Estudio de la cinética de la hidrólisis enzimática del bagazo

Estudio de la cinética de la hidrólisis
enzimática del bagazo pretratado
Yailet Albernas-Carvajal1*, Gabriela Corsano2, Layanis Mesa Garriga1,
Ronaldo Santos Herrero1 y Erenio González Suárez1
Centro de Análisis de Procesos. Facultad de Química y Farmacia. Universidad Central “Marta
Abreu” de Las Villas Villas. Carretera a Camajuaní Km 5 ½. Santa Clara. Cuba. 2Instituto de
Desarrollo y Diseño (CONICET-UTN). Avellaneda 3657 - (S3002GJC) Santa Fe, Argentina
1
Study of enzymatic hydrolysis kinetic of pretreated bagasse
Estudi de la cinètica de la hidròlisi enzimàtica del bagàs pretractat
Recibido: 16 de abril de 2014; revisado: 17 de julio de 2014; aceptado: 19 de julio de 2014
RESUMEN
En el estudio se determinan los parámetros fundamentales de la cinética enzimática a partir de un modelo cinético pseudo-homogéneo de Michaelis Menten, previamente estudiado con otros materiales lignocelulósicos,
para determinar la velocidad de producción de Azúcares
Reductores Totales (ART) en el tiempo. Para ello se emplearon los resultados obtenidos a nivel de laboratorio, en
el cual se llevó a cabo la hidrólisis enzimática del bagazo
previamente pretratado de forma ácida y básica. Se emplearon las enzimas Celulolíticas Novozyme CellicRCTec2
y β-glucosidasa con código NS50010, en un experimento
con un diseño factorial 23 haciendo réplicas al azar. Los
valores de la constante de Michaelis Menten y constante
de inhibición determinados (KM y KI) son intrínsecos al sistema de celulosa y celulasa dado, y son independientes
de las variables de operación empleadas.
Palabras clave: Bagazo; hidrólisis enzimática; Michaelis
Menten; modelo cinético.
SUMMARY
In this work, the enzymatic kinetic essential parameters are
determined through the pseudo-homogeneous Michaelis–
Menten kinetic model, which was previously studied using
different lignocellulosic materials in order to establish the
total reducing sugar (ART) production rate. For that purpose, experimental results of enzymatic hydrolysis of bagasse were used, where an acid and alkaline pretreatment
was previously applied. The Novozyme CellicRCTec2 and
β-glucosidase with code NS50010 Cellulolitics enzymes
AFINIDAD LXXII, 570, Abril - Junio 2015
were used, in a test with 23 factorial design and random
replicas. The Michaelis–Menten constant and inhibition
parameters (KM and KI) are intrinsic to the given cellulose
and cellulase system, and they are independent of the
used operation variables.
Key words: Bagasse; enzymatic hydrolysis; Michaelis
Menten; Kinetic model
RESUM
En l’estudi es determinen els paràmetres fonamentals de
la cinètica enzimàtica a partir d’un model cinètic pseudo-homogeni de Michaelis Menten, prèviament estudiat
amb altres materials lignocel·lulòsics, per determinar la
velocitat de producció en el temps de Sucres Reductors
totals (SRT). Per a això es van emprar els resultats obtinguts a nivell de laboratori, en el qual es va dur a terme
la hidròlisi enzimàtica del bagàs prèviament pretractat de
manera àcida i bàsica. Es van emprar els enzims cel·lulòlitics Novozyme CellicRCTec2 i β-glucosidasa amb codi
NS50010, en un experiment amb un disseny factorial 23
fent rèpliques a l’atzar. Els valors de la constant de Michaelis Menten i de la constant d’inhibició determinats (KM i KI)
són intrínsecs al sistema de cel·lulosa i cel·lulasa donat, i
són independents de les variables d’operació utilitzades.
Paraules clau: Bagàs; hidròlisi enzimàtica; Michaelis
Menten; model cinètic.
*Autor para la correspondencia: [email protected]
127
1. INTRODUCCIÓN
Los modelos para la reacción de la hidrólisis enzimática
se pueden clasificar dentro de dos categorías: tipo de
modelo (empírico o mecanístico) y tipo de sustrato (puro
o impuro). La mayoría de los modelos mecanísticos para
esta reacción son o modelos Michaelis Menten con algún
tipo de inhibición o modelos más detallados con múltiples
reacciones. Esos modelos generalmente consideran múltiples reacciones debido a la acción de diferentes tipos de
enzimas o diferentes sustratos (cristalino y amorfo) o una
combinación de los dos. Los modelos más simplificados
incluyen una sola expresión de velocidad de reacción para
la hidrólisis, mientras que los modelos que consideran
múltiples reacciones usan varias expresiones de velocidad
y muchos parámetros.
En la tabla siguiente se relacionan las características básicas de la cinética, lo asumido, y la aproximación modelada de varios modelos establecidos en las diferentes
etapas de la comprensión del complejo de reacciones de
la hidrólisis de la celulosa.
Tabla 1. Características básicas de la cinética, lo asumido,
y la aproximación modelada de varios modelos establecidos en las reacciones de la hidrólisis de la celulosa.
Estado del
sustrato
Sistema Aproximación
Inhibición
enzimático
cinética
Referencia
Material
homogéneo
E12
QSS
Competitiva
(Howell and
Stuck, 1975)
Material
homogéneo
E123
MM
Competitiva
(Huang, 1975)
Grado de
polimerización
E1, E2, E3
MM
No Competitiva
(Okazaki and
Moo-Young,
1978)
Material
homogéneo
E123
QSS
Competitiva
(Howell and
Mangat, 1978)
Cristalino
y amorfo
E123
MM
-
(Peitersen and
Ross, 1979)
Cristalino
y amorfo
E123
QSS
Material
homogéneo
E12, E3
-
Competitiva Ryu et al. (1982)
No Competitiva
(Fan and
Lee, 1983)
E1, endo-glucanasa; E2, celobiohidrolasas; E3, celobiosa; E12, combina E1 y E2; E123, combina E1, E2 y E3, QSS,
estado cuasi estacionario; MM, Michaelis-Menten
Posteriormente se hicieron otros estudios en este sentido;
en 1999, Ljunggren (1999) desarrolló un modelo cinético
que incluye características o factores como inhibición de
producto final de celobiosa y glucosa, desactivación de
enzima y un nuevo parámetro de sustrato. El modelo se
basa en reacciones homogéneas y heterogéneas, las cuales son influenciadas por el producto final y la desactivación de la enzima. En el 2003 Gan et al. (2003) presentan la
cinética enzimática de la hidrólisis de la celulosa considerando un sistema de reacción heterogéneo sólido líquido.
En el 2004, Li et al. (2004) desarrollan un modelo pseudo
homogéneo de Michaelis Menten con inhibición competitiva, considerando sustrato soluble hipotético, empleando
un método gráfico y en el 2007 González (2007) emplea un
algoritmo de optimizaciones sucesivas a partir de valores
iniciales de KM, Vm y KI, mediante Runge Kutta de cuarto
orden. Demuestra que el modelo de inhibición no competitiva se descarta para este caso.
128
Entre las ventajas de considerar Michaelis-Menten para este
tipo de reacciones de hidrólisis enzimática, se encuentran:
• La aparente analogía entre la cinética enzimática y la
cinética celular que ha sido ampliamente empleada
para sugerir una estructura de la expresión cinética
•
para la conversión de sustratos por células vivientes.
• Permite analizar diversos factores ambientales que
influyen en la actividad enzimática como la temperatura, el pH, etc.
• Permite derivar expresiones una vez conocido el
mecanismo de inhibición.
• Toma en consideración elementos relacionados con
el mecanismo de hidrólisis enzimática.
• La expresión de Michaelis - Menten es mucho más
robusta que el modelo de Monod de cinética celular,
Villadsen et al. (2011).
El objetivo fundamental del presente trabajo es obtener
el modelo cinético de la hidrólisis enzimática del bagazo
de caña de azúcar pretratado.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Desarrollo de la hidrólisis enzimática del bagazo pretratado
La reacción de hidrólisis enzimática de la celulosa es catalizada por las enzimas celulasas, las cuales son altamente
específicas. Los productos de la hidrólisis son usualmente
azúcares reductores, incluyendo la glucosa. La reacción
se lleva a cabo bajo condiciones suaves (pH: 4,8, T: 4550˚C). Al contrario de los catalizadores comunes, las enzimas presentan una elevada especificidad con respecto
al sustrato, y su uso reduce la obtención de subproductos
indeseables González (2007). La reacción de hidrólisis enzimática se caracteriza por un sustrato insoluble (celulosa)
y un catalizador soluble (enzimas). Existen fundamentalmente tres tipos de celulasas en los sistemas completos: endoglucanasa, exoglucanasa o celobiohidrolasa y
β-glucosidasa o celobiasa tal como lo aborda González
(2007).
Para obtener las mejores condiciones en la obtención del
hidrolizado se realizó un diseño factorial de experimentos
23 con réplicas al azar, empleando el bagazo pretratado
anteriormente en las etapas de hidrólisis ácida y básica,
Granado et al. (2013) y las enzimas Celulolíticas Novozyme CellicRCTec2 y β-glucosidasa con código NS50010,
el volumen de la segunda enzima fue del 10% del volumen total de enzima a utilizar. El experimento se realizó
en beakers con un volumen de 25 mL de solución tampón
HAc-acetato de sodio de pH 4,8 en zaranda a 2,5 rps (150
rpm). Para la determinación de los ART se aplicó la técnica
del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) a partir de la elaboración previa de la curva de calibración en un Espectrofotómetro Genesys 20 a 540 nm. Por el método de diferencia
de pesada se determinó la lignina presente en el bagazo
pretratado.
En el desarrollo de la hidrólisis enzimática las variables independientes estudiadas fueron la temperatura, en la cual
el nivel inferior se corresponde con los mejores resultados
de Mesa (2010) y el nivel superior 50 ºC que es la óptima
reportada por el fabricante de la enzima empleada. Las
otras dos variables estudiadas fueron la concentración de
enzima y de sustrato tomando los niveles de las mismas a
partir de los estudios de Mesa (2010).
AFINIDAD LXXII, 570, Abril - Junio 2015
previa de la curva de calibración en un Espectrofotómetro Genesys 20 a 540 nm. Por el
método de diferencia de pesada se determinó la lignina presente en el bagazo pretratado.
En el desarrollo de la hidrólisis enzimática las variables independientes estudiadas
fueron la temperatura, en la cual el nivel inferior se corresponde con los mejores
resultados de Mesa (2010) y el nivel superior 50 ºC que es la óptima reportada por el
fabricante de la enzima empleada. Las otras dos variables estudiadas fueron la
concentración de enzima y de sustrato tomando los niveles de las mismas a partir de los
estudios
Mesa (2010).
Para un sistema dado los valores de k dependen de la
Modelodecinético
pseudo - homogéneo para la reacción
de hidrólisis enzimática del bagazo
eficiencia de contacto entre el sustrato insoluble y la so-
2.2.
Modelo cinético
pseudo - homogéneo
para la reacción
hidrólisis enzimática
lución de celulasa, de las propiedades del sustrato y conEl mecanismo
simplificado
pseudo-homogéneo
dedeMidel bagazo
diciones de operación como tipo y tamaño del reactor,
chaelis-Menten para determinar la velocidad de producmezclado y concentración inicial de sustrato. Los valores
ción de ART en el tiempo, parte de que el azúcar se proEl mecanismo simplificado pseudo-homogéneo de Michaelis-Menten para determinar la
de T dependen de las mismas variables anteriores, espeduce de un sustrato soluble hipotético cuya concentración
velocidad de producción de ART en el tiempo, parte de que el azúcar se produce de∞ un
inicial correspondería a la concentración de ART producicialmente de la concentración inicial de sustrato. Por otro
sustrato soluble hipotético cuya concentración inicial correspondería a la concentración
da finalmente según lo planteado en las referencias Gonlado se asume que los valores de KM y KI son intrínsecos al
de ART producida finalmente según lo planteado en las referencias González (2007), y
zález (2007) y Li et al. (2004).
sistema dado de celulosa y celulasa, y son independientes
Li et al. (2004).
Un esquema simplificado del mecanismo de reacción se
de las variables de operación descritas previamente.
muestra
a
continuación:
Un esquema simplificado del mecanismo de reacción se muestra a continuación:
Celulosa ( S )
EG / CBH
→ Oligosacárido(O)
BG
⇔ Glu cos a (G ) (1)
(1)
3. RESULTADOS
Y DISCUSIÓN
Donde:
Donde:
S: Sustrato
Sustratoinsoluble,
insoluble,
Oligosacárido
soluble,
G: GluResultados experimentales de la hidrólisis enzimática
S:
O: O:
Oligosacárido
soluble,
G: Glucosa,
EG: Endoglucanasa,
cosa, Celobiohidrolasa,
EG: Endoglucanasa,
CBH: Celobiohidrolasa, BG:
Los niveles de las variables estudiadas experimentalmenCBH:
BG: β- glucosidasa
β- glucosidasa
te y explicadas en el epígrafe de la sección anterior fueron:
El primer paso es la reacción heterogénea entre sustrato
Variables independientes:
4
insoluble S y solución enzimática para producir el oligosaX1: Temperatura:
38-50 ºC
cáridos soluble O bajo la acción sinergística de EG y CBH,
X2: Concentración de la enzima: 10-20 UPF/g
la cual se considera como el paso que gobierna la veloCE (0,15-0,31mL/g)
cidad
global
de
reacción.
El
segundo
paso
es
la
reacción
X
:
Concentración
de sustrato: 5 - 10 %
3
El primer paso es la reacción heterogénea entre sustrato insoluble S y solución
homogénea
los oligosacáridos
producir
enzimática parade
producir
el oligosacáridospara
soluble
O bajo laglucosa
acción sinergística de CS
EG y(50-100 g/L)
G,
catalizada
principalmente
porque
la gobierna
BG y con
una veloVariable
dependiente:
CBH,
la cual paso
se considera
el paso
la velocidad
global
de reacción.
El
primer
es la como
reacción
heterogénea
entre
sustrato
insoluble
S yEl solución
cidad
depaso
reacción
muchohomogénea
mayor que
la del
primer paso.
Formación
de Azúcares Reductores Totales (ART) g/L
segundo
es
la
reacción
de
los
oligosacáridos
para
producir
glucosa
G,
enzimática
para producir
el oligosacáridosOsoluble
O bajo
la acción sinergística
de EG y
Si
se considera
que los
liberados
duran- mucho mayor
En la que
tabla 2 se muestra la matriz experimental planteada,
catalizada
principalmente
poroligosacáridos
la BG y con una velocidad
de reacción
CBH,
la cual seestán
considera
como el
que gobierna
la velocidad
global
reacción.
El al azar de los experimentos 1, 5, 6 y 8.
te
la reacción
formados
enpaso
su mayor
proporción
por
se de
hicieron
réplicas
la del
primer paso.
segundo
paso
es
la
reacción
homogénea
de
los
oligosacáridos
para
producir
glucosa
G,
celobiosa,
la que
suma
oligosacáridos
y glucosa
O+G), están formados
También
Si se considera
los de
oligosacáridos
O liberados
durante(Tla=reacción
en se muestran los valores máximos de ART obtenicatalizada
principalmente
por
la BG
y condeuna
velocidad
de
reacción(Tmucho
mayor
que de experimento.
representan
la fracción
de los
de
la reacción
dos
a las
48 horas
su mayor proporción
por celobiosa,
laproductos
suma
oligosacáridos
y glucosa
= O+G),
la
delinhiben
primerlapaso.
que
las
enzimas
como
representan
fracción
de loscelulasas.
productos Considerando
de la reacción que
inhiben las enzimas
Si
se considera
que los oligosacáridos
Osimplificado
liberados
durante
la reacción
estánTabla
formados
en experimental para hidrólisis enzimática
único
efecto
inhibitorio,
el esquema
deesquema
reaccelulasas.
Considerando
como
único efecto
inhibitorio,
el
simplificado
de 2. Matriz
ción
queque
se
a:por celobiosa, la suma de oligosacáridos y glucosa
reacción
sereduce
reduce a:
su
mayor
proporción
(T = O+G),
Exp
X1
X2
X3
ART max obtenido (g/L)
(2) de la reacción que inhiben 1las enzimas
EG / CBH / la
BG fracción
+
+
+
48,74
representan
de
los
productos
S
→T
1-R(2)
+
+
58,02
celulasas. Considerando como único efecto inhibitorio, el esquema simplificado
de +
2
+
+
25,38
El
modelo
pseudo
homogéneo
asume
T es producimodeloque
pseudo
– –homogéneo
asume
que Tque
es producido
a partir de un sustrato
reacción
se reduce
a:
3
+
+
38,05
do
a
partir
de
un
sustrato
soluble
hipotético
cuya
concensoluble
hipotético
cuya
concentración
durante
la
reacción
corresponde
a
la
diferencia
4
+
19,26
EG / CBH / BG
- ( 2) +
+
40,82
S la máxima
T de T corresponde
tración
durantecantidad
la→
reacción
a laladiferencia
entre
producida durante
reacción, (Ten∞) y la cantidad 5de T
5-R
+
+
35,01
presente
en el tiempo
t. El nuevo
sustrato (T∞durante
-T) se introduce
en los modelos cinéticos
tre
la máxima
cantidad
de T producida
la reacción,
+
20,58
El
modelo
pseudo de
–T∞homogéneo
que del
T es
producido
partir
de6 un
sustrato
un nuevoasume
parámetro
modelo
cinéticoa para
el cual
se
de∞)Michaelis-Menten.
(T
y la cantidad
Tespresente
en
el tiempo
t. El
nuevo
6-R
+
23,03
soluble
hipotético
cuya
concentración
durante
la
reacción
corresponde
a
la
diferencia
halla una relación
con la concentración
inicialcinéticos
de sustrato.
7
+
31,23
sustrato
(T∞ -T) funcional
se introduce
en los modelos
de
8 de
-de T 15,59
y la cantidad
entre
cantidad
producida
durantedel
la reacción,
Según la
Li máxima
et al. (2004)
(2007),
la expresión
para
determinar(Tla∞)velocidad
Michaelis-Menten.
Ty ∞González
es de
unTnuevo
parámetro
modelo
8-R
15,78
reacción de
laelformación
deElART
en
elsustrato
tiempo
es
siguiente:
presente
en
tiempo
nuevo
(Tla
-T)
se introduce
∞funcional
cinético
para
el cual t.se
halla
una
relación
con la en los modelos cinéticos
k Eo
(T∞ − T
dT Michaelis-Menten.
es un nuevo parámetro del modelo cinético para el cual se
de
T)∞ sustrato.
concentración
inicial
de
=
(3)
+ (al.
− T )la concentración
dt una
K Li
1 / K(2004)
T ] + 0y,9González
(T∞ con
Según
et
(2007), la expresión
halla
relación
inicial depara
sustrato. Obtención de los parámetros del modelo pseudo-hoM [1
I )funcional
determinar
la velocidad
de reacción
delalaexpresión
formación
mogéneo
de Michaelis
Menten
Según Li et al.
(2004) y González
(2007),
paradedeterminar
la velocidad
de
Donde:
ART
en el
es la siguiente:
Aplicando dicha metodología propuesta por Li et al. (2004)
reacción
detiempo
la formación
de ART en el tiempo es la siguiente:
T∞: Representa el máximo valor de T (O+G) alcanzado durante la reacción
se grafican los valores de T(O+G) (g/L) en el tiempo (t) obk Eo (T∞ − T )
dT
sustrato hipotético del modelo pseudo-homogéneo. tenidos al final(3de
(T∞ -T):
= Concentración de
) la hidrólisis enzimática tomando como
] + 0molecular
dt Relación
K M [1 +entre
(1 / KelI )Tpeso
,9(T∞ − T )de (3)
0,9:
una unidad de glucosa en celulosa base
y el peso
de cálculo 100 kg de material.
molecular de la glucosa.
En la figura 1 se observa la tendencia de la formación de
Donde:
Donde:
k:
Constante
aparente
que representa
frecuencia
enlace entreducelulosa y celulasa
ART en el tiempo de los experimentos realizados y sus
T∞: Representa
el máximo
valorlade
T (O+G)dealcanzado
Constante
aparente
de Michaelis
Mentenalcanzado
que representa
la la
afinidad
entre la apreciándose como tendencia general que la maK∞M:: Representa
T
el máximo
valor de T- (O+G)
durante
reacción
réplicas,
rante la reacción
celulosa
y la celulasa.dede
-T):
Concentración
sustrato
hipotético
del modelo
pseudo-homogéneo.
(T∞ -T):
yor
formación de azúcares ocurre en las primeras 5 a 15
(T
Concentración
sustrato
hipotético
del
modelo
∞
KI: Constante
aparente
inhibición
competitiva
o no competitiva
celulosa0,9:
Relación
entre el de
peso
molecular
de una unidad
de glucosa entre
en celulosa
y ela peso
horas,
ya
partir de ese momento la formación de ART
pseudo-homogéneo.
y celulasa.
molecular
de
la glucosa.
ocurre de forma más moderada.
0,9: glucosa
Relación
entre
el peso molecular de una unidad de
Eo: Concentración inicial de la enzima.
Si sey analiza
glucosa
en celulosa
y el peso
molecularde
deenlace
la gluk: Constante
aparente
que representa
la frecuencia
entre celulosa
celulasael experimento 1-R y 8 se observa como en el
1-R
la
máxima
formación de ART es de aproximadamente
cosa.
K
:
Constante
aparente
de
Michaelis
Menten
que
representa
la
afinidad
entre la
M
Para
un sistema dado los valores de k dependen de la eficiencia de contacto entre el
58 g/L, siendo este valor mucho mayor que en el experik: Constante
aparente
que representa la frecuencia de encelulosa
y
la
celulasa.
sustrato insoluble y la solución de celulasa, de las propiedades del sustrato y
mento
que es de 16 g/L, este comportamiento se debe
lace entreaparente
celulosadey celulasa
inhibición
competitiva
no competitiva
entre 8celulosaK
I: Constante
condiciones
de operación como
tipo y tamaño
del reactor,o mezclado
y concentración
a
que
en
el 1-R la temperatura a la que se llevó a cabo el
KM: Constante
aparente
de
Michaelis
Menten
que
repreglucosa
y celulasa.
inicial
de sustrato.
Los valores de T∞ dependen de las mismas variables anteriores,
experimento
fue de 50ºC, siendo esta la temperatura de
especialmente
senta ladeafinidad
entre
la
celulosa
y
la
celulasa.
la concentración
inicial de sustrato. Por otro lado se asume que los
Eo: Concentración
inicial de la enzima.
trabajo
K
: Constante
de inhibición
competitiva
o no y celulasa,
I
valores
de KM y aparente
KI son intrínsecos
al sistema
dado de celulosa
y sonóptima reportada para esta enzima y en el 8 fue de
38ºC que fue la óptima obtenida por Mesa (2010).
competitiva
entre
celulosa-glucosa
y celulasa.
independientes
de las
variables
de operación
descritas
previamente.
Para
un sistema
dado
los valores
de k dependen
de la eficiencia de contacto entre el
Eo: Concentración inicial de la enzima.
sustrato insoluble y la solución de celulasa, de las propiedades del sustrato y
5
condiciones de operación como tipo y tamaño del reactor, mezclado y concentración
inicial de sustrato. Los valores de T∞ dependen de las mismas variables anteriores,
especialmente de la concentración inicial de sustrato. Por otro lado se asume que los
valores de KM y KI son intrínsecos al sistema dado de celulosa y celulasa, y son
AFINIDAD LXXII, 570, Abril - Junio 2015
129
independientes de las variables de operación descritas previamente.
En la tabla 3 se muestran los resultados obtenidos de la figura
anterior para la determinación de la velocidad inicial (dT/dt) t → 0
Tabla 3. Determinación de la velocidad inicial (dT/dt) t → 0
Figura 1. Formación de ART experimentales en el tiempo
Si se compara el 1-R con el 2, en el cual se mantienen
constantes la temperatura y la concentración de enzima,
se observa que a medida que es mayor la concentración
de sustrato (1-R) mayor es la formación de ART, manteniéndose el mismo comportamiento en el caso de la concentración de la enzima en los experimentos 1-R y 3 en
los cuales se evidencia claramente que a mayor concentración de enzima mayor será la formación de T notando
una diferencia marcada de producción de ART de aproximadamente 18 g/L, Albernas (2014).
Siguiendo la metodología planteada por Li et al. (2004) se
determina la T∞ para los experimentos 1-R, 8 y 2 (figura 2)
a partir de graficar T (O+G) en el tiempo. Se tomaron los
experimentos 1-R y 8 por representar las condiciones de
los extremos de las variables independientes y el 2 por
representar un punto intermedio; lo cual permite que el
experimento sea válido para todo el rango de las variables
independientes estudiado.
Experimentos
(dT/dt)t→0
1/(dT/dt)t→0
T∞
1/T∞
1-R
6,25
0,160
58
0,0172
2
3,57
0,280
26
0,0385
8
2,1
0,476
16
0,0625
A partir de los resultados obtenidos en la tabla anterior se
grafica 1/(dT/dt)t→0 vs 1/T∞, en la misma se determina en
intercepto y la pendiente de dicha recta obteniéndose así
AA partir
partir de
de los
los resultados
resultados obtenidos
obtenidos en
en lala tabla
tabla anterior
anterior se
se grafica
grafica 1/(dT/dt)
1/(dT/dt)t→0
t→
los valores de KM y k.
A
partir
de
los
resultados
obtenidos
en
la
tabla
anterior
se
grafica
1/(dT/dt)
en
la
misma
se
determina
en
intercepto
y
la
pendiente
de
dicha
recta
obtenié
en
la
misma
se
determina
en
intercepto
y
la
pendiente
de
dicha
recta
obtenié
t→0
Pendiente = KM/kEo
en
misma
seKKdetermina
en intercepto y la pendiente de dicha recta obtenién
los
loslavalores
valores
de
k.
M
Myyk.
Intercepto
= de
0,9/kEo
valores g/L
de KM y k.
Klos
=217,49
M
/kEo
Pendiente
k=Pendiente
0,735 h-1==KKMM/kEo
Pendiente
Intercepto
Intercepto===K0,9/kEo
0,9/kEo
M/kEo
Intercepto
= 0,9/kEo
K
g/L
KMM=217,49
=217,49
g/L
-1-1
0,735
Kk=
k=
0,735hhg/L
M=217,49
-1
k= 0,735 h
Figura 4. Determinación de k y KM
Análisis de la constante de Michaelis-Menten obtenida
Figura
Figura4.4.Determinación
Determinaciónde
dekkyyKKMM
(KM).
Figura
4.
Determinación
de
k ydeKM
La máxima concentración de sustrato que se utilizó fue
3.2.1.
Análisis
de
la
constante
de
Michaelis-Menten
obtenida
3.2.1.
Análisis
de
la
constante
de
Michaelis-Menten
obtenida(K
(KMM).).
100 g/L, esto quiere decir la mayor parte de los centros
La
concentración
de
que
se
fue
de
esto
3.2.1.
Análisis
de la
constante
de Michaelis-Menten
(KM).
La máxima
máxima
concentración
de sustrato
sustrato
queestán
se utilizó
utilizó
fueobtenida
de 100
100 g/L,
g/L,
esto quier
quie
activos
del
complejo
enzima-sustrato
no
ocupados.
Esto
se debe
ade
la los
presencia
el sustrato
lignina,
que
La
máxima
concentración
deen
sustrato
que
sede
utilizó
fue
de 100 g/L, esto
quiereo
mayor
parte
activos
del
enzima-sustrato
no
mayor
parte
de
los centros
centros
activos
del complejo
complejo
enzima-sustrato
no están
están
actúa
barrera
entre el activos
sustrato
la enzima.
En que
re- actúa
mayor
parte
deaa la
los
centros
dely complejo
enzima-sustrato
no están
o
Esto
se
debe
en
de
barrera
Estocomo
se
debe
la presencia
presencia
en elel sustrato
sustrato
de lignina,
lignina,
que
actúa como
como
barrer
acciones
enzimáticas
en
Lehninger
planEsto
se debe
la presencia
en el sustrato
de (1981),
lignina,
que actúa
como barrera
sustrato
yy lalaaenzima.
En
reacciones
enzimáticas
en
Lehninger
(1981
sustrato
enzima.
Engeneral,
reacciones
enzimáticas
en general,
general,
Lehninger
(1981
tea
que cuando
[S] <<En
K , la velocidad
de reacción
es de Lehninger (1981)
sustrato
y la enzima.
enzimáticas
en es
general,
que
[S]
lala velocidad
de
que cuando
cuando
[S] <<
<< KKMM,M,reacciones
velocidad
de reacción
reacción
es de
de primer
primer orden
orden con
con re
re
primer orden con respecto al sustrato, aspecto que fue
que
cuando
[S] <<
Kfue
, laasumido
velocidad
dedesarrollo
reacción del
es
primermodelo
orden ycon
sustrato,
aspecto
que
en
presente
un
sustrato,
aspecto
que
fue
asumido
enelel
desarrollo
delde
presente
modelo
yda
dares
un
M
asumido en el desarrollo del presente modelo y da una
sustrato,
que
asumido
en el desarrollo del presente modelo y da una
de
del
mismo.
delalaadecuación
adecuación
delfue
mismo.
medida
deaspecto
la adecuación
del mismo.
Figura 2. Determinación de T∞
Posteriormente en la figura 3 se determina la velocidad inicial (dT/dt) t → 0 a partir de la curva que muestra la evolución
en el tiempo de T (g/L).
de la adecuación del mismo.
3.3.
de
de
3.3. Determinación
Determinación
deKKII(Constante
(Constante
deinhibición)
inhibición)
Determinación
de KI (Constante
de inhibición)
Para
determinar
constante
inhibición
3.3.
Determinación
de
KI (Constante
de inhibición)
Paradeterminar
determinarlalala
constante
deinhibición
inhibición
se integra
integra lala ecuación
ecuación 44
Para
constante
dede
KI,KK
se
integra
I,I, se
laPara
ecuación
4 iniciales
bajo
finales
(T===TT en
determinar
lalasconstante
4
condiciones
ycondiciones
(T
=iniciales
=0
yy TTintegra
== t,t, respecti
condiciones
iniciales
y finales
finalesde
(Tinhibición
= To
To en
en yttK
=0
enlatt ecuación
respect
I, se
To
en t =0 y Tla
T en t y= siguiente:
t,
respectivamente)
condiciones
iniciales
finales
(T = To en obteniendo
t =0 y T = laT en t = t, respectiv
obteniendo
obteniendo
la=ecuación
ecuación
siguiente:
ecuación
obteniendo
la ecuación
lnln[([T(T∞∞−siguiente:
tt siguiente:
−TT00))//(T(T∞∞−−TT)])]
==ββ
−−γγ
00,9,9 ((TtT −−TT00)) ln [(T∞00−,9,9T(0T(T) /−(−TTT∞00)−) T )]
=β
− γ (4)
0,9 (T − T0 )
0,9 (T − T0 )
ooYY==ββXX––γ,γ,donde
donde
o Y =KK
β X –11γ, donde
KK
ββ == MM
TT ++ MM (5)
KkkMEE00 K
1KI I ∞∞ KkkMEE00
T∞ +
β=
k E 0 KK I
k E0
1
1
1
γ = 1 K M 1 − 1 (6)
γ = 0,9 kEM0 K I − kE0
0,9 kE0 K I
Figura 3. Determinación de (dT/dt) t → 0
130
kE0
(6)
(6)
t
(7 )
Y≡
(7)
t
(7 )
Y ≡ 0,9 (T − T0 )
0,9[(T(T −− T
ln
T00 )) / (T∞ − T )]
∞
X ≡ ln [(T − T ) / (T − T )]
(8)
∞
0,9 (T0 − T0∞)
X≡
(8)
(
)
−
0
,
9
T
T
Se sustituyeron los0 valores de T (g/L) en el tiempo correspondientes a los experimentos
Se
los valores7de
(g/L)calcular
en el tiempo
correspondientes
a los
experimentos
1-Rsustituyeron
y 8 en las ecuaciones
y 8T para
los valores
de X y Y, los
cuales
satisfacen
1-R
y 8 en las
ecuaciones
7 y 8 para calcular los valores de X y Y, los cuales satisfacen
la
ecuación
de una
línea
recta.
AFINIDAD LXXII, 570, Abril - Junio 2015
la
ecuación
de una
recta.
Para
determinar
unlínea
simple
valor razonable de KI se trazan líneas rectas de X vs Y para
Para determinar un simple valor razonable de K se trazan líneas rectas de X vs Y para
γ =
1 KM 1
1
−
0,9 kE0 K I kE0
(6)
t
(7 )
0,9 (T − T0 )
ln [(T∞ − T0 ) / (T∞ − T )] (8)
respecto a la máxima concentración de sustrato que se
X≡
(8)
0,9 (T − T0 )
utilizó que fue de 100 g/L, lo que demuestra que la mayor
Se sustituyeron los valores de T (g/L) en el tiempo correspondientes a los experimentos
parte de los centros activos del complejo enzima-sustrato
y 8 en las ecuaciones
7 y 8depara
calcular
valores de
X y Y, los cuales
nosatisfacen
están ocupados, debido a la presencia de lignina en el
Se1-R
sustituyeron
los valores
T (g/L)
en los
el tiempo
corresla ecuación adelos
unaexperimentos
línea recta.
material a hidrolizar, que actúa como barrera.
pondientes
1-R y 8 en las ecuaciones 7
determinar
valor
de cuales
KI se trazan
líneas rectas de 3.
X vs
para
El Ymodelo
cinético desarrollado en el presente trabajo
y 8Para
para
calcularun
lossimple
valores
derazonable
X y Y, los
satisfacen
experimentos
1-Rlínea
y 8 hasta
obtener un intercepto que satisfaga simultáneamente
las guía para la obtención de modelos cinéticos
sirve como
la los
ecuación
de una
recta.
ecuaciones
5 y 6un
para
cada valor
valor razonable
de concentración
inicial
de sustrato.
de hidrólisis enzimática de diferentes materiales lignocePara
determinar
simple
de KI se
trazan
líneas
lulósicos, teniendo en cuenta que el mismo presenta las
rectas de X vs Y para los experimentos 1-R y 8 hasta obtener
limitaciones siguientes:
un intercepto que satisfaga simultáneamente las ecuaciones 5
•El valor de k depende de la eficiencia de contacto entre
y 6 para cada valor de concentración inicial de sustrato.
el sustrato insoluble y la solución de celulasa, de las propiedades del sustrato y condiciones de operación.
•El valor de T∞ depende de las mismas variables anteriores y en especial de la concentración inicial del sustrato.
•Los valores de KM y KI son intrínsecos al sistema dado
de celulosa y celulasa, y son independientes de las variables de operación descritas anteriormente (al cambiar
la enzima o el sustrato cambian estos valores y hay que
repetir todo el procedimiento)
•Teniendo en cuenta lo reportado por González (2007),
solo se ajusta al mecanismo de inhibición competitiva.
Figura 5. Determinación de β y γ para KI
Y≡
Los resultados obtenidos son:
5. AGRADECIMIENTOS
β = 18,57
γ = - 0,2
Figura
Los autores agradecen el apoyo del Ministerio de Cieng/L 5. Determinación de β y γ para KI
KI = 32,64
cia,
Tecnología e Innovación Productiva de la República
Se asume que los valores de KM y KI son intrínsecos del sistema de celulosa
y celulasa
Los
resultados
son:
dado
y que son obtenidos
independientes
de las variables descritas anteriormente, al Argentina
igual que lo(MINCYT) y el Ministerio de Ciencia, Tecnología
y Medio Ambiente de la República de Cuba (CITMA).
β=
18,57 Li et al. (2004) y lo explica Albernas (2014).
aplicaron
γ = - 0,2
KI3.4.
= 32,64
g/L
Determinación
de K (Constante de equilibrio)
el modelo
planteado
la metodología
por Lidel
et al. (2004)6.deBIBLIOGRAFÍA
G (g/L)
SeSegún
asume
que los
valoresende
KM y KI sonreportada
intrínsecos
vs T (g/L)
se determina
para el caso
en ycuestión
los indepenvalores de G (g/L) - T (g/L),
sistema
de celulosa
y celulasa
dado
que son
encontrando
un modelo
en eldescritas
cual la pendiente
es:
dientes
de las
variables
anteriormente,
al igual
1. Albernas, Y., Procedimiento para la síntesis y el diseño
K Li et al. (2004) y lo explica Albernas (2014).
que
lo
aplicaron
óptimo de plantas discontinuas de obtención de bioePendiente =
K +1
tanol empleando bagazo de caña de azúcar., Tesis en
Opción al Grado Científico de Doctor en Ciencias TécDeterminación de K (Constante de equilibrio)
10 Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas,
nicas,
Según el modelo planteado en la metodología reportada
Departamento de Ingeniería Química, Santa Clara, 2014.
por Li et al. (2004) de G (g/L) vs T (g/L) se determina para
2. Fan, LT., & Lee, YH., Kinetic studies of enzymatic
el caso en cuestión los valores de G (g/L) - T (g/L), enconhydrolysis of insoluble cellulose: derivation of a metrando un modelo en el cual la pendiente es:
K
chanistic kinetic model., Biotechnol Bioeng, Vol. 14,
Pendiente =
1983, pp. 2707-2733.
K +1
3. Gan Q., Allen S.J., & Taylor G., Kinetic dynamics in heterEl valor de la constante de equilibrio, K, obtenido es de
ogeneous enzymatic hydrolysis of cellulose: an overview,
3,35.
an experimental study and mathematical modeling., ProDespués de calculados cada uno de los parámetros antecess Biochemistry, Vol. 38, 2003, pp.1003-1018.
riores se sustituye en la ecuación 3 expresión general del
El valorydesela determina
constante deasí
equilibrio,
K, obtenido
es de 3,35. de
4. Granado J., Cornes, I., Albernas, Y., Corsano, G.,
modelo
la expresión
de velocidad
Despuésde
de la
calculados
cadade
uno
de los
se sustituye en la ecuación
González, E., Santos, R., y Mesa L., Aproximación
reacción
formación
ART
en parámetros
el tiempo anteriores
siendo esta
3
expresión
general
del
modelo
y
se
determina
así
la
expresión
de velocidad de de
reacción
las expresiones cinéticas en las etapas de pretrala siguiente:
de la formación de ART en el tiempo siendo
tamiento ácido y básico del bagazo., Centro Azúcar,
esta la siguiente:
0,735 ⋅ 42,2 (58 − T )
dT
Vol.(940,
(9)
) No. 4, Sept-Dic, 2013, pp. 8-15.
=
dt 217,49 [1 + (1 / 32,6) T ] + 0,9 (58 − T )
5. González, A., Hidrólisis enzimática de bagazo de
caña; cinética y diseño preliminar de reactores., Tra4. CONCLUSIONES
bajo presentado en opción al título de Ingeniero QuíEl experimento que mejores condiciones presenta en la etapa de hidrólisis
mico, Universidad industrial de Santander, Escuela de
4.1.CONCLUSIONES
enzimática es el experimento 1-R con la mayor producción de ART en elIngeniería
tiempo Química Bucaramanga, 2007.
que es de 58 g/L
con
una concentración
máxima
de enzima
de 0,31
mL/g JA., & Stuck, JD., Kinetics of solka floc celluHowell.
1. El experimento
que
mejores
condiciones
presenta
en lay sustrato6.
100hidrólisis
g/L respectivamente.
lose hydrolysis by Trichoderma viride cellulose., Bioetapa yde
enzimática es el experimento 1-R con
El valor
de la constante
deen
Michaelis
– Menten
esteg/L
complejo enzimatechnol
sustrato Bioeng, Vol. 17, 1975, pp. 873-893.
la 2.
mayor
producción
de ART
el tiempo
que espara
de 58
g/L) respecto
a la máxima
concentración
de sustrato
que se JA., & Mangat, M., Enzyme deactivation dures elevado
(KM=217,49
7. Howell,
con una
concentración
máxima
de enzima
y sustrato
de
utilizóy que
100 g/L, lo que demuestra que la mayor parte de losing
centros
cellulose hydrolysis., Biotechnol Bioeng, 20, 1978,
0,31 mL/g
100fue
g/Lderespectivamente.
activosde
dellacomplejo
enzima-sustrato
no están
ocupados,
debido a la presencia
de
pp. 847-863.
2. El valor
constante
de Michaelis
– Menten
para
lignina en enzima
el material
a hidrolizar,
que actúa
barrera.
este complejo
sustrato
es elevado
(Kcomo
=217,49
g/L)
M
3. El modelo cinético desarrollado en el presente trabajo sirve como guía para la
obtención de modelos cinéticos de hidrólisis enzimática de diferentes materiales
lignocelulósicos, teniendo en cuenta que el mismo presenta las limitaciones
siguientes:
AFINIDAD
LXXII,
Abril
2015
131
• El valor
de k570,
depende
de -laJunio
eficiencia
de contacto entre el sustrato insoluble y la
solución de celulasa, de las propiedades del sustrato y condiciones de operación.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
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