Biología Molecular 2002 Guía de Trabajos Prácticos

Maestría Biología Molecular Médica
Biología Molecular
2002
Guía de Trabajos Prácticos
1
MATERIALES PELIGROSOS DE USO EN EL LABORATORIO
BROMURO DE ETIDIO: Mutagénico. Puede causar irritación respiratoria, de ojos y piel.
Evitar el contacto con piel y ropas. Evitar respirar el polvo. Lavar bien todo el material en
contacto luego de usar. Usar en lugares ventilados. Usar guantes.
FENOL: Acido muy fuerte con alta capacidad de penetración. Produce quemaduras
graves. Usar en lugares ventilados. Usar guantes.
CLOROFORMO: Carcinogénico, teratogénico. Nocivo por ingestión, irrita la piel. Riesgo
de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por inhalación o
ingestión. Usar guantes.
ACRILAMIDA: Carcinogénico, teratogénico. Riesgo de efectos graves para la salud en
caso de exposición prolongada por inhalación o ingestión. Usar guantes.
HIDROXIDO DE SODIO: Alcali fuerte. Evitar contacto con la piel. Usar guantes.
ACIDO ACETICO: Inflamable. Provoca quemaduras graves. No respirar los vapores. En
caso de contacto con los ojos lavar inmediata y abundantemente con agua y acudir a un
médico. Usar guantes.
MERCAPTOETANOL: Perjudicial para la salud si se inhala o ingiere. Tóxico si entra en
contacto con la piel. En caso de contacto con los ojos enjuagar con agua y acudir a un
médico. Usar guantes.
LUZ UV: Mutagénica. Proteger los ojos con anteojos apropiados y/o pantalla protectora.
En caso de una exposición prolongada (más de un minuto) utilizar también máscara
protectora. Usar guantes.
TEMED: Muy inflamable. Tóxico por inhalación o ingestión. Irritante para el sistema
respiratorio y la piel, evitar contacto con la piel y los ojos. Usar guantes.
METANOL: Producto inflamable. Tóxico por inhalación o ingestión. Conservar alejado de
las llamas o fuente de chispas. Evitar el contacto con la piel. En caso de ingestión beber
etanol 40% y acudir a un médico. Usar guantes.
2
Preparación de DNA plasmídico- Digestión con enzimas de restricción.
Minipreparacion de DNA plasmidico (vector pBLcat6, ver mapa en la hoja nº: 8 )
1. Se inoculan 5 ml de medio LB-ampicilina (100 g/ml) (Solución madre de
ampicilina 1000X) con una colonia de E. coli (DH5α) que contiene el plásmido
a aislar. Dejar crecer O.N. a 37°C.
2. Se cosechan las células por centrifugación a 5000 rpm durante 5 min. a
temperatura ambiente. Se descarta el sobrenadante.
3. Se resuspende el pellet en 100 l de Solución I con vortex. Agregar RNAsa A a
una concentración final de 20 g/ml (Sol. madre 10 mg/ml).
4. Agregar 200 l de la Solución II preparada en el momento. Mezclar
suavemente por inversión y dejar en hielo por 10 min.
5. Agregar 150 l de Solución III fría. Mezclar suavemente por inversión y dejar
en hielo por 10 min.
6. Centrifugar 15 min. a 10000 rpm en microcentrífuga.
7. Transferir el sobrenadante en un tubo limpio. Extraer con un volumen de
fenol:cloroformo (1 vol de fenol + 1 vol de cloroformo), mezclando bien por
inversión.
8. Centrifugar 2 min. a máx velocidad en microcentrífuga para separar las fases.
9. Tomar la fase acuosa (superior) y transferir a otro tubo.
10. Agregar 2 vol de etanol absoluto y dejar 30 min. a –20°C.
11. Centrifugar 20 min. a 10000 rpm, eliminar el sobrenadante, secar el pellet y
resuspender en 40 l de buffer TE.
Digestión con enzimas de restricción
Protocolo de digestión del vector con una enzima de restricción
pBLCAT6
Buffer 10X Enz RestrX
Enz RestrX
H2O c.s.p.
x l (0.1 a 0.4 g DNA en H2O o TE)
1 l
1 U/g DNA
10 l
Dejar 2 horas a 37°C.
Visualización y cuantificación del vector
Electroforesis en gel de agarosa
3
1. Preparar 100 ml de agarosa 1% en buffer TAE 1X en un erlenmeyer de 250 ml.
Calentar la suspensión hasta fundir la agarosa. Agregar 4 l de Bromuro de
Etidio (10 mg/ml). OJO CANCERIGENO.
2. Verter la agarosa fundida en la cuba de electroforesis y colocar el peine
mientras la agarosa está líquida. Dejar solidificar. Retirar el peine y agregar
buffer TAE 1X hasta cubrir la superficie del gel.
3. Sembrar las muestras a analizar en los wells y un marcador de peso molecular
y masa para poder cuantificar.
4. Correr el gel a 80 Volts 3 horas o a 100 Volts 2 horas.
5. Visualizar las bandas con luz ultravioleta.
IMPORTANTE
TENER MUCHO CUIDADO CON EL MANIPULEO DEL GEL, DADO QUE EL
BROMURO DE ETIDIO ES CANCERIGENO. USAR GUANTES.
PREPARACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES Y TRANSFORMACIÓN
1. Se inocula 1.5 ml de medio LB con E. coli Nova-blue. Se deja crecer O.N. a
37°C.
2. A la mañana siguiente sembrar 6 ml de LB con 0.1 ml del cultivo.
3. Agitar a 37°C hasta llegar a una DO de 0.6 a 600 nm (aprox. 2 horas).
4. Centrifugar en microcentrífuga a 4°C.
5. Resuspender el pellet con 2.5 ml de CaCl2 50 mM. Dejar a 4°C 15 min.
6. Centrifugar en microcentrífuga 2 min. a 4°C.
7. Resuspender en 500 l de solución CaCl2 50 mM.
8. En un eppendorf estéril mezclar 100 l de células competentes obtenidas en 7.
con 10 l de la preparación de DNA para transformar.
9. Incubar 10 min. en hielo y transferir a 42°C durante 2 min. (MUY
IMPORTANTE).
10. Agregar 1 ml de LB e incubar durante 30 min.-1 hora a 37°C.
11. Sembrar 100 l de distintas diluciones en placas de LB-ampicilina.
Preparación de DNA genómico
1- Cada grupo recibirá dos eppendorfs de 1.5 ml con esporas del hongo M. rouxii
crecidas en condiciones aeróbicas durante 6 horas en medio YPG.
Resuspenderlas, juntando ambos pellets, en 0.5 ml de TE.
4
2- Centrifugar 15 seg. a máxima velocidad, descartar el sobrenadante y
resuspender el pellet en el líquido residual.
3- Agregarle 0.15 ml de la SOLUCION DE LISIS y 0.15 ml de fenol:cloroformo
(1:1). Agregarle 0.2 g de bolitas de vidrio (aprox. 150-200 l).
4- Vortexear 3-4 min.
5- Agregar 0.15 ml de TE. Centrifugar 5 min. a máx. velocidad. Transferir la fase
acuosa (superior) a un tubo eppendorf de 1.5 ml.
6- Agregar 0.9 ml de ETOH 100%, mezclar por inversión. Centrifugar a máx.
velocidad por 2 min.
7- Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 0.3 ml de TE + 30 g de
RNAsa A. Incubar 10 min. a 37°C.
8- Extraer 4 veces con fenol:cloroformo.
9- Agregar 1/10 vol de acetato de sodio 3M pH 5.2 + 2.5 vol de ETOH 100%.
Mezclar.
10- Centrifugar 15 min a máx. velocidad.
11- Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 0.5 ml de ETOH 70%.
12- Centrifugar 5 min. a máx. velocidad.
13- Descartar el sobrenadante y dejar secar el pellet.
14- Resuspender el pellet en 0.3 ml de H2O destilada estéril o TE.
15- Repetir desde el paso 9 hasta el 12. Dejar secar el pellet.
16- Resuspender el pellet en 60 l de H2O destilada estéril o TE.
Cuantificación: Se realizará una dilución de la muestra y se procede a leer a
260nm y a 280nm. 1 OD 260nm: 50gml
PCR - Amplificación por PCR de un fragmento de DNA.
Se utilizará como templado el DNA genómico preparado en la clase anterior.
Colocar en un tubo eppendorf de 0.5 ml lo siguiente:
(Mantener siempre en hielo hasta el momento de la PCR)
DNA
Buffer 10X
MgCl2 (25 mM)
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
Primer 5'
Primer 3'
Taq DNA Pol.
H2O c.s.p.
100 ng
5 l
4 mM final
0.4 mM final
0.4 mM final
0.4 mM final
0.4 mM final
10 pmoles
10 pmoles
2.5 U
50 l
Agregar 1 gota de aceite mineral.
5
Centrifugar 10 seg. a máx. velocidad.
Colocar en la máquina cicladora.
Programa PCR:
95°C 3 min
Desnaturalización 95°C 1 min
Apareamiento
55°C 30 seg
Elongación
72°C 1 min
x 35
Elongación
72°C 10 min
Preparar un gel de agarosa 1% en buffer TAE 1X con BrEt y correr para visualizar
el producto de la PCR.
Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes.
1. Preparación de las placas de vidrio.
Limpiar bien las placas de vidrio con alcohol y una vez secas colocarlas en los
armadores interponiendo los separadores correspondientes entre ambas. La placa
de vidrio mas grande es la posterior (para el sistema que utilizamos son las placas
de silica).
2. Preparación de los geles.
Se correrán geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 10% con SDS.
Gel separador (10%):
Acrilamida/Bisacrilamida......2.67ml
Tris-ClH 1.5 M pH:8.8..........2 ml
SDS 10% w/v.......................80 l
H2O destilada.......................3.2 ml
APS 10%............................. 40 l
TEMED.................................6 l
Volumen total ......................8 ml
Cargar los geles con aproximadamente 4 ml de la solución de gel separador y
luego adicionar suavemente agua destilada con la pipeta, para evitar el contacto
con el oxígeno del aire. No moverlos hasta que gelifiquen, lo cual se verá por la
formación de una interfase. Volcar el agua y llenarlos con el gel stacking (gel
concentrador).
Gel stacking o concentrador (4%):
Acrilamida/Bisacrilamida......0.53ml
6
Tris-ClH 0.5 M pH:6.8..........1ml
SDS 10% w/v.......................40 l
H2O destilada.......................2.4 ml
APS 10%............................. 20 l
TEMED.................................4 l
Volumen total ......................4 ml
Colocar inmediatamente los peines en la parte superior evitando la formación de
burbujas y cuidando que queden derechos.
3. Armado de las cubas.
Retirar el peine y colocar la placa en la cuba de electroforesis colocando el vidrio
delantero hacia la parte interna de la cuba. Llenar la cuba con el buffer de corrida y
proceder al sembrado de las muestras.
4. Preparación de las muestras.
4.1 Inducción de la proteína de fusión:
a. Se cultivan las colonias tranformadas en 2 ml de LB O.N.
b. Se diluye el cultivo 1/10 en medio LB fresco y se cultivan a 37º C hasta fase
logarítmica (3-5 horas).
c. Se agrega el inductor IPTG hasta una concentración final 1 mM y se dejan
crecer hasta 3-5 horas.
4.2 Preparación de extractos:
a. Se centrifugan las células y se resuspenden en agua (aprox. 100 l).
b. Se agrega buffer de siembra hasta 1x final y se hierven 10-15 minutos.
c. Se centrifugan a max velocidad 5 minutos y se siembran en los geles 15-20 l.
5.Corrida electroforética.
Se conecta la cuba a la fuente de poder y se corren a 80 V, media hora y 100 V,
una hora, hasta que el colorante llegue a la parte inferior del gel.
6. Fijación y tinción.
Se desarma la cuba, se retira el gel de las placas de vidrio y se mide la distancia
recorrida por el colorante. Se procede a la fijación y tinción de las bandas
proteicas con el colorante Coomasie blue. Se deja en agitación durante 1 hora y
se procede a desteñir con la Solución lavadora.
7
Primers y secuencia a ser amplificada:
Primers: SM4 y SM6
SM4
841
GAACAAGCTGAAAATATTCAAAAGTCTGTCGCCAACAATTTTCTGTTTAAAAACATGGAC
281
E Q A E N I Q K S V A N N F L F K N M D
901
GAGGAACACTACCAAGACATAGTAAACGCCATGATTGAAAAGCCTGTGAGAAAAGGTGAG
301
E E H Y Q D I V N A M I E K P V R K G E
961
ACAATTATTGAACAAGGTGCGGTAGGTGATTACTTTTATGTCGTCGCTTCAGGTACTTTT
321
T I I E Q G A V G D Y F Y V V A S G T F
1021
GACTGTTACATTAAAAAGCCAGGGCAAGAGAAACCTTTAAAGGTAACTTCTTATGAAAGA
341
D C Y I K K P G Q E K P L K V T S Y E R
1081
GGAGGAAGTTTTGGTGAATTGGCTCTAATGTACAATGCACCACGTGCTGCCACCGTTACT
361
G G S F G E L A L M Y N A P R A A T V T
1141
TCTACTTCAGAAAGTGTCTTRTGGGCACTCGATCGTGTCACCTTCAGAACCATCTTGATG
381
S T S E S V L W A L D R V T F R T I L M
1201
8
GAAAACACAGCTCTTAAAAGGAGAGTTTACGAATCGTTTTTGGAGGAAGTAGCCTTGTTA
401
E N T A L K R R V Y E S F L E E V A L L
1261
ATATCATTAGAACCTTATGAACGCCATAAAATAGCGGACTCTCTCGAGACTATCTTTTTT
421
I S L E P Y E R H K I A D S L E T I F F
SM6
Plásmido pBLcat6:
Soluciones, buffers y medios:
9
MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO YPG
Peptona 1%
Extracto de levadura 0.3%
Glucosa 2%
MEDIO LB (1litro) Bacto triptona 10 g
Extracto de levadura 5 g
NaCl 5 g
Sólido
Agar 20 g
SOLUCIONES Y BUFFERS
SOLUCION DE LISIS
Tritón X-100
SDS
NaCl
Tris-HCl pH 8
EDTA
2%
1%
100 mM
10 mM
1 mM
SOLUCION I (se autoclava)
Tris-HCl pH 8
EDTA pH 8
25 mM
10 mM
SOLUCION II (preparar en el momento)
NaOH
SDS
0.2 N
1%
SOLUCION III
Acetato de potasio (60 ml) 5 M
Acético glacial (11.5 ml)100 %
H2O (28.5 ml)
BUFFER TE
Tris-HCl pH 8
EDTA
10 mM
1 mM
BUFFER TAE (50X, 1 litro)
10
Tris base
Acético glacial
EDTA pH 8
242 g
57.1 ml
100 ml de 0.5 M
BUFFER DE LIGADO (10X)
Tris-HCl pH 7.8
MgCl2
DTT
ATP
300 mM
100 mM
100 mM
500 mM
ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA (30%T, 2.6% C)
Acrilamida
Bisacrilamida
Volumen total
29.2 gr.
0.8 gr.
100ml
BUFFER DE CORRIDA SDS-PAGE
TrisBase 15g
Glicina 72 gr
SDS 5g.
BUFFER DE SIEMBRA MUESTRAS SDS-PAGE
Agua destilada
Tris-HCl 0.5 M pH:6.8
Glicerol
SDS 10%(w/v)
Azul de Bromofenol 0.1%(w/v)
mercaptoetanol
Vol total
4.8 ml
1.2ml
1ml
2ml
0.5ml
0.5ml
10 ml
SOLUCIÓN TINCIÓN COOMASSIE BRILLANT BLUE
Coomassie Brillant blue R-250 0.15% en solución de Metanol 8%+Acético 7%
DESTEÑIDORA
Metanol 50%
Acético 10%
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