio es disolver el N2 y el O2 que se
extraen de la fase móvil gracias a su elevada solubilidad en helio. El helio
tiene una solubilidad muy baja en la mayoría de las fases lo que permite la
disolución de N2 y O2 en el gas borboteado, dando como resultado una
solución relativamente libre de gases.
Cuando se está usando el borboteo por helio hay que ser consciente de los
potenciales cambios que pueden tener lugar en la composición de la fase
móvil debido a la volatilidad selectiva de cualquier aditivo de la fase móvil,
p.ej., ácido Trifluoroacético (TFA).
Se debe evitar un borboteo por helio “vigoroso” ya que puede provocar
perturbaciones excesivas en la superficie de la fase móvil, dando como
resultado la introducción de más aire que el que es eliminado.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Desgasificación por Vacío.
La desgasificación por vacío se puede llevar a cabo de tres maneras:
•
•
•
En discontinuo
Incidental
Desgasificación en línea
La desgasificación en discontinuo tiene lugar en un matraz a vacío que
contendrá la fase móvil a la que se someterá un proceso continuo de vacío,
bien generado por aspiración con agua, o simplemente con una bomba de
vacío.
La desgasificación incidental se lleva a cabo haciendo pasar la fase móvil a
través de un filtro de membrana. Puesto que el líquido se microdispersa
mientras está expuesto a un ligero proceso de vacío, se produce la
desgasificación. La desgasificación incidental es más bien un tratamiento
secundario cuando se necesite eliminar materia particulada de la fase móvil
por vacío antes de su uso.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La desgasificación en línea es el método más empleado actualmente. La
fase móvil está encerrada en un tubo permeable a los gases mientras
atraviesa la unidad de desgasificación. El gradiente de vacío generado hace
expulsar los gases retenidos en la fase móvil, atravesando éstos la
membrana del tubo.
Ultrasonidos
Este es el menos eficiente de todos los mecanismos de desgasificación ya
que solo elimina aproximadamente el 30% de los gases disueltos. La fase
móvil se desgasifica por sonicación de forma que los gases disueltos se
aglomeran formando burbujas con el suficiente tamaño para flotar hasta la
superficie del líquido. Dicha técnica es limitada, pues se lleva a cabo fuera
del sistema y el calor generado en el proceso de sonicación puede provocar
la pérdida de los compuestos más volátiles de la fase móvil por evaporación
selectiva. Sus limitaciones se compensan generalmente por sus ventajas en
simplicidad y bajo coste.
En consecuencia el ultrasonidos no es muy recomendable y si es usado debe
serlo durante el mínimo tiempo posible y preferiblemente con un baño de
agua que controle la temperatura.
La figura anterior muestra la eficacia relativa de los diferentes métodos
de desgasificación, tomando como criterio el porcentaje de oxígeno
eliminado de un volumen de metanol determinado en función del
tiempo.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
3.4 Filtración de la Fase Móvil
La filtración elimina el polvo además de otras partículas y contaminantes,
siendo por tanto una etapa fundamental en la preparación de cualquier fase
móvil tampón. Las partículas pueden alojarse en el sistema de aporte de
disolvente, provocando desgaste en los componentes del cabezal de la
bomba, generando fugas, flujos irregulares y cambios en la composición de
la fase móvil. Las partículas pueden también alojarse en la válvula de
inyección generando fugas cruzadas entre los puertos de la válvula que dan
como resultado áreas y/o alturas de picos irreproducibles y causan una
disminución de la vida útil de ésta.
La filtración de la fase móvil también ayuda a prevenir la obstrucción de la
línea, o de la guarda columna si la hubiere, evitando los cambios continuos
de éstas y reduciendo pérdidas de tiempo y costes. El filtro en línea debe
instalarse después del sistema de inyección pero antes de la columna
analítica. De este modo cualquier partícula generada por el desgaste de los
componentes del asiento del rotor procedentes de la válvula de
conmutación del inyector será retenida de modo eficaz.
Sin filtración de la fase móvil y sin añadir un sistema protector de filtro en
línea, las partículas que entran en el HPLC pueden acumularse en cabeza de
columna traduciéndose en una amplia variedad de problemas
cromatográficos.
Un bloqueo parcial en la entrada de la columna se traduce en un aumento
de la presión y por tanto en deterioro de la forma de los picos
cromatográficos, efecto que queda patente en desdoblamientos, frentes o
colas en los picos. La figura siguiente muestra el efecto de una frita
parcialmente bloqueada a la introducción de muestra en la columna. Sin
bloqueo, la muestra sale de los tubos de conexión, distribuyéndose
uniformemente dentro de la frita de entrada y después en cabeza de
columna.
Cuando hay un bloqueo parcial se impide la distribución homogénea de la
muestra en cabeza de columna, obteniéndose anomalías en las formas de
pico.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
En ocasiones también puede haber cambios en los tiempos de retención del
analito (TR), el factor de capacidad del analito (k’), disminución en la
selectividad de la separación, presencia de picos falsos o adsorción
irreversible del analito en la columna con la consecuente reducción de la
vida útil de esta.
Usar filtros mezcla de éster celulosa − acetato y nitrato de celulosa −
(0.22µm de tamaño de poro) para disolventes acuosos tamponados, p.ej.
Whatman Membra-Fil.
Usar Teflon (Polytetrafluoroetileno − PTFE) (0.22µm de tamaño de poro)
para solventes orgánicos. Es frecuente que la membrana de PTFE esté
laminada sobre una trama de polipropileno como soporte para aumentar su
durabilidad.
Es muy recomendable reservar material de vidrio específico que solo se
utilice para el proceso de filtración de la fase móvil y así prevenir
contaminación imprevista.
Un conjunto de vidrio debe dejarse solo para solventes acuosos tamponados
y otro distinto para solventes orgánicos.
Cualquier vidrio debe ser inspeccionado ante la posible presencia de
material particulado para prevenir contaminación accidental de las fases
móviles pre-filtradas
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Es una buena práctica el filtrar cualquier disolvente que no sea de grado
para HPLC antes de mezclarlo y emplearlo en la preparación de fase móvil.
Cuando se filtran mezclas de disolventes, las diferencias entre las presiones
parciales de cada solvente pueden ser causa de cambios en la composición.
En consecuencia, el usuario debe ser consciente de los cambios en la
concentración de los solventes - y ser consecuente con los PNT
(Procedimientos Normalizados de Trabajo).
Generalmente no es aconsejable filtrar los disolventes de calidad HPLC
suministrados por el fabricante. Estos disolventes se suministran ya
eficazmente filtrados a 0.22µm y posteriormente embotellados bajo
condiciones de “sala-limpia”. En consecuencia, el riesgo de introducción de
materia particulada o contaminantes aumenta considerablemente cuando se
realiza de nuevo la filtración en el laboratorio.
Los filtros pueden estar revestidos o contener materiales como tensioactivos
o glicerina, que podrían arrastrarse como contaminación a la fase móvil. Por
tanto, es una buena práctica pre-lavar los filtros y desechar los primeros
lavados.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Filtros de Disolventes en línea
El uso de disolventes de alta calidad para HPLC suele eliminar la necesidad
de filtración manual. Sin embargo, la mayoría de fabricantes recomiendan el
uso de filtros para disolventes en línea:
Generalmente los filtros están hechos de vidrio sinterizado o acero
inoxidable, que deben ser limpiados o reemplazados mensualmente. El
bloqueo de uno de los filtros causará pequeños cambios en la composición
de la fase móvil, provocando fluctuaciones en los tiempos de retención:
Fluctuaciones en los tiempos de retención debido
al bloqueo de un filtro en línea.
El mejor método de limpieza para los filtros de acero inoxidable es por
ultrasonidos en isopropanol (IPA). Los filtros de vidrio sinterizado nunca
deben ser lavados por ultrasonidos, siendo el mejor método la inmersión en
IPA durante 24 horas.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Crecimiento microbiológico
Los disolventes contaminados o el crecimiento microbiano en las botellas de
disolvente, pueden taponar los filtros y perjudicar al funcionamiento de la
bomba. El crecimiento microbiano también puede bloquear el
automuestreador, provocando variaciones en los volúmenes inyectados o
recubriendo las ventanas de la celda de flujo provocando así líneas de base
erráticas y reduciendo la sensibilidad.
Una línea de base errática causada por crecimiento
microbiano en la fase móvil
Es recomendable tomar las siguientes precauciones:
• Si es posible usar botellas estériles para los disolventes.
• Reemplazar disolventes acuosos y tamponados cada dos días.
• Evitar la exposición directa al sol o usar botellas de vidrio ámbar.
Otras Consideraciones para la Fase Móvil:
Rango del pH
Rango del pH del equipo 2.3 – 9.5
Rango del pH extendido 2.3 – 12.5
Corrosivos para el acero inoxidable
Ácido clorhídrico
Ácidos inorgánicos y ácidos fuertes
Haluros Básicos (Cloruro de Sodio, Ioduro de Litio)
Tetracloruro de Carbono con 2-propanol o THF
Agentes acomplejantes (EDTA, ácido cítrico, ácido acético)
Ataque al cuarzo y vespel
Soluciones alcalinas, pH>11
Si se usan los compuestos anteriores será necesario un mantenimiento más frecuente del HPLC.
Cuando se usen, al finalizar el análisis la bomba u otros componentes del HPLC deben ser purgados a
fondo.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Otra cuestión relativa al uso de filtros es la filtración de las muestras antes
de inyectarlas. Aunque filtrar la muestra permite eliminar partículas, existe
la posibilidad de perder analitos por ser absorbidos irreversiblemente en la
membrana de los filtros. El efecto inmediato sería la obtención de áreas y/o
alturas de picos irreproducibles.
Por tanto, es aconsejable realizar de una serie de pruebas previas que
controlen la recuperación de los analitos a los niveles de concentración
esperados cuantificando a partir de soluciones “fortificadas”, a fin de
determinar si el filtro es compatible y no retiene los compuestos en
cuestión. Dicho proceso se ilustra a continuación:
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
4
Sistemas de bombeo
El objetivo de esta sección es:
•
•
•
•
Describir la función de la bomba
Describir los principios de funcionamiento del sistema de bombeo
Describir los dos procesos por los cuales se forma el gradiente de
fase móvil
Enumerar y describirlas incidencias y los procesos de mantenimiento
más comunes
4.1 Funciones de la Bomba
La misión de la bomba es enviar continuamente un flujo fase móvil libre de
pulsos al inyector, columna y detector, independientemente de la
contrapresión del sistema.
Cada sistema de bombeo debe cumplir los siguientes requisitos:
•
•
•
•
•
Todas las partes de la bomba en contacto con fluidos han de ser de
materiales inertes
El rango normal de presiones en HPLC es de 100 – 6000 psi (14.2 psi =
1 Bar) dependiendo del equipo utilizado. Esto correspondería a unos
flujos de rango 0.5 - 10mL/min, dependiendo de la geometría y
relleno de la columna, etc. La mayoría de las bombas están
preparadas para alta presión, pero se utiliza un sistema limitador de
presión (“Cut-off”) para evitar daños en otros componentes del
sistema como la celda de flujo del detector.
Algunas bombas de tipo flujo constante pueden producir un perfil de
presión pulsado. Si el detector usado es sensible al flujo se puede
producir ruido u ondulaciones de la línea de base. Tales variaciones
de flujo son normalmente “amortiguadas” usando un volumen muerto
comprimible situado entre la bomba y el inyector (“Damper”). El
fabricante normalmente incorpora el “dámper” en el propio módulo
de bombeo.
El volumen interno de la bomba debería ser lo más pequeño posible.
Esto garantiza que los cambios en la composición de la fase móvil
puedan ser rápidos durante el gradiente de elución. Se evita de esta
forma que los tiempos de re-equilibrio resulten el paso limitante en
cualquier análisis.
Los sellos de las bombas, arandelas, juntas y ocasionalmente los
pistones del cabezal de la bomba necesitan ser reemplazados, por lo
que deben ser de fácil acceso. Los asientos de las válvulas
antirretorno tienen tendencia a desgastarse y necesitarán sustituirse
si se bloquean o quedan pegados. La forma más efectiva de prolongar
el tiempo entre mantenimientos es filtrar la fase móvil y usar unos
procedimientos correctos de puesta en marcha y apagado
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
4.2 Bomba Recíproca de Pistón Simple
El mayor reto de cualquier fabricante de bombas de HPLC es proporcionar
un flujo de fase móvil libre de pulsaciones. La simplicidad del cabezal de la
bomba de pistón simple es ideal para separaciones isocráticas, que
requieren un flujo fijo de un único solvente durante todo el análisis. La
incorporación de un amortiguador de pulsos (“damper”) de bajo volumen
permite obtener un flujo libre de pulsaciones.
Además de minimizar las pulsaciones de flujo gracias a la incorporación de
un amortiguador de pulsos, los equipos de HPLC modernos pueden variar la
velocidad del pistón del cabezal de la bomba, de forma que su velocidad sea
menor en la etapa de dispensación que en la etapa de llenado del pistón,
minimizando de esta forma los efectos de la pulsación.
Principio de Operación
Las válvulas antirretorno (“Check-Valves”) ó válvulas de “Bola y Asiento”
están diseñadas para permitir únicamente un flujo unidireccional de fase
móvil. La “bola”, hecha de un material químicamente inerte como el rubí,
se asienta en un asiento de zafiro sintético.
En función de la posición del pistón en un determinado momento la bola se
encuentra situada directamente contra el asiento, deteniendo de forma
efectiva el flujo de la fase estacionaria, o suspendida en el cuerpo principal
de la válvula, donde ofrece poca resistencia al flujo de la fase móvil,
permitiendo su paso al sistema de HPLC.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Las imágenes ilustran el funcionamiento de las válvulas de entrada y
salida durante los periodos de llenado y dispensación de una bomba
recíproca de pistón simple.
Aunque las válvulas antirretorno proporcionan miles de horas de
funcionamiento ininterrumpido, son componentes consumibles, y como
tales requerirán de limpieza o sustitución después de un uso prolongado. Las
fases móviles sin filtrar, corrosivas o altamente tamponadas reducirán
considerablemente el tiempo de vida de las válvulas antirretorno.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
4.3 La Bomba Recíproca de Doble Pistón
Comparándola con la bomba de pistón simple, el diseño de la bomba
recíproca de doble pistón ofrece flujos más reproducibles con la
correspondiente reducción de las fluctuaciones de presión. Sin embargo, la
mayor complejidad del diseño de la bomba de doble pistón aumenta
también sus requerimientos de mantenimiento, puesto que el pistón
adicional y los sellos del mismo están sometidos también a desgaste y
requieren sustitución.
Principio de Operación
Este diseño de la bomba es muy eficiente, porque mientras un pistón se está
llenando con fase móvil, el segundo pistón está entregando fase móvil al
sistema de HPLC. Este desfase de 180º en el funcionamiento del pistón
produce un flujo de fase móvil virtualmente libre de picos, y permite gran
reproducibilidad en gradientes de fase móvil. Este diseño se utiliza a
menudo junto con un amortiguador de pulsos, para obtener la menor
fluctuación de presión posible durante la dispensación de la fase móvil.
La imagen ilustra el principio de funcionamiento de la bomba recíproca
de doble pistón.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
4.4 La Bomba Binaria de Gradiente
Las bombas isocráticas sirven para atender las necesidades básicas del
cromatografista moderno. Sin embargo, cuando se requiere un gradiente de
fase móvil, durante el cual se introduce gradualmente en la fase móvil un
solvente más fuerte para eluir de la columna los analitos fuertemente
retenidos, se requiere un diseño de bomba más sofisticado.
Hay dos formas básicas de conseguir un gradiente en la fase móvil. La
primera es emplear dos bombas reciprocas trabajando al unísono –esto se
denomina bomba binaria de gradiente. Las bombas binarias consisten en dos
“canales” de solvente, donde cada canal está conectado a una bomba
recíproca idéntica y el flujo de disolvente procedente de cada bomba se
combina en una cámara de mezcla de bajo volumen, un amortiguador de
pulsos, y finalmente una segunda cámara de mezcla.
Los flujos individuales de bombeo –o ratio volumen/flujo- de cada una de
estas bombas recíprocas están controlados electrónicamente, permitiendo
mezclar proporcionalmente el solvente de los dos canales. Por lo tanto, si se
necesita un gradiente con la composición de 50% del solvente A y 50% del
solvente B, las bombas trabajarán a flujos iguales, y si el flujo total deseado
es de 1mL/min, cada bomba entregará el solvente a 0.5mL/min.
Puesto que la mezcla de solventes se produce después de las bombas, se
denomina “mezcla a alta presión”.
La imagen ilustra el principio de operación de la bomba de gradientes de
doble pistón recíproco
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
4.5 La Bomba Cuaternaria de Gradiente
Una solución alternativa para la formación de un gradiente de fase móvil es
usar solamente una bomba de doble pistón conectada a una válvula
proporcional de cuatro canales controlada por el software. La válvula
proporcional se encuentra entre el desgasificador y la bomba, y permite
introducir volúmenes exactos de cada solvente en una cámara de mezcla,
suministrando después la mezcla de solventes formada al sistema de HPLC.
Cada puerto de la válvula solenoide permanece abierto sólo una fracción de
lo que se denomina “ciclo de trabajo” de la bomba. El gradiente de elución
se consigue alternando la fracción de este ciclo en que cada solenoide
permanece abierto, permitiendo que la fuerza de elución efectiva de la fase
móvil cambie en función del tiempo. Por lo tanto, si el ciclo de la bomba es
de un segundo y la composición del gradiente deseada es del 25% de
solvente A, 25% del solvente B, 25% del solvente C y 25% del solvente D,
cada solenoide permanecerá abierto un cuarto de segundo, permitiendo a
las alícuotas de cada uno de los cuatro solventes mezclarse en igual
proporción.
Las características individuales de viscosidad y compresibilidad de cada
solvente afectarán al funcionamiento de la válvula de proporción, y pueden
ajustarse convenientemente desde el software del instrumento.
En comparación con la bomba de gradiente binario, donde la mezcla del
solvente ocurre después de la bomba y se denomina “mezcla a alta
presión”, la bomba de gradiente cuaternario mezcla el solvente antes de la
bomba y se denomina “mezcla a baja presión”. Esta mezcla no es tan
efectiva como la producida a alta presión, y muestra:
•
Menor reproducibilidad del gradiente
Cuando se trabaja a flujos menores de 1.0mL/min p.ej., las bombas
de gradiente binario ofrecen mayor precisión y reproducibilidad que
las bombas cuaternarias. Además, si existe una diferencia apreciable
en la proporción relativa de los solventes mezclados, por ejemplo del
98% de solvente A y 2% del solvente B, de nuevo se obtendrá mayor
reproducibilidad con un sistema de mezcla a alta presión que con uno
que emplee válvula de mezcla a baja presión.
•
Efectos de Cavitación
Durante la mezcla de disolventes en la válvula proporcional pueden
generarse burbujas. Esto es debido a que los gases disueltos tienen
menor solubilidad en la mezcla final que en los solventes iniciales.
•
Líneas de base ruidosas y erráticas
Durante la mezcla a baja presión podría producirse inmiscibilidad
entre los disolventes y formación de burbujas. Estos efectos
producen caídas de presión en la mezcla, variación de los flujos, y
contribuyen a líneas de base erráticas y ruidosas.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La imagen muestra el funcionamiento de la válvula proporcional en una
bomba recíproca de doble pistón
4.6 Formación de Gradientes y Tiempo Muerto
(“Dwell-Time”)
El volumen interno de una bomba de HPLC debería ser idealmente lo más
pequeño posible, esto permite una rápida formación del gradiente y además
una transferencia efectiva de los métodos con gradiente entre sistemas
intra- e inter-laboratorio. El tiempo que se necesita entre la formación del
gradiente de solvente hasta que éste llega al comienzo de la columna
analítica se denomina “tiempo muerto del sistema” (tD).
El tiempo muerto del sistema se calcula determinando primero el “volumen
muerto del sistema (VD), que es característico del volumen extra-columna
mostrado por la bomba y la longitud total de los conectores entre el HPLC, y
se determina como sigue:
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Cálculo del Volumen Muerto del Gradiente
1.
Quitar la columna y conectar el inyector al detector mediante una
pequeña unión de 0.010-in. d.i. (o menor) – esto se suele denominar
“capilar de restricción”. Un regulador de contrapresión después del
detector ayudará a mantener la suficiente presión en el sistema para
un buen funcionamiento de la válvula antirretorno (“Check-Valve”).
2.
Como solvente A usar agua calidad HPLC, y como solvente B añadir
alrededor de 0.1% de acetona a agua HPLC (también puede usarse
metanol o acetonitrilo en lugar de agua).
3.
Ajustar la longitud de onda a la máxima absorbancia del compuesto
añadido (265nm para la acetona).
4.
Realizar un cromatograma a 100% de A y otro a 100% de B, ajustando la
escala de absorbancia en los datos del sistema, para que ambas señales
del solvente muestren una señal dentro de la escala
5.
Programar un gradiente lineal de 0-100% B en 10min a 2mL/min. Las
condiciones exactas no son críticas, simplemente asegúrese que el
volumen total del gradiente es al menos de 20mL. Mantenga una etapa
isocrática al 100% B durante al menos 5min al final.
El cromatograma resultante debería aparecer aproximadamente como
en la figura superior. La etapa isocrática al principio de la gráfica
representa el volumen muerto del sistema (VD), seguido por la etapa
de gradiente, y finalmente la etapa isocrática mantenida hasta el final.
La curvatura del cromatograma debería ser mínima al final del
gradiente, y debería ser lineal excepto al principio y al final.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
6.
Determinar en primer lugar el tiempo de retención del sistema
situando el tiempo a mitad de gradiente (t1/2) – la mitad de la
distancia vertical entre el inicio y el final de los segmentos isocráticos;
9.2min para el cromatograma descrito.
Restar a continuación la mitad del tiempo de gradiente; 10min/2 =
5min para este ejemplo de (t1/2)
El resultado es el tiempo muerto del sistema (tD); 9.2min – 5min =
4.2min.
Finalmente transformar tD en volúmen muerto (VD) multiplicando por
el flujo empleado en el método p.ej. 4.2min x 2mL/min = 8.4mL.
Es esencial que los tiempos de equilibrio de la columna y del sistema se
controlen durante el re-equilibrio del gradiente. Esto es, en este ejemplo,
el tiempo total de equilibrio usando una columna de 150 x 4.6mm a un flujo
de 2mL/min sería:
4.2 min (tD) + (1.7ml (volumen muerto de la columna) / 2ml/min x
número de volúmenes de columna)
O para un re-equilibrio de 5 volúmenes de columna:
4.2 + ((1.7/2) x 5 = 8.45min
O para un re-equilibrio de 10 volúmenes de columna:
4.2 + ((1.7/2) x 10) = 12.7min
Los sistemas de mezclado a alta presión con bombas binarias pueden
conseguir volúmenes extra-columna muy pequeños. Las mezclas a alta
presión proporcionan los menores volúmenes muertos ya que el gradiente se
forma después de la bomba, esto se traduce en un menor tiempo de
retención cuando se requieren gradientes rápidos o muy rápidos. Quitar la
segunda cámara de mezcla reduce aún más el volumen de retención.
El volumen efectivo de mezcla de un sistema de gradiente cuaternario a
baja presión necesita ser mayor que para un sistema de gradiente binario a
alta presión para asegurar una correcta mezcla de solventes. Este hecho
incrementa el volumen muerto, haciendo que la respuesta de estos sistemas
se alargue y los cambios en el gradiente se muestren apreciablemente más
lentos.
Ajustar el volumen de retención (VD) a su HPLC le permitirá una
transferencia del método más eficaz. Compensando los diferentes
volúmenes muertos en diferentes sistemas, los tiempos de retención de los
analitos y por lo tanto el perfil del cromatograma pueden mantenerse
idénticos.
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4.7 Incidencias de la Bomba
La Válvula de Purga
La causa más probable de un incremento de presión en el sistema es un
bloqueo parcial en la primera frita después del sistema de inyección – El
filtro In-Line o la pre-columna- sin embargo si ninguno de estos dos
elementos están instalados, el problema puede venir de la cabeza de la
propia columna. Si tales aumentos de presión son comunes, es
recomendable seguir algunas medidas preventivas adicionales, como instalar
un filtro de línea o someter a las muestra a una filtración previa antes de su
inyección.
El conjunto de válvula de purga contiene PTFE como frita en la mayoría de
los sistemas de HPLC. Está diseñado para eliminar los depósitos que puedan
provenir de los sellos de los pistones arrastrados por la fase móvil. Cuando
esta frita se bloquea se produce un incremento en la contra presión del
sistema. Si esta presión llega aproximadamente a los 10 Bar mientras se
bombea fase móvil con la válvula de purga abierta, debe cambiarse la frita
No sustituir la frita puede dar como resultado una línea de base errática
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
El material del sello del Pistón puede ser arrastrado hasta bloquear la frita
y la parte superior de la columna analítica. Los bloqueos en este punto
retrasan la entrada de los analitos en la columna, produciendo picos no
uniformes con hombros. Este tipo de picos también pueden originarse por
otro tipo de anomalías, pero una frita de columna bloqueada, a menudo
provocará hombros en todos los picos cromatográficos
Una frita de Columna bloqueada por restos del sello de los pistones
produciendo picos con hombro
Pistón y Sellos
Los sellos del Pistón están diseñados para desgastarse con el uso, siendo su
vida útil muy dependiente del tipo y de la concentración de las fases
móviles tampón que se utilicen.
Una fuga en el sello del pistón provoca fluctuaciones en la línea de base
como podemos observar en el gráfico:
Línea de base sinusoidal indicativa de un pistón rallado o sello con fugas
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Cualquier cambio del sello del pistón deberá implicar una inspección visual
del mismo, ya que si existen arañazos en la superficie del pistón, pueden
llevar prematuramente al fallo del nuevo sello reemplazado. Antes de la
inspección del pistón se deben limpiar los posibles depósitos de sales,
principalmente los restos de los tampones o del sello, utilizando un trapo
limpio, sin pelusas, empapado con una mezcla 1:1 de H2O:MeOH , y solo en
una dirección , desde la base hacia el extremo.
Luego, lo examinaremos con luz brillante y con la ayuda de una lupa para
verificar que no hay presente ningún arañazo o estrías.
Los sellos del Pistón están diseñados con frecuencia para deformarse con el
fin de ajustarse al pistón con el que están emparejados. En consecuencia es
posible que haya que sustituir el pistón y el sello al mismo tiempo.
Nota: Algunos fabricantes de instrumentos ofrecen e incluyen accesorios
integrados para la limpieza continua de los sellos facilitando así la
eliminación de los depósitos de cristal que proviene de los tampones
alrededor de los sellos. Con estos accesorios se hace pasar una solución de
lavado por los sellos de pistones para aumentar la vida útil de los mismos.
Una buena solución para lavado es la formada por un 10% de isopropanol en
agua.
En algunos casos esta solución de lavado también sirve para lubricar el
movimiento del pistón a través de un segundo conjunto de sellos residente
en el propio hardware del sello. En ese caso debe usarse siempre una
solución de lavado, incluso aunque no se empleen tampones como fase
móvil.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Válvulas Antirretorno
La cristalización de los tampones, el crecimiento microbiano en las botellas
de los disolventes y el aire pueden perjudicar el sellado entre la bola de
rubí y el soporte o asiento de zafiro en la válvula antirretorno. La
sedimentación y el crecimiento microbiológico pueden provocar que este
problema permanezca constantemente. En estos casos puede observarse una
línea base con fluctuaciones características y repetitivas:
Típica línea de base producida por una válvula antirretorno defectuosa
Para regenerar una válvula antirretorno pegada o parcialmente bloqueada,
se puede seguir el siguiente proceso de limpieza:
Sonicar durante 10mins en una mezcla 1:1 de H2O:MeOH (1:1)
Sonicar durante 10mins en 0.1M HNO3.
Sonicar durante 5mins in MeOH antes de reinstalarla
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Burbuja(s) de Aire en el Cabezal de la Bomba
La captura de aire es un problema relativamente común en bombas de
pistón recíproco, produciéndose en aquellos componentes del sistema que
están contacto directo con la fase móvil como las válvulas de entrada y
salida, pistón, sello del pistón, y cabezal de la bomba.
Las burbujas en el interior de los cabezales de la bomba a menudo generan
una línea de base de tipo sinusoidal:
Las burbujas de aire, si no se introducen directamente en el sistema por una
deficiente desgasificación de la fase móvil, pueden formarse por la creación
de un ligero vacío en el cabezal durante el ciclo de succión (llenado) de la
bomba. La combinación de baja presión, permitiendo la desgasificación, y
los “puntos de nucleación” de la superficie de de los componentes son
ideales para la creación de burbujas.
La válvula proporcional, utilizada para la mezcla en los sistemas a baja
presión
para la creación las condiciones isocráticas o en gradiente
requeridas, puede también introducir burbujas debido a la menor
solubilidad del aire en la mezcla de solventes comparada con la de los
solventes puros individuales. Este efecto se denomina “cavitación”.
Una vez que la pequeña burbuja se ha formado puede actuar en realidad
como un amortiguador de presión, amortiguando el efecto de succión y
dispensación de la bomba, haciendo que ésta proporcione un flujo bajo y a
menudo errático. Aflojar ligeramente las conexiones de las válvulas de
salida y dejar fluir fase móvil del cabezal de la bomba puede servirnos para
purgar las burbujas de aire. En la mayoría de las ocasiones simplemente
abrir la válvula de purga y aumentar el flujo de fase móvil - a flujos de hasta
5mL/min- será suficiente para eliminar las burbujas de aire presentes.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Una disminución de la presión de trabajo generalmente implica una fuga en
el sistema. Debe corregirse apretando, reajustando o cambiando el conector
defectuoso. Los fabricantes a menudo incorporan un test específico para el
diagnóstico de fugas, que puede realizarse para verificar la integridad del
cabezal de la bomba y otros componentes del sistema. El fallo en alguna
parte del test puede relacionarse con el mal funcionamiento de algún
componente específico del sistema cromatográfico reduciéndose así el
tiempo en que el instrumento queda fuera de operación al detectarse más
rápidamente la avería.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Tutorial 1
Pregunta 1
Del siguiente listado de componentes selecciona aquellos que contribuyen a
un ensanchamiento de las bandas cromatográficas, es decir, disminuyen la
eficiencia en un sistema típico de HPLC
Componente HPLC
Si/No
Tubos de conexión
Filtro de Línea
Cabezales de la bomba
Guarda-columna
Inyector
Conexiones-uniones
Celda de flujo del Detector
Botellas de disolvente
Columna Analítica
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 2
La ilustración siguiente es el diagrama esquemático de un cabezal de doble
pistón recíproco. Identifica y etiqueta cada componente.
Usando la tabla siguiente, explica cual es la función de cada uno de los
componentes e indica cuál es su fallo asociado más frecuente
Componente
del Equipo
Función
Incidencia
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 3
Evaluar el problema propuesto en el siguiente cromatograma y sugerir las
posibles causas y cómo podemos corregirlo
Pregunta 1
Observaciones:
Posible(s) Causa(s) y Solución(es):
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 4
Un gas disuelto en la fase móvil puede provocar múltiples problemas
cromatográficos. Considera éstos y completa la siguiente tabla.
Problema Observado
Causa
Acción Correctora
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
5
Inyectores
El Objetivo de esta sección es:
•
•
•
Describir la función del sistema de inyección del HPLC.
Explicar los principios de operación de los sistemas de inyección HPLC
más comunes.
Enumerar y describir las incidencias más frecuentes y los
procedimientos de mantenimiento.
5.1 Componentes del Sistema de Inyección
El sistema de inyección se encuentra situado después de la bomba, estando
por lo tanto localizado en la parte alta presión del sistema de suministro de
solventes. La inyección de una muestra (a baja presión) en el sistema
representa una etapa crítica del proceso cromatográfico. Las válvulas de
inyección de muestra, o válvulas de conmutación, permiten la introducción
de cantidades precisas de muestra en el sistema y en la columna.
Inyectando directamente en el flujo de fase móvil a alta presión se elimina
la necesidad de parar el flujo de fase móvil, minimizando así de forma
efectiva cualquier perturbación en la línea de base cromatográfica
realizando un cambio, esencialmente libre de pulsaciones, en la dirección
del flujo de fase móvil.
La figura siguiente muestra la válvula de conmutación Rheodyne de 6
puertos y dos posiciones, cuyo diseño conforma la base para todas las
válvulas de inyección. La válvula se compone de una parte estática
(“stator”) enfrentada a un sello giratorio (“rotor seal”), en el que se han
mecanizado unos canales entre los puertos que permiten que el flujo de
fase móvil evite el loop(*) de inyección (“by-pass”) para la carga de muestra
(“load”), o vaya hacia él (“inject”) para la inyección de la muestra.
En la posición intermedia entre “load” e “inject”, el sello del rotor bloquea
momentáneamente el flujo de fase móvil hacia la columna. Este bloqueo
causa un pulso de presión en cabeza de columna, porque por un tiempo
finito el flujo efectivo de fase móvil cae a cero. Puesto que tales pulsos no
son deseables, la válvula debe girarse lo más rápidamente posible para
minimizar cualquier pulso de flujo y presión. Además, estos repetidos
choques de presión pueden dañar la columna, comprimiendo su fase
estacionaria y provocando la aparición de volúmenes muertos que
producirán formas de pico cromatográfico defectuosas, ejemplificadas por
la aparición de hombros y desdoblamiento en los picos.
(*) La traducción de LOOP es BUCLE pero ha preferido mantenerse la palabra
inglesa original por la generalización de su uso en el argot cromatográfico.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Componentes de una válvula de conmutación Rheodyne de 6 puertos
El Rotor es un disco fabricado normalmente en material polimérico Vespel.
Esta poliimida confiere al rotor unas características de bajo desgaste y alta
Resistencia, admitiendo un rango de pH de 0−10.
Figura mostrando rotores de inyección de Vespel
.
Para fases móviles con pH sobre 10 se recomienda un Rotor Seal compuesto
de material polimérico Tefzel o PEEK, ya que ambos proporcionan mayor
resistencia química y versatilidad en el rango completo de pH de 1−14. Los
ácidos oxidantes fuertes, como el Ácido Nítrico o el Sulfúrico no son
compatibles con PEEK.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Figura mostrando el rango de pH de los diferentes materiales
NB: los colores de pH mostrados son sólo con fines ilustrativos
El rotor está situado internamente en el cuerpo de la válvula de inyección, y
hace un cierre a alta presión contra la cara del estátor. Como el rotor gira
físicamente en cada secuencia de inyección, y sufre un deterioro de los
canales entre los puertos por la exposición a un pH alto y por las raspaduras
producidas por la fase móvil o partículas contenidas en los solventes, se
desgastará con el uso. En consecuencia, este es uno de los componentes del
HPLC que necesitarán una sustitución rutinaria.
La cara del estátor y el cabezal permiten la introducción y expulsión de la
fase móvil a través de los puertos capilares específicos de entrada y salida.
El puerto de inyección facilita el llenado del loop de muestra con una
jeringa, mientras que el puerto de desechos (“waste”) ventea el loop
permitiendo que se elimine el exceso de muestra.
Existen varias configuraciones para la inyección de un determinado volumen
de la solución de muestra en la fase móvil; uno, muy ampliamente utilizado
emplea un loop de inyección de volumen pre-determinado. Este loop puede
llenarse de dos formas distintas:
Llenado Completo del Loop
Puesto que el loop contiene fase móvil, la solución de muestra introducida
se mezclará y se diluirá necesariamente con esta fase móvil residente
mientras la desplaza. Por tanto, para que el loop se rellene de forma
homogénea, debe inyectarse un volumen de solución de muestra de entre 2
y 5 veces el volumen del loop, eliminando así cualquier posible efecto de
dilución.
Aunque el loop controle efectivamente el volumen de muestra inyectada,
haciendo que la cantidad de muestra introducida por la jeringa no sea un
parámetro critico, para obtener máxima precisión y linealidad es una
práctica recomendada cargar siempre el loop con el mismo volumen de
muestra p.ej. 3x volumen del loop ± 10%, En consecuencia, para un loop de
100µL se correspondería con un volumen de 270−330µL por inyección. La
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reproducibilidad es esencial para mantener la precisión y exactitud; El
volumen absoluto inyectado es de menor importancia.
Llenado Parcial del Loop
La técnica de llenado parcial del loop se utiliza habitualmente cuando es
importante ahorrar una muestra valiosa o limitada. Para obtener la mejor
precisión posible el volumen de muestra inyectada no debe superar el 50%
de la capacidad del loop del inyector. Durante la carga del loop, la muestra
introducida “empuja” a la fase móvil de su interior enviándola fuera a
través de la salida de desechos (“waste”), y durante ese proceso de
intercambio el frente de muestra se diluye.
Este efecto de dilución está causado por el perfil de flujo parabólico de un
líquido en movimiento por el interior de un segmento de tubo ya que
debido al flujo laminar, el centro de la corriente de fluido se mueve más
deprisa que la capa de líquido que está cerca de la pared del tubo. Una
forma de evitar la citada discriminación durante la inyección es inyectar una
burbuja de aire inmediatamente delante del volumen de muestra inyectado.
De esta forma se evita cualquier posible mezcla de la solución de muestra
con la fase móvil contenida en el loop.
La consecuencia de este fenómeno es que la muestra diluida ocupa en
realidad unos 2µL del volumen del loop por cada 1µL de la muestra cargada
con la jeringa. Por lo tanto, asegurándonos de cargar <50% del volumen
efectivo del loop, evitamos que el frente de la banda de muestra diluida
salga del loop y provoque errores relacionados con la precisión y a la falta
de reproducibilidad.
Este efecto se muestra en el siguiente conjunto de figuras, que ilustra los
efectos de la dilución de muestra en el área de pico obtenida:
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
1.
Injección de 1µL de muestra en un loop de volumen fijo de 20µL. Los
efectos de flujo laminar crean un tamaño de muestra diluida de 2µL.
2.
Injección de 5µL de muestra en un loop de volumen fijo de 20µL. Los
efectos de flujo laminar crean un tamaño de muestra diluida de 10µL.
3.
Injección de 10µL de muestra en un loop de volumen fijo de 20µL. Los
efectos de flujo laminar crean un tamaño de muestra diluida de 20µL.
4.
Inyección de 20µL de muestra en un loop de volumen fijo de 20µL. El
volumen de inyección es el mismo que un llenado completo del loop.
Los efectos de flujo laminar crean un volumen de muestra
ligeramente diluido.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La figura anterior muestra los efectos de dilución representando el área
obtenida frente a los diferentes volúmenes de inyección en un loop de
volumen fijo de 20µ
µL.
Cuando se carga un volumen <10µL de muestra existe una relación lineal
entre el volumen introducido en el loop y la cantidad de muestra inyectada
en columna. Cuando se cargan >40µL, el volumen real inyectado es ± 5% del
volumen del loop.
Sin embargo, en el rango entre 10−40µL se observa una relación no-lineal
diferente.
Después de la inyección son necesarios 5−10 volúmenes de loop para
desplazar completamente la muestra del mismo. Se recomienda por tanto,
mantener el inyector en la posición "inject" (paso principal) el tiempo
necesario para permitir que la fase móvil fluya a través del loop arrastrando
completamente la muestra.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
5.2 Automuestreadores
Los automuestreadores son ampliamente utilizados en los laboratorios de
análisis para aumentar el nº de muestras analizadas, mejorar la precisión,
eliminar la necesidad de que haya personal presente para hacer las
inyecciones manuales y reducir los costes laborales asociados al análisis
rutinario.
Aunque los fabricantes han diseñado automuestreadores bajo diferentes
principios y estrategias, todos ellos incluyen cuatro componentes esenciales
que permiten el automatismo mecánico del sistema de inyección manual:
1.
2.
3.
4.
Las muestras se mantienen en viales de tamaño estándar. Cada vial
está sellado con un septum, que, o bien es parte integral del tapón, o
se ajusta en su lugar gracias a éste, evitando la evaporación selectiva
del disolvente de la muestra y los consiguientes de cambios en su
concentración.
Los viales están situados en gradillas que permiten un orden de
inyección aleatorio o en serie. Dichas gradillas pueden ser
termostatizadas para evitar la degradación de las muestras
térmicamente lábiles.
Se emplea una aguja de inyección para penetrar el septum, y tomar el
volumen de muestra requerido para la inyección. Dependiendo del
automuestreador, dicha aguja puede ser fija o intercambiable.
Una válvula de inyección commutable que permite la introducción de la
muestra en el loop previamente a la inyección. La conmutación de
dicha válvula de inyección se realiza bien por un actuador neumático o
eléctrico.
La mayoría de automuestreadores emplean alguna de las tres
configuraciones de carga siguientes, en las que la muestra es o bien
“extraída” o “empujada” hacia un loop de volumen fijo, o bien la aguja de
inyección es parte integral del loop de inyección.
5.2.1
Automuestreador
Llenado”
de
“Extracción-
Este diseño de automuestreador extrae la muestra en la dirección del loop
por succión con la jeringa. Debido a su simplicidad y fiabilidad fue muy
popular, pero actualmente es redundante debido a los otros dos diseños.
A continuación se muestra el esquema de operación de este tipo de
automuestreador. Se une una jeringa al puerto de desechos y una aguja,
por medio de tubos de conexión, al puerto de inyección. La aguja se inserta
en el vial y extrae muestra de éste hasta que se ha llenado el loop con el
volumen de inyección especificado. El giro posterior del rotor de la válvula
de inyección permite arrastrar la muestra contenida en el loop hacia la
cabeza de columna.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Load
Position
Inject
Position
Aunque es a la vez simple y fiable, este diseño de automuestreador adolece
de una excesiva pérdida de muestra durante la secuencia de inyección.
Como muestra la figura, es necesario mucho volumen de muestra para llenar
la aguja y sus tubos de conexión antes de llegar al loop, y en consecuencia
se pierden entre 10−100µL de muestra por inyección.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
5.2.2
Automuestreador de “Empuje-Llenado”
En este diseño de automuestreador la aguja se mueve hacia el vial, toma el
volumen requerido de muestra y se mueve entonces hacia el puerto de
inyección para “empujar” la muestra al interior del loop. El llenado y
vaciado de la jeringa se controla con un motor de pasos que es capaz de
ofrecer una dispensación de volumen precisa y reproducible.
Aunque generalmente queda un pequeño volumen residual de muestra en la
aguja y su capilar de conexión, éste diseño no presenta el gran desperdicio
de muestra mostrado por el diseño “extracción-llenado”, y en consecuencia
requiere un menor volumen “extra” de muestra. Esta característica es una
ventaja para el análisis de trazas, donde a menudo el volumen de muestra
disponible es limitado.
Load
Position
Wash
Step
Inject
Position
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
5.2.3
Automuestreador de Loop Integrado
Aunque es más complicado de operación que los dos diseños previos, las
características del diseño del automuestreador de loop integrado aseguran
que no haya pérdidas de muestra y como consecuencia de ello haya ido
aumentando su popularidad.
La serie de figuras mostrada a continuación ilustra la secuencia de eventos
de carga e inyección de muestra:
1.
Se dispensa y/o succiona un disolvente de lavado a través del loop, con
la aguja asentada firmemente en un asiento de aguja de alta presión.
2.
Después de lavar la aguja, ésta se mueve hacia el vial, donde se extrae
el volumen especificado de muestra directamente hacia el loop por
medio de un sistema de medida calibrado. El sistema de medida se
compone de un pistón y su sello, que pueden desgastarse produciendo
fugas y volúmenes de inyección no reproducibles.
3.
La aguja se inserta de nuevo en el asiento de inyección de alta presión
y el rotor de la válvula de inyección se mueve hacia su posición de
inyección con lo que la muestra es arrastrada hacia la cabeza de
columna.
Puesto que la muestra se encuentra completamente contenida en la porción
del loop barrida por la fase móvil, se inyecta toda la muestra que fue
extraída del vial. Además, el lavado continuo de la válvula de inyección y el
loop, que se produce tras la inyección, elimina los efectos de memoria
(“sample carry-over”).
El volumen máximo que puede inyectarse es función del tamaño del loop
integrado, típicamente 100µL. Los fabricantes ofrecen también una
función de multi-extracción (multidraw option) para compensar esta
limitación en el volumen de inyección. Cuando se emplea esta opción se
permite que varios volúmenes de 100µL sean combinados hasta un máximo
de 1.400mL aumentando así el volumen de inyección y ayudando al análisis
de trazas.
La parte más débil de este diseño de automuestreador es el sello de alta
presión, que tras las repetidas inserciones de la aguja eventualmente se irá
desgastando y fugará siendo necesaria su sustitución.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La ruta que sigue la fase móvil en su
paso por el automuestreador se
denomina a veces “‘main pass’ o
camino principal
El sello del Rotor gira para permitir a la
aguja que entre en el vial de muestra y al
pistón que extraiga ésta hacia el loop.
La Fase Móvil evita (“by-pass”) los
principales componentes del sistema de
inyección. Esta posición se conoce
frecuentemente como posición de “bypass”
o de carga”Load”
Posición de
Carga
El Rotor vuelve a su posición inicial
(“main pass”) y la Fase Móvil empuja
la muestra contenida en el loop
hacia la columna
Posición de
Inyección
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
5.3 Incidencias del Automuestreador
La tabla siguiente muestra los problemas citados con más frecuencia sobre
los automuestreadores:
Problema
% del Total
Obstrucción de la aguja de muestra
22
Mala precisión y reproducibilidad
17
Problemas mecánicos
14
Posición de la Gradilla e
Identificación de la muestra
12
Efecto Memoria
9
Fugas
9
Sellos
7
Prestaciones
6
Otros
5
Fuente − LC-GC Europe Volume 4, No.5 (1986) Pg. 416−420
La aguja de muestra
La obstrucción de la aguja de muestra es el problema más frecuente que
presentan los automuestreadores. Una preparación adecuada de la muestra
ayudará por lo general a reducir el número de problemas creados por
partículas, bien filtrando o centrifugando las muestras antes de su
inyección.
Para desbloquear una aguja obstruida se recomienda la siguiente secuencia
de limpieza:
1.
2.
3.
Empape la aguja con un disolvente apropiado p.ej. isopropanol.
No sonique la aguja si está soldada al capilar ya que existe la
posibilidad de que se fracture o se rompa por la unión.
Intente desplazar la obstrucción con un alambre.
Conecte la aguja a la bomba por medio de un capilar y haga fluir
disolvente con presiones progresivamente crecientes para “reventar” la
obstrucción.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
El asiento y el capilar de alta presión
Las fugas en esta zona son por lo general
detectables a simple vista y bastante evidentes.
El asiento de la aguja se deformará para ajustarse
a la forma exacta de la aguja, por lo que la aguja
y el asiento deberán cambiarse al mismo tiempo
La muestra y la fase móvil comienzan a mezclarse justo después del asiento
de aguja de alta presión. Este capilar es propenso a obstruirse bien por
partículas de desolvatación de las muestras o de los tampones sólidos. El
ruido esporádico (Spikes) en la inyección es un indicador de tales
obstrucciones.
El Rotor Seal
El Efecto memoria, junto a una mala precisión en areas y alturas, son
indicios de un rotor seal agotado. El rotor seal debe revisarse para buscar
síntomas de desgaste, especialmente un ahondamiento en los microcanales
entre los puertos que puede generar puntos de retención de muestra
localizados. Estos puntos se “limpian” en la siguiente inyección produciendo
un mini-cromatograma o picos fantasma.
Un pico fantasma causado por contaminación en el rotor seal
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Figura mostrando la adsorción y efecto memoria de un rotor seal
Algunos materiales de rotor pueden adsorber menos la muestra que otros
por lo que puede merecer la pena investigar si el efecto se reduce o se
elimina cambiando entre Vespel, Tefzel y PEEK.
El lavado regular con fase móvil puede ayudar a minimizar la contaminación
del rotor seal.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Ajuste del volumen de inyección al poder de elución del
disolvente de la muestra
En condiciones ideales el poder de elución del disolvente de la muestra no
debería afectar a la separación cromatográfica, ya que éste se diluiría de
forma instantánea hasta tener la misma composición que la fase móvil.
Sin embargo, esta dilución del disolvente de la muestra lleva en la práctica
un periodo de tiempo finito para que la fase móvil la realice.
Las siguientes figuras ilustran el deterioro de la forma de pico debido a una
inadecuada combinación de disolvente de muestra y fase móvil, mostrando
la inyección de una mezcla test de cuatro componentes disueltos en
diferentes disolventes y separados en una columna C18 de fase reversa en
condiciones isocráticas de MeOH:H2O 60:40 (v/v).
En cada cromatograma la mezcla test estaba disuelta en:
•
•
•
•
(a) − Fase Móvil
(b) − Tetrahidrofurano
(c) − Etanol
(d) − Butanol
La siguiente tabla proporciona unas guías para elegir el volumen de
inyección en función del poder de elución de los disolventes de la muestra
con respecto a la fase móvil.
Fuerza Eluotrópica del Disolvente
Volumen Máximo de Inyección
100% Disolvente Fuerte
≤10µL
Algo más fuerte que la Fase Móvil
≤25µL
Fase Móvil
≤15% del volumen de pico
Más débil que la Fase Móvil
Grande
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
100% Disolvente Fuerte
En esta exigente situación es necesario mantener el volumen de inyección lo
más bajo posible para evitar la distorsión de los picos. La recomendación es
no superar los 10µL. Cuando el disolvente de la muestra es más fuerte que
el 80% de Fase Móvil se pueden inyectar volúmenes mayores puesto que la
diferencia de composición entre el disolvente de la muestra y la fase móvil
es proporcionalmente menor.
Más Fuerte que la Fase Móvil
Cuando el disolvente de la muestra no es más de un 25% más fuerte que la
fase móvil, es posible inyectar volúmenes de hasta 25µL. Observe no
obstante el cromatograma para vigilar la posible distorsión en los picos dada
la interrelación existente entre esta regla y la anterior.
En general, los problemas de solubilidad de los analitos son la razón
principal para aumentar el poder de elución de los disolventes de muestra
empleados. Para minimizar las variaciones de poder elución en la inyección,
se recomienda disolver el analitos en una alta concentración del disolvente
de mayor poder de elución y después, diluirlo con el disolvente más débil
para corregir progresivamente la diferencia de fuerza eluotrópica. En el
peor escenario posible hay que disolver la muestra en un 100% de disolvente
fuerte y mantener el volumen de inyección al mínimo posible.
Fase Móvil
La mejor situación posible es que el disolvente de la muestra y la fase móvil
sean iguales, tanto en poder de elución como en pH. En esta situación,
debido a la homogeneidad de disolventes, no hay que preocuparse por los
efectos de dilución.
Sin embargo, el volumen de inyección es limitado. La contribución del
volumen de inyección al ensanchamiento del pico cromatográfico puede
determinarse con la siguiente ecuación:
Vol. Muestra.Inyectada2 + Vol.PicoColumna2 = Vol.PicoTotal2
Si el pico más estrecho (p.ej. el primero) fuese de 30 de anchura a línea de
base, Su volumen de pico en columna (Vol.PicoColumna) a un flujo de 1mL/min
sería igual a,
(1mL/min / 60) x 30 = 500µL
En consecuencia, el volumen máximo de muestra que puede inyectarse sin
aumentar el ancho de pico más de un 1% sería igual a,
Vol.
Vol.
Vol.
Vol.
Vol.
Muestra.Inyectada2 = Vol.PicoTotal2- Vol.PicoColumna2
Muestra.Inyectada2 = (505µL)2 – (500µL)2
Muestra.Inyectada2 = 5025
Muestra.Inyectada = √5025
Muestra.Inyectada = ~70µL
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Más Débil que la Fase Móvil
Para establecer el efecto del poder de elución de la fase móvil hay que
considerar la “Regla de Tres”, que establece que un cambio del 10% en el
disolvente fuerte producirá aproximadamente un cambio de tres veces en el
tiempo de retención de los analitos.
Por lo tanto, si un pico cromatográfico tiene un tiempo de retención de
5min en una fase móvil 40:60 agua:acetonitrilo, en una fase móvil de 60:40
agua:acetonitrilo su tiempo de retención aumentará hasta aproximadamente
45min (3 x 3 x 5min = 45min).
En consecuencia, si la muestra se inyecta en 60:40 agua:acetonitrilo, las
moléculas de analito viajarán más lentamente a través de la columna, hasta
que el disolvente de muestra sea completamente diluido por la fase móvil.
Las bandas cromatográficas que se mueven más lentamente que la fase
móvil tienden a comprimirse, debido a que la fase móvil alcanza a las
moléculas de analitos en la “cola” del pico tenderán a moverse más rápido
en la columna, cazando a las moléculas de analito adelantadas que se
encuentran en la fase móvil de menor poder de elución.
Cuando la diferencia entre la fuerza eluotrópica del disolvente de la
muestra y la de la fase móvil aumenta, es posible aumentar
progresivamente cada vez más el volumen de inyección. Este aumento
permite un “enfoque”, o “concentración” de los analitos en la columna y se
emplea a menudo en análisis medioambientales para facilitar la detección
de trazas de pesticidas.
Excepciones a lo anterior son los casos en que la fase móvil contenga
aditivos a nivel de traza, en ese caso se recomienda siempre inyectar las
muestras disueltas en fase móvil. P.ej. las separaciones por par-iónico se
basan en el equilibrio entre el reactivo de par-iónico entre la fase móvil y la
estacionaria. Si se inyecta la muestra en un disolvente que no contenga el
par-iónico este equilibrio se desplaza a la fase móvil provocando distorsión
en los picos.
Aunque las inyecciones de loop parcial son generalmente menos precisas
que las que realizan el llenado completo del loop, este problema se reduce
con los automuestreadores gracias a que su elevada precisión en la
inyección hace que este error sea constante.
En condiciones normales la línea de desechos (“waste”) de los a
automuestreadores de loop integrado nunca se utiliza. Pueden aparecer
problemas de precision cuando la línea de desechos se obstruye
parcialmente con sales de los tampones o cualquier otro residuo de la
evaporación del disolvente de la muestra. Se recomienda lavar la línea de
desechos regularmente, lo que será una práctica habitual de la operación
con automuestreadores.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Debe considerarse la viscosidad del disolvente de la muestra. Si la aguja de
inyección intenta extraer a demasiada velocidad el volumen de un
disolvente viscoso, puede que el volumen de inyección seleccionado no
entre completamente en el loop. Este fenómeno se denomina “cavitación”,
y produce formación de burbujas, comprometiendo la repetibilidad del
automuestreador.
Pueden aparecer también problemas de precisión si el vial de muestra se
llena en exceso. En estas circunstancias se produce un vacío parcial, que es
suficiente para producir cavitación cuando se extrae la muestra. Se
recomienda no llenar los viales a más de tres cuartos de su capacidad para
minimizar el impacto de dichos efectos.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Problemas Mecánicos
Una operación fiable del automuestreador requiere que se mantenga limpio
y se compruebe regularmente su adecuado ajuste. Hay que limpiar
rápidamente todas las salpicaduras de tampones y/o reactivos para prevenir
la creación depósitos, que pueden corroer o restringir el movimiento del
automuestreador. Por esta razón los viales de muestra nunca deben
rellenarse cerca del autoinyector.
Debe comprobarse periódicamente el alineamiento de la gradilla de
muestras, muchos fabricantes incorporan mensajes de error en sus softwares
para avisar que la gradilla no está o está incorrectamente colocada.
Muy importante, el automuestreador es una parte del sistema HPLC que
debe lavarse exhaustivamente con fase móvil después de análisis de
muestras con tampones o fases móviles tamponadas. Reemplazar en primer
lugar el componente tampón de la fase móvil por H2O para eliminar
cualquier depósito de sales potencialmente corrosivas en la válvula de
inyección, aguja del inyector y capilares. Después, extrayendo la columna si
fuera necesario, lavar con H2O para asegurar que todas las trazas de las
sales del los tampones se eliminan completamente.
Posición de la Gradilla e Identificación de Muestra
Las
muestras
incorrectamente
identificadas
pueden
provocar
potencialmente consecuencias graves en los resultados reportados. Aunque
las imprecisiones de la inyección se pueden corregir con un apropiado
estándar interno y un bloqueo o fallo mecánico se evidencia porque no se
realiza la inyección de la muestra, el posicionamiento del automuestreador
es crucial para una inyección correcta. Los automuestreadores emplean
sensores ópticos o mecánicos para asegurar la adecuada selección del vial, y
éstos deben mantenerse limpios y en adecuado funcionamiento.
Una rápida revisión visual de los cromatogramas y los datos de muestra
asociados para comprobar si los estándares se correlacionan
adecuadamente, antes de sacar ningún vial del automuestreador, permitirá
la identificación de cualquier muestra que requiera un re-análisis.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Efecto Memoria
El Efecto Memoria aparece cuando la inyección de un blanco de disolvente
produce una mini versión del cromatograma inyectado previamente. En la
mayoría de los casos este efecto se produce en la válvula de inyección
debido a adsorción de muestra.
El Efecto Memoria entre inyecciones puede eliminarse de diferentes formas:
•
Implementando un régimen de lavado de la aguja entre inyecciones.
Los automuestreadores de loop integrado están configurados para
mantener la orientación de la inyección de muestra, permitiendo así
el lavado continuo del sistema de inyección y de la válvula de
inyección durante todo el cromatograma y reduciendo o eliminando
de esta forma el efecto memoria.
Otros diseños de automuestreadores permiten lavados de aguja y/o
de jeringa entre las inyecciones. Esta solución de lavado puede
provenir de una fuente externa rellenada independientemente, o bien
puede encontrarse en la propia gradilla del automuestreador en una
posición definida por el usuario.
•
Minimizando el impacto del Efecto Memoria
La dilución de muestra, además de mejorar la precisión del
automuestreador como se estudió anteriormente, reduce el efecto
memoria porque los automuestreadores tienen un volumen muerto
finito p.ej. 0.1µL, que representa el volumen de muestra residual.
Por lo tanto, con una inyección de muestra de 10µL este volumen
residual generaría un 1% de efecto memoria, pero sería solo del 0.1%
para una inyección de 100µL.
Como alternativa a la dilución se recomienda ordenar las muestras de
menor a mayor concentración, ya que un efecto memoria de volumen
fijo generará menos problemas cuando a una concentración baja le
sigue una mayor que al revés.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
El Efecto memoria, junto a una mala precisión en áreas y alturas, son
indicios de un rotor seal agotado. El rotor seal debe revisarse para buscar
síntomas de desgaste, especialmente un ahondamiento en los microcanales
entre los puertos que puede generar puntos de retención de muestra
localizados. Estos puntos se “limpian” en la siguiente inyección produciendo
un mini-cromatograma o “picos fantasma”.
El Efecto memoria o los picos fantasma también pueden ser consecuencia de
materiales adsorbidos provenientes de la inyección previa que han sido
desorbidos en la nueva solución de muestra inyectada. Tal adsorción puede
ocurrir en varios puntos del sistema de inyección, y puede comprobarse
lavando éste con 10 x 5 volúmenes de loop para a continuación re-inyectar
un blanco. Si no aparecen picos hay que optimizar la rutina de lavado o
investigar posibles modos de adsorción de los componentes de la muestra en
la superficie de los componentes del inyector y corregirlos cuando sea
necesario.
Algunos materiales de rotor pueden adsorber menos la muestra que otros
por lo que puede merecer la pena investigar si el efecto se reduce o se
elimina cambiando entre Vespel, Tefzel y PEEK.
Fugas
El Aire puede introducirse potencialmente en el sistema a través de las
paredes permeables de los tubos de PTFE empleados en el automuestreador.
Esto no representa problemas si se utilizan en su lugar tubos de acero
inoxidable o PEEK en la sección de toma de muestra de la unidad.
Una tuerca conectada o parcialmente apretada en la conexión del loop de
muestra con la aguja de inyección puede también provocar la entrada de
aire cuando la muestra se succiona desde el vial.
Un cuerpo de la válvula de inyección mal montado, o un componente
“sospechoso” pueden producir también fugas en el cuerpo de la válvula.
Desmonte la válvula y vuelva a montarla según las instrucciones del
fabricante para solucionarlo.
Debido a su creciente complejidad, los inyectores más caros tienen más
áreas con fallos potenciales, y por lo tanto, mayor mantenimiento. Sin
embargo, también disponen de sistemas mejorados de detección de fugas
y/o burbujas y una mayor precisión en la inyección de volumen variable.
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- 85 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
6
Columnas
Los objetivos de esta sección son:
•
•
Describir los procesos generales de limpieza, purga y almacenamiento
de las columnas HPLC.
Relacionar y describir los procedimientos de diagnóstico y
mantenimiento más comunes.
6.1 Limpieza, Purga y Almacenamiento de la
Columna
Limpieza
Las columnas deben limpiarse antes de su purga y almacenamiento ya que
este proceso permite regenerar la superficie de la fase estacionaria después
de un uso prolongado, asegurando así la eliminación de contaminantes o
aditivos de la fase móvil que pudieran haber quedado fuertemente
retenidos. Este proceso tiene la misma importancia tanto si la columna se
ha utilizado para una única aplicación o analito en particular, como si ha
sido empleada para la separación de analitos o métodos diferentes.
La limpieza de columna debe realizarse rutinariamente al final de cada lote
de muestras cuando se emplea una separación isocrática para prevenir de
esta forma la acumulación de contaminantes provenientes de las muestras.
Los métodos que empleen análisis en gradiente en cambio, limpian ya la
columna cuando la proporción del disolvente de mayor poder de elución se
aumenta al final de cada análisis. Limpiar exhaustivamente una columna nos
asegura que el siguiente usuario no experimentará tiempos de equilibrio
prolongados
ni deberá realizar un gran número de inyecciones de
acondicionamiento.
Purga de la Columna
Después de la Limpieza, la columna debe ser convenientemente purgada
para eliminar cualquier traza de sales (tampones)
y/o aditivos
provenientes de la fase móvil. Estas sales pueden precipitar introduciendo
partículas que causarán bloqueos provocando el aumento de la presión de
trabajo. En ocasiones, algunas sales empleadas como tampones, pueden
ser de naturaleza corrosiva pudiendo provocar daños en la superficie
metálica del interior de la columna si quedasen retenidas en el ella varios
días, generando así un aumento del ruido de línea de base o incluso
produciendo fugas.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Almacenamiento de la Columna
La lectura de la documentación proporcionada por el fabricante de la
columna nos indicará cuál es el disolvente apropiado para su
almacenamiento. Si se requiere cambiar de disolvente a otro no miscible
con el que actualmente contiene la columna, deberá emplearse un
disolvente intermedio que sea miscible con ambos.
Al desconectar la columna del equipo deben apretarse convenientemente
los tapones para evitar la evaporación del disolvente de almacenamiento y
el consiguiente secado de la fase estacionaria.
A continuación se
almacenamiento que
estacionarias con base
del fabricante para
columna.
describe un protocolo genérico de purga y
puede utilizarse con la mayoría de las fases
de sílice. Por favor, consulte la literatura específica
comprobar requerimientos especiales para cada
1.
Sustituya la fase móvil que contiene el tampón por H2O, y cambie a una
composición idéntica de H2O: orgánico a la utilizada en el método de
separación original. Esta etapa limpia de forma muy eficiente la
columna y el sistema dejándolos libres de cualquier sal de los tampones
que pudiera precipitar.
Por ejemplo, Si la fase móvil es 50mM KH2PO4 y Acetonitrilo 60:40
(v/v), sustituiremos el 60% de tampón KH2PO4 con Agua purgando
abundantemente.
Se recomienda utilizar típicamente 10 volúmenes de columna, aunque
si se han empleado reactivos formadores de pares de iones, pueden ser
necesarios de 30 a 50 volúmenes para asegurar la limpieza correcta.
2.
Después de la purga pasar a 95:5 (v/v) H2O: orgánico. Este proceso
puede realizarse a una velocidad de cambio del 10% de orgánico por
minuto, de forma que el alto contenido de H2O elimine todas las trazas
de sales tampón, eliminado así la posibilidad de precipitados
posteriores al pasar eluyentes que contengan una alta concentración de
orgánico.
Se recomienda en esta etapa purgar con 5 volúmenes de columna.
Nunca se deben usar las columnas de fase reversa a un 100% H2O o
podrían quedar desactivadas por un colapso de fase. El colapso de fase
se produce habitualmente cuando la fase móvil tiene un contenido de
agua mayor del 95%, y se describe como una auto-asociación de los
ligandos hidrofóbicos alquil y aril de la fase estacionaria en un intento
de evitar a un eluyente altamente polar.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Como consecuencia de este proceso la superficie de la sílice se
desactiva con respecto a los analitos no polares y sus tiempos de
retención se reducen con la consiguiente pérdida de resolución.
La Figura muestra la auto-asociación de los ligandos de la fase
estacionaria en presencia de una fase móvil altamente acuosa.
Solo debe emplearse un 100% H2O si la columna ha sido diseñada por el
fabricante como compatible con fases móviles 100% acuosas. Las
columnas que son capaces de trabajar a 100% de agua tienen
típicamente una fase estacionaria modificada en la que los ligandos se
han protegido del colapso de fase incorporándoles un grupo funcional
polar en el interior de su estructura. La misión de ese grupo funcional
es adsorber una capa de H2O de forma que se sitúe bajo la porción
hidrofóbica del ligando eliminándose así la posibilidad de un colapso de
fase.
La Figura muestra la activación de la fase estacionaria en presencia
de un solvente orgánico.
3.
Pase a 100% de solvente orgánico y lave el sistema y la columna
exhaustivamente para eliminar los contaminantes, incluyendo aquellos
fuertemente absorbidos provenientes de la matriz de las muestras.
Este proceso puede realizarse a 10% orgánico por minuto. Se
recomiendan típicamente cambios de 5 volúmenes de columna.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
4.
Cambie la composición a 40:60 (v/v) H2O:orgánico como disolvente
genérico de almacenamiento para columnas HPLC con base de sílice.
Esta composición de la fase móvil evita el riesgo de crecimientos
microbianos, mantiene la superficie de la sílice “empapada” y evita la
formación de células electrolíticas que podrían crear depósitos de iones
metálicos provenientes de las fritas en la sílice del relleno, provocando
la activación de silanoles residuales e introduciendo efectos de
columna secundarios.
Se recomienda utilizar típicamente 5 volúmenes de columna.
Este protocolo también es adecuado para el almacenamiento del
instrumento.
A continuación se muestra de forma esquemática el proceso de purga y
almacenamiento. Si la presión de trabajo del sistema lo permite, el flujo
puede aumentarse a 2 mL/min para realizar un cambio más rápido en la
composición H2O:organico. El protocolo completo puede programarse en un
método de purga, que puede ejecutarse al final de cada secuencia o lote de
muestras.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
6.2 Incidencias de la Columna
El diagnóstico de las columnas se realiza habitualmente a partir del estudio
del cromatograma y de los picos cromatográficos. Los parámetros de
operación del sistema también proporcionan información útil para el
diagnóstico (la perspectiva de los componentes).
Siempre es recomendable proteger a las columnas de deterioro debido a la
obstrucción por partículas o muestras fuertemente retenidas. Éstas pueden
bloquear eventualmente la frita de entrada u ocluir la fase estacionaria
provocando un aumento en la presión de trabajo o una pobre forma del pico
cromatográfico respectivamente. Es muy recomendable por tanto la
instalación de filtros de línea y/o guardacolumnas en el sistema. Las
partículas y las especias fuertemente adsorbidas pueden provenir
potencialmente de:
• Sellos de los pistones
• Sello del rotor de la válvula de inyección.
• Sales de los tampones precipitadas o no disueltas.
• Matrices de las muestras contaminadas.
La tabla siguiente relaciona los problemas más frecuentes con las columnas:
Problema con la columna
% de frecuencia
Problemas con la presión
24
Mala reproducibilidad
16
Recuperación de la muestra
14
Pérdida de resolución
13
Inestabilidad
11
Formación de volúmenes muertos
8.1
Fugas en las conexiones
4.8
Rango de pH
2.0
Baja eficacia
2.0
Saturación de las columnas
2.0
Costes
1.7
Otros
1.5
Fuente − LC-GC Europe (1994)
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Uso de las columnas
Una vez se ha usado una columna para la separación de muestras “reales” la
selectividad proporcionada ésta variará necesariamente de la ofrecida por
una columna nueva de la misma marca y referencia. Las Columnas pueden
llegar a modificarse de diversas formas una vez se utilizan de forma
experimental:
•
•
•
En condiciones de pH bajo, la columna puede perder las especies activas
o ligandos (endcapping).
Algunos materiales fuertemente retenidos pueden enlazarse de forma
irreversible a la cabeza de columna provocando un aumento de la
presión del sistema.
Los analitos de naturaleza fuertemente básica pueden quedar enlazados
irreversiblemente a los grupos silanol libres de la fase estacionaria. Este
ionización de los silanoles puede reducirse realizando las separaciones a
bajo pH, ya que habitualmente éstos grupos muestran valores de pka
entre 3.8−4.1.
Puesto que cada método HPLC opera en diferentes condiciones analíticas y
se utiliza para diferentes tipos de muestras, los cambios que potencialmente
puedan producirse en la columna serán únicos para cada método. Por lo
tanto, una vez que una columna haya sido usada para una determinada
aplicación, puede no volver a ofrecer nunca una separación idéntica a la
obtenida en una columna equivalente nueva, observándose a menudo
importantes diferencias cromatográficas entre ellas.
Este hecho también puede observarse cuando se utiliza una misma columna
con diferentes métodos y analitos. En este caso pudiera ser necesario
realizar varias inyecciones de acondicionamiento (“priming” injections) con
el nuevo analito para llegar a conseguir una cromatografía reproducible. Los
tiempos de equilibrado de la columna deberán a menudo aumentarse para
adecuar la columna a los cambios en la selectividad.
Con el fin de evitar en lo posible la aparición de tales variaciones, se
recomienda que cada columna se dedique a un método y tipo de analítico
específico. El intercambio indiscriminado de columnas para el desarrollo de
métodos puede producir una separación cromatográfica no representativa
una vez se traslade a una columna nueva, que no habría sido expuesta a la
variedad de muestras de su predecesora.
Estas variaciones pueden
reducirse si se emplea un procedimiento adecuado de lavado de la columna.
Filtros de Línea
Una de las causas más comunes del deterioro de la columna es el aumento
excesivo de la presión de trabajo. Este aumento de la presión se produce
habitualmente por la acumulación de material particulado en la frita de
entrada a la columna, y una de las formas más económicas y efectivas de
aumentar la vida de ésta es incorporar un filtro de línea de alta presión
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
entre el Automuestreador y la Columna. Un filtro de línea situado en esa
posición evita que las partículas provenientes de la muestra o del rotor de la
válvula de inyección del automuestreador alcancen la cabeza de la columna.
Es MUY recomendable incluir un filtro de línea de alta presión en todos los
sistemas HPLC con la única excepción de los sistemas de volumen muerto
extremadamente pequeño, en los que el incremento “extra” en el volumen
de columna puede contribuir al ensanchamiento y dispersión de los picos.
Fuera de este escenario no se observarán cambios apreciables en el
cromatograma.
El filtro de línea puede examinarse visualmente para observar si hay
depósitos de contaminación o cambios en el color de su superficie cuando la
presión del sistema aumenta apreciablemente. El tamaño más habitual de
poros para estos filtros está alrededor de 0.5µm.
Limpio − el filtro puede reinsertarse para su uso.
Sucio –El filtro ha cambiado de color o muestra
depósitos en su superficie. Descartar y reemplazar.
Figura mostrando filtros de línea limpio y contaminado.
Guarda Columnas/Discos
Una guarda columna es una columna corta – típicamente de 10-20 mm de
longitud- que contiene la misma fase estacionaria que la columna analítica.
Si se utiliza un sistema de cartuchos, entonces es necesario utilizar un
soporte de cartuchos adecuado. Los discos guarda columna son pequeños
discos fritados que cuando se alojan en su soporte se enroscan directamente
en la columna analítica. En comparación con un filtro de línea, una guarda
columna o disco debe utilizarse solamente como filtro “químico”, para
asegurar la eliminación de cualquier material potencialmente retenido o
agresivo evitando así el posterior fallo posterior de la columna analítica.
En algunos casos una guardacolumna puede proporcionar suficiente
protección como para eliminar el “clean up” (preparación de muestra
previo) de la muestra. Sin embargo, ya que una guarda columna puede
quedar contaminada con una gran variedad de materiales fuertemente
retenidos, es un requisito obligatorio que cuando se lave con un disolvente
fuerte se haga sin conexión con la columna analítica, evitando así que las
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
especies peligrosas pasen inadvertidamente a la cabeza de la columna
analítica.
Nunca debe usarse una guarda columna como columna de saturación de
sílice, ya que cualquier volumen muerto generado en la guarda columna
comprometerá necesariamente la cromatografía. Si la columna saturadora
se estima necesaria para una aplicación en particular (p.e. Fase Móvil de
alto pH), debe ser instalada antes del inyector y con un filtro de línea
inmediatamente después para retener las pequeñas partículas de sílice
resultantes de la disolución de la sílice.
La Figura muestra el efecto negativo de formación de un volumen muerto
en la guardacolumna con el consiguiente deterioro de la forma de pico.
Tanto la incorporación al sistema de HPLC de un filtro de línea como la de
una guarda columna, provocan una aumento del volumen extra-columna,
que podría contribuir a un mayor ensanchamiento de pico en sistemas con
un volumen muerto extremadamente pequeño.
Figura mostrando guarda columnas y cartuchos típicos.
Figura mostrando un disco guarda típico.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
¿Cuándo se debe sustituir una guarda columna? Existen tres procedimientos
fundamentales para determinar cuándo sustituir una guarda columna:
1.
¡No se recomienda esperar al deterioro de la separación
cromatográfica!
Si es posible, se puede monitorizar la separación de una pareja de
picos del cromatograma que estén peor resueltos que los picos de
interés, estableciendo un criterio para predecir el momento adecuado
antes de que la guarda columna potencialmente falle.
Esto se muestra en el cromatograma de abajo, que muestra la
separación de un grupo de herbicidas. La pareja crítica, los picos
cromatográficos que están peor resueltos uno del otro, están marcados
como 1 y 2. Los picos cromatográficos de interés están marcados como
3 y 4. Si monitorizamos la separación entre los picos 1 y 2 a lo largo del
tiempo, puede establecerse un criterio de valoración que nos permita
cambiar la guarda columna sin comprometer el análisis con respecto a
los picos de interés 3 y 4.
2.
3.
Monitorizar el número de muestras inyectadas con la guarda columna
instalada hasta que el sistema deje de proporcionar una separación
satisfactoria.
Modificar el PNT de forma que la guarda columna se sustituya
aproximadamente al 80% del tiempo de vida esperado – ¡sea proactivo
en lugar de reactivo!
Monitorizar la vida efectiva de la columna en función del volumen de
eluyente empleado o de la fecha en la que la guarda columna fue
instalada.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Limpieza (Clean-up) de la muestra
En el contexto de la limpieza de muestra siempre existe un balance entre
los costes del citado proceso de limpieza frente a los costes de sustitución
de la columna.
Consideremos un ejemplo bioanalítico en el que se desea medir la
concentración de un fármaco en plasma. La precipitación de las proteínas
por medio de la adición de acetonitrilo al plasma, agitación en Vortex,
centrifugación e inyección del sobrenadante producirán muestras
“razonablemente” sucias permitiéndonos quizás entre 100 y 500
inyecciones. Por el contrario, una muestra mucho más limpia obtenida tras
un procedimiento de limpieza por Extracción en Fase Sólida (SPE), nos
permitirá obtener una vida media de unas 1000-2000 inyecciones. Este
proceso SPE y posterior inyección de muestra puede automatizarse
empleando un formato de 96-pocillos.
Mientras que la ganancia en tiempo de vida de la columna pudiera no
justificar por sí sola el coste de este elaborado y caro proceso de limpieza,
el método se beneficiaría de la mejora en reproducibilidad lo que
considerado a lo largo de los años debería tenerse en cuenta.
Sustitución de la Columna
Poniendo en práctica las recomendaciones detalladas hasta ahora podremos
incrementar apreciablemente la vida de las columnas pero en definitiva
éstas deben considerarse como materiales consumibles. La duración de una
columna viene determinado por un gran número de factores interrelacionados, p.ej. Tampones y su pH, limpieza de muestra, etc, pero
habitualmente un rango entre 500-2000 inyecciones puede considerarse
aceptable.
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7. Picos con Cola
La aparición de colas en los picos es una de las deformaciones
cromatográficas más frecuentes. Se dice que un pico tiene cola cuando
muestra una asimetría mayor de 1.2, aunque en ocasiones picos con valores
de As tan altos como 1.5 puedan ser aceptables para una gran variedad de
ensayos. El factor de asimetría de pico (π) se calcula según la siguiente
ecuación:
π = wb2 / wb1
Donde;
wb2 = Ancho del pico en la línea de base después del centro del pico
wb1 = Ancho del pico en la línea de base antes del centro del pico
La principal causa de aparición de cola en un pico es la coincidencia de más
de un mecanismo de retención. En las separaciones por Fase Reversa, el
principal modo de retención de los analitos es a través de interacciones
hidrofóbicas no-específicas con la fase estacionaria. Sin embargo, también
son frecuentes las interacciones polares con grupos de silanoles residuales
existentes en el soporte de sílice. Compuestos que posean en su estructura
grupos amino o cualquier otro grupo básico, pueden interactuar
fuertemente con los grupos silanoles ionizados, produciendo picos con cola.
Este efecto se muestra en la figura siguiente a un pH >3.0.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Estas interacciones secundarias pueden minimizarse si se realiza la
separación a un pH más bajo, asegurando así la protonación completa de los
citados grupos silanol residuales;
Otra alternativa es la utilización de columnas “end-capped”. “End-capping”
es el nombre que se da al proceso químico por el cual los grupos silanoles
residuales de la fase estacionaria se transforman en otros grupos funcionales
sustancialmente menos polares en su superficie. Esta modificación tiene el
efecto de reducir las interacciones secundarias que puedan producirse
potencialmente con moléculas de analitos polares.
Los reactivos químicos empleados para el proceso de “end-capping”
incluyen generalmente;
•
•
Trimetilclorosilosano (TMCS)
Hexametildisilazano (HMDS)
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
El proceso de “End-capping” reduce las colas observadas con analitos
polares, bloqueando de forma eficiente sus interacciones con los grupos
silanol residuales que pudieran ser potencialmente ionizables. A pesar de
ello, el “end-capping” sólo disminuye aproximadamente a un 50% el número
de grupos silanol no reaccionados. Debido a factores de impedimento
estérico este tipo de reacciones rara vez son eficientes en términos
absolutos y en consecuencia una columna completamente “end capped” no
es nunca tanto como debería!
En el caso de que todos los picos cromatográficos muestren cola debe
considerarse la posibilidad de que la columna se haya sobrecargado por un
exceso de muestra. Evalúe aplicando la ecuación descrita previamente en
la página 104. Si fuera necesario utilice una fase estacionaria de mayor
capacidad p.ej. de mayor % carbono o tamaño de poro, utilice una columna
de mayor diámetro, o reduzca la cantidad absoluta de muestra o volumen
inyectado.
Examine la columna por si se hubieran formado volúmenes muertos o se
hubiera bloqueado parcialmente la frita de entrada. Sustituir la columna
por otra nos confirmará rápidamente el problema.
Si se sospecha que existe algún volumen muerto, quite las conexiones de
cierre y revise la cabeza de columna. Si se observa algún hueco en el relleno
cúbralo con fase estacionaria, o si no, limpie o sustituya la frita de entrada
y pruebe la columna de nuevo para ver si el problema estaba originado o no
por una frita parcialmente obstruida. En ocasiones, invertir la columna y
lavarla con un 100% de un disolvente fuerte también permite eliminar
bloqueos y contaminación del filtro de entrada.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Compruebe las instrucciones del fabricante para ver si la columna puede
mantenerse en la orientación inversa de flujo o no.
Si sólo uno, o algunos, de los picos cromatográficos muestran cola,
considere la posibilidad de que la columna esté mostrando efectos de
partición o retención secundarios.
Reduzca la probabilidad de que cualquier analito potencialmente básico
interactué con los grupos silanol residuales usando columnas fabricadas con
sílice desactivada (Tipo B), que han sido completamente bloqueadas (“endcapped”). Como parte de cualquier procedimiento de desarrollo de métodos
reduzca el pH de la fase móvil para suprimir la ionización de cualquier grupo
silanol. En general, una fase móvil con pH <3 será suficiente para este
propósito. Adicionalmente, el empleo de fases móviles a bajo pH asegura la
protonación de los analitos ácidos, aumentando su retención y minimizando
cualquier tipo de interacción iónica.
La figura de abajo ilustra el efecto producido en las colas de pico al reducir
el pH de separación. La mezcla de cinco fármacos básicos consiste en
Fenilpropanolamina, Efedrina, Anfetamina, Metanfetamina y Fenteramina
(Picos 1−5) respectivamente. El primer cromatograma se adquirió a un pH
de la fase móvil de 7.0, y en estas condiciones de separación, el Pico 4,
Metanfetamina muestra un factor de cola USP al 5% (USP Tf 5%) de 2.35.
La disminución del pH de la fase móvil reduce la interacción de los analitos
básicos con los grupos silanol residuales eliminado de esta forma la cola
excesiva de los picos. El segundo cromatograma se adquirió con una fase
móvil a pH 3.0 y el USP Tf (5%) de la Metanfetamina en estas condiciones se
redujo a 1.33.
La adición de Trietilamina (TEA) a la fase móvil en niveles de concentración
de 5−10mM, también reduce o posiblemente elimina, la cola en compuestos
básicos. La TEA compite con los analitos polares básicos por enlazarse con
los grupos silanol residuales, produciendo una función de “pseudo endcapping”. Esta alternativa sin embargo es menos conveniente, ya que la
fase estacionaria se altera irreversiblemente por la adición de tal
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
modificador, afectando a la selectividad mostrada por el sistema de
separación posteriormente.
La cromatografía de pares de iones puede resolver el problema de las colas
para analitos ácidos o básicos. Otra opción para la separación de especies
iónicas podría ser emplear cromatografía de intercambio iónico.
Desde un punto de visto práctico, generalmente sólo es posible utilizar el pH
para suprimir la ionización ácida ya que la ionización básica requiere valor
de pH típicamente mayores de 8, y a ese pH se puede producir la disolución
de la sílice. Sin embargo, los fabricantes de columnas ofrecen versiones que
permiten trabajar a un pH mayor, protegiendo la sílice de su disolución por
medio de ligandos bi- y tri- dentados. Estos ligandos son en realidad dos o
tres ligandos tradicionales que se han puenteado por medio de procesos
químicos patentados antes de aplicarlos a la fase estacionaria.
Su
estructura puenteada permite proteger su superficie frente a valores
extremos de pH.
La Figura muestra ligandos bidentados y la protección ofrecida a la
superficie de la sílice gracias a su estructura de puente.
Un único pico con cola también podría producirse por un pequeño pico
eluyendo inmediatamente después del pico cromatográfico de interés. La
posibilidad de que esto ocurra es la razón primordial por la que las colas de
pico nunca deben ignorarse.
Como se describía en el apartado
“desdoblamiento de picos y hombros”, podemos confirmar la presencia de
un interferente cambiando la longitud de onda de detección, o mejorar la
resolución de la separación empleando una columna de mayor eficiencia
p.ej. una columna más larga o empaquetada con partículas de menor
tamaño.
Ajuste la selectividad del sistema frente a compuestos co-eluyentes
variando la composición o el tipo de la fase móvil, la temperatura, o la fase
estacionaria de la columna. Emplee algún procedimiento de “clean-up”
p.ej. SPE para eliminar cualquier contaminante interferente. Evalúe si
alguno de los picos coeluyentes pueden provenir de inyecciones anteriores
haciendo una inyección en blanco y siguiendo el procedimiento descrito en
“Ensanchamiento de Picos” de la pág. 105.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
8.
Picos con Frente
Si todos los picos cromatográficos muestran frente debe considerarse la
posibilidad de una sobrecarga de la columna por exceso de muestra
inyectada. Evalúelo aplicando la ecuación descrita previamente en la pág.
104. Si fuera necesario utilice una fase estacionaria de mayor capacidad
p.ej. de mayor % carbono o tamaño de poro, utilice una columna de mayor
diámetro, o reduzca la cantidad absoluta de muestra o volumen inyectado.
Si se ha inyectado un volumen de muestra excesivamente grande, y el
solvente de la muestra y la fase móvil no están adecuadamente
emparejados, pueden producirse dos equilibrios de distribución, provocando
una partición diferencial en la columna. Refiérase a las reglas empíricas
descritas en las páginas 54-56 en relación al adecuado emparejamiento de
entre el volumen de inyección con la fuerza eluotrópica del disolvente de la
muestra para eliminar éste fenómeno.
Un único pico que muestre frente también puede deberse a un pequeño pico
que eluya justo antes del pico cromatográfico de interés. Esta posibilidad es
la principal razón por la que un pico con frente nunca debe ser ignorado.
Como se describía en el apartado “desdoblamiento de picos y hombros”,
podemos confirmar la presencia de un interferente cambiando la longitud de
onda de detección, o mejorar la resolución de la separación empleando una
columna de mayor eficiencia p.ej. una columna más larga o empaquetada
con partículas de menor tamaño.
Ajuste la selectividad del sistema frente a compuestos co-eluyentes
variando la composición o el tipo de la fase móvil, la temperatura, o la fase
estacionaria de la columna. Emplee algún procedimiento de “clean-up”
p.ej. SPE para eliminar cualquier contaminante interferente. Evalúe si
alguno de los picos coeluyentes pueden provenir de inyecciones anteriores
haciendo una inyección en blanco y siguiendo el procedimiento descrito en
la pág. 89.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Tutorial 2
Pregunta 1
Usando la tabla siguiente enumere cinco partes del Automuestreador de
Loop completo que pueden requerir mantenimiento rutinario.
Indique la principal incidencia que puede presentar cada una de los
componentes enumerados y cuál sería la solución más adecuada para
remediarla.
Componente
Incidencia
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Solución
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 2
A continuación se muestran dos cromatogramas que pueden o no darnos
información sintomática del status operacional del sistema HPLC.
Indique que acciones pueden ser necesarias para mejorar la cromatografía
obtenida. Rellene sus respuestas empleando la tabla incluida.
Condiciones:
Muestra:
Columna:
Flujo:
Fase Móvil:
Vol Inyección:
Detección:
Cuatro Esteroides Anabolizantes de un suero
concentrado.
Concentración estimada − 10ug/mL.
RP C18 columna 150 x 4.6 mm 5µm
Obtenida sin ninguna información histórica previa.
1.5mL/min
46% Agua- MeOH:0.01% KHPO4 v/v (pH 5.2)
100µL
254nm
Incidencia
Solución
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
9
Detectores
El objetivo de esta sección es:
•
•
•
•
Describir las propiedades del detector ideal.
Definir los términos y conceptos más comunes.
Describir el diseño y los principios de operación de los detectores de
HPLC más comunes.
Ennumerar y describir las incidencias más importantes con los
detectores y los procedimientos de mantenimiento.
9.1 El Detector Ideal
El Detector ideal debería mostrar las siguientes características:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Ser igual de sensible para todos los picos eluidos o registrar únicamente
aquellos picos que sean de interés.
No ser afectado por cambios de temperatura o composición de la fase
móvil.
Ser capaz de monitorizar trazas de las especies a analizar.
No contribuir de forma apreciable al ensanchamiento de los picos.
Proporcionar una respuesta rápida que le permita detectar picos
cromatográficos estrechos provenientes de la columna.
Ser robusto y fácil de mantener.
Terminología y Conceptos Generales
Selectividad
Un Detector no selectivo reacciona frente a una propiedad general del
eluyente que pasa a través de él. Cuando un analito eluye de la columna, las
características de esa propiedad cambian, y ese cambio bruto se mide y se
registra. Esta detección no-selectiva es característica del detector de índice
de refracción.
En contraste, los detectores selectivos no reaccionan simplemente a los
cambios en las propiedades generales en el eluyente sino que miden una
respuesta definida que se produce por cambios en una propiedad específica
o característica del analito. Dicha detección selectiva es característica de
los detectores de Absorbancia UV, Fluorescencia y Espectrometría de Masas.
Sensibilidad
La señal más baja detectable no debe ser nunca menor de tres veces la
altura del ruido promedio en la línea de base; Es decir, una relación señal a
ruido (S/N) de 3:1 para un analito determinado determina su "Limite de
Deteccion".
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Si la cantidad de analito inyectado cae por debajo de su límite de
detección, entonces la señal no podrá diferenciarse del ruido. Para los
análisis cuantitativos se recomienda una relación señal/ruido de 10:1 y
define el “Límite de Cuantificación”.
Figura mostrando una S/N de 10:1 − El Límite de Cuantificación (LoQ).
A continuación se incluye un cuadro comparativo de la selectividad y
sensibilidad ofrecida por diferentes detectores:
Tipo de Detector
Selectividad
Sensibilidad
(Min. Masa Detectada)
Indice de Refracción
Baja
1−5µg
Conductividad
Baja
10−50ng
Light Scattering Evaporativo
Baja
0.1−1.0ng
Media
0.5−1.0ng
Electroquímico
Alta
50−500pg
Fluorescencia
Alta
10−100pg
Espectrómetro de Masas
Alta
1−25pg
UV/Visible
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Rango Lineal
El Detector ideal debería proporcionar una señal de respuesta cuya área
fuera proporcional a la cantidad de muestra inyectada, independientemente
de si está cantidad es grande o pequeña. Esta linealidad no es infinita, pero
debe extenderse en el rango más amplio posible. La pendiente de la recta
en el diagrama de abajo se denomina respuesta y representa en que
magnitud el detector responde a un cambio específico en la concentración
de la muestra:
Figura mostrando la respuesta de un detector lineal y uno no lineal
¿Area o Altura de Pico?
Es una práctica común emplear el área de pico cromatográfico para
propósitos cuantitativos ya que proporciona una medida más robusta. Sin
embargo, en ocasiones la altura de pico puede proporcionarnos resultados
más exactos y reproducible, como es el caso de una pareja de picos crítica
que o esté bien resuelta:
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
9.2 El Detector UV/Visible
Principio Operacional − Detector UV/Visible Sintonizable
Con el Detector UV/Vis Sintonizable, o de longitud de onda variable, la
longitud de onda requerida se pre-selecciona por el analista por medio de
software. Esta selección produce el movimiento físico de una red de
difracción (monocromador) alojado en el interior del detector, permitiendo
que un haz con la longitud de onda de la luz seleccionada ilumine el camino
óptico de la celda de flujo y llegue al fotodiodo. El fotodiodo mide el
cambio de absorbancia de los componentes de la muestra que pasan a través
de la celda de flujo enviando una señal de respuesta al sistema de registro.
Beam Splitter
Detector UV/Visible de Longitud de Onda Variable (Sintonizable)
Principio Operacional − Detector UV/Visible Diodo-Array
A diferencia del detector sintonizable, el detector UV/Visible Diodo-Array
(DAD) permite que pasen a través de la celda el rango completo de luz
proveniente de la fuente. Esta luz se divide posteriormente en su espectro
por medio de la red de difracción alcanzando la serie de fotodiodos, cada
uno de ellos capaz de medir con precisión una porción extremadamente
definida del espectro electromagnético de la luz incidente. Esta distribución
óptica permite obtener mayor información que la obtenida simplemente con
un análisis cromatográfico a una única longitud de onda.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Detector UV/Visible Diodo-Array (DAD)
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
9.3 Incidencias y Mantenimiento del Detector
UV/Visible
Lámparas de Deuterio y Tungsteno
Una lámpara de Deuterio produce radiación intensa en el rango de
longitudes de onda de 190−400nm gracias a una descarga de plasma
realizada en una atmósfera de Deuterio (D2 ó “Hidrógeno Pesado”). Las
Lámparas de Tungsteno se usan a menudo junto a lámparas de Deuterio, y
emiten luz en el UV cercano y en la región visible del espectro
electromagnético, típicamente en el rango de longitudes de onda de 340850 nm.
La vida útil de cualquier lámpara de detector es necesariamente función del
número total de horas en que una lámpara en particular puede realizar su
trabajo de forma útil. En concreto, la vida útil de una lámpara será
proporcionalmente más corta si la aplicación a que se dedica es a un análisis
de trazas muy exigente más que a un método de ensayo, ya que una vez que
el ruido de la línea de base o la deriva excedan los límites establecidos por
el método, la lámpara deberá ser sustituida.
Lineas de base con Ruido o Deriva indicativas de una lámpara gastada
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La emisión de una lámpara de Deuterio decrece de forma exponencial. En
concreto, ésta emisión decrece lentamente hasta el final de la vida de la
lámpara, momento en que comienza a decrecer rápidamente produciéndose
finalmente un fallo en su encendido. Este rápido deterioro en la emisión
puede proporcionar al usuario un aviso sobre el inminente fallo de la
lámpara. A medida que la emisión de la lámpara se reduce se producirá una
disminución en la relación S/N y en consecuencia no se obtendrá la
sensibilidad a los analitos requerida por el método.
Una lámpara de deuterio puede considerarse inutilizable cuando su emisión
cae por debajo de del 50% de su valor original a una longitud de onda
específica, o cuando el test de idoneidad del sistema (system suitability) no
cumple el valor de S/N especificado. Existen tres razones fundamentales del
decrecimiento de la emisión con el tiempo:
•
•
•
Evaporación del Tungsteno, Molibdeno o recubrimiento del filamento,
que produce una emisión reducida o problemas en el encendido.
Reacción del material de recubrimiento con la envoltura de cuarzo.
Solarización de la envoltura de cuarzo a 200−250nm, provocando el
desarrollo de absorción entre éstas longitudes de onda.
La vida útil de una lámpara de deuterio es inversamente proporcional al
número de encendidos que experimenta. Mantener la lámpara
continuamente encendida aumentará su vida útil unas tres veces, en un
promedio de 8 horas diarias de funcionamiento. Encender y apagar la
lámpara en los descansos entre análisis o durante la noche reducirá
apreciablemente su vida útil, siendo al final un procedimiento improductivo
ya que la lámpara requerirá un tiempo de calentamiento de
aproximadamente 30 minutos para estabilizar la línea de base.
¿Cuál es la vida media esperada de una lámpara de deuterio? Típicamente
entre 800 y 1000 horas, ó 1800-2000 horas en las lámparas de deuterio de
larga duración. La fuente de Tungsteno de la porción visible de muchos
detectores UV/Visible tiene una vida extraordinariamente larga y en general
falla porque se funde.
Es importante resaltar que las lámparas de deuterio tienen caducidad en su
almacenamiento. La lámpara puede envejecer considerablemente durante
su almacenamiento, de forma que pueda ser inutilizable para su uso en un
detector después de sólo 6 meses. Se recomienda por lo tanto pedir una
lámpara de repuesto cuando estemos cerca del fin de su vida útil más que
disponer permanentemente de una lámpara de repuesto a mano.
Muchos softwares actuales disponen de una función de diagnóstico
incorporada que nos permite medir la intensidad y el envejecimiento de la
lámpara.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
La Celda de Flujo
La contaminación de la propia celda o de sus ventanas puede ser el
resultado de una limpieza inadecuada del sistema o del tipo de muestra en
sí misma. Unas ventanas de la celda que estén sucias producirán una
pérdida progresiva tanto en la intensidad de la luz incidente como en la
saliente, afectando así a la absorbancia de los analitos y a su respuesta en
función del tiempo.
Pérdida de sensibilidad causada por unas ventanas de la celda sucias
Cualquier contribución a la absorbancia generada por la propia celda puede
comprobarse y medirse por medio de un test específico de intensidad:
típicamente esto implica el llenado de la celda con H2O o un solvente de
referencia.
Los siguientes procedimientos genéricos de limpieza de la celda de flujo se
incluyen como suplemento a las recomendaciones específicas del fabricante
para cada detector en particular; por favor, consulte los manuales de
operación antes de emplear cualquiera de estos procedimientos.
Los procedimientos generales de limpieza son aplicables a todos los
detectores ópticos y pueden tener la forma de alguno de los siguientes:
•
•
•
Backflushing (limpieza en contracorriente)
Limpieza con disolvente
Límpieza con ácido
La limpieza de la celda de flujo en contracorriente (Backflushing) elimina
con frecuencia material particulado que pudiera haber bloqueado el tubo de
entrada. Se conecta la bomba a la salida del detector y se invierte el flujo
de eluyente a través de la celda, enviando el flujo directamente al
contenedor de desechos. Si se observaban síntomas de una contrapresión
alta, al invertir el flujo, la presión caerá y se eliminará el bloqueo.
Este procedimiento debe aplicarse con precaución puesto que una presión
excesiva sobre la celda de flujo podría provocar fugas alrededor de las
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
ventanas o incluso la rotura de la propia celda de cuarzo. Para evitar la
sobrepresión en la celda hemos de seleccionar la presión máxima de la
bomba por debajo de la máxima presión que admita la celda e ir
incrementando gradualmente el flujo en pasos de 0.1mL/min para evitar
choques de presión. Una celda estándar de 1.0 cm de paso óptico suele
tener una presión máxima de alrededor de 120 Bar.
La limpieza con disolventes es útil cuando nos encontramos en presencia de
un contaminante orgánico soluble o se sospecha que hay gotas de un
solvente inmiscible en la celda de flujo. Pasando a través de la celda una
serie de solventes con propiedades físicas y químicas diferentes p.ej.
viscosidad, polaridad, etc, puede eliminarse de forma eficiente cualquier
contaminante en un amplio rango de solubilidades. Dichas series de
disolventes pueden consistir en Metanol, seguido de Tetrahidrofurano (THF),
Cloruro de Metileno antes de volver de nuevo al Metanol.
La limpieza ácida es el más agresivo de los tres procedimientos de limpieza
descritos. Este procedimiento implica el paso de un ácido por la celda del
detector para eliminar contaminantes y posterior paso de H2O para eliminar
todos los restos de ácido. Para asegurar la eliminación de cualquier traza de
residuo de ácido, y cualquier residuo potencialmente absorbente en el UV a
bajas longitudes de onda, es necesario bombear H2O a través de la celda de
flujo.
Se utiliza preferentemente Acido Nítrico ya que los ácidos
halogenados p.ej. HCl atacan agresivamente los componentes de acero
inoxidable de la celda.
Si ninguno de los métodos de limpieza anteriores eliminan la contaminación
o los problemas de bloqueo, la celda tiene que desmontarse o reemplazarse.
Existen Kits de Reconstrucción que son normalmente más económicos que
adquirir una celda completamente nueva. Consulte el manual de operación
para las recomendaciones y advertencias específicas.
El paso de burbujas de aire a través de la celda causará picos de ruido
(spikes) en el cromatograma. La desgasificación incorrecta del eluyente es
por lo general la causa de los problemas con burbujas, especialmente si se
ha utilizado mezcla a baja presión. La reducción de presión resultante de la
mezcla de disolventes requiere una desgasificación adicional puesto que el
aire es menos soluble en la mezcla de solventes que en el solvente puro
original.
Una celda de flujo sucia puede atrapar microburbujas cuando pasan a través
de ella. Estas microburbujas pasan normalmente a través de la celda sin ser
notadas pero cuando se atrapan pueden asociarse para generar burbujas
mayores afectando al ruido y la deriva de línea de base. Cualquier burbuja
atrapada debe purgarse de la celda requiriendo en ocasiones el uso de
isopropanol, cuya mayor viscosidad comparada con el acetonitrilo o
metanol, ayuda a arrastrar la burbuja enviándola a desechos.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Una lectura de absorbancia que se va fuera de escala de forma inmediata y
evidente puede ser el resultado de una ventana de celda rota. El Solvente
que pasa a través de la celda de flujo puede fugar hacia la superficie
externa de la ventana provocando dichos cambios de absorción.
La Red de Difracción (Monocromador)
En la mayoría de los detectores UV/Visible de longitud de onda variable el
monocromador viene pre-alineado de fábrica, y está encerrado en una
unidad óptica sellada junto a algunos espejos que conforman el camino
óptico. Un fallo en el monocromador se evidencia porque es incapaz de fijar
la longitud de onda requerida para el análisis y requerirá de la intervención
de un ingeniero de servicio técnico.
Debe comprobarse la exactitud de longitud de onda bien empleando una
solución de calibración conocida con un máximo de absorción definido, o
bien, empleando una banda característica de emisión de la lámpara de
deuterio.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
9.4 Picos Negativos
La aparición de picos negativos se produce debido a factores no relacionados
con las interacciones entre los analitos y la columna. Se observan picos
Negativos cuando los cables de señal del detector están invertidos, o cuando
el interruptor de polaridad se encuentra en la posición incorrecta. Los picos
Negativos son normales cuando se utiliza el Detector de Indice de Refracción
Los picos Negativos aparecerán en el cromatograma si la absorbancia de la
muestra es menor que la de la fase móvil a la longitud de onda de
detección. Hay que emplear por lo tanto fases móviles que muestren una
absorbancia UV/Vis baja, o cambiar la longitud de onda de detección del
analito.
Si a lo largo del tiempo se concentran en la fase móvil compuestos
fuertemente absorbentes puede aparecer una situación similar si el
disolvente se recicla. Si está empleando reciclado de fase móvil y comienzan
a aparecer picos negativos tras un uso prolongado de la fase móvil, lave
abundantemente la columna con un disolvente fuerte y re-equilíbrela, con
fase móvil recientemente preparada. Si desaparece el problema de picos
negativos, es un indicio de que la fase móvil estaba contaminada.
Cuado se emplea el detector de Diodo Array (DAD) es recomendable
emplear una longitud de onda de referencia para posibilitar la sustracción
de línea de base. Esto tiene la ventaja de corregir una línea de base con
deriva mejorando así los límites de detección y de cuantificación.
Es
importante asegurarse de que la longitud de onda de referencia y el ancho
de banda (bandwith) se han elegido correctamente para prevenir la
posibilidad de que se produzca una absorbancia mayor que la de los analitos
a detectar y se generen picos negativos en el cromatograma.
El procedimiento correcto para la selección de las longitudes de onda de
detección y de referencia se describe en relación con el espectro UV del
ácido anísico. Para optimizar la detección de la menor cantidad posible de
ácido anísico seleccione la longitud de onda de medida al pico más intenso
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
del espectro, es decir, 252nm. Tratando el espectro como si fuera un pico
pseudo-cromatográfico, compruebe su anchura a media altura (PWHH). Este
será en ancho de banda de la longitud de onda de medida (Bandwith) p.ej.
30nm.
Es posible reducir los efectos de fondo gracias a una adecuada elección de
las longitudes de onda de medida y de referencia. La longitud de onda de
referencia puede emplearse para eliminar los siguientes efectos, que
provocarán todos ellos derivas de línea de base durante el análisis
cromatográfico o bien mostrarán ondulaciones o ruido en la misma;
1.
2.
Reducción del ruido generado por:
• Particulas en suspensión
• Cambios en el índice de refracción del eluyente cuando se emplean
gradientes de elución.
• Turbulencias en la celda de flujo
Reducción en la deriva del instrumento causada por:
• Envejecimiento / deformacion de la lámpara
Identifique en el cromatograma el pico que absorbe a la longitud de onda
mayor, en el ejemplo es el ácido anísico. Determine la longitud de onda a
la que el pico del ácido anísico deja de absorber, se considera generalmente
cuando la absorbancia cae por debajo de 1.0mAU, y en el ejemplo del ácido
anísico será 300nm. Para evitar la posibilidad de una contribución a la
absorbancia de la longitud de onda de referencia elegida, añada 10nm a
este valor − Esta longitud de onda será el límite inferior de la longitud de
onda de referencia, i.e. 310nm.
Para eliminar los efectos de fondo descritos hay que elegir un ancho de
banda grande, típicamente de 100nm, y situar la longitud de onda de
referencia en el punto medio de esta ventana i.e. 360nm.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
9.5 El Detector de Light Scattering Evaporativo
Principio de Operación − Detector Light Scattering Evaporativo
El Detector de Light Scattering Evaporativo (ELSD) mide la cantidad absoluta
de luz dispersada por las partículas de analito que se secan mediante
evaporación. Siempre que la muestra esté presente en la cantidad
suficiente, no se evapore por sí misma, o se descomponga durante la etapa
de secado, el detector proporcionará una respuesta medible.
El mecanismo de detección de Light Scattering Evaporativo implica tres
etapas:
1.
2.
3.
Nebulización, utilizando N2 u otro gas inerte, para formar un aerosol o
pluma de gotitas uniformes.
Evaporación del eluyente en un tubo de evaporación con temperatura
controlada e independiente, generando una pluma de partículas de
analito no-volátiles.
Detección Óptica de la luz dispersada por las partículas de analito de
un haz de luz incidente. La respuesta es proporcional a la masa de
analito que pasa a través del haz de luz, y es independiente de
cualquier propiedad espectral del analito.
El Detector de Light Scattering Evaporativo
El ELSD puede considerarse universal, y representa técnica de detección
ideal para todos los compuestos no volátiles, un amplio rango de
compuestos volátiles con la adecuada selección del eluyente, y aquellos
compuestos que no poseen cromóforos UV/visible o varían mucho en sus
coeficientes de extinción. Su sensibilidad es superior a la ofrecida por los
detectores de índice de refracción, y se obtiene sin los problemas de deriva
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
de línea de base, gracias a la independencia de la detección de las
características espectrales de absorción del eluyente.
La medida cuantitativa de la luz dispersada por una solución se realiza
habitualmente con iluminación láser. La luz dispersada se mide como
función del ángulo entre el detector y la dirección del haz incidente. En
consecuencia, las medidas realizadas simultáneamente en un amplio rango
de ángulos de dispersión permiten la determinación directa de la masa
molar y el tamaño de las moléculas en solución, sin necesidad de generar
una curva de calibración basada en referencia o suposiciones físicas sobre la
muestra.
Si es necesario, el analista puede crear una curva de calibración universal
para un único analito, con la que puede interpolarse la concentración de
todos los analitos de la misma clase.
Incidencias y Mantenimiento del Detector de Light-Scattering
Evaporativo
La Celda de Detección
Eventualmente la celda de detección de cada instrumento de light
scattering se ensuciará: esto es especialmente cierto para la cromatografía
acuosa. Detenga el flujo de fase móvil, y aumente el flujo de gas de
nebulización para arrastrar cualquier partícula no volátil del interior de la
celda. Por favor, consulte el manual de operación antes de realizar
cualquier procedimiento de limpieza.
Cualquier fase móvil que se utilice sin filtrar o tampones que empleen sales
o modificadores no volátiles contribuirán a un ruido excesivo de línea de
base o a picos continuos (spikes). En el peor de los escenarios dichos
aditivos pueden contaminar el tubo de deriva del detector y la celda de
detección. Modificadores volátiles que son aceptables incluyen: Ácido
Trifluoroacético, Ácido Acético, Formiato Amónico, Acetato Amónico e
Hidróxido Amónico.
Si la señal del detector de light-scattering evaporativo está fuera de escala
mientras la de la traza UV correspondiente es normal, esa respuesta
aumentada es debida a compuestos que no absorben en el UV pero que
eluyen de la columna. Recuerde que el ELSD responderá a todos los analitos
semi-volátiles y no-volátiles.
Ruido de Línea de Base
Debido a una temperatura en el tubo de evaporación insuficiente, el ruido
en la línea de base cromatográfica puede aumentar como resultado de una
evaporación de fase móvil ineficaz. Aumente la temperatura de evaporación
en pasos de 5ºC tanto como se necesite para localizar la temperatura más
baja a la que se evaporará la fase móvil de forma eficiente, pero que
minimice la pérdida de cualquier componente semi-volátil de la muestra.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Cuando se realizan gradientes de elución optimice la temperatura de
evaporación para la condición de solvente
que representa la mayor
carga de evaporación. En análisis con Gradiente por Fase Reversa significará
que la alta proporción de H2O al inicio del gradiente requerirá una
temperatura de evaporación mayor que la correspondiente a una alta
proporción de solvente orgánico. Este proceso se invertirá cuando se
realicen análisis con gradiente en Fase Normal.
Un nebulizador parcialmente bloqueado o dañado, y la degradación de la
columna por exposición a disolventes incompatibles o condiciones extremas
de pH pueden contribuir a elevados niveles de ruido.
9.6 El Detector Espectrométrico de Masas
Los Espectrómetros de Masas trabajan ionizando las moléculas y analizando
e identificando posteriormente estos iones según sus respectivos ratios
masa/carga (m/z). Los dos componentes en este proceso son:
1.
2.
La Fuente de Iones, donde se generan los iones.
El analizador de Masa, que ordena los iones según su ratio m/z.
Existen diferentes tipos de Fuentes de iones utilizadas comúnmente en
Cromatografía Líquida/Espectrometría de Masas (LC/MS), siendo cada una
de ellas adecuada para diferentes grupos de compuestos. Muchos de los
recientes avances en LC/MS se han producido en el diseño de las Fuentes de
iones y en las técnicas para ionizar las moléculas de analito que separan los
iones resultantes de la fase móvil.
La introducción de las técnicas de Ionizacion a Presión Atmosférica (API) ha
permitido expandir el número y el tipo de los compuestos analizables que
pueden ionizarse de forma efectiva. Durante el proceso API, las moléculas
de analitos se ionizan en primer lugar, antes de ser mecánica y
electrostáticamente “filtradas” de las especies neutras. Las técnicas
comunes API son:
1.
2.
3.
Ionización por Electrospray (ESI).
Ionización Química a Presión Atmosférica (APcI).
Fotoionización a Presión Atmosférica (APPI).
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Aplicabilidad relativa de los analitos a las técnicas API.
Principio Operacional − Ionización por Electrospray (ESI)
ESI utiliza la química en solución para pre-formar y mantener los iones de
analito antes de que alcancen al espectrómetro de masas. El flujo de
eluyente se convierte inicialmente en un aerosol (nebulización) en la fuente
a presión atmosférica. Mientras el aerosol se encuentra en la fuente está
sometido a un fuerte campo electrostático y a una corriente caliente de gas
de secado inerte.
El campo electrostático de alto potencial induce una posterior disociación
de las moléculas de analito, mientras que el gas de secado reduce
progresivamente las gotas de aerosol por evaporación del eluyente. Al
reducirse el tamaño de las gotas, la concentración de la carga aumenta y
llegado un cierto tamaño se alcanza el límite Rayleigh de inestabilidad
generándose a su vez grupos de gotas cada vez más pequeñas.
Eventualmente, el tamaño de gota se reduce tanto que las fuerzas de
repulsión entre los iones de la misma carga exceden la tensión superficial de
la gota, y son desorbidos directamente en fase gaseosa a través de una serie
de explosiones de Coulomb.
Estos iones son atraídos y conducidos a través de un capilar, unos conos de
muestreo, y lentes skimmer hacia el analizador de masas para su posterior
detección. Desde que los iones son desorbidos de las gotas hasta que
alcanzan al analizador de masas, pueden aparecer una gran variedad de
reacciones en fase gaseosa, típicamente transferencia de protones e
intercambio de cargas.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Figura ilustrando el proceso de ionización por Electrospray
Cualquier compuesto capaz de formar iones en solución, bien sea a través
de un efecto de inducción de carga o bien debido a la existencia de algún
grupo ionizable en su estructura, es susceptible de ser analizado por ESI.
ESI es especialmente útil para el análisis de grandes biomoléculas, como las
proteínas, oligonucleótidos y carbohidratos. Estas grandes moléculas
adquieren múltiples cargas y, a través de un proceso denominado
Deconvolución, esa serie de señales de múltiple carga puede convertirse y
asignarse a una única carga en una escala de masa real. ESI puede también
emplearse para analizar pequeñas moléculas farmaceúticas como
benzodiacepinas u otras moléculas de interés biológico.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Principio de Operación − Ionización Química a Presión
Atmosférica
En APcI el eluyente se vaporiza en un nebulizador calentado, típicamente a
350-500ºC. El calor causa la vaporización del eluyente a la fase gaseosa
ionizándose sus moléculas posteriormente gracias a electrones que
provienen de la descarga continua de una aguja de corona. Los iones de
solvente formados transfieren entonces su carga a las moléculas de analito
que son consecuentemente atraídas hacia el capilar de entrada y conducidas
a través del mismo, de los conos de muestreo y de las lentes de skimmer
hacia el analizador de masas para su posterior detección.
Figura ilustrando el proceso de Ionización Química a Presión Atmosférica
APcI se aplica a una gran variedad de analitos polares y no polares. Sin
embargo, rara vez se producen los fenómenos de carga múltiple que son tan
característicos de ESI, y en consecuencia su aplicabilidad está típicamente
dirigida a moléculas de menos de 1500 Da de peso molecular que no sean
térmicamente lábiles.
En comparación con ESI, la máxima sensibilidad en APcI se consigue
generalmente cuando se emplea cromatografía en fase normal, ya que su
mecanismo de ionización favorece a las moléculas neutras en solución, y los
disolventes empleados en este modo cromatográfico no mantienen
fácilmente iones en solución.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Principio de Operación − Fotoionización a Presión Atmosférica
APPI opera de forma similar a APcI. El eluyente LC se nebuliza en primer
lugar con un vaporizador calentado pasando a la fase gaseosa. Los fotones
emitidos en la fuente por una lámpara de descarga se controlan
cuidadosamente con respecto a sus energías de ionización, permitiendo la
ionización de tantas moléculas de analito como sea posible mientras se
minimiza la ionización de las moléculas del eluyente. Los iones de analito
formados son atraídos hacia el capilar de entrada, y conducidos a través del
mismo, de los conos de muestreo y de las lentes de skimmer hacia el
analizador de masas para su posterior detección.
APPI se aplica a la mayoría de analitos analizables por APcI, pero muestra
una sensibilidad mejorada para los compuestos altamente no-polares cuando
se realiza la cromatografía a bajos flujos (<100µL/min).
Incidencias y Mantenimiento del Espectrómetro de Masas
Iones Contaminantes
La contaminación de iones en el espectro de masas produce una pérdida de
sensibilidad en los analitos y aumenta la complejidad en la asignación de las
masas. Estos iones contaminantes pueden provenir de diferentes orígenes,
incluyendo:
1.
2.
3.
La Fase Móvil
La mayoría de los solventes de grado HPLC contendrán impurezas que
no absorban en el UV, o estén presentes a niveles de concentración por
debajo de los límites de detección de la mayoría de otros detectores
LC, pero pueden ser la mayor fuente de contaminación de iones
observada en el espectro de masas.
Las botellas de vidrio de H2O grado HPLC son extraordinariamente
proclives a contener iones sodio y potasio que generan iones aducto de
una intensidad significativa.
Modificadores de la Fase Móvil.
Muchos de los modificadores típicos de las fases móviles pueden
generar por sí mismos iones fuertes, o introducir iones contaminantes
en la fase móvil.
Siempre que sea posible deben utilizarse reactivos de la mayor pureza
posible, y minimizar la concentración empleada.
Tubos de Conexión.
Evite los tubos de plástico para minimizar la introducción de iones
Ftalato. El ión de Ftalato 609Da es a menudo el pico base de cualquier
espectro de masas, y puede ser introducido inadvertidamente desde los
tapones con septum.
Minimice la contribución de los Ftalatos purgando la fuente con N2 gas
a temperaturas más altas de las utilizadas por término medio para
eliminar la contaminación.
Utilice tubo PEEK incoloro para reducir el ruido de fondo.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
4.
5.
Los tubos de acero inoxidable a menudo producen adsorción de los
analitos y contaminación con álcali.
El Gas de Secado
La contaminación por el gas de secado es especialmente importante en
APcI, pues es extremadamente sensible a los mecanismos de ionización
en fase gaseosa.
La principal impureza en el N2 proveniente de cilindros o de Tanques
Dewar es la existencia de hidrocarburos. La principal impureza en los
generadores de N2 es el O2 con trazas de Ar, puesto que los prefiltros
de los generadores atrapan los hidrocarburos.
Línea de Exhaust (Escape)
En algunas ocasiones es posible que algunos contaminantes fluyan en
hacia la fuente provenientes de la línea de exhaust. Cuando la salida
de exhaust de la fuente y la de la bomba de vacío externa están
combinadas en una, es posible que algo del aceite de la bomba migre
hacia la cámara de spray recubriendo los componentes de la fuente y
generando contaminación del analizador de masas. Para evitarlo se
puede incorporar una trampa intermedia entre la salida de la bomba y
la fuente, manteniendo una presión positiva en la cámara de spray en
todo momento.
Es recomendable disponer de unos espectros de masas de fondo y de blanco
obtenidos bajo condiciones estándar como referencia. Esto ayudará en la
potencial identificación de fuentes de contaminación en situaciones futuras.
Mantenimiento de la Bomba Rotatoria
Las Bombas Rotatorias son responsables de proporcionar el vacío inicial, y se
emplean para ayudar a la bomba turbomolecular de alto vacío unida
directamente al espectrómetro de masas. El vacío inicial está típicamente
en el rango de 1.5 − 2.5 Torr. Adicionalmente, la bomba rotatoria captura y
atrapa solvente residual, contaminantes y analitos introducidos en el
espectrómetro de masas.
El nivel de fluido de la bomba rotatoria debe comprobarse una vez a la
semana. Esto se hace normalmente por inspección visual del nivel de fluido
en la ventana situada en el frontal de la bomba. El nivel de fluido debe
estar entre las líneas marcadas de nivel máximo y mínimo. Si está cercano a
la línea de mínimo, hay que añadir fluido o alternativamente sustituirlo todo
si nos encontramos próximos la fecha de mantenimiento.
Cuando está limpio, el fluido de la bomba tiene un color Amarillo pálido,
que a través del tiempo y uso se va oscureciendo gradualmente. Cada seis
meses, o incluso antes dependiendo del uso, es necesario cambiar el fluido
de la bomba. Para éste cambio es necesario apagar y ventear el
espectrómetro de masas según las instrucciones del fabricante.
Eleve la bomba del suelo y coloque un contenedor para recoger el fluido
viejo que saldrá al retirar el tapón de drenaje. Desenrosque y quite el tapón
de la parte superior de la bomba y posteriormente el tapón de drenaje de
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
la parte inferior del cuerpo de la bomba permitiendo que el aceite drene.
El fluido drenará más rápido y más completamente si la bomba está aún
caliente. Desechar el fluido antiguo para su tratamiento como residuo
tóxico. Reinstale el tapón de drenaje y llene la bomba con fluido nuevo
hasta que su nivel esté cerca pero no por encima de la línea superior
marcada en la ventana de visualización.
Aproximadamente una vez a la semana será necesario hacer un “ballast” de
la bomba. El “ballasting” se realiza abriendo la válvula de “ballast” de la
bomba rotatoria, lo que permite a la atmósfera entrar a través del fluido de
la bomba y eliminar contaminantes atrapados restaurando su
compresibilidad. Adicionalmente, este proceso permite que cualquier aceite
atrapado en el filtro drene de nuevo al reservorio principal. El “Ballasting”
debe realizarse únicamente cuando el instrumento no está en uso, ya que el
vacío en el analizador estará necesariamente comprometido durante el
proceso. No deje la bomba con la válvula de Ballast abierta durante largos
periodos de tiempo ya que esto puede potencialmente provocar daños; 30 a
60 min deben ser suficientes dependiendo del uso del instrumento, flujos y
tipo de tampones empleados.
Figura ilustrando la posición de la válvula de gas “ballast”
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Tutorial 3
Pregunta 1
Evaluar los problemas mostrados en el siguiente cromatograma y sugerir las
posibles causas de éstos y cómo pueden corregirse:
Observaciones:
Posibles Causa(s) y Solución(es):
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- 125 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
Pregunta 2
Usando los conocimientos adquiridos durante el curso complete un programa de
mantenimiento para su sistema de HPLC empleando la tabla de abajo como guía.
Componente
Frecuencia de Mantenimiento.
Cada……..
Procedimiento de
Mantenimiento
48 Horas
Semana
Mes
+ Mes
La Fase Móvil
Solvente
Tamponado
Filtros de
Solvente
La Bomba
Check
Valves
Pistones y
Sellos
Frita Válvula
de Purga
Cebado
El Autoinyector
Sello del
Rotor
Aguja y
Asiento de
la Aguja
La columna
Guarda
Columna
Columna
El Detector
Lámpara
Celda Flujo
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- 126 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
10. Guia para incidencias
La interpretación del cromatograma HPLC es esencial para el diagnóstico
correcto y la corrección de los problemas en LC. Los problemas se pueden
identificar a partir del cromatograma y pueden englobarse en una de las
tres categorías siguientes:
•
•
•
Líneas de Base
La apariencia o el perfil de la línea de base pueden ayudar en la
identificación de muchos de los problemas asociados con los
componentes del sistema.
Forma de los Picos
La forma del pico cromatográfico proporciona una valiosa información
al caracterizar las prestaciones proporcionadas tanto por los
componentes del sistema como por la columna.
Tiempos de Retención
Cualquier variación observada en los tiempos de retención de los
analitos es crítica en el diagnóstico para eliminar problemas del
sistema LC.
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Incidencias y Mantenimiento en HPLC
10.1 Líneas de Base
La pariencia de la línea de base cromatográfica puede describirse de
múltiples formas distintas. Estas se describen a continuación, haciendo
referencia a las posibles causas y sus acciones correctoras.
10.1.1 Líneas de Base Erráticas
Mostradas en el cromatograma como variaciones aleatorias a corto plazo
(positivas y negativas), no muestran un patrón lógico cuando las estudiamos
en un intervalo mayor de tiempo.
La siguiente tabla enumera una serie de razones por las cuales la línea de
básica puede ser errática, junto a la solución apropiada sugerida.
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- 128 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Líneas de Base Erráticas
Componente
Botellas de Disolvente
Causa Potencial
Desgasificación mezcla incorrecta de la Fase Móvil
Solución
Asegurese de desgasificar convenientemente.
Asegúrese que la Fase Móvil se ha preparado correctamente de acuerdo al
PNT, incluyendo la(s) necesaria(s) etapa(s) de filtración.
Bomba HPLC
Fallos en la Válvula Proporcional de Gradiente (mezclado)
Llene las 4 botellas de disolvente con el mismo volumen del mismo y
realice una mezcla 1:1:1:1 durante un tiempo suficiente. El consumo en
cada botella de disolvente debe ser el mismo si las válvulas individuales de
cada canal operan correctamente.
Válvulas antirretorno de entrada y/o salida pegadas o parcialmente
bloqueadas.
Sustituya y compruebe
Realice los tests de mantenimiento específico indicados por el fabricante
para evaluar la integridad de los componentes individuales del cabezal de
la bomba.
Limpie o sustituya los que sean necesarios siguiendo el protocolo descrito
(ver pg. 46 ss), o las instrucciones del fabricante.
Fugas en los sellos de los pistones
Sustituya y compruebe.
Automuestreador
Adsorción de muestra en los componentes de la válvula de inyección.
Columna
Ligero “sangrado” de muestra fuertemente retenida o matriz
Use un disolvente para la muestra lo más fuerte posible sin que
comprometa la forma de pico (ver pgs. 65 ss).
Implemente un régimen de lavados de la válvula tras cada inyección.
Use una guarda columna.
Asegurese de que la columna se lava con un disolvente fuerte después de
cada muestra o lote de muestras (ver pgs. 86 ss).
Detector
Tiempo de Reequilibración insuficiente
Mínimo 10 volúmenes de columna. En
volúmenes de columna.
Polvo o suciedad en los tarjetas electrónicas
Sustituya el detector y compruebe. Si es necesario solicite una visita al
servicio técnico.
Lámpara cerca del fin de su vida útil.
Mantenga un diario del uso de la lámpara.
Celda de Flujo contaminada con muestra y/o matriz
Captura de Datos
Conversor Analógico-Digital o tarjetas electrónicas defectuosas
métodos con Par Iónico 20−50
Establezca un tiempo obligatorio de sustitución de la lámpara p.ej. 80%
del total de su vida útil esperada.
Desmonte y limpie o sustituya la celda de flujo según las directrices del
fabricante.
Sustituya el sistema de captura de datos y compruebe. Si es necesario
solicite una visita al servicio técnico.
Conexiones con mala toma de tierra.
Compruebe y ajuste todos los cables de conexión visibles.
Perdída de contacto en los cables
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HPLC Troubleshooting and Maintenance
10.1.2 Línea de Base Cíclica (Corta Frecuencia)
Se observa como una oscilación cíclica positiva o negativa y a corto plazo
en la traza cromatográfica.
Línea de base cíclica a corta frecuencia y línea de base normal
No confunda una burbuja de aire en la celda del detector con un problema
con la lámpara. Las burbujas de aire pueden fluir hacia el detector y causar
un pico muy estrecho, o una perturbación que se parece a un pico
cromatográfico, aunque de una ancho de pico apreciablemente menor. En
otros casos la burbuja de aire puede pararse en la celda de flujo y causar un
desplazamiento dramático de la línea de base; generalmente fuera de
escala.
La desgasificación inapropiada de los disolventes es por lo general la causa
más frecuente de problemas con burbujas, y en especial si se está
empleando un sistema de mezcla a baja presión. En estos casos la reducción
de presión producida en la mezcla de los disolventes permite la
desgasificación de los mismos al ser menos solubles en la mezcla que en los
disolventes por separado.
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- 130 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Si no lo tiene instalado, considere usar un regulador de contrapresión
después del detector para evitar la desgasificación asociada a la reducción
de presión. Elija un regulador de contrapresión que tenga una especificación
de presión MENOR que la presión máxima que permite la celda de flujo del
detector. Como alternativa puede usar un tubo PEEK de 50 cm de longitud y
0.17mm de d.i. a la salida del detector y al que se le conecta la línea de
desechos.
Es posible identificar problemas de burbujas de aire parando el flujo de la
fase móvil, si el problema es una burbuja, la línea de base permanecerá
estable, bien dentro ó fuera de escala. En cambio, un problema electrónico
en la lámpara permanecerá cuando se pare el flujo de fase móvil.
La tabla siguiente enumera diferentes razones por las que la línea de base
del cromatograma puede mostrar oscilaciones de corta frecuencia junto con
su solución adecuada.
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- 131 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Línea de Base Cíclica (Corta Frecuencia)
Componente
Botellas de Disolvente
Causa Potencial
Desgasificación o mezcla inapropiada de la fase móvil
Solución
Asegurese de desgasificar convenientemente.
Asegúrese que la Fase Móvil se ha preparado correctamente de acuerdo al
PNT, incluyendo la(s) necesaria(s) etapa(s) de filtración.
Bomba HPLC
Aire atrapado en el cabezal(es) de la bomba
Rellene las botellas de disolvente y cebe las líneas lo que se requiera.
Abra la válvula de purga, aumente el flujo (5mL/min) para desplazar el
aire atrapado.
Válvulas antirretorno de entrada y/o salida pegadas o parcialmente
bloqueadas.
Afloje la rosca de la válvula de salida para desplazar el aire atrapado.
Sustituya y compruebe.
Limpie o sustituya si es necesario utilizando el protocolo genérico descrito
(ver página 46 ss), o siguiendo las instruccines del fabricante.
Automuestreador
Sustituya o repare el amortiguador de pulsos (damper)
Solicite una visita del servicio técnico si se requiere.
Fuga potencial en el cuerpo de la válvula de inyección que introduce aire.
Realice el test de mantenimiento especificado por el fabricante para
evaluar la integridad de los componentes del automuestreador.
Loop o conexión de la aguja potencialmente defectuosos.
Revise la válvula conmutable para buscar conexiones flojas.
Desmonte y re-asiente la válvula conmutable o sustituya sus comentes si
es necesario.
Detector
Burbujas de aire atrapadas en la celda de flujo.
Purge el aire. NO exceda el límite máximo de operación-típicamente 120
bar para una celda de flujo de 1 cm y 13µL de volumen.
Revise la documentación del fabricante para confirmar.
Si no se encuentra integrado en el detector, conecte un restrictor de
contra presión para evitar la desgasificación. Típicamente un tubo de PEEK
de 50cm de largo y 0.17mm d.i. será suficiente.
Fluctuaciones de la corriente eléctrica de alimentación
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Compruebe otros instrumentos
fluctuaciones si es necesario.
e
instale
protección
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- 132 -
contra
las
HPLC Troubleshooting and Maintenance
10.1.3 Línea de Base Cíclica (Larga Frecuencia)
Observada como una oscilación positiva o negativa de la traza
cromatográfica de larga frecuencia.
La tabla siguiente enumera diferentes razones por las que la línea de base
del cromatograma puede mostrar oscilaciones de larga frecuencia junto con
su solución adecuada.
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HPLC Troubleshooting and Maintenance
Línea de Base Cíclica (Larga Frecuencia)
Componente
Causa Potencial
Solución
Botellas de Disolvente
Fluctuaciones de Temperatura que cambian la composición del disolvente
o su viscosidad
Compruebe que la botella de disolvente está cerrada.
Bomba de HPLC
Aire atrapado en el cabezal(es) de la Bomba
Abra la válvula de purga, aumente el flujo (5mL/min) para desplazar el
aire atrapado.
Columna
Fluctuaciones en la temperatura del termostado de columnas
Compruebe la calibración de temperatura del horno de columnas.
Ligero “Sangrado” de una muestra o de matriz fuertemente retenida
Asegúrese de que la columna se lava con un disolvente fuerte al final de
cada muestra o lote de muestras analizadas.
Burbuja(s) de aire atrapada(s) en la celda del detector
Purge el aire. NO exceda el límite máximo de operación-típicamente 120
bar para una celda de flujo de 1 cm y 13µL de volumen.
Mantenga constante la temperatura de la fase móvil.
Afloje la rosca de la válvula de salida para desplazar el aire atrapado.
Detector
Revise la documentación del fabricante para confirmar.
Si no se encuentra integrado en el detector, conecte un restrictor de
contra presión para evitar la desgasificación. Típicamente un tubo de PEEK
de 50cm de largo y 0.17mm d.i. será suficiente.
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HPLC Troubleshooting and Maintenance
La figura de abajo muestra como la termostatización de la fase móvil no
solo asegura una línea de base aceptable sino que además mantiene una
forma de adecuada del pico cromatográfico.
El cromatograma (b) se obtuvo con una temperatura de columna de 380C,
pero con la fase móvil entrando a temperatura ambiente (220C). Puede
observarse una apreciable distorsión y ensanchamiento de los picos.
El cromatograma (a) se obtuvo empleando un pre-calentador del eluyente,
que consiste en un tubo de acero inoxidable de 0.25mm d.i. enrollado como
una bobina plana y fijado al bloque de calentamiento del horno de
columnas, situado entre el automuestreador y la columna. Algunos hornos
comerciales incluyen ya un pre-calentador de fase móvil.
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- 135 -
Incidencias y Mantenimiento en HPLC
10.1.4 Lineas de Bases con Deriva
Se define como Deriva a la variación de la señal cromatográfica con el
tiempo siempre en la misma dirección (tendencia), sea ésta positiva o
negativa.
La tabla siguiente indica diferentes razones por las que la línea de base del
cromatograma puede mostrar deriva junto con su solución adecuada.
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HPLC Troubleshooting and Maintenance
Líneas de Base con Deriva
Componente
Botellas de Disolvente
Causa Potencial
Fuerte absorbacia mostrada por un(os) componete(s) de la fase móvil.
Contaminación y/o Evaporación de la Fase Móvil.
Solución
Si se usa un Detector Diodo-Array (DAD) seleccione una longitud de onda
de referencia y un ancho de banda adecuados para eliminar el efecto de
absorbancia del (los) componente(s).
Registre los nº de lote de los disolventes y aditivos para identificar fuentes
potenciales de contaminantes que absorban.
Prepare fase móvil fresca y compruebe de nuevo.
Compruebe los puntos de ebullición de los componentes de la fase móvil.
Tape las botellas de disolvente para evitar pérdidas por evaporación.
Bomba HPLC
Automuestreador
Inmiscibilidad de los disolventes empleados en la Fase Móvil.
Lave el sistema con un disolvente intermedio compatible antes de
introducir nueva fase móvil. Evalúe la posible inmiscibilidad refiriéndose a
la tabla de miscibilidad (Ver pág. 15).
Columna no acondicionada con la nueva fase móvil.
Cebe las líneas y lave el sistema de HPLC hasta que se obtenga una línea
de base estable.
Re-equilbrado insuficiente de la columna o del gradiente de elución.
Si empleamos un gradiente completo (i.e. 5 − 100% solvente B), debemos
asegurar un cambio de 10 volúmenes de columna antes de realizar una
nueva inyección de muestra.
Adsorción de muestra en los componentes de la válvula de inyección.
Mantenga la posición de inyección de la válvula del inyector al menos unos
minutos después de la introducción de la muestra para asegurar un lavado
intenso.
Use un disolvente de la muestra tan fuerte como sea posible sin que se
comprometa la forma de pico
Implemente un régimen de lavado de la válvula después de cada
inyección.
Columna
Detector
Ligero “sangrado” de muestra o matriz fuertemente retenida.
Asegúrese de que la columna se lava con un disolvente fuerte después de
cada muestra o lote de muestras.
Método de Fase Reversa con formación de Pares Iónicos.
Aumente el tiempo de re-equilibrado a 20-25 volúmenes.
Exposición del Sistema gradientes de temperatura.
Termostatice la columna y las líneas de entrada y salida de la misma.
Dirección Negativa − Componente fuertemente absorbente en un eluyente
débil.
Seleccione en el DAD la longitud de onda de referencia y un ancho de
banda adecuados para eliminar el efecto de absorbancia del (los)
componente(s)
Dirección Positiva − Componente fuertemente absorbente en un eluyente
fuerte.
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Compruebe que está usando el disolvente correcto.
Asegúrese de que la polaridad de la señal del detector está correctamente
seleccionada.
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HPLC Troubleshooting and Maintenance
10.1.5 Líneas de Base con Ruido
Las perturbaciones momentáneas positivas o negativas o los saltos de la
señal cromatográfica causando picos transitorios se denominan “spikes”.
La forma más simple de comprobar si hay un excesivo ruido en la línea de
base es realizar un cromatograma sin inyectar muestra. Amplíe el
cromatograma blanco resultante de forma que pueda medir fácilmente la
amplitud de la línea de base. Seleccione una región de ésta, p.ej.
aproximadamente de un minuto, expandiéndola lo suficiente para mostrar el
ruido, y trace líneas que describan a “grosso modo” los límites de éste. La
distancia física entre ambas líneas puede convertirse a unidades de
Absorbancia (AU).
La mayoría de los detectores tienen especificaciones de ruido de 0.5 − 1.0 x
10-5 AU, de forma que un detector que muestre excesivo ruido puede
identificarse con facilidad. Un ruido excesivo en la línea de base puede
reducirse de forma aceptable gracias a la instalación de un filtro de
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resitencia capacitancia.
Las especificaciones del detector se suelen dar sobre una celda seca y vacía
a 255nm.
No es muy práctico tener que crear una celda seca,
especialmente si se desea medir el ruido bajo condiciones similares a las del
análisis cromatográfico. Es aceptable sustituir la técnica de la celda de flujo
seca por una fase móvil isocrática y estacionaria. Si el ruido observado en
estas condiciones está aproximadamente a 2x de la especificación, el
detector está funcionado correctamente. El ruido a λs más bajas, como
215nm, será mayor aquel mostrado a 255nm con la fase móvil fluyendo a
través de la celda.
Los transitorios (“Spikes”) se caracterizan por tener un ancho de pico a
mitad de altura considerablemente menor que un pico cromatográfico real.
Aparecerán de forma aleatoria durante el análisis cromatográfico, estando
por encima del ruido de línea de base determinado de la forma
anteriormente indicada. Una lámpara de detector cerca del límite de su
vida o un ruido electrónico excesivo generalmente causan este tipo de
perturbaciones. La tabla siguiente sugiere diferentes causas para que una
línea de base muestre ruido junto con su solución propuesta.
- 138 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Líneas de Base Ruidosas
Componente
Causa Potencial
Solución
Botellas de Disolvente
Burbujas de aire en la Fase móvil
Aségurese de desgasificar adecuadamente
Bomba HPLC
Compruebe todas la conexiones buscando fugas que pudieran provocar la
entrada de aire
Elimine está posibilidad parando el flujo de fase móvil: si aún se muestra
el ruido entonces el conjunto de suministro de disolvente no es la causa.
Compruebe las áreas alrededor del cabezal de la bomba por si hubiera
depósitos de sales de los támpones.
Apriete las conexiones si es necesario.
Automuestreador
Introducción de aire durante la inyección.
Realice los test de mantenimiento especificados por el fabricante para
evaluar la integridad de los componentes individuales del
Automuestreador.
Disolvente de la muestra o Fase móvil incorrectas
Columna
Sustituya los componentes dudosos si es necesario.
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Si la viscosidad del disolvente de la muestra es alta, o posee un bajo punto
de ebullición, es conveniente reducir la velocidad de succión de muestra y
la de inyección para evitar cavitación.
Temperatura de la Columna mayor que el punto de ebullición de alguno de
los componentes de la fase móvil.
Pérdida de los ligandos de la fase estacionaria.
Disminuya la temperatura de separación para evitar la ebullición del
disolvente.
Crawford
Scientific
Revalide el método si hay una pérdida de©resolución
o cambia
la
selectividad de la columna.
Compruebe que el método está operando en el rango correcto de pH para
esa columna.
Compruebe que el método funciona dentro de los límites de
especificados para esa columna.
Disolución de la sílice de la fase estacionaria.
Detector
Pertubaciones
electrónicos.
eléctricas
“spikes”
provenientes
de
los
circuitos
pH
Sustituya el detector y compruebe.
Solicite una visita del servicio técnico si se requiere.
Burbujas de aire atrapadas en la celda del detector.
Purge el aire. NO EXCEDA el límite superior de presión establecido para la
celda del detector, típicamente de 120 bares para una celda estándar de
1cm de paso óptico y 13µL de volúmen.
Revise la literatura del fabricante para confirmarlo.
Si no se encuentra integrado en el detector, conecte un restrictor de
contra presión para evitar la desgasificación. Típicamente un tubo de PEEK
de 50cm de largo y 0.17mm d.i. será suficiente.
Mantenga un registro de las horas de uso de la lámpara.
Captura de Datos
Lámpara cerca del límite de su vida útil.
Establezca un periodo de sustitución obligatorio de la lámpara. P.ej. al
80% de su tiempo de vida útil esperada.
Mala toma de tierra / Conexión floja
Sustituya el sistema de adquisición de datos y compruebe.
Revise y reconecte todos los cables de conexión visibles.
- 139 -
2007
HPLC Troubleshooting and Maintenance
10.2
Formas de Pico
10.2.1 Ensanchamiento de los Picos
La corrección de picos ensanchados requiere determinar si dicho
ensanchamiento es producto de cambios en el sistema HPLC, deterioro de la
columna o se trata de un “eluido tardío” proveniente de una inyección
anterior.
Si todos los picos separados se han ensanchado, siendo los primeros los que
muestren más ensanchamiento, el problema vendrá causado simplemente
por la introducción de un gran volumen extra-columna en el sistema;
•
•
•
Adición de una longitud de tubo desproporcionada.
Una conexión de capilar o de columna deficiente.
Conexiones de PEEK (ajustables a mano) desgastadas.
Si no es así, o el ensanchamiento de pico se viene observando durante un
periodo de tiempo largo, es un indicativo del deterioro general de la propia
columna.
La Eficiencia de la Columna, o número de platos (N), se usa como medida
matemática del deterioro de una columna en función del tiempo y del
número de inyecciones. Midiendo el número de platos para un determinado
compuesto de la muestra, o evaluando el pico cromatográfico con un
conjunto de estándares de calidad recomendado por el fabricante de la
columna, y comparando el resultado con el registro histórico nos indicará la
magnitud del deterioro. Siempre que la fase móvil y el resto de parámetros
del sistema no se hayan cambiado, la retención de los analitos no debería
variar significativamente cuando la eficiencia caiga.
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- 140 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
La Eficiencia de la columna se puede calcular aplicando la ecuación
siguiente:
N = 5.54 x (tR / w0.5)2
Dónde;
N=
Número de Platos de la Columna
tR = Tiempo de Retención del Analito
w0.5 = Ancho de pico a mitad de altura (FWHH)
•
•
Si N aumenta cuando aumenta el tiempo de retención del analito, es
que la columna genera la mayor contribución al volumen muerto del
sistema, y el HPLC funciona correctamente.
Si N decrece o llega a ser aleatorio cuando aumenta el tiempo de
retención del analito, es el HPLC quien genera la mayor contribución
al volumen muerto del sistema y no funciona adecuadamente.
Hay que evaluar si otros componentes del sistema pueden también
contribuir al ensanchamiento de los picos. Éstos incluyen guarda columnas
deterioradas, o la introducción inadvertida de gran volumen extra-columna.
Los compuestos de alto peso molecular, en especial las proteínas, pueden
ensanchar sus picos en columnas de tamaños de poro < 80A; asegurese que
usa un tamaño de poro > 300A cuando analice dichas especies químicas.
Puede sospecharse de que un pico que eluye tarde provenga de una
inyección previa cuando aparece como un único pico ancho en un
cromatograma con el resto de los picos estrechos. Es importante destacar
que este pico puede no aparecer en todas las inyecciones, y por lo tanto
puede no ser observado inicialmente, especialmente en separaciones multicomponente complejas. Puesto que este “eluído tardío” en cuestión sufre
simplemente de un aumento en su factor de capacidad (k’), una
aproximación simple para identificar su origen es permitir que el
cromatograma tenga una duración de muchas veces el tiempo de análisis
normal.
Una forma más eficiente para localizar a un pico de elución tardía es
calcular primero su tiempo de retención real. Esta aproximación tiene la
ventaja de que permite saber con que inyección en particular está
realmente asociado el pico.
En primer lugar determine el nº de platos de un pico determinado del
cromatograma. Como ejemplo tomaremos un pico con tiempo de retención
de 12min, y un ancho de pico a mitad de altura (PWHH) de 0.15min. A
partir de la ecuación descrita anteriormente obtendríamos:
N = 5.54 x (12 / 0.15)2 y
N = 35,456
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2007
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- 141 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Resolviendo la ecuación para tR tendríamos;
tR = 0.425 x (w0.5) x √N y
tR = 12.0
Midiendo el ancho de pico a mitad de altura del último pico es posible
predecir su tR.
En este ejemplo supondremos que el ancho de pico problema es de 0.5min.
Utilizando este ancho de pico, y el número de platos previamente
determinado a partir del pico cromatográfico de 35.456, el tiempo de
retención calculado es de 40min. Esto significa que el último pico que eluye
está relacionado con una inyección realizada 40 min antes. Re-inyectando la
muestra sospechosa y alterando el tiempo de análisis en consecuencia
podemos confirmar este tiempo de retención.
A menudo no es posible eliminar estos picos de elución tardía. Por lo tanto,
en lugar de modificar las condiciones de separación, o esperar hasta que el
pico eluya antes de hacer la siguiente inyección, es generalmente más
conveniente modificar el tiempo de análisis de forma que el pico de elución
tardío caiga en una zona irrelevante del cromatograma posterior.
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- 142 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
10.2.2 Desdoblamiento de Picos y Hombros
Si todos los picos del cromatograma son dobletes probablemente la
columna ha desarrollado un vacío o canalizaciones en su inicio. La
sustitución de la columna confirmará rápidamente el problema.
Si se sospecha de la existencia de un vacío hay que desmontar la conexión
de cabeza de columna y comprobar visualmente la misma. Si existe un vacío
hay que rellenarlo con fase estacionaria, y si no, limpiar o sustituir la frita y
probar la columna de nuevo para establecer si el problema fue
originalmente
causado
por
una
frita
parcialmente
obstruida.
Adicionalmente, invertir la columna y lavarla con un 100% de disolvente
fuerte puede eliminar cualquier contaminación que bloquee la entrada de la
columna enviándola directamente a desechos. Compruebe las instrucciones
del fabricante para saber si la columna puede mantenerse en orientación de
flujo inversa.
Puesto que el bloqueo parcial de la frita de entrada de la columna está
generado por depósitos de partículas existentes en la fase móvil, disolvente
de la muestra o rotor seal, asegurese de filtrar adecuadamente e insertar un
filtro de línea entre el inyector y la cabeza de columna.
Si solamente uno de los picos del cromatograma se muestra como un
doblete, podemos sospechar de la existencia de otro pico o interferencia
que coeluye. Confirme la presencia de esta interferencia cambiando la
longitud de onda del detector, o mejorando la resolución de la separación
usando una columna que proporcione una mayor eficiencia, p.ej. una
columna más larga o empacada con partículas de menor tamaño.
Ajuste la selectividad mostrada por el sistema de separación frente a los
compuestos que coeluyen alterando la composición o el tipo de la fase
móvil, la temperatura de separación o la fase estacionaria de la columna.
Use algún procedimiento previo de limpieza de la muestra p.ej. SPE para
eliminar cualquier interferencia contaminante. Evalúe si un determinado
pico que coleuye proviene de una inyección previa o no, inyectando un
blanco y evaluando según el procedimiento descrito en la pág 141.
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- 143 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
Lave de forma rutinaria la columna con un disolvente fuerte de alto poder
de elución cuando realice separaciones isocráticas. Este efecto se muestra
en la figura de abajo, donde la forma de pico de un grupo de drogas básicas
son separadas isocráticamente en una fase móvil de 25mM Na2HPO4
(pH3.0):MeOH (60:40) y su forma se mejora significativamente tras un
lavado de columna con 100% de acetonitrilo.
Si se ha inyectado un volumen de muestra demasiado grande, y el solvente
de la muestra y la fase móvil no han sido adecuadamente emparejados, se
producirán dos equilibrios de distribución, generando un particionamiento
diferencial de la muestra en la columna. La consecuencia de esto será la
formación de dobletes o picos con hombros. Refererirnos a las reglas
empíricas descritas en las págs. 79 ss en relación con el emparejado del
volumen de inyección y la fuerza del disolvente de la muestra ayudará a
eliminar este fenómeno.
La siguiente figura ilustra el deterioro en la forma de pico debido a un
inadecuado emparejamiento entre el disolvente de la muestra y la fase
móvil, mostrando la inyección de una mezcla de cuatro componentes
disuelta en diferentes disolventes y separada en una columna de fase
reversa C18 bajo condiciones isocráticas de MeOH:H2O 60:40 (v/v).
La mezcla test se separó en cada cromatograma disuelta en;
• (a) − Fase Móvil
• (b) − Tetrahidrofurano
• (c) − Etanol
• (d) − Butanol
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- 144 -
HPLC Troubleshooting and Maintenance
El aumento de la fuerza de elución del disolvente produce una degradación
apreciable de la forma de pico cromatográfico.
Evalúe si la columna ha sido saturada en masa. Es posible determinar
empíricamente la masa máxima que puede inyectarse en un determinado
análisis empleando la ecuación siguiente:
ωmax ≈ 50 x (1 − k' / k')2 x dc2
Dónde;
ωmax =
k' =
dc =
Masa de muestra en µg
Factor de Capacidad
Diámetro interno de la Columna en cm
Esta ecuación no funciona bien para tamaños de partícula < 5µm, o si
compuestos básicos muestran adsorción diferencial con la fase estacionaria.
ωmax se refiere a cada compuesto independiente en la muestra y no a la
masa total de muestra. Por lo tanto, si no hay componentes de la muestra
por encima del 10% de la masa total de muestra ωmax será 10x el valor
efectivo calculado.
Si se requiere use una fase estacionaria de mayor capacidad, es decir, con
un mayor % de carbono u mayor tamaño de poro, una columna con mayor
diámetro o reduzca la cantidad total de muestra inyectada.
Desmonte la válvula de inyección y revise el rotor seal en búsqueda de un
posible desgaste, incluyendo roturas entrecuzadas, que pueden generar la
presencia de una ruta de flujo inesperada en el inyector. Sustituya el rotor
seal si es necesario, fijando un número máximo de inyecciones antes de
sustituir periódicamente el mismo. Para más información refiérase a la
sección 5.3 Incidencias del Automuestreador − "Efecto Memoria".
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10.2.3 Picos con Cola
La aparición de colas en los picos es una de las deformaciones
cromatográficas más frecuentes. Se dice que un pico tiene cola cuando
muestra una asimetría mayor de 1.2, aunque en ocasiones picos con valores
de As tan altos como 1.5 puedan ser aceptables para una gran variedad de
ensayos. El factor de asimetría de pico (π) se calcula según la siguiente
ecuación:
π = wb2 / wb1
Donde;
wb2 = Ancho del pico en la línea de base después del centro del pico
wb1 = Ancho del pico en la línea de base antes del centro del pico
La principal causa de aparición de cola en un pico es la coincidencia de más
de un mecanismo de retención. En las separaciones por Fase Reversa, el
principal modo de retención de los analitos es a través de interacciones
hidrofóbicas no-específicas con la fase estacionaria. Sin embargo, también
son frecuentes las interacciones polares con grupos de silanoles residuales
existentes en el soporte de sílice. Compuestos que posean en su estructura
grupos amino o cualquier otro grupo básico, pueden interactuar
fuertemente con los grupos silanoles ionizados, produciendo picos con cola.
Este efecto se muestra en la figura siguiente a un pH >3.0.
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Estas interacciones secundarias pueden minimizarse si se realiza la
separación a un pH más bajo, asegurando así la protonación completa de los
citados grupos silanol residuales;
Otra alternativa es la utilización de columnas “end-capped”. “End-capping”
es el nombre que se da al proceso químico por el cual los grupos silanoles
residuales de la fase estacionaria se transforman en otros grupos funcionales
sustancialmente menos polares en su superficie. Esta modificación tiene el
efecto de reducir las interacciones secundarias que puedan producirse
potencialmente con moléculas de analitos polares.
Los reactivos químicos empleados para el proceso de “end-capping”
incluyen generalmente;
•
•
Trimetilclorosilosano (TMCS)
Hexametildisilazano (HMDS)
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El proceso de “End-capping” reduce las colas observadas con analitos
polares, bloqueando de forma eficiente sus interacciones con los grupos
silanol residuales que pudieran ser potencialmente ionizables. A pesar de
ello, el “end-capping” sólo disminuye aproximadamente a un 50% el número
de grupos silanol no reaccionados. Debido a factores de impedimento
estérico este tipo de reacciones rara vez son eficientes en términos
absolutos y en consecuencia una columna completamente “end capped” no
es nunca tanto como debería!
En el caso de que todos los picos cromatográficos muestren cola debe
considerarse la posibilidad de que la columna se haya sobrecargado por un
exceso de muestra. Evalúe aplicando la ecuación descrita previamente en
la página 104. Si fuera necesario utilice una fase estacionaria de mayor
capacidad p.ej. de mayor % carbono o tamaño de poro, utilice una columna
de mayor diámetro, o reduzca la cantidad absoluta de muestra o volumen
inyectado.
Examine la columna por si se hubieran formado volúmenes muertos o se
hubiera bloqueado parcialmente la frita de entrada. Sustituir la columna
por otra nos confirmará rápidamente el problema.
Si se sospecha que existe algún volumen muerto, quite las conexiones de
cierre y revise la cabeza de columna. Si se observa algún hueco en el relleno
cúbralo con fase estacionaria, o si no, limpie o sustituya la frita de entrada
y pruebe la columna de nuevo para ver si el problema estaba originado o no
por una frita parcialmente obstruida. En ocasiones, invertir la columna y
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lavarla con un 100% de un disolvente fuerte también permite eliminar
bloqueos y contaminación del filtro de entrada.
Compruebe las instrucciones del fabricante para ver si la columna puede
mantenerse en la orientación inversa de flujo o no.
Si sólo uno, o algunos, de los picos cromatográficos muestran cola,
considere la posibilidad de que la columna esté mostrando efectos de
partición o retención secundarios.
Reduzca la probabilidad de que cualquier analito potencialmente básico
interactué con los grupos silanol residuales usando columnas fabricadas con
sílice desactivada (Tipo B), que han sido completamente bloqueadas (“endcapped”). Como parte de cualquier procedimiento de desarrollo de métodos
reduzca el pH de la fase móvil para suprimir la ionización de cualquier grupo
silanol. En general, una fase móvil con pH <3 será suficiente para este
propósito. Adicionalmente, el empleo de fases móviles a bajo pH asegura la
protonación de los analitos ácidos, aumentando su retención y minimizando
cualquier tipo de interacción iónica.
La figura de abajo ilustra el efecto producido en las colas de pico al reducir
el pH de separación. La mezcla de cinco fármacos básicos consiste en
Fenilpropanolamina, Efedrina, Anfetamina, Metanfetamina y Fenteramina
(Picos 1−5) respectivamente. El primer cromatograma se adquirió a un pH
de la fase móvil de 7.0, y en estas condiciones de separación, el Pico 4,
Metanfetamina muestra un factor de cola USP al 5% (USP Tf 5%) de 2.35.
La disminución del pH de la fase móvil reduce la interacción de los analitos
básicos con los grupos silanol residuales eliminado de esta forma la cola
excesiva de los picos. El segundo cromatograma se adquirió con una fase
móvil a pH 3.0 y el USP Tf (5%) de la Metanfetamina en estas condiciones se
redujo a 1.33.
La adición de Trietilamina (TEA) a la fase móvil en niveles de concentración
de 5−10mM, también reduce o posiblemente elimina, la cola en compuestos
básicos. La TEA compite con los analitos polares básicos por enlazarse con
los grupos silanol residuales, produciendo una función de “pseudo endTraducción Grupo Biomaster 2009
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capping”. Esta alternativa sin embargo es menos conveniente, ya que la
fase estacionaria se altera irreversiblemente por la adición de tal
modificador, afectando a la selectividad mostrada por el sistema de
separación posteriormente.
La cromatografía de pares de iones puede resolver el problema de las colas
para analitos ácidos o básicos. Otra opción para la separación de especies
iónicas podría ser emplear cromatografía de intercambio iónico.
Desde un punto de visto práctico, generalmente sólo es posible utilizar el pH
para suprimir la ionización ácida ya que la ionización básica requiere valor
de pH típicamente mayores de 8, y a ese pH se puede producir la disolución
de la sílice. Sin embargo, los fabricantes de columnas ofrecen versiones que
permiten trabajar a un pH mayor, protegiendo la sílice de su disolución por
medio de ligandos bi- y tri- dentados. Estos ligandos son en realidad dos o
tres ligandos tradicionales que se han puenteado por medio de procesos
químicos patentados antes de aplicarlos a la fase estacionaria.
Su
estructura puenteada permite proteger su superficie frente a valores
extremos de pH.
La Figura muestra ligandos bidentados y la protección ofrecida a la
superficie de la sílice gracias a su estructura de puente.
Un único pico con cola también podría producirse por un pequeño pico
eluyendo inmediatamente después del pico cromatográfico de interés. La
posibilidad de que esto ocurra es la razón primordial por la que las colas de
pico nunca deben ignorarse.
Como se describía en el apartado
“desdoblamiento de picos y hombros”, podemos confirmar la presencia de
un interferente cambiando la longitud de onda de detección, o mejorar la
resolución de la separación empleando una columna de mayor eficiencia
p.ej. una columna más larga o empaquetada con partículas de menor
tamaño.
Ajuste la selectividad del sistema frente a compuestos co-eluyentes
variando la composición o el tipo de la fase móvil, la temperatura, o la fase
estacionaria de la columna. Emplee algún procedimiento de “clean-up”
p.ej. SPE para eliminar cualquier contaminante interferente. Evalúe si
alguno de los picos coeluyentes pueden provenir de inyecciones anteriores
haciendo una inyección en blanco y siguiendo el procedimiento descrito en
“Ensanchamiento de Picos” de la pág. 105.
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10.2.4 Picos con Frente
Si todos los picos cromatográficos muestran frente debe considerarse la
posibilidad de una sobrecarga de la columna por exceso de muestra
inyectada. Evalúelo aplicando la ecuación descrita previamente en la pág.
104. Si fuera necesario utilice una fase estacionaria de mayor capacidad
p.ej. de mayor % carbono o tamaño de poro, utilice una columna de mayor
diámetro, o reduzca la cantidad absoluta de muestra o volumen inyectado.
Si se ha inyectado un volumen de muestra excesivamente grande, y el
solvente de la muestra y la fase móvil no están adecuadamente
emparejados, pueden producirse dos equilibrios de distribución, provocando
una partición diferencial en la columna. Refiérase a las reglas empíricas
descritas en las páginas 54-56 en relación al adecuado emparejamiento de
entre el volumen de inyección con la fuerza eluotrópica del disolvente de la
muestra para eliminar éste fenómeno.
Un único pico que muestre frente también puede deberse a un pequeño pico
que eluya justo antes del pico cromatográfico de interés. Esta posibilidad es
la principal razón por la que un pico con frente nunca debe ser ignorado.
Como se describía en el apartado “desdoblamiento de picos y hombros”,
podemos confirmar la presencia de un interferente cambiando la longitud de
onda de detección, o mejorar la resolución de la separación empleando una
columna de mayor eficiencia p.ej. una columna más larga o empaquetada
con partículas de menor tamaño.
Ajuste la selectividad del sistema frente a compuestos co-eluyentes
variando la composición o el tipo de la fase móvil, la temperatura, o la fase
estacionaria de la columna. Emplee algún procedimiento de “clean-up”
p.ej. SPE para eliminar cualquier contaminante interferente. Evalúe si
alguno de los picos coeluyentes pueden provenir de inyecciones anteriores
haciendo una inyección en blanco y siguiendo el procedimiento descrito en
la pág. 89.
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10.2.5 Efecto Memoria y Picos Fantasma
Los picos fantasmas son picos que aparecen en el cromatograma, incluso
cuando no se ha realizado ninguna inyección. Hay dos causas frecuentes
para la aparición de picos fantasma:
1.
Puede ser un pico de elución tardío proveniente de una inyección
anterior. Debido a que tal pico habrá estado en la columna durante un
tiempo apreciable, se mostrará como mucho más ancho que el resto de
picos cromatográficos de su alrededor.
La fuente potencial puede trazarse empleando el método de cálculo de
tiempos de retención descrito anteriormente en la pg 141. Modifique
el método según se necesite, incluyendo el lavado de la columna con
un disolvente fuerte para eliminar cualquier contaminante potencial
que estuviera fuertemente adsorbido.
2.
Los picos fantasmas pueden derivarse de una fase móvil contaminada.
Bajo condiciones isocráticas los picos pueden ser distintos, o se puede
observar un desplazamiento de la línea de base sólo después de que el
HPLC esté funcionando durante algún tiempo. En condiciones de
gradiente los picos normalmente aparecen al mismo tiempo de
retención, tanto en la inyección de un blanco como en la de una de
muestra.
En cualquier caso, dichos picos fantasma pueden trazarse como
originados por una fase móvil contaminada. Para aislar la fuente
contaminación use fase móvil recién preparada, sólo disolventes de
grado HPLC, Agua de grado HPLC y aditivos y tampones de alta pureza.
Si el problema persiste elimine uno a uno los componentes de la fase
móvil hasta aislar el problema.
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El Reciclaje de fase móvil se encuentra limitado a las separaciones
isocráticas exclusivamente, y es más útil para aquellos métodos
empleados para análisis rutinarios con concentraciones de muestra
moderadas como ocurre con frecuencia en los laboratorios de Control
de Calidad. Los componentes de la muestra se diluyen en el tanque de
recogida de fase móvil de forma que pasa un tiempo considerable
hasta que el fondo (“background”) del cromatograma cambia de forma
preciable. Esto se evidencia por lo general en una línea de base
ascendente o un mayor nivel de ruido, produciéndose una pérdida en la
sensibilidad de los analitos. En ese momento también pueden
observarse picos fantasma de cuando en cuando.
A menudo se añade ácido trifluoroacetico (TFA) a las fases móviles de fase
reversa como agente formador de par-iónico para estrechar los picos
cromatográficos. Potencialmente puede aparecer contaminación del TFA si
se utiliza una única botella como origen, ya que la exposición del TFA al aire
lo oxida rápidamente. Considere por lo tanto el uso de ampollas de TFA
selladas individualmente más que alicuotar desde una botella ya abierta.
Este puede ser especialmente aplicable para el análisis de estabilidad de
muestra forzadas a degradarse. El Tetrahidrofurano sufre también de los
mismos problemas de degradación oxidativa.
La posibilidad de que el sistema de inyección pueda ser la fuente de picos
fantasma también existe. Material proveniente de las muestras de
inyecciones anteriores puede haber quedado adsorbido en diferentes
componentes del sistema de inyección, especialmente en el rotor seal, y
producirse unn “sangrado” en una escala grande tiempo. Evalúe lavando el
sistema de inyección con un disolvente fuerte para inyectra posteriormente
un blanco. Si no se observan picos en el blanco, optimice e incorpore ese
régimen de lavado al método, o investigue el mecanismo potencial de la
adsorción del componente y corríjalo en consonancia.
Puesto que diferentes materiales de rotor pueden adsorber materiales
diferentes de la muestra, merecería la pena investigar si el efecto se
disminuye o incluso se elimina, cambiando entre rotores de Vespel,
Tefzel y PEEK que están comercialmente disponibles.
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10.2.6 Picos Negativos
La aparición de picos negativos se produce debido a factores no relacionados
con las interacciones entre los analitos y la columna. Se observan picos
Negativos cuando los cables de señal del detector están invertidos, o cuando
el interruptor de polaridad se encuentra en la posición incorrecta. Los picos
Negativos son normales cuando se utiliza el Detector de Indice de
Refracción.
Los picos Negativos aparecerán en el cromatograma si la absorbancia de la
muestra es menor que la de la fase móvil a la longitud de onda de
detección. Hay que emplear por lo tanto fases móviles que muestren una
absorbancia UV/Vis baja, o cambiar la longitud de onda de detección del
analito.
Si a lo largo del tiempo se concentran en la fase móvil compuestos
fuertemente absorbentes puede aparecer una situación similar si el
disolvente se recicla. Si está empleando reciclado de fase móvil y comienzan
a aparecer picos negativos tras un uso prolongado de la fase móvil, lave
abundantemente la columna con un disolvente fuerte y re-equilíbrela, con
fase móvil recientemente preparada. Si desaparece el problema de picos
negativos, es un indicio de que la fase móvil estaba contaminada.
Cuado se emplea el detector de Diodo Array (DAD) es recomendable
emplear una longitud de onda de referencia para posibilitar la sustracción
de línea de base. Esto tiene la ventaja de corregir una línea de base con
deriva mejorando así los límites de detección y de cuantificación.
Es
importante asegurarse de que la longitud de onda de referencia y el ancho
de banda (bandwith) se han elegido correctamente para prevenir la
posibilidad de que se produzca una absorbancia mayor que la de los analitos
a detectar y se generen picos negativos en el cromatograma.
El procedimiento correcto para la selección de las longitudes de onda de
detección y de referencia se describe en relación con el espectro UV del
ácido anísico. Para optimizar la detección de la menor cantidad posible de
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ácido anísico seleccione la longitud de onda de medida al pico más intenso
del espectro, es decir, 252nm. Tratando el espectro como si fuera un pico
pseudo-cromatográfico, compruebe su anchura a media altura (PWHH). Este
será en ancho de banda de la longitud de onda de medida (Bandwith) p.ej.
30nm.
Es posible reducir los efectos de fondo gracias a una adecuada elección de
las longitudes de onda de medida y de referencia. La longitud de onda de
referencia puede emplearse para eliminar los siguientes efectos, que
provocarán todos ellos derivas de línea de base durante el análisis
cromatográfico o bien mostrarán ondulaciones o ruido en la misma;
1.
2.
Reducción del ruido generado por:
• Particulas en suspensión
• Cambios en el índice de refracción del eluyente cuando se emplean
gradientes de elución.
• Turbulencias en la celda de flujo
Reducción en la deriva del instrumento causada por:
• Envejecimiento / deformacion de la lámpara
Identifique en el cromatograma el pico que absorbe a la longitud de onda
mayor, en el ejemplo es el ácido anísico. Determine la longitud de onda a
la que el pico del ácido anísico deja de absorber, se considera generalmente
cuando la absorbancia cae por debajo de 1.0mAU, y en el ejemplo del ácido
anísico será 300nm. Para evitar la posibilidad de una contribución a la
absorbancia de la longitud de onda de referencia elegida, añada 10nm a
este valor − Esta longitud de onda será el límite inferior de la longitud de
onda de referencia, i.e. 310nm.
Para eliminar los efectos de fondo descritos hay que elegir un ancho de
banda grande, típicamente de 100nm, y situar la longitud de onda de
referencia en el punto medio de esta ventana i.e. 360nm.
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10.3
Tiempo de Retención
El tiempo de retención de los analitos puede fluctuar, aumentar o disminuir,
y es crítico para diagnosticar y eliminar problemas en el sistema de HPLC.
El diagnóstico de las variaciones observadas en el tiempo de retención
equiere determinar si el problema está generado por el sistema HPLC o por
la columna. A partir de los principios fundamentales;
•
•
Si el tiempo muerto (t0) y el tiempo de retención del analito (tR)
varían juntos podemos sospechar de un cambio en el flujo de
eluyente. En este escenario el factor de capacidad (k') se mantendrá
constante.
Si es sólo el tiempo de retención del analito tR el que varía, entonces
k' cambiará también. En este escenario las sospechas van dirigidas a
un en cambio en la selectividad del sistema de separación, es decir,
en la composición de la fase móvil, la temperatura, la fase
estacionaria de la columna, etc.
10.3.1 Tiempos de Retención Fluctuantes
La variación en el tiempo de retención de los analitos se debe generalmente
a cambios producidos en la composición de la fase móvil, y es típicamente el
resultado de una mezcla de solventes inconsistente. Una reducción del
5−10% en el tiempo de retención del analito por fase reversa puede
producirse por cada 1% de incremento en la proporción del componente
orgánico de la fase móvil. Esta variación es bien conocida, y a menudo se
utiliza para producir grandes cambios en la selectividad particular de un
sistema de separación para un rango de analitos cuando es necesario.
La figura a continuación muestra la variación de tiempo de retención en una
serie de inyecciones consecutivas de una mezcla estándar de cuatro
componentes, empleando un sistema de mezcla a baja presión. La parte
inicial del método de separación emplea una sección isocrática de 12 mn a
62% B.
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Suponiendo que el contenido de las botellas de disolvente se ha preparado
correctamente, la incorrecta composición de la fase móvil puede provenir
de unos de los dos problemas siguientes;
1.
Si existe una restricción en uno o más de los canales de disolvente que
vienen desde las botellas hacia la válvula de proporción, la proporción
obtenida de la mezcla de solventes será incorrecta. Para eliminar la
posibilidad de que el suministro de una o más fases móviles esté
restringido, hay que desconectar la línea de entrada de disolvente de
la válvula proporcional. Una vez desconectada, el líquido debe sifonar
libremente si no existe ninguna restricción.
Afloje el tapón de la botella de disolvente si está cerrado, para liberar
cualquier vacío parcial de la botella. Si la presurización insuficiente
fuese la causa del problema el solventes sifonará entonces
perfectamente. Si el flujo queda aún restringido, quitar el filtro de
entrada de disolvente y comprobar si sifona de nuevo. Si la línea sifona
libremente el filtro está bloqueado. Si el filtro es del tipo de vidrio
sinterizado límpielo sumergiéndolo en ácido nítrico 6M, para después
lavarlo abundamentemente con H2O, después con MeOH, y de nuevo
con agua antes de reinstalarlo. No lo sonique, puesto que podría
provocarse la fractura del vidrio debido a la frecuencia de ultrasonidos
aplicada.
Si una línea de disolvente se encuentra restringida se introducirá menos
disolvente, generando un ligero vacío en la válvula proporcional de
gradiente. En consecuencia, cuando la segunda válvula se abra habrá
un torrente del nuevo disolvente para compensar ese vacío parcial, con
el resultado de que la proporción de disolvente introducido variará. Un
exceso de disolvente B en la fase móvil hará que los analitos eluyan
antes, como en el ejemplo observado en el cromatograma del
ejemplo.
2.
Si el suministro de disolvente no se encuentra restringido, el problema
puede encontrarse en el software de control o sospecharse de un
problema mecánico en la válvula proporcional. Los sistemas de mezcla
a baja presión trabajan abriendo cada válvula proporcional durante un
tiempo determinado, cerrándola, y abriendo después la segunda
válvula, etc. En el ejemplo anterior, si el ciclo total de la válvula
fuese de 100ms, y se necesitara una fase móvil isocrática de 38% A:62%
B la válvula A permanecerá abierta durante 38ms y la válvula B durante
62ms.
Para comprobar si hay fallos en la válvula proporcional, cebe todas las
líneas con el mismo disolvente y partiendo de volúmenes iguales en las
botellas realice una mezcla cuaternaria de proporción fija 1:1:1:1 (v/v)
durante un tiempo fijo a un flujo fijo. La reducción del volumen en
cada botella de disolvente debe ser la misma si la válvula funciona
correctamente.
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Adicionalmente, cuando se dejan preparadas fase móviles durante un
tiempo los solventes más volátiles de la mezcla pueden evaporarse,
produciendo un cambio en las características generales de retención.
Sin embargo la evaporación no tiene mucha influencia en los métodos
en fase reversa, a menos que la botella de disolvente se caliente
durante el uso. Pueden producirse problemas con la fase móvil cuando
se usa un disolvente reciclado incorrectamente. Asegúrese de que la
botella de disolvente contiene un minímimo de unos tres litros de fase
móvil, y que está siendo agitada constantemente. De esta forma los
contaminantes o cualquier otro pequeño cambio en el eluyente
proveniente de la columna serán diluidos eficientemente antes de
pasar a través del sistema la próxima vez.
Las variaciones de tiempo de retención también pueden ser causadas por
fluctuaciones de la temperatura. Por cada cambio de 1ºC en la temperatura
de la columna puede producirse un cambio del 1−2% en el tiempo de
retención. La forma más sencilla de eliminar este problema potencial es
asegurarse de que tanto la columna como la fase móvil están
termostáticamente controladas. Compruebe problemas potenciales de
temperatura usando un termómetro calibrado, y determine si cualquier
fluctuación de temperatura observada se correlaciona con cambios en el
tiempo de retención de los analitos.
El envejecimiento de la columna puede también contribuir a variaciones en
el tiempo de retención. El empleo de guarda columna puede extender en la
práctica la vida efectiva de una columna. Más aún, se recomienda el uso de
guarda columna por una razón específica; servir de filtro para eliminar
materiales fuertemente retenidos que podrían contaminar potencialmente
la columna analítica.
Analizar estándares de comprobación con más frecuencia puede permitir un
sistema de captura de datos que actualice convenientemente la deriva
observada en el tiempo de retención. Asigne un pico cromatográfico de la
muestra como pico de referencia. El uso de un estándar interno puede
ayudar también, en especial si se utilizan tiempos de retención relativos en
lugar de absolutos.
La tabla siguiente muestra el efecto observado de cambiar las condiciones
de separación en el tiempo de retención tR de los analitos.
Efecto del cambio de las Condiciones de Separación en la
retención de los analitos
Variable
Método
Cambio Variable
Cambio Prom. tR
Flujo
Todos
+1%
-1%
Temperatura
Todos salvo SEC
+10C
-(1−2%)
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Composición de la Fase Móvil:
Solvente Orgánico
RP-HPLC*
+1% (v/v)
-(5−10%)
pH
RP-HPLC
+0.01 unit
±(0−1%)
Solvente Fuerte
Fase Normal
+1%
-(1−2%)
Tampón:
SEC
+1%
0%
Solvente Orgánico
* Incluyendo Cromatografía de Pares de Iones RP-HPLC
Mejora la fiabilidad de cualquier análisis LC con respecto a las variaciones
en tiempo de retención y a la forma de los picos asegurándose de que la
capacidad tamponadora de la fase móvil es suficiente para compensar
cualquier cambio de pH.
Generalmente un tampón funcionará con la mayor eficiencia cuando se
encuentre en ±1 unidades de pH del pka del analito. Es muy importante
saber que los tampones fosfato no proporcionan la capacidad tamponadora
deseada en el rango de pH de 3−6. Este rango de pH puede llenarse bien
usando un tampón acetato (pka 4.8), o citrato, ya que este tampón muestra
tres pkas en el rango de pH típico de las separaciones en fase reversa. Sin
embargo, el citrato tiene el inconveniente de ser altamente corrosivo para
las superficies de acero inoxidable.
La tabla siguiente muestra el rango efectivo de la capacidad tamponadora
de diferentes tampones ácidos comunes:
Valores pka para Tampones Ácidos comunes
Tampón
Pka
Rango pH efectivo*
Fosfato
2.1
1.1 − 3.1
7.2
6.2 − 8.2
12.3
11.3 − 13.3
Acetato
4.8
3.8 − 5.8
Citrato
3.1
2.1 − 4.1
4.7
3.7 − 5.7
5.4
4.4 − 6.4
* Rango pH efectivo − ±1 pH unidades del pka
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Para mantener una adecuada capacidad tamponadora de las muestras de
analitos, comience con una concentración de tampón entre 25−50mM. No
emplee menos de 20mM, a no ser que utilice un detector espectrométrico
de masas.
Considere cambiar a un sistema tampón de naturaleza volátil p.ej. acetato
amónico o formiato amónico. Los tampones volátiles previenen contra la
contaminación y el ensuciamiento de la fuente del espectrómetro de masas,
mejorando la sensibilidad y la eficiencia en la detección.
La figura de abajo muestra el efecto negativo producido por variación del
pH en el tiempo de retención del analito y en su forma de pico. Los dos
compuestos cromatografiados son ácido benzoico y sórbico respectivamente.
A un pH tamponado de 3.5 éstos ácidos débiles se encuentran
completamente protonados, y por lo tanto muestran tiempos de retención
largos en una caolumna de fase reversa. (Cromatograma A). A un pH
tamponado a pH 7.0 los ácidos se encuentran completamente
desprotonados. Poseen ahora un grado de polaridad mucho mayor que a pH
3.5, y en consecuencia su tiempo de retención decrece dramáticamente
(Cromatograma B). Sin embargo, se utiliza un pH no tamponado de 7.0 el
estado de ionización de estos analitos no está controlado de forma
eficiente, y el equilibrio dinámico está constantemente cambiando entre la
forma ionizada e ion- suprimida y tanto el tiempo de retención como la
forma de pico varían dramáticamente (Cromatograma C).
10.3.2 Decrecimiento del Tiempo de Retención
Si el tiempo muerto(t0) y el tiempo de retención (tR) decrecen
simultáneamente, el factor de capacidad del analito (k') permanecerá
constante. En este escenario puede sospecharse de un progresivo aumento
en el flujo. Compruebe los parámetros de operación del método y la
calibración del flujo del sistema.
Chequee el pH de cualquier fase móvil tampón utilizada. A menos que se
establezca específicamente por parte del fabricante de la columna, el pH de
operación debe mantenerse en el rango de pH de 2 a 8. Por debajo de pH 2
el enlace siloxano que une el ligando de la fase estacionaria al soporte de
sílice se romperá, produciéndose la pérdida de fase estacionaria. Por
encima de aproximadamente pH 8 se produce la disolución del soporte de
sílice. En ambos casos disminuirá el tiempo de retención de los analitos.
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Considere cambiar el tipo de columna a una variedad polimérica no basada
en sílice para permitir separaciones cromatográficas a pH extremo.
Asegúrese de que la columna no esta sobrecargada. Aplique la ecuación
descrita en la pág 145, y si fuera necesario aumente la carga de carbono de
la columna utilizada, o disminuya la cantidad absoluta de la masa de analito
aplicado bien diluyendo la muestrta o reduciendo el volumen de inyección.
Elimine cualquier interacción secundaria de la columna usando un
modificador de fase móvil o tamponando ésta adecuadamente. La
Trietilamina puede añadirse como base competitiva para eliminar las
interacciones polares con los grupos silanol residuales, y para aumentar la
carga de carbono efectiva de la columna.
Si realiza gradientes de elución asegúrese de que todos componentes del
disolvente se mezclan en la proporción y calidad de mezcla adecuadas.
Afloje los tapones de las botellas de disolvente para liberar cualquier
formación de vacío parcial, asegurando la completa presurización y el
llenado completo de las líneas de alimentación de disolvente.
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10.3.3 Aumento del Tiempo de Retención
Si el tiempo muerto(t0) y el tiempo de retención (tR) aumentan
simultáneamente, el factor de capacidad del analito (k') permanecerá
constante.
En este escenario puede sospecharse de una progresiva
disminución en el flujo. Compruebe los parámetros de operación del método
y la calibración del flujo del sistema.
Compruebe el cabezal de la bomba buscando fugas. Si realiza gradiente de
elución compruebe que el gradiente está siendo mezclado y proporcionado
correctamente.
Afloje los tapones de las botellas de disolvente para
liberar cualquier formación de vacío parcial, asegurando la completa
presurización y el llenado completo de las líneas de alimentación de
disolvente.
10.4
Incidencias con la Presión
Durante el funcionamiento puede esperarse algún aumento en la
contrapresión del sistema. Un aumento en la viscosidad de la fase móvil
producirá un incremento en la presión del sistema, y puede producirse
simplemente por una reducción de la temperatura de operación de la
columna. De forma similar cualquier cambio en la composición de la fase
móvil puede alterar la viscosidad. El Isopropanol es cuatro veces más
viscoso que el metanol a temperatura ambiente, mientras que una mezcla
de H2O:MeOH 40:60 (v/v) generará aproximadamente el doble de la presión
que el MeOH puro.
Otros factores que contribuirán a un incremento en la presión del sistema
son el aumento del flujo, el aumento de la longitud de la columna, la
reducción del tamaño de las partículas de sílice o cualquier bloqueo o
restricción en la ruta seguida por la fase móvil. Elimine la columna como
causa del aumento de presión retirándola del sistema y sustituyéndola por
una unión de volumen cero.
Para localizar un bloqueo parcial reduzca el flujo de fase móvil de forma
que se obtenga una presión inferior a 500psi. Con las gafas de protección
puestas, vaya aflojando sistemáticamente las conexiones LC, yendo desde el
detector hacia la bomba. Cuando se afloje la conexión justo antes del
componente bloqueado la presión caerá de forma significativa. La pieza
sospechosa puede limpiarse o sustituirse si es necesario. Si después de
eliminar el bloqueo éste vuelve a aparecer al poco tiempo, debemos
examinar con mayor detalle la fuente potencial del problema.
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10.4.1 Aumento Continuo de la Presión sin
Inyecciones de Muestra
Cuando se observa un aumento constante en la presión del sistema sin que
se hayan realizado inyecciones las causas pueden ser las siguientes:
1.
Partículas en la Fase Móvil
Deben filtrarse todos los disolventes y tampones que no sean de gradoHPLC a través de un filtro de 0.22µm para eliminar cualquier material
particulado; ver págs 40 ss para más información. Las partículas en la
fase móvil pueden dañar los sellos de los pistones del cabezal de la
bomba. El desgaste de los sellos de los pistones puede provocar que las
válvulas antirretorno se peguen produciendo incrementos de presión,
además de las variaciones en el tiempo de retención de los analitos
debido al inadecuado suministro de fase móvil. Cuando se sustituyan
los sellos es necesario evaluar también el desgaste de los pistones. Con
una lupa y luz intensa compruebe que no se han formado estrías o
canales en el émbolo del pistón. Cualquier daño del pistón producirá
inmediatamente un daño en el sello reproduciendo el problema.
2.
Los componentes de la Fase Móvil son inmiscibles o insolubles.
Compruebe la compatibilidad de los disolventes de la fase móvil usando
la tabla de compatibilidad de la pág 15. Emplee un disolvente
intermedio de lavado cuando tenga que cambiar entre fases móviles
potencialmente inmiscibles. Elimine cualquier traza de tampón con
agua antes de la siguiente aplicación, para evitar la posible
precipitación y la introducción inadvertida de material particulado en
el sistema cuando se cambia de un método a otro.
3.
Fase Móvil Inestable (polimerización).
4.
Formación de volúmenes vacíos en la columna
Las prestaciones de la columna se irán deteriorando con el tiempo. La
exposición continua a alta presión producirá la compresión de la fase
estacionaria, y el desarrollo de un volumen vacío en cabeza de
columna. Además del aumento en la contrapresión, la forma del pico
cromatográfico
comenzará
a
deteriorarse;
se
producirá
ensanchamiento de los picos debido a la caída de la Eficiencia y
aparecerán desdoblamientos de los picos y hombros.
La disolución de la sílice se produce a pH alto. A menos que lo
establezca específicamente el fabricante, no use tampones con pH por
encima de pH 8. Al trabajar con una fase móvil a pH alto debe
emplearse una columna saturadora que puede ayudar a prolongar la
vida de la columna analítica. Una columna saturadora puede ser una
columna vieja del mismo tipo que la columna analítica situada entre el
cabezal de la bomba y el automuestreador. Para minimizar la
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contrapresión adicional producida la columna saturadora suele ser de
150 mm o más corta.
El fundamento técnico es que la fase móvil iniciará el ataque a la
columna saturadora en primer lugar, pre-tratando de forma efectiva la
fase móvil de forma que será menos agresiva con la columna analítica.
A medida que el relleno de la columna saturadora se va disolviendo se
generan micropartículas de sílice que van acumulándose y bloqueando
la frita de salida de la columna saturadora. Estas partículas se van
haciendo cada vez más pequeñas, y eventualmente pueden pasar a
través del filtro de salida de la columna saturadora. Es muy
conveniente por lo tanto instalar un filtro de línea de 0.5µm o menor
entre la salida de la columna saturadora y la entrada del
automuestreador para atrapar estas partículas.
Con la disponibilidad comercial de rellenos de sílice estables a alto pH,
y de fases sin sílice resistentes al ataque pH, actualmente hay menos
justificación en el uso de columnas saturadoras.
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10.4.2 Aumento Continuo de la Presión con
Inyecciones de Muestra
1.
Particulas en la muestra
Las partículas existentes en la muestra producen contaminación en la
frita de entrada de la columna, generando un incremento de la presión
y anormalidades en la forma de los picos p.ej. colas, desdoblamientos,
etc. Revise visualmente la calidad de la muestra disuelta antes de
inyectarla para decidir si necesita o no ser filtrada. Si el aspecto es
turbio o hay visible material particulado, filtre a través de un filtro de
0.5 o 0.22µm.
Instale un filtro de línea entre el inyector y la columna, y si se
sospecha de contaminación proveniente de la muestre instale una
guarda columna para servir de filtro químico y de partículas.
2.
Compuestos de la Muestra insolubles en la Fase Móvil.
Bajo condiciones de inyección ideales el disolvente de la muestra debe
ser el mismo que la fase móvil, o más débil. De esta forma se evitarán
anormalidades en la forma de los picos ya que el disolvente de la
muestra no requiere dilución a la concentración de la fase móvil y se
evitan mecanismos de partición secundarios. Refiérase a las págs 79−82
para más información sobre las condiciones a aplicar cuando se
inyecten muestras en solventes de mayor fuerza eluotrópica que la fase
móvil para asegurar la solubilidad.
3.
Componentes de la muestra irreversiblemente enlazados a la fase
estacionaria de la columna.
Asegúrese de que todos los componentes de la muestra son eluidos de
la columna después de su uso. Elimine los analitos fuertemente
adsorbidos lavando la columna con un disolvente de gran poder de
elución. Asegúrese de que el poro de la fase estacionaria es suficiente
para analizar los analitos en cuestión; use columnas con tamaño de
poro de 300Å para compuestos de peso molecular mayor de 5kDa.
Invierta el flujo de fase móvil a través de la columna para acelerar la
eliminación de cualquier analito fuertemente retenido o liberar el
bloqueo parcial del filtro de entrada de la columna. Las columnas con
base de sílice pueden invertirse generalmente sin consecuencias. Sin
embargo, algunas columnas especiales como las de Filtración en Gel o
las de resinas de intercambio iónico pueden no ser tan robustas.
Consulte la literatura proporcionada por el fabricante de la columna
para aclarlo.
Desconecte la columna, inviértala y conecte la antigua salida al tubo
que viene del automuestreador. Lave aproximadamente con 20
volúmenes de columna de fase móvil ~ 50mL para una columna de 4.6
x 250mm para eliminar cualquier partícula de la frita, antes de
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conectar su salida (la antigua entrada) al detector. Deje la columna en
esta configuración de flujo inverso y continúe la operación
normalmente.
10.5
Sensibilidad
Una baja sensibilidad puede producirse por alguna de las razones siguientes:
1.
•
•
2.
•
•
•
•
3.
•
•
•
4.
•
•
¿Hay suficiente muestra?
Compruebe pérdidas durante la preparación de la muestra realizando
análisis de muestras dopadas con una concentración conocida de
analito.
Considere el uso de estándar interno para ajustar las pérdidas
durante la el proceso de preparación de muestra optimizando el
método de forma apropiada.
¿Problemas en el Inyector?
Compruebe la calibración del automuestreador.
Aplique la técnica de inyección adecuada para el volumen disponible
de muestra. Consulte las págs 79-82 para más información sobre el
llenado completo o parcial del loop.
La aguja del Inyector está parcialmente obstruida.
Rotor Seal desgastado, con una ruta no barrida por la fase móvil.
¿Problemas en el Detector?
Compruebe el flujo de fase móvil a través del detector, despejando
cualquier posible bloqueo.
La atenuación del Detector es demasiado alta.
Es importante verificar los datos cromatográficos proporcionados por
el sistema de tratamiento de datos periódicamente, evaluando el
aspecto de la línea de base, picos y separación en general. Con el fin
de evaluar adecuadamente la sensibilidad del sistema es necesario
disponer se una vista estándar o atenuación del instrumento. Aunque
la atenuación puede fijarse en el propio instrumento, es más
frecuente que la realice el sistema de tratamiento de datos. Un
usuario puede pensar que tiene mala sensibilidad frente a un analito
si la atenuación se ha seleccionado muy alta.
Concentración de la Muestra fuera del rango lineal del detector.
Diluya o pre-concentre la muestra para llevar a los analitos dentro del
rango lineal del detector.
¿Cambio en el Flujo?
Flujo Reducido
Un flujo reducido generará picos cromatográficos anchos.Las áreas de
pico se mantendrán constantes, aunque la altura de pico se reducirá,
reduciendo la sensibilidad efectiva y los límites de detección y
cuantificación. Compruebe los ajustes del método.
Evalúe el sistema de suministro de disolvente para comprobar si los
sellos de los pistones se han desgastado o las válvulas antirretorno se
han pegado o bloqueado parcialmente afectando al fujo de fase
móvil.
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•
La reducción de la temperatura de separación, la viscosidad de la
fase móvil, cambian el flujo efectivo y los efectos de transferencia de
masa.
10.6 Recuperación
Una mala recuperación de la muestra puede producirse por múltiples
razones, pero se debe típicamente a la adsorción irreversible de los
ananlitos en la fase estacionaria o en los componentes extra-columna.
Aumente la fuerza eluotrópica de la fase móvil para minimizar la adsorción.
Para la separación de analitos básicos emplee sílice desactivada, columnas
con en-capping, o añada una base competitiva como la trietilamina para
minimizar las interacciones retentivas secundarias. Considere usar una
columna de fase estacionaria pomérica si la adsorción en demasiado fuerte.
Emplee componentes inertes en las conexiones y tubos.
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