1 GENERALIDADES SOBRE PURIFICACION DE PROTEÍNAS. El

GENERALIDADES SOBRE PURIFICACION DE PROTEÍNAS.
El método de purificación debe diseñarse desde un principio teniendo en cuenta la
cantidad de proteína que se requiere. Hay etapas de purificación que se pueden
aumentar de escala fácilmente y otras en que no es posible hacerlo.
El grado de pureza necesario dependerá del uso que se va a dar a la proteína. Para
usos en investigación, la escala es reducida y es mas importante la pureza que el
rendimiento. Para usos terapéuticos la escala es mayor y la pureza requerida es
máxima. Para usos industriales, frecuentemente se requiere gran cantidad, bajo
costo y pureza menor.
Si el interés está en la proteína y no importa el organismo de origen, conviene
buscar una fuente fácil de obtener, barata, que contenga esa proteína en
abundancia. Si existe la posibilidad de partir de organismos enteros o de células en
cultivo, esto último es en general preferible. Lo óptimo es producir la proteína por
métodos de DNA recombinante.
Dependiendo de la finalidad, la proteína debe ser obtenida en estado nativo o puede
estar desnaturalizada. Para actividad biológica, debe estar nativa; para determinar
estructura primaria, puede estar desnaturalizada.
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Se debe seleccionar un método de determinación específico de la proteína
en cuestión (p.ej.: actividad, si se trata de una enzima; unión de ligando a un
receptor; unión de un anticuerpo específico en un RIA) y un método de
determinación de la proteína total. Debe tenerse en cuenta que, salvo la
determinación de proteína por análisis de aminoácidos o por peso seco, todos los
demás métodos son semicuantitativos, a menos que se los estandardice con la
propia proteína en estudio. Entre estos métodos se pueden mencionar 1)
espectrofotometría en el UV (280 nm, Trp; 210-215 nM, unión peptídica); Biuret
(Cu2+ alcalino); Lowry (Cu2+ alcalino + reactivo de Folin-Ciocalteau); Bradford
(Coomassie Blue); unión de Ag.
La actividad específica (AE) es igual a la relación entre la cantidad de
proteína que se purifica sobre la cantidad de proteína total.
El grado de purificación es el cociente de la AE en la etapa 2 sobre la AE
en la etapa 1 (la purificación global, AE final sobre AE inicial)
Se debe utilizar un método adecuado para juzgar la pureza de la proteína
obtenida; actualmente se utiliza SDS-PAGE, monodimensional o, preferentemente,
bidimensional. En otras épocas, se utilizó la ultracentrifugación analítica.
Se debe evitar la proteólisis de la proteína en estudio durante su
purificación, utilizando “cócteles” de inhibidores de proteasas, y trabajando tan
rápido como sea posible y en frío, para minimizar su acción.
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Purificacion step
Cell-free extract
ConA-Sepharo se
Mono Q
Mono P
Total
Protein
Total
activity
Specific
Activity
Yield
Purification
factor
mg
unitsa
unitsa/mg
%
Fold
227.5
5.6
0.67
0.36
56.00
43.75
25.95
14.70
0.246
7.81
38.73
40.83
100
78.1
46.34
26.25
1
31.75
157.44
165.97
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ESQUEMA GENERAL DE UN METODO DE PURIFICACION
1) Separación de las células.
2) Si la proteína es intracelular, ruptura celular y separación de restos.
3) Concentración.
4) Aislamiento primario.
5) Purificación de alta resolución.
6) “Pulido” del producto final.
Problemas a ser resueltos para diseñar el proceso:
1) Elegir etapas basadas en diferentes principios fisicoquímicos.
2) Elegir entre operaciones alternativas, en base a la escala final buscada.
3) Diseñar una secuencia de etapas óptima, con el menor número de etapas
posible, lo que aumentará el rendimiento final.
4) Minimizar la desnaturalización y efectos de superficie; evitar agregación:
minimizar la degradación; cuidar la limpieza y desinfección del equipo usado.
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METODOS PARA LA RUPTURA DEL MATERIAL
A menos que se trate de una proteína extracelular, liberada al medio, las
células o tejidos deben romperse para extraer la proteína de interés. Esta
ruptura debe ser sólo la necesaria, no excesiva, para evitar la extracción
inútil de proteínas contaminantes.
Los distintos tipos de células tienen diferente susceptibilidad a la ruptura.
Las células animales son muy fáciles de romper, pues carecen de pared.
Las vegetales tambien, pues, pese a tener pared celular, su gran tamaño
las hace vulnerables a la ruptura mecánica. Las células bacterianas son
más resistentes, y esta propiedad depende de que sean Gram positivas o
Gram negativas. El predominio del peptidoglicano en la pared de las
primeras, las hace mucho mas sensibles a métodos suaves, como la
digestión con lisozima. Los hongos filamentosos y las levaduras son los
más resistentes a la ruptura. Tienen paredes celulares que contienen
hasta 80 - 90 % de polisacárido (quitina y glicanos en hongos, manano y
glucano en levaduras), además de lípidos y proteínas.
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ALGUNOS METODOS DE RUPTURA DE CELULAS
1) Mortereado con arena, alúmina, bolitas de vidrio, carburo de silicio.
2) Molinos de ruptura, por agitación con abrasivos.
3) Uso de licuadoras u otros dispositivos con cuchillas rotativas.
4) Sonicación.
5) Congelación y descongelación.
6) Extrusión de líquido o sólido (material congelado)
7) Descompresión explosiva.
8) Enzimas líticas, seguido por shock osmótico o tratamiento mecánico.
9) Detergentes (Triton, digitonina) o solventes (tolueno).
10) Aislamiento previo de la organela en que se encuentra la proteína.
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METODOS DE SEPARACION Y CONCENTRACION
Remoción de agua y moléculas pequeñas por
1) Agregado de un polímero seco on poros muy pequeños como para
que la proteína penetre (Sephadex G-25).
2) Remoción a través de una membrana semipermeable
(ultrafiltración). Celdas filtrantes. Diálisis contra polietilenglicol.
“Diálisis” en vacío.
3) Remoción de agua en vacío: liofilización. Buffers volátiles,
como el bicarbonato de amonio.
Cambios de buffer:
1) Diálisis. 2) Filtración por gel; 3) Diafiltración.
Purificación por ultrafiltración.
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PURIFICACIÓN Y CONCENTRACION POR PRECIPITACION
1) Precipitacion por aumento de la fuerza iónica (salting-out):
Series de Hoffmeister. Sulfato de amonio.
2) Precipitación por disminución de la fuerza iónica (salting-in)
3) Precipitación por alteración del pH (mínima solubilidad en el pI).
4) Precipitación por solventes orgánicos (etanol, acetona), que
disminuyen la constante dieléctrica de la solución y por ello su poder
de solvatación.
5) Desnaturalización de impurezas por altas temperaturas, extremos
de pH, solventes orgánicos.
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METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS.
1)Ruptura del material y obtención de un extracto libre de células.
2)Precipitación (sales, pH, alta temperatura, solventes orgánicos).
3)Diálisis o ultrafiltración. Concentración.
4)Fraccionamiento cromatográfico.
Principio de separación
Forma y tamaño
Carga neta
Punto isoeléctrico
Hidrofobicidad
Función biológica
Antigenicidad
Contenido en carbohidrato
Grupos sulfhidrilos libres
Capacidad de ligar metales
Tipo de cromatografía
Filtración por gel
Cromatografía de intercambio iónico.
Cromatoenfocado
Cromatografía de interacción
hidrofóbica
Cromatografía en fase reversa
Cromatografía de afinidad
Inmunoadsorción
Cromatografía con lectinas
inmobilizadas
Cromatografía covalente
Cromatografía de quelatos metálicos
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CROMATOGRAFIA
Separación diferencial de los componentes de una muestra entre una fase
móvil y una fase estacionaria.
La fase móvil es el solvente en que se introduce la muestra y con el que se
eluyen las proteínas (puede ser el mismo o variar durante la corrida).
La fase estacionaria comprende las partículas, en general esféricas, con que
se llena la columna. Estas partículas están formadas por una matriz y, en
la mayoría de los casos, moléculas de menor o mayor tamaño con las que se
la derivatiza, para adaptarla a los diferentes procedimientos
cromatográficos.
La matriz es el sustrato sólido de la fase estacionaria. Las más comunes son
celulosa, dextrano, agarosa, poliacrilamida y silica.
Deben tener buena estabilidad mecánica y química, alta capacidad, tamaño
y forma adecuada de poros, superficie inerte para minimizar las
interacciones no específicas, y tamaño de partícula adecuado al flujo de
solvente deseado y a la presión operativa.
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TIPOS DE CROMATOGRAFIA
Según la presión a que se opera la corrida, se pueden considerar tres tipos:
1.
Corridas a presión normal (LPLC, low-pressure liquid
chromatography). Presión inferior a 5 bar. Pueden usarse matrices de
escasa rigidez, como la agarosa o el dextrano.
2.
Corridas a presión intermedia (MPLC, medium-pressure liquid
chromatography, tambien llamada FPLC (Fast protein liquid
chromatography). Presión entre 6 y 50 bar. Requiere matrices mas
rígidas. Permite flujos mayores.
3.
Corridas a alta presión (HPLC, high-pressure - o high-performance liquid chromatography). Presiones mayores de 50 bar. Requiere
matrices de rigidez alta, partículas pequeñas y columnas y tuberías de
material altamente resistente a la presión, como el acero inoxidable o
el titanio.
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CARACTERISTICAS TIPICAS DE LPLC Y HPLC.
Característica
LPLC
Tamaño de partícula (μ)
100
Flujo (ml.cm-2.h-1)
10 - 30
Presión de trabajo (bar)
<5
> 50
Tiempo de separación (hs.)
Hasta 24
1-3
Volumen de muestra
ml - litro
μl - ml
Etapa de purificación
Variable
En general tardía
Buena
Excelente
Resolución
Dificultades
HPLC
10
100 - 300
Largo tiempo,
Alto costo de equipo,
cámara fría
Posible desnaturalización
por presión.
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OTRAS CONSIDERACIONES GENERALES.
El tamaño de la columna a utilizar dependerá del procedimiento
cromatográfico a seguir y de la cantidad de muestra a purificar.
La aplicación de la muestra a la columna se hace generalmente a través de
un “loop”, imprescindible para FPLC o HPLC. En LPLC puede hacerse
aplicación manual.
La elución de las proteínas introducidas en la columna puede hacerse sin
cambiar la composición de la fase móvil (elución isocrática) o
cambiandola, por etapas o continuamente (gradientes).
Normalmente, luego de la corrida la columna debe ser regenerada,
dejandola en condiciones de ser reutilizada. En general si las columnas no
se utilizan continuamente deben ser guardadas conteniendo un agente
conservador, como el etanol al 20 % o la azida sódica, para evitar el
crecimiento de microorganismos.
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METODOS CROMATOGRAFICOS BASADOS EN LA CARGA
DE LA PROTEINA.
Todas las proteínas contienen residuos cargados, positiva o
negativamente, y su balance a un determinado valor de pH da
la carga neta de la molécula a ese pH. El valor de pH en el
que las cargas se balancean, y en consecuencia la carga neta de
la molécula es 0, es el punto isoeléctrico de la proteína.
Los métodos cromatográficos basados en la carga son dos:
1) La cromatografía de intercambio iónico.
2) El cromatoenfocado.
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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.
La mayoría de las proteínas tienen su pI entre pH 5 y 9. Por encima de su pI
la carga neta de la proteína es negativa, y por debajo es positiva.
El material utilizado es una matriz derivatizada con grupos cargados
positivamente (que intercambian iones negativos, y se llaman por eso
intercambiadores aniónicos, como DEAE-celulosa) o negativamente
(intercambiadores catiónicos, como CM-celulosa).
La adsorción puede hacerse en “batch” o en columna. Las proteínas migrarán
(en condiciones isocráticas) en base a su carga neta a ese determinado pH. Si
se trabaja a un valor de pH tal que muchas proteínas se adsorben, la elución
se hará cambiando el pH o aumentando la fuerza iónica del buffer.
Los intercambiadores pueden ser débiles (utilizables cuando la proteína tiene
carga elevada a ese pH) o fuertes (cuando la carga es baja). No conviene usar
intercambiadores fuertes para proteínas muy cargadas a ese pH, pues la
interacción será muy fuerte y la elución más dificil.
La regeneración de la columna se hace con alta fuerza iónica (ClNa 1 M,p.ej.).
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GRUPOS INTERCAMBIADORES DE IONES USADOS EN
PURIFICACION DE PROTEINAS.
Fórmula
Nombre
Abreviatura
Aniónico fuerte
- CH2N+(CH3)3
- C2H4N+(C2H5)3
Trimetilaminometil
Trietilaminoetil
TAM TEAE -
Aniónico débil
- C2H4N+H3
- C2H4N+(C2H5)2
Aminoetil
AE -
Dietilaminoetil
DEAE -
Sulfo
S-
Sulfometil
SM -
Carboxi metil
CM -
Catiónico fuerte
- SO3- CH2 SO3Catiónico débil
- CH2 - COO-
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PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI
POR FPLC EN COLUMNA DE MONO Q (INTERCAMBIADOR ANIÓNICO)
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CROMATOENFOCADO
El cromatoenfocado puede ser considerado como una extensión del
isoelectroenfocado (IEF) y la cromatografía de intercambio iónico.
En IEF las proteínas se separan por electroforesis en un gradiente de pH; se
aplica en electroforesis bidimensional.
En cromatografía de intercambio iónico se puede eluir con un gradiente de
pH, que se forma fuera de la columna.
En cromatoenfocado, el gradiente se forma dentro de la columna, mezclando
una matriz de intercambio aniónico pre-ajustada a un valor de pH, con un
buffer de pH más bajo.
La proteína al descender en la columna encontrará valores crecientes de pH;
cuando llegue a su pI se volverá electronegativa, y se unirá a la matriz
positivamente cargada.
Como el buffer sigue corriendo, la proteína se
separará y unirá sucesivamente, hasta eluirse en una banda muy definida
(“enfocada”) al pH correspondiente a su pI.
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PURIFICACION DE LA SERINA CARBOXIPEPTIDASA DE TRYPANOSOMA CRUZI
POR FPLC EN COLUMNA DE MONO P (CROMATOENFOCADO)
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PURIFICACION BASADA EN LA HIDROFOBICIDAD
La llamada originalmente “cromatografía de partición” utilizaba una fase
estacionaria polar y una fase móvil orgánica.
La cromatografía en fase reversa se denomina de ese modo porque utiliza
una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. La fase estacionaria
está en general formada por cadenas alifáticas de hasta C18 unidas a una
matriz de silica. La fase móvil es un solvente polar como metanol,
propanol, etanol o acetonitrilo.
Estas condiciones pueden causar la
desnaturalización de muchas proteínas . Por ello se las utiliza en general en
HPLC en fase reversa (RP-HPLC), para purificar proteínas y péptidos
para su secuenciación. Se usan contraiones como el ácido trifluoroacético
para asociarse con grupos cargados en la proteína y aumentar su
hidrofobicidad.
Para purificar proteínas en estado nativo se utilizan condiciones mas suaves,
en la llamada cromatografía de interacción hidrofóbica. Se utiliza en
general octil-Sepharosa o fenil-Sepharosa; la adsorción de las proteínas se
hace en general a alta fuerza iónica, y la elución disminuyéndola, y, si es
necesario, agregando un solvente como propanol o butanol.
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CROMATOGRAFIA COVALENTE
A pH 8, reaccionan la mayor parte de las proteínas que contienen Cys-SH; a pH 4,
sólo las que tienen Cys residuos con un pKa muy bajo, como la papaína.
La columna se regenera con 2,2´-dipiridildisulfuro. La piridin-2-tiona absorbe a 343 nm
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CROMATOGRAFIA DE QUELATOS METALICOS (IMAC)
La matriz tiene unido covalentemente un quelante, como el ácido
iminodiacético.
Se carga la columna con un ión adecuado, que puede ser Zn2+, Ni2+, Cu2+,
Co2+. La proteína se adsorbe a la columna si tiene residuos agrupados de
His, Cys o Trp. Se puede eluir con quelantes, o bajando el pH a 4 - 6, o
compitiendo con imidazol.
Esta técnica es muy usada actualmente para purificar proteínas
recombinantes, expresandolas como fusiones con un “tag” de poly-His (en
general 6 residuos), que pueden agregarse en el N o en el C-terminal. Se
eluyen con imidazol.
Si todo funciona bien, se puede tener proteína recombinante pura en un solo
paso de purificación. Debe tenerse en cuenta que iones como el Co2+ pueden
catalizar la oxidación de grupos en la proteína, en especial de -SH.
Luego de la purificación la columna se regenera con un quelante como
EDTA, y para reutilizarla se la debe volver a cargar con metal.
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CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
Se basa en que todas las proteínas tienen sitios de unión para algún ligando, ya
sea una molécula pequeña (p.ej.: un análogo del sustrato de una enzima, una
hormona para un receptor) u otra proteína (p-ej.: la Concanavalina A para unir
glicoproteínas de alta manosa, o anticuerpos específicos para ligar sus antígenos).
El ligando elegido para la proteína que se desea purificar debe inmovilizarse
sobre una matriz adecuada.
La especificidad del ligando puede ser absoluta (p.ej.: avidina para carboxilasas
con biotina) o relativa (p.ej.: Cibacron Blue para dehidrogenasas NAD o NADPdependientes). La afinidad de la proteína por el ligando debe ser moderada (KL
entre 10-4 y 10-8 M) para permitir una buena unión y una disociación ulterior del
complejo en condiciones no desnaturalizantes.
Para desarrollar el material para cromatografía de afinidad, primero hay que
activar la matriz (p.ej.: agarosa con BrCN) y luego fijarle el ligando. El material
debería ser lo suficientemente estable como para permitir su reutilización.
Se pueden expresar proteínas recombinantes como fusiones que permiten aplicar
cromatografía de afinidad (glutation S-transferasa y GSH-Sepharosa; maltosebinding protein (MBP) y maltosa-agarosa).
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GLUTAMATO DEHIDROGENASA-NADP DEPENDIENTE
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CRUZIPAINA
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FILTRACION POR GEL (CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION
MOLECULAR, O DE TAMIZADO MOLECULAR)
El material cromatográfico es un gel en partículas esféricas, de porosidad controlada, sin
derivatizaciones. La separación de las proteínas se hace en base a la forma y la masa de la
proteína. La elución es isocrática. Las proteínas que no penetran en absoluto en los poros
del gel son las que salen primero (en el llamado volumen de exclusión o volumen vacío, Vo).
Las demás moléculas en la muestra se separan, saliendo últimas las que penetran por
completo en las particulas de gel. Se usa en general fuerza iónica alta, para minimizar las
interacciones de las proteínas entre si, y de las proteínas con la matriz (en este último caso,
no relacionadas con el tamaño de poro).
Los materiales mas comunes son geles de dextrano (Sephadex), de agarosa (Sepharosa), de
agarosa y poliacrilamida (Biogel A), de poliacrilamida (Biogel P). Puede usarse en LPLC, y
tambien en FPLC (Superosa, Superdex) y HPLC (silica porosa, como Lichrosorb).
En la filtración por gel es crítica la relación entre el volumen de muestra y el volumen de la
columna (1 a 5 % del volumen total (Vt) del gel), por lo cual es una técnica que no se puede
aumentar en escala mas que hasta un cierto punto. Para desalado de proteínas, se admite
hasta un 25 - 30 % del Vt.
Aplicaciones: Purificación de proteínas - Desalado - Determinación de pesos moleculares
de proteínas nativas - Determinación de constantes de equilibrio de unión (“binding”).
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Purificacion step
Cell-free extract
ConA-Sepharose
Mono Q
Mono P
Total
Protein
Total
activity
Specific
Activity
Yield
Purification
factor
mg
unitsa
unitsa/mg
%
Fold
227.5
5.6
0.67
0.36
56.00
43.75
25.95
14.70
0.246
7.81
38.73
40.83
100
78.1
46.34
26.25
1
31.75
157.44
165.97
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PURIFICACION DE PROTEINAS DE MEMBRANA.
Proteínas integrales y Proteínas periféricas
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PROTEINAS INTEGRALES
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Para purificar proteinas de membrana, lo mejor es empezar purificando
la membrana. La solubilización de las proteínas dependerá de que se
trate de proteínas integrales o periféricas.
Proteínas periféricas: Buffer con EDTA 0.1 - 1 mM, o alta fuerza iónica,
hasta 1 M ClNa o ClK. En algunos casos se requieren condiciones más
drásticas(urea 8 M, clorhidrato de guanidina 6 M). Incluir inhibidores
de proteasas.
Proteinas integrales: Las que tienen una parte soluble sustancial, pueden
ser solubilizadas cortando la parte que las ancla en la membrana con
fosfolipasas o proteasas, según de qué ancla se trate. Las de Clase I se
extraen por delipidación con solventes orgánicos, agentes caotrópicos o
detergentes.
Detergentes: Moléculas anfifílicas, relativamente pequeñas. Por encima
de la concentración micelar crítica las moléculas coalescen a través de su
parte hidrofóbica para formar micelas, en equilibrio con el monómero.
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Cuando se agrega un detergente a una membrana, se particiona
dentro de la bicapa hasta que esta se hace inestable y se desintegra.
Los lípidos forman en general micelas mixtas con el detergente, en
tanto que las proteínas hidrofóbicas se cubren con una monocapa
del mismo.
Actualmente se usa mucho el Triton X-114, que tiene la propiedad
de ser miscible con el agua a 0 - 4oC, pero se separa en dos fases a
20 - 25oC. Las proteínas integrales, solubilizadas a baja
temperatura, particionan en la fase de detergente al llevarlas a 20 25oC.
Existe una variedad considerable de detergentes empleados en
purificación de proteínas de membrana. Pueden ser detergentes
iónicos, como el SDS o el CTAB, o no iónicos, como la digitonina,
el octilglucósido, el Lubrol, el Triton, y otros.
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PURIFICACION DE LAS PROTEINAS SOLUBILIZADAS.
Las proteínas periféricas (o los fragmentos hidrofílicos de proteínas
integrales) en general se purifican por los mismos métodos que los
usados para las solubles. Las proteínas integrales presentan
problemas especiales, debido a que requieren la presencia continua de
detergentes o solventes orgánicos.
La filtración por gel puede aplicarse; prácticamente todos los
materiales para esta técnica pueden usarse en presencia de detergentes
o desnaturalizantes, y existen algunas resinas (poliéteres hidroxilados,
dextranos hidroxipropilados) admiten solventes orgánicos. La
cromatografía de intercambio iónico y el cromatoenfocado pueden
utilizarse, en presencia de detergentes no iónicos. La cromatografía
en fase reversa en algunos casos puede aplicarse, con la muestra
solubilizada en ácido fórmico al 50 - 70 % en agua. La cromatografía
de afinidad es aplicable en general, requiriendose a veces resinas de
altas porosidad y brazos espaciadores largos.
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PURIFICACION DE PROTEINAS PARA USO TERAPEUTICO.
Lo que se requiere en este caso es la máxima pureza. Por lo demás, los
métodos usados son como para cualquier proteína soluble. La fuente
pueden ser tejidos o sueros animales, sistemas de expresión
procarióticos y eucarióticos, o hibridomas.
El nivel aceptable de contaminantes se relaciona con la frecuencia de
administración de la proteína, y está regulado por las autoridades
sanitarias. La significación clínica de los contaminantes es variable: 1)
Antigenicidad: puede dar origen a reacciones de hipersensibilidad. 2)
Transformación por DNA. 3) Enfermedades transmisibles (virus,
priones). 4) Pirogenicidad por lipopolisacáridos de pared bacteriana.
Para insulina, se considera que el nivel de contaminantes por debajo
del cual no se producen anticuerpos es de 10 ppm. Para DNA se
pueden considerar aceptables valores de 10 pg por dosis. Para virus y
priones, ausencia completa.
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Se requieren, por lo tanto, métodos muy sensibles para la detección
de contaminantes. Para contaminantes proteicos, lo mas usados son
los métodos inmunológicos. Tambien puede usarse tinción con Ag.
El límite de sensibilidad es del orden de 5 ppm por inmunoensayo, 25
- 50 ppm por Western blot y de 200 - 400 ppm por tinción con plata.
Para DNA contaminante, se usan técnicas de hibridización. Para
detección de virus, hibridizaciones y PCR con oligonucleótidos
adecuados. Para endotoxinas bacterianas, gelificación de lisado de
amebocitos de Limulus polyphemus.
OTRAS APLICACIONES ESPECIALES:
1) SECUENCIACION: Evitar el bloqueo del N-terminal (usar urea
libre de cianato). Usar RP-HPLC o SDS-PAGE y electrotransferencia
para la purificación final.
2) CRISTALOGRAFIA: La pureza debe ser alta, pero sobre todo
deben evitarse las microheterogeneidades de la propia proteína a
cristalizar (en especial la proteína desnaturalizada). Es bueno terminar la
purificacion con cromatografía de afinidad.
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PURIFICACION DE PROTEINAS EN GRAN ESCALA.
La escala de producción de proteínas y péptidos por la industria biotecnológica
es de gramos a kilogramos, y utiliza columnas cromatográficas en un rango de
volumen de litros a miles de litros.
El aumento de escala es un problema de ingeniería e involucra consideraciones
que no están asociadas con ciencia pura, como se la considera en el laboratorio.
La operación en escala pequeña busca obtener cantidades limitadas de
proteína, con mucha atención de personal altamente capacitado. En la
operación a gran escala, se debe minimizar el costo y aumentar al máximo el
rendimiento. Esto implica minimizar la intervención humana, sobre todo de
científicos calificados. El proceso debe ser tan sencillo como sea posible. Las
etapas innecesarias son antieconómicas, bajan el rendimieto y multiplican los
problemas. Si el proceso de laboratorio está destinado desde un comienzo a una
aplicación industrial, el método de purificación debe ser diseñado desde el
principio con miras a su aplicación en gran escala. Hay etapas de purificación
que pueden llevarse a una escala industrial y otras que no.
La industria biotecnológica es extremadamente competitiva, y el factor tiempo
es crítico.
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El manejo de soluciones de proteínas en gran escala implica una serie de
problemas técnicos, como evitar la formación masiva de espuma (que causa
desnaturalización) en el bombeo de las soluciones, necesario para transferirlas
entre etapas, evitar la agregación de las proteínas al aumentar su concentración,
y evitar escrupulosamente la contaminación microbiana, que lleva a
degradación.
Las operaciones a realizar son como en cualquier purificación en escala normal,
pero con características especiales.
Separación de sólidos: Se pueden utilizar centrífugas industriales o filtración.
Las centrífugas de alta velocidad requieren refrigeración, y contención
adecuada para evitar la formación de aerosoles contaminantes del medio
ambiente. El costo aumenta a medida que disminuye el tamaño de las partículas
a separar. Los filtros pueden ser los llamados filtros profundos (tierra silícea, 5
a 10 cm de espesor) o membranas (microfiltración). Los problemas más
importantes son la floculaciòn de las proteínas, su unión a las membranas y la
desnaturalización.
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Ruptura celular: las técnicas más aplicables a gran escala son el
homogeneizador y el molino con bolitas de vidrio. Homogenizador: la
suspensión (15 - 20 % de peso seco) es forzada a alta presión a través de
una válvula estrecha; es el método mas usado, pero no sirve para
microorganismos filamentosos. Puede procesar hasta 6000 litros/hora.
Los molinos usan como abrasivo bolitas de vidrio, de 0.3 - 0.4 mm de
diámetro. Sirve para microorganismos filamentosos. Acepta 30 - 60 % de
células, peso húmedo, en suspensión y procesa hasta 2000 litros/hora.
Tambien puede utilizarse en ciertos casos lisis enzimática (lisozima, por
ejemplo) o química (tolueno, detergentes como SDS o Triton X-100,
agentes caotrópicos como guanidina o urea).
Operaciones primarias de separación: Incluyen la concentración, que se
puede hacer por ultrafiltración o por precipitación, con sales o solventes
orgánicos. La remoción de ácidos nucleicos puede hacerse con nucleasas, o
agentes precipitantes, como la polietilenimina, polímero catiónico de peso
molecular 24 kDa. Esta precipitación remueve además los restos celulares
(“cell debris”).
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Operaciones de purificación de proteínas: Se debe buscar un mínimo de
etapas, para disminuir los costos y aumentar el rendimiento. En general,
una etapa preparativa (que debe dar un alto rendimiento, aunque no
purifique mucho, y puede ser una precipitación salina); una etapa de alta
resolución, que debe dar un producto altamente purificado, por ejemplo
cromatografía de intercambio iónico o de afinidad, o cromatoenfocado; y
una etapa final, de “pulido” del producto, para eliminar los últimos
contaminantes; a esta altura de la purificación, puede emplearse
filtración por gel. Es lo más frecuente que el aumento de escala en los
métodos cromatográficos se obtenga aumentando el radio de la columna y
manteniendo, o aumentando poco, su altura. Pero esto dependerá,
naturalmente, del tipo de cromatografía que se use.
Existen columnas con volúmenes totales de hasta 2500 litros, con diámetro
de 2 metros y alturas ajustables, hasta alrededor de 80 cm. La elución
isocrática es más frecuente que el uso de gradientes, para simplificar la
operación.
Se pueden emplear columnas radiales, que constituyen un concepto nuevo
en el campo de la cromatografía en columna.
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Cromatografia de flujo radial.
La muestra se distribuye del encabezamiento
de la columna (6) al canal anular externo (1); de alli difunde a través de la pared
porosa (5), a través del material cromatográfico, pasa luego a través de la pared
porosa interna (4)y llega al canal interno (2) de donde pasa al colector.
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