seguimiento del virus de la mancha blanca

INSTITUTO DEL MAR DEL PERÚ
SEDE REGIONAL TUMBES
LABORATORIO DE SANIDAD ACUÍCOLA
INFORME ANUAL - 2007
Contacto: [email protected]
INVESTIGACIONES EN PATOBIOLOGÍA Y SANIDAD ACUÍCOLA: MONITOREO Y VIGILANCIA
EPIDEMIOLÓGICA DE LOS PRINCIPALES PATÓGENOS QUE AFECTAN LOS CULTIVOS DE
LANGOSTINOS EN LA REGIÓN TUMBES
Prevalencia y distribución de la Bacteria de la Necrosis del Hepatopáncreas (NHPB) en
estanques de cultivo intensivo de Penaeus vannamei.
Vigilancia epidemiológica del Virus de la Mionecrosis Infecciosa (IMNV) en poblaciones
silvestres de Penaeus vannamei y Penaeus stylirostris.
RUBÉN ALFARO AGUILERA
Y
MERVIN GUEVARA TORRES
2006
Investigaciones en Patobiología y Sanidad Acuícola
INFORME ANUAL 2007
LABORATORIO DE SANIDAD ACUÍCOLA
Rubén Alfaro Aguilera y Mervin Guevara Torres
TABLA DE CONTENIDO
Parte I: Prevalencia y distribución de la bacteria de la necrosis del hepatopáncreas en estanques
de cultivo intensivo de Penaeus vannamei.
1. INTRODUCCIÓN.................................................................................................................................................................... ……..3
MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................................................................................. 4
2.1. RECOLECCIÓN DE MUESTRAS ..................................................................................................................................... 4
2.1.1. Langostinos ................................................................................................................................................................... 5
2.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS .......................................................................................................................... 5
2.2.1. Extracción de ADN ........................................................................................................................................................ 5
2.2.2. Análisis por PCR............................................................................................................................................................ 5
2.2.3. Análisis de los datos ...................................................................................................................................................... 6
3. RESULTADOS................................................................................................................................................................................ 7
3.1. PREVALENCIA ........................................................................................................................................................... 7
3.2. DISTRIBUCIÓN ........................................................................................................................................................... 9
4. DISCUSIÓN................................................................................................................................................................................. 100
5. CONCLUSIONES........................................................................................................................................................................ 111
6. RECOMENDACIONES ............................................................................................................................................................... 122
7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS........................................................................................................................................... 122
Parte II: Vigilancia epidemiológica del virus de la mionecrosis infecciosa (IMNV) en poblaciones
silvestres de Penaeus vannamei y Penaeus stylirostris.
1. INTRODUCCIÓN......................................................................................................................................................................... 144
2. MATERIALES Y MÉTODOS....................................................................................................................................................... 166
2.1. COLECTA DE LANGOSTINOS SILVESTRES ................................................................................................................ 166
2.2. TAMAÑO DE MUESTRA Y CALENDARIO DE MUESTREO ............................................................................................... 166
2.3. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS ...................................................................................................................... 166
2.3.1. Extracción de ARN .................................................................................................................................................... 166
2.3.2. Análisis por RT-PCR.................................................................................................................................................. 177
2.3.3. Análisis de los datos .................................................................................................................................................. 177
3. RESULTADOS............................................................................................................................................................................ 177
4. DISCUSIÓN................................................................................................................................................................................. 188
5. CONCLUSIONES.......................................................................................................................................................................... 19
6. RECOMENDACIONES ................................................................................................................................................................. 19
7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS........................................................................................................................................... 200
ANEXOS ....................................................................................................................................................................... 21
1
Laboratorio de Sanidad Acuícola
Informe anual 2007
RESUMEN
La investigación comprende aspectos relacionados con la patobiología y sanidad acuícola en langostinos bajo cultivo y
del ambiente natural aledaño de la Región Tumbes incluyendo estudios de monitoreo del agente infeccioso de la necrosis del
hepatopáncreas, y la vigilancia epidemiológica del virus exótico IMNV (virus de la mionecrosis infecciosa). Estos estudios
permitieron obtener conocimientos actualizados de la presencia y distribución espacio-temporal de agente etiológico NHPB
(Bacteria de la hepatopancreatitis necrotizante) y detectar la presencia o ausencia de IMNV en los langostinos silvestres en los
canales de marea de la Región Tumbes.
La enfermedad de la Necrosis Hepatopancreática (NHP), tiene como signo principal la flacidez muscular, característica
que últimamente ha sido reportada en los langostinos de cultivo intensivo; produce además altas tasas de mortalidades y elevado
porcentaje post-cosecha de langostino para descarte, disminuyendo la rentabilidad del producto. Para determinar si la NHPB
era el agente causal de estas anomalías, se realizó una evaluación sanitaria para establecer su prevalencia y distribución; se
analizaron un total de 3360 langostinos de 09 empresas langostineras con cultivo intensivo. Se obtuvo una prevalencia global de
2 % en el periodo de estudio, determinándose que la NHPB está presente en el 77% de las zonas con cultivo intensivo incluidas
en este estudio, las que se encuentran distribuidas a lo largo del litoral tumbesino.
El virus de la Mionecrosis Infecciosa (IMNV) ha causado pérdidas económicas considerables, estimadas en alrededor
de $20 millones USD en Brasil donde se manifestó por primera vez. Este virus se ha extendido considerablemente,
encontrándose en Indonesia y se sospecha su presencia en Tailandia y China. Las mortalidades a cosecha se calculan en
alrededor del 70%. Para el año 2006 se reportó en las langostineras de Ecuador y de Tumbes- Perú, langostinos con signos
clínicos muy parecidos a los que presentan los langostinos infectados con IMNV en Brasil. Las investigaciones y monitoreo
realizados descartaron la presencia de dicho virus en Ecuador. El IMARPE programó para el año 2007 un monitoreo constante,
de langostinos nativos como Penaeus vannamei y Penaeus stylirostris de los esteros de la Región, para detectar la posible
presencia y estimar la prevalencia y distribución del virus de la IMNV. Para este fin se colectaron 2407 especimenes de 5
estaciones preestablecidas (esteros) los que fueron analizados por la técnica de la PCR, resultando negativos, concluyéndose
que las poblaciones silvestres de P. vannamei y P. stylirostris de Tumbes se encuentran libres del IMNV.
Palabras Claves: Prevalencia, Penaeus vannamei, IMNV, NHPB.
2
Investigaciones en Patobiología y Sanidad Acuícola
PREVALENCIA Y DISTRIBUCION DE LA BACTERIA DE LA NECROSIS DEL
HEPATOPÁNCREAS (NHPB) EN ESTANQUES DE CULTIVO INTENSIVO DE
Penaeus vannamei DE LA REGION TUMBES
PREVALENCE AND DISTRIBUTION OF THE NECROTIZING HEPATOPANCREATITIS
BACTERIUM (NHPB) IN PONDS INTENSIVE CULTIVATION Penaeus vannamei OF THE
REGION TUMBES
1. INTRODUCCIÓN
La Necrosis del Hepatopáncreas (NHP), fue reconocida por primera vez en Texas en
1985, posteriormente se reportó en países de América Latina como Brasil, Costa Rica, Panamá
Venezuela, Ecuador y Perú (JOHNSON 1989, FRELIER et al. 1992). Inicialmente se denominó
enfermedad del hepatopáncreas granulomatoso por la característica formación de granulomas;
tiene como agente causal una bacteria intracelular tipo rickettsia que se observa como un
pequeño cocobacilo Gram negativo que infecta y se multiplica en el citoplasma de las células
epiteliales de los túbulos del hepatopáncreas.
La NHP está asociada con factores ambientales como la temperatura y salinidad elevada
por períodos prolongados de tiempo, reportándose la enfermedad en los sistemas de cultivo
cuando la temperatura oscila entre 29 y 35ºC y las salinidades entre 20 a 38 %o.
La NHP es una enfermedad severa, que causa mortalidades rápidas en los langostinos
si no es detectada a tiempo, puesto que ataca el hepatopáncreas (HP), importante órgano
encargado de la digestión del alimento, absorción y almacenaje de nutrientes. La fase inicial de
la enfermedad no es detectable por tener signos clínicos inespecíficos. El diagnóstico presuntivo
mayormente se realiza con montajes en fresco de porciones de HP, en los que se observa
ausencia o cantidad reducida de gotas de lípidos, paredes engrosadas y estrangulaciones de los
túbulos. Para confirmar el diagnóstico se procede a análisis de histopatología (H & E) que
presenta como características típicas atrofia y lesiones granulomatosas multifocales en el HP
(LIGHTNER 1996). Así mismo, la NHP es confirmada histológicamente por hibridación in situ con
una sonda complementaria de ADN probe ó por microscopia electrónica (TEM).
En LOY et al. (1996), detectaron el agente etiológico en cultivos de P. vannamei
mediante el método de reacción en cadena de la polimerasa. Amplificaron por PCR un segmento
definido del gen 16S rRNA ribosomal usando primers específicos para las regiones variables
(V5, V8 y V9), pf-1 5´ ACG TTG GAG GTT CGT CCT TCA G 3´, pr-1 5´ TCA CCC CCT TGC
TTC TCA TTG T 3´, pr-2 5’ CCA GTC ATC ACC TTT TCT GTG GTC 3´, usando como molde
3
Laboratorio de Sanidad Acuícola
Informe anual 2007
ADN extraído de tejido de camarones conseguidos de dos regiones diferentes (Norte y Sur
América), obteniendo segmentos de 660 y 441 bp específicos de bacteria NHP de 16S rDNA.
Así mismo, BRIÑEZ et al. (2003) reportaron la presencia de NHP en P. vannamei por PCR
utilizando DNA purificado de muestras fecales infectadas como molde. Los primers usados
fueron específicos para la región 16S del gen rRNA (pf-1 1:5 ACG TTG GAG GTT CGT CCT
TCA-g 3´/ pr- 2:5´ TCA CCC CCT TGC TTC TCA TTG T 3´), obteniendo como resultados
segmentos positivos de 440 bp.
La sede Regional de Tumbes del IMARPE, en su afán de realizar una evaluación
sanitaria para establecer la prevalencia y distribución de la NHPB que impacten al cultivo del
langostino, planteó para el año 2007 que el Laboratorio de Sanidad Acuícola realice un
monitoreo a las empresas langostineras que posean estanques con cultivo intensivo, a lo lago de
la Región Tumbes.
Para llevar a cabo este monitoreo, el Laboratorio de Sanidad Acuícola realizó
quincenalmente desde el mes de febrero salidas de campo con la finalidad de recolectar
muestras de langostinos de las empresas langostineras con cultivo intensivo; estas muestras son
llevadas al laboratorio y mediante la técnica de la PCR y método utilizado por Loy et al. (1996),
realiza el descarte de la presencia de la NHPB en los langostinos provenientes de los diferentes
lugares del monitoreo.
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. Recolección de muestras
2.1.1. Langostinos
Se analizaron un total de 3360 muestras procedentes de nueve empresas langostineras
con cultivos intensivos (siembras a densidades de 80 a 150 individuos/m2) con
invernaderos: Camarones S.A.C., La Bocana S.A., Pacífico Azul S.A.C., La Fragata S.A.,
Criador El Guamito S.A., Campo Lan Karina de INYSA, Marinazul S.A., Isla Bella S.A.C y
Domingo Rodas S.A. Se seleccionó 01 estanque por empresa y las muestras fueron
tomadas al azar realizando 05 lances de atarraya por estanque para obtener una
submuestra de 25 langostinos, los cuales fueron colocados en bolsas plásticas rotuladas
(empresa, número de estanque y temperatura del agua) y transportados al laboratorio con
hielo.
4
Investigaciones en Patobiología y Sanidad Acuícola
En el laboratorio, se toman datos individuales de los langostinos como peso, talla y
alguna característica adicional externa de interés (flacidez, deformación o necrosis
cuticular). Los hepatopáncreas son extraídos, pesados, inmersos en etanol al 90% y
conservados a –20 ºC.
2.2. Procesamiento de las muestras
2.2.1. Extracción del ADN
Se siguió la metodología según GUSTINCICH et al. (1991)
De los hepatopáncreas conservados, se tomó 20 mg, se maceró en presencia de 100 μl
de EDTA 500 mM (pH 8) y 600 μl de solución DTAB [12% dodeciltrimetilamonio bromuro,
2,25 M NaCl, 150 mM Tris-HCl (pH 8.6), 75 mM EDTA], luego se incubó por 5 min. a 75ºC.
Después de la incubación se agregó 0,7 ml de cloroformo, se mezcló con vortex y fue
centrifugado a 12000 rpm por 5 min. El sobrenadante (250 μl) fue transferido a otro tubo y
adicionando 100 μl de solución CTAB (5% cetiltrimetilamonio bromuro, 0,4 M NaCl) y 900 μl
de agua destilada autoclavada, se mezcló y centrifugó a 12000 rpm por 10 min; el
sobrenadante fue descartado y el pellet resuspendido en 150 μl de solución disolvente
(NaCl 1,2 M), se incubó a 75ºC por 5 min y centrifugó a 12000 rpm por 5 min. La solución
fue transferida a un nuevo microtubo con 300 μl de etanol al 95%, se mezcló y fue
centrifugado nuevamente a 12000 rpm por 5 min, el pellet fue lavado con etanol al 75% y
resuspendido con buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8).
2.2.2. Análisis de PCR
Las muestras fueron analizadas mediante la técnica de PCR, el volumen final para cada
reacción fue de 20 μl, conteniendo 2 μl de ADN, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1.5
mM MgCl2, 125 μM dNTPs y 5 pmol de cada primer, pf-1: 5’-ACG-TTG-GAG-GTT-CGTCCT-TCA-g-3’ y pr-2: 5’-TCA-CCC-CCT-TGC-TTC-TCA-TTG-T-3’ (Loy y Frelier 1996). Las
muestras fueron sometidas a 35 ciclos: desnaturalización a 95ºC por 30 seg., hibridación a
58ºC por 30 seg., extensión a 72ºC por 1min., con un ciclo adicional de 72ºC por 5 min de
reparación de la hebra del ADN; para evitar los falsos negativos, las muestras que
resultaron negativas son procesadas por segunda vez incluyendo en el análisis la β-actina
como control interno. Las muestras fueron sometidas a 35 ciclos que consistieron en
desnaturalización a 95ºC por 20 seg., hibridación a 52ºC por 30 seg., extensión a 72ºC por
30 seg., con un ciclo adicional de 72ºC por 4 min.
5
Laboratorio de Sanidad Acuícola
Informe anual 2007
Los productos de amplificación fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa
al 1% conteniendo 0,5 µg/ml de bromuro de etidio y en amortiguador TAE al 1X.
Obteniéndose una banda positiva de 400 pb y una banda de 424 pb para el control interno.
2.2.3. Análisis de los datos
Prevalencia:
La prevalencia (P) cuantifica la proporción de individuos de una población que padecen
de una enfermedad en un momento o periodo determinado; su cálculo se reraliza mediante
la expresión:
P = Nº de casos con la enfermedad en un momento dado
Total de la población en ese momento
Tamaño de muestra:
Para fijar el tamaño de muestra necesario y estimar la cantidad de enfermos en los
estanques de cultivo se usó la formula correspondiente a la estimación de una proporción
(prevalencia), para un nivel de confianza del 95%
Donde:
n = 3,8416. P. (1- P)
E2
n: tamaño de muestra necesario
P: prevalencia esperada
E: error absoluto aceptado
Los datos fueron analizados con el programa estadístico SPSS, la prevalencia se
determinó usando el programa Win Episcope 2.0, donde se determinó que para una
prevalencia esperada del 2% es necesario 150 ejemplares como valor mínimo, teniendo en
cuanta que la población es mayor a 100,000 individuos.
Para propósito de este monitoreo se asumió que si la NHPB está presente en los
estanques con cultivo intensivo, al menos se encontrará que el 2% de los animales
susceptibles son positivos a la bacteria, con un 95% de confianza.
6
Investigaciones en Patobiología y Sanidad Acuícola
3. RESULTADOS
3.1. Prevalencia
Se realizaron 132 visitas a 09 empresas langostineras, de las cuales se obtuvo un total
de 3360 ejemplares de langostino Penaeus vannamei (postlarvas, juveniles y preadultos)
las que fueron tomadas al azar. La prevalencia global a la NHPB para el periodo en estudio
fue de 2,05%. Entre las langostineras monitoreadas la mayor prevalencia se encontró en
Domingo Rodas, quien para el término del monitoreo proporcionó un total de 238
ejemplares para analizar de los cuales 29 resultaron positivos por PCR para la NHPB con
una prevalencia de 12,18% (Tabla 01), seguida de la langostinera Camarones con el
5,88%.
En la Tabla 02, se presenta el número de muestras colectadas por langostinera y la
prevalencia a la NHPB encontrada en cada ciclo de cultivo. Las empresas Fragata y
Marinazul se mostraron libres de la NHPB a lo largo de los monitoreos, sin embargo cabe
señalar que ninguna de ellas estuvo presente en todos los monitoreos por problemas
técnicos, no contando por tanto con todos los datos. Así mismo la empresa Isla Bella fue
incluida en el monitoreo al final del estudio. Por estas razones, no es posible afirmar que
dichas empresas se encontraron libres o con bajas prevalencia a la NHPB en todo el
período de estudio, ya que en esos casos la información está incompleta.
Tabla 01. Prevalencia global a la NHPB encontrada en las diferentes langostineras al finalizar el
periodo de estudio febrero-diciembre 2007.
LANGOSTINERA
Domingo Rodas
Camarones
Pacífico Azul
Lan Karina
La Bocana
Isla Bella
Criador el Guamito
La Fragata
Marinazul
Positivos Ejemplares Prevalencia
a NHPB
analizados
(%)
29
28
4
3
3
1
1
0
0
69
238
476
349
376
539
177
538
454
213
3360
12,18
5,88
1,15
0,80
0,56
0,56
0,19
0,00
0,00
2,05
La empresa Pacífico Azul, tras no poder controlar las mortalidades en la primera
campaña, atribuidas en parte a la flacidez y en parte a los elevados valores de Nitritos en el
agua de los estanques, tuvo cosechas de emergencia; para este periodo se encontraron
7
Laboratorio de Sanidad Acuícola
Informe anual 2007
prevalencias para la NHPB del 1,78% que aparentemente se incrementaron en los
siguientes días. Por coordinación de los directivos se decidió postergar las siembras por
una temporada, por lo que no se pudo contar con datos de la segunda campaña.
Tabla 02. Prevalencia a la NHPB encontrada en las diferentes langostineras con cultivo intensivo
y por campaña de cultivo.
Empresa
Campaña
Criador El Guamito
Primera
Segunda
Tercera
Primera
Segunda
Tercera
Primera
Segunda
Tercera
Primera
Segunda
Tercera
Primera
Segunda
Tercera
Primera
Segunda
Tercera
Primera
Segunda
Tercera
Primera
Segunda
Tercera
Primera
Segunda
Tercera
La Fragata
Pacífico Azul
Domingo Rodas
La Bocana
Camarones
Lan Karina
Marinazul
Isla Bella
Año 2007
Densidad de
Positivos
siembra (indv/m2)
100
100
120
SD
120
120
80
SD
150
SD
SD
SD
80
80
80
100
100
100
90
90
150
SD
SD
80
SD
SD
200
0
1
0
SD
0
0
4
SD
0
5
5
19
0
0
3
28
0
0
1
2
0
SD
SD
0
SD
SD
1
69
Nº de
Prevalencia
Muestra
(%)
191
163
184
SD
221
233
225
SD
124
121
54
63
199
156
184
150
188
138
148
153
75
SD
SD
213
SD
SD
177
3360
0,00
0,61
0,00
SD
0,00
0,00
1,78
SD
0,00
4,13
9,26
30,16
0,00
0,00
1,63
18,67
0,00
0,00
0,68
1,31
0,00
SD
SD
0,00
SD
SD
0,56
2,05
SD: Sin dato
Independientemente de la fecha o estación del año la bacteria causante de la NHP
estuvo presente en los cultivos. Esto es más notorio en la langostinera Domingo Rodas en
la que la bacteria estuvo presente en todas las campañas de cultivo (Tabla 02).
8
Investigaciones en Patobiología y Sanidad Acuícola
14
12
10
8
%
6
4
2
0
Langostineras monitoreadas
Figura 01: Prevalencia a la NHPB de las diferentes langostineras monitoreadas, durante el
periodo febrero a diciembre 2007.
3.2. Distribución
La bacteria causante de la NHP está distribuida a lo largo del Litoral Tumbesino. La
mayor prevalencia se encontró en la zona del Distrito de Corrales a la margen izquierda del
Río Tumbes, en la empresa langostinera Domingo Rodas (12,18%), seguida de la empresa
Camarones (5,88%) sector el Alcalde distrito de Tumbes, estas zonas pueden considerarse
de mayor riesgo debido a la mayor presencia de langostineras informales que no llevan
controles sanitarios adecuados (larva no certificada, manejo inadecuado del agua). Así
mismo se encontró menores prevalencias en las zonas de cultivo del distrito de Zarumilla,
carretera a Puerto Pizarro, en las langostineras El Guamito (0,19%), Isla Bella (0,56) y en el
sector El Bendito, carretera Al Salto en la empresa Pacífico Azul (1,15%), y en el sector
Chacra Gonzáles, la empresa Lan Karina (0,8%) (Figura 02). Las menores prevalencias
pueden atribuirse al mejor control sanitario en el ciclo de cultivo que aplican estas
empresas (desinfección de materiales, pediluvios, administración de personal, larva
certificada libre de NHPB).
9
Laboratorio de Sanidad Acuícola
80.525 W
80.475 W
Informe anual 2007
80.425 W
80.375 W
80.325 W
80.275 W
3.400 S
80.225 W
3.400 S
MAR DE GRAU
3.425 S
3.425 S
ESTERO EL BENDITO
3.450 S
3.450 S
ESTERO SOLEDAD
3.475 S
3.475 S
ESTERO EL JELÍ
3.500 S
3.500 S
ZARUMILLA
ESTERO ALCALDE
3.525 S
BOCA DEL RÍO TUMBES
Leyenda
Zonas con NHPB
(El tamaño de los aros varía
según el número de ocurrencias)
3.550 S
3.575 S
80.475 W
80.425 W
3.550 S
3.575 S
TUMBES
80.525 W
3.525 S
80.375 W
80.325 W
80.275 W
80.225 W
Figura 02. Distribución de la presencia de la NHPB en las zonas de cultivo, de febrero a diciembre del 2007.
Langostineras con cultivo intensivo y prevalencia respectiva: 1. Domingo Rodas, 2. La Bocana, 3. Camarones, 4.
Criador El Guamito, 5. Isla Bella, 6. La Fragata, 7. Pacífico Azul, 8. Lan Karina y 9. Marinazul.
4. DISCUSIÓN
Una prevalencia global del 2,05 % indica que la enfermedad no está afectando de forma
relevante a la población estudiada, sin embargo es importante resaltar que esta prevalencia no
corresponde a todas las langostineras, ni a todas las campañas de cultivo.
Así se puede observar que los valores de prevalencia de 30,16% en la tercera campaña de la
langostinera Domingo Rodas y de 18,67% en la primera campaña de la empresa Camarones
(Tabla Nº 01), están directamente relacionadas con las elevadas mortalidades diarias (de 3000 a
10000 langostinos) registradas en esas empresas (com. per. jefes de producción), que los llevó a
cosechar de emergencia el estanque afectado, reportando para el caso de Camarones un 15 %
de flacidez en el producto final, debido posiblemente a la NHPB; de la misma manera sucede
con la empresa Domingo Rodas, Lan Karina, Criador El Guamito e Isla Bella quienes reportan
elevadas mortalidades de forma intermitente que finalmente se detienen, pero que su efecto
negativo se refleja en las supervivencia al final del cultivo o en la eficiencia del producto en
planta, lo que nos lleva a sospechar que la sola presencia del patógeno en el sistema ya
representa un riesgo para el cultivo.
10
Investigaciones en Patobiología y Sanidad Acuícola
En las muestras colectadas de la mayoría de los estanques monitoreados, se
encontraron langostinos con aparente flacidez que resultaron negativos a la NHPB; así mismo se
encontraron langostinos aparentemente sanos que resultaron positivos, esto estaría relacionado
al momento de la toma de muestra, es decir si los animales fueron muestreados justo al inicio de
un brote, será fácil detectar al patógeno aunque los langostinos apenas muestren síntomas ni
lesiones. Sin embargo, si el muestreo se realiza al finalizar el brote, será difícil detectar al
patógeno aún observando animales lesionados entre los supervivientes, ya que se supone que
sobreviven porque eliminan el patógeno, pero los que mueren sin eliminar al patógeno
desaparecen de la población y no son muestreados, a lo que se conoce como sesgo de la
supervivencia. Quizás esto explique los valores negativos en langostinos con lesiones
características de NHP (flacidez, hepatopáncreas degenerado, pleópodos melanizados etc.).
Cabe mencionar que la siembra en estanques con cultivo intensivo se realiza con
postlarva proveniente de laboratorios que certifican el estado sanitario de las mismas, por lo que
se presume que las infecciones con NHPB se realizan en el transcurso del cultivo (presencia de
vectores), asociado con factores ambientales y fisiológicos (temperatura, salinidad, estrés por
elevada densidad de siembra, etc.) los que juegan un papel importante en el desarrollo de la
enfermedad. Esta patología al igual que muchas otras, puede pasar desapercibida los primeros
días de cultivo (prevalencia no detectable) y aparecer repentinamente (por algún detonante), es
por ello importante que el monitoreo de los organismos bajo estudio sea llevado desde el inicio
de la siembra, lo que ayudaría a un mejor conocimiento del desenvolvimiento de los patógenos,
en este caso del NHP, en los langostinos durante el desarrollo del cultivo.
Los datos de temperatura y salinidad por lo general son difíciles de incluir en este tipo de
estudios por ser muy variables en el tiempo y sus efectos se manifiestan posteriormente, siendo
necesario los datos de variación diarios. Es posible sospechar que el brote de la enfermedad
relacionada con estos factores pueda deberse a una tercera variable en juego como es el
sistema de manejo de cada empresa (densidades de siembra de 90 a 120 indv/m2, calidad de
agua, nutrición, etc.) como posible desencadenante de las mortalidades reportadas.
5. CONCLUSIONES
- Se obtuvo una prevalencia global de la NHPB del 2,05 %, que indicaría que la
enfermedad no está afectando de forma relevante a los langostinos.
11
Laboratorio de Sanidad Acuícola
Informe anual 2007
- La mayor prevalencia a la NHPB se encontró en la langostinera Domingo Rodas
(30,16%) en la tercera campaña de cultivo, estando presente en el transcurso de todo el cultivo.
- En las langostineras Fragata y Marinazul, no se detectó la presencia de la NHPB.
- La prevalencia total de la NHPB para este periodo de estudio (febrero-diciembre) fue de
2,05%. Sin embargo, se reportaron elevadas mortalidades, lo que nos llevaría a deducir que la
sola presencia del patógeno en el sistema representaría un riesgo para el cultivo, si los
parámetros ambientales (temperatura, salinidad, nitritos, etc.) no permanecen estables.
- La NHPB se encuentra distribuida en el 77% de las zonas con cultivo intensivo
incluidas en este estudio a lo largo del litoral tumbesino, lo que estaría relacionado directamente
con los niveles de bio-seguridad que aplica cada empresa en su cultivo.
- No todos los langostinos con aparente flacidez, anorexia y degeneración de
hepatopáncreas son positivos a la NHPB, siendo necesario descartar otras patologías haciendo
uso de procedimientos histológicos, hasta hoy los más confiables.
6. RECOMENDACIONES
- Este estudio permite obtener información actualizada de la dinámica espacial y
temporal de la NHPB en los cultivos, por lo tanto es necesario complementarlo con el descarte
de otras enfermedades de diferente índole (WSV, IHHNV, vibriosis, toxinas y nutricionales).
- Se debe incluir en el estudio un seguimiento diario de las variaciones de los parámetros
ambientales para poder relacionarlos con el brote y evolución de las enfermedades.
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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13
Laboratorio de Sanidad Acuícola
Informe anual 2007
VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DEL VIRUS DE LA MIONECROSIS
INFECCIOSA (IMNV) EN POBLACIONES SILVESTRES DE Penaeus vannamei
Y Penaeus stylirostris DE LA REGIÓN TUMBES.
EPIDEMIOLOGICAL SURVEILLANCE OF THE INFECTIOUS MIONECROSIS VIRUS (IMNV) IN
WILD POPULATIONS OF Penaeus vannamei Y Penaeus stylirostris OF TUMBES REGION.
1. INTRODUCCIÓN
En el año 2002, durante el periodo seco del estado de Piauí en Brasil, se registraron en
algunas granjas de engorde langostinos que mostraban una progresiva opacidad muscular y
mortalidades a partir de los 7 g. En un principio se confundió esta sintomatología con una
infección denominada enfermedad del algodón, causada por microsporidios que provoca una
opacidad lechosa en la parte abdominal- caudal de los langostinos y que afecta principalmente a
las especies de Pennaeus monodon y Fenneropenaeus merguiensis (NUNES et al., 2004)
Se enviaron muestras desde Brasil a la Universidad de Arizona, donde se descartó la
presencia de microsporidios. Sin embargo, los análisis histopatológicos apuntaron hacia un
síndrome de músculo acalambrado que tiene como sintomatología la necrosis muscular del
abdomen y en el cefalotórax provocado por factores ambientales o nutricionales. Tras no
encontrar el agente causal de la enfermedad se asumieron las siguientes hipótesis etiológicas:
tóxica (causada por alguna cianotoxina), nutricional (deficiencia de vitamina E), física (factores
ambientales extremos) y viral o bacteriana (NUNES et al., 2004)
En el año 2003, tras el anormal temporal de lluvias que se presentó en el estado de
Piaurí que trajo como consecuencia un severo incremento en los nutrientes de las aguas y que
condujo a floraciones excesivas de microalgas especialmente cianofitas, la prevalencia de la
enfermedad se incrementó, ocurriendo mortalidades progresivas durante varios meses, trayendo
consigo pérdidas económicas considerables estimadas en alrededor de $20 millones USD. No
fue sino hasta mediados del mismo año que se realizaron bioensayos de infección utilizando
tejido de langostinos con la sintomatología de necrosis muscular y exponiendo a langostinos
libres de patógenos específicos de la especie Penaeus vannamei, los cuales desarrollaron una
alta prevalencia de necrosis muscular a los 12 días de cultivo, lo que dio fuertes indicaciones
para la hipótesis viral; finalmente en el año 2004 en la Universidad de Arizona se confirmó la
presencia viral en los langostinos enfermos a través de microscopía electrónica. Este nuevo virus
fue denominado virus de la Mionecrosis Infecciosa (IMNV) (LIGHTNER et al., 2004a).
14
Investigaciones en Patobiología y Sanidad Acuícola
El IMNV, tiene una forma icosaédrica, sin envoltura o superficie de protección, de 40
nanómetros de diámetro, presenta un genoma de doble hebra simple (dsARN) molécula de 7560
bp. El análisis filogenético indica que puede pertenecer a la familia Totiviridae o representar una
nueva familia de virus dsARN que infecta a invertebrados (BONNIE et al., 2006).
La sintomatología típica de los camarones infectados por IMNV es la necrosis del
músculo estriado del abdomen y cefalotórax, manifestándose como pérdida de la transparencia
de la cola, que finalmente se necrosa tomando un color rojizo. Las mortalidades pueden ocurrir
en todos los ciclos de cultivo de Penaeus vannamei incrementándose conforme se incrementa la
tasa de alimentación diaria, cuando los langostinos están sobre los 6 gr. Las mortalidades a
cosecha se calculan en alrededor del 70% (LIGHTNER et al., 2004b; NUNES et al., 2004). Se
demostró por el método de Hibridación in situ que además de Penaeus vannamei,
experimentalmente también es susceptible de ser infectadas con el IMNV las especies Penaeus
stylirotris y Penaeus monodon (TANG et al., 2005).
En 1999 en Centro y Sudamérica, la epidemia de WSV causó grandes pérdidas en el
cultivo de P. vannamei, y actualmente la IMNV en Brasil, lo cual revela la necesidad de contar
con un plan de contingencia ante nuevas epidemias. En la actualidad los países que practican la
vigilancia epidemiológica de sus poblaciones de animales silvestres tienen más probabilidades
de detectar la presencia de enfermedades infecciosas, lo que permite adoptar medidas de
prevención eficientes.
La zona norte del Perú, por su ubicación geográfica y gran actividad langostinera está
propensa al ingreso y establecimiento de diversas enfermedades exóticas de carácter bacteriano
y viral, que pueden truncar el desarrollo acuícola. Teniendo en cuenta que existen muchas
langostineras informales que no toman las debidas precauciones al importar larvas para sus
cultivos, la vigilancia y el seguimiento de brotes patógenos en poblaciones de animales silvestres
revisten especial trascendencia en estos tiempos de rápido movimiento transfronterizo de
animales vivos y el estrecho contacto entre fauna salvaje y doméstica.
Uno de los grandes beneficios, derivados de un programa eficaz de vigilancia sanitaria
de especies acuáticas en estado salvaje, en este caso del camarón, radica en la detección
precoz de enfermedades nuevas, que aún no están presentes en los sistemas de cultivo de
Perú, Ecuador y Colombia como son el virus de la cabeza amarilla (YHV) de procedencia
15
Laboratorio de Sanidad Acuícola
Informe anual 2007
asiática, y el virus de la mionecrosis infecciosa (IMNV) de Brasil, las que podrían traer graves
consecuencias económicas.
Este estudio tuvo como objetivo, a través de un monitoreo constante de los esteros
durante el período de febrero a diciembre, por ser hábitat de langostinos nativos como P.
vannamei susceptible naturalmente al IMNV, y de Penaeus stylirostris,
susceptible
experimentalmente, detectar la posible presencia y distribución del virus de la mionecrosis
infecciosa.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Colecta de langostinos silvestres
Se estableció cinco estaciones de muestreo en los esteros o canales de marea: El
Bendito, La Envidia, Soledad, El Algarrobo y Matanzas. La elección de estos lugares se hizo
teniendo en cuenta que es en estas zonas donde se encuentran muchas empresas langostineras
informales donde no existe mayor control en cuanto a la posible introducción de enfermedades.
2.2. Tamaño de muestra y calendario de muestreo
Se colectó un promedio de 20 ejemplares de juveniles y adultos por especie en cada
estación de muestreo, para asegurar que el número acumulativo de ejemplares por especie y por
estación exceda el número mínimo (150) necesario para lograr un nivel de confianza del 95% y
con una prevalencia del 2%, para una población silvestre mayor a 100,000 individuos (DE CLERS,
1994). Los muestreos se realizaron quincenalmente por el periodo comprendido de febrero a
diciembre del 2007.
2.3. Procesamiento de las muestras
Los ejemplares colectados fueron colocados en bolsas plásticas rotuladas (estación,
fecha, hora y temperatura de agua) y transportadas al laboratorio en un cooler con hielo. En el
laboratorio se extrajo las branquias de los langostinos (muestra usada para el análisis), la que
fue preservada en etanol al 96%.
2.3.1. Extracción de ARN
Para realizar la extracción de ARN, se usó el Kit para detección de IMNV de IQ-2000TM
para lo cual las branquias fueron maceradas en presencia de la solución de extracción,
mezcladas con cloroformo y centrifugadas a 12000 rpm por 15 min. La fase acuosa fue
16
Investigaciones en Patobiología y Sanidad Acuícola
transferida a un nuevo tubo, mezclada con isopropanol y centrifugada a 12000 rpm por 10
min. El pellet recuperado fue lavado con etanol al 75% y centrifugado a 7500 rpm por 5
min.; se procedió a secar el pellet a temperatura ambiente y se disolvió en DEPC ddH2O
2.3.2. Análisis por PCR
La muestras fueron analizadas mediante la técnica de Nested PCR; el protocolo de
amplificación fue el contenido en el manual de procedimientos del Kit para detección de
IMNV de IQ-2000TM, que consiste en un primer paso de RT-PCR que consta de 15 ciclos y
una Nested PCR de 30 ciclos de 94 ºC por 20s; 62 ºC por 20 s, 72 ºC por 30s y un ciclo
adicional de 72 ºC por 30s, 20 ºC por 30s para finalizar.
Los amplicones fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa al 2% conteniendo
0,5 µg/ µl de bromuro de etidio y en amortiguador TAE al 1X. En muestras positivas se
obtendrá una banda de 284 pb.
2.3.3. Análisis de los datos
El tamaño de muestra fue calculado usando el programa Win Episcope 2.0 (Blas y col.,
1996), el cual se usa para medir la enfermedad en poblaciones animales en diferentes
situaciones. Los datos serán analizados para determinar la prevalencia usando la fórmula:
P = Nº de casos con la enfermedad en un momento dado
Total de la población en ese momento
3. RESULTADOS
Se analizaron un total de 2407 ejemplares de los cuales 1477 fueron P. vannamei y 930
P. stylirostris, colectados en los diferentes ambientes naturales (esteros o canales de marea).
Todos los ejemplares resultaron negativos al IMNV, obteniéndose por lo tanto que la población
bajo estudio se encuentran libres de IMNV. Tabla 01.
Tabla 01. Número de ejemplares colectados por estación de muestreo en los meses de febrero a diciembre del 2007.
Estación de
Muestreo
(Esteros)
P. vannamei
P. stylirostris
Total de ejemplares
colectados
Positivos
a IMNV
Prevalencia
(%)
Algarrobo
Soledad
El Bendito
La Envidia
Matanzas
145
400
167
378
387
194
30
279
298
129
339
430
446
676
516
0
0
0
0
0
-
Total
1477
930
2407
0
0
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Laboratorio de Sanidad Acuícola
Informe anual 2007
4. DISCUSIÓN
Este estudio fue diseñado para detectar la presencia del IMNV en los langostinos
silvestres de la Región de Tumbes P. vannamei y P. stylirostris, basados en la asunción de que
dicho patógeno se encuentra en los ambientes naturales (canales de marea), infectando a estos
peneidos que son susceptibles a contraerlo. Aún cuando se ignora si el IMNV puede estar
presente en las zonas aledañas de cultivo, es importante el monitoreo constante de patógenos
exóticos, para detectar a tiempo su aparición. Hay claras evidencias en acuicultura de que
muchos patógenos que producen enfermedades en los sistemas de producción, tienen su origen
en individuos silvestres de las mismas especies o de especies similares. Sin embargo las
condiciones que favorecen la aparición de epidemias en acuicultura raramente se encuentran en
las poblaciones silvestres, previniendo la ocurrencia de enfermedades o efectos negativos sobre
estas poblaciones, lo que no significa que tales efectos no existan.
El virus del IMNV se ha encontrado en Brasil, Indonesia y se sospecha su presencia en
Tailandia y China. En Ecuador se reportaron casos de langostinos de cultivo con opacidad
muscular sin razón aparente, signo clínico muy similar al causado por el IMNV; sin embargo, el
análisis por PCR arrojó resultados negativos para este patógeno; así mismo, después de
analizar las muestras de 2407 langostinos colectados de 5 estaciones, no se encontró ningún
positivo al IMNV en este estudio, lo que supone que los canales de marea de la Región Tumbes
estarían libres de este patógeno.
En esta investigación se tuvo en cuenta evitar la presencia de falsos negativos, para lo
cual el kit de diagnóstico utilizado lleva incorporado en su sistema de análisis un control interno
que codifica una región específica para la familia de los decápodos; de esta forma se elimina la
posibilidad de falsos resultados negativos causados por fallas en el proceso de extracción
(ausencia de ADN o degeneración del mismo) o de reacción.
El nivel de sensibilidad de la técnica utilizada para el análisis de detección fue del 98 %,
el límite de detección de 10 copias por reacción, el cual es comprobado con el estándar positivo
cuantificado (el cual supervisa la sensibilidad de detección). Esto respaldaría los resultados
negativos encontrados como correctos.
18
Investigaciones en Patobiología y Sanidad Acuícola
En los trabajos publicados sobre este tema, el rango de hospederos para IMNV parece
estar limitado al cultivo de P. vannamei. Aún cuando P. stylirostris y P. monodon han sido
experimentalmente infectados vía inyección con el virus purificado de la mionecrosis, no se han
reportado mortalidades (TANG et al., 2005), sugiriendo que estas especies son naturalmente
susceptibles al virus, pero son refractarias a los signos clínicos de la enfermedad.
Las interacciones entre enfermedades y la exposición a patógenos procedentes de
organismos silvestres a cultivados depende fuertemente de la situación actual del control de las
enfermedades de los animales cultivados. La liberación de altos niveles de patógenos desde los
estanques de cultivo al medio natural expone a las poblaciones silvestres, pudiendo conducir a la
aparición de enfermedades en ellas, aun cuando las condiciones del medio no son favorables
como detonante para una epidemia. Los animales silvestres pueden permanecer como
infectados latentes, los cuales si llegan a establecerse en los sistemas de cultivo con grandes
densidades y sumado a las fluctuaciones de temperatura, salinidad y nutrientes,
desencadenarían una rápida propagación de cualquier patógeno. Sin embargo cabe señalar que
la identificación de individuos enfermos en poblaciones silvestres de animales acuáticos es
bastante difícil. Existen datos disponibles que sugieren que cuando ocurre una epidemia en las
poblaciones silvestres, ésta tiende a localizarse en una zona, diluyéndose finalmente debido a
las bajas densidades de los organismos susceptibles.
5. CONCLUSIONES
- No existe presencia de IMNV en las poblaciones silvestres de P. vannamei y de P.
stylirostris de la Región Tumbes.
- Si la enfermedad de la Mionecrosis apareciera, será más fácil detectarla en estanques
de cultivo, los cuales reúnen las condiciones favorables para la aparición de la misma.
6. RECOMENDACIONES
- El monitoreo de la aparición del virus de la Mionecrosis debe ser realizado en
langostinos de cultivo, por ser estos los que reúnen las condiciones, ya que está confirmado que
los brotes de IMNV aparecen típicamente inducidos por estrés.
19
Laboratorio de Sanidad Acuícola
Informe anual 2007
7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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20
Investigaciones en Patobiología y Sanidad Acuícola
ANEXOS
CARTA DE LAS ESTACIONES DE MUESTREO (Canales de marea)
21
Laboratorio de Sanidad Acuícola
Informe anual 2007
TOTAL DE EJEMPLARES COLECTADOS PARA EL MONITOREO
EPIDEMIOLOGICO DE IMNV POR TRIMESTRE DE MUESTREO - 2007
P. vannamei
P. stylirostris
Total
IMNV
Primer
333
206
539
Negativo
Segundo
342
288
630
Negativo
Tercer
368
180
548
Negativo
Cuarto
434
256
690
Negativo
1477
930
2407
Trimestre
TOTAL DE EJEMPLARES COLECTADOS PARA EL MONITOREO
EPIDEMIOLOGICO DE IMNV POR ESTACION DE MUESTREO - 2007
P. vannamei
P. stylirostris
Total
IMNV
Canal de marea Algarrobo
145
194
339
Negativo
Canal de marea Soledad
400
30
430
Negativo
Canal de marea El Bendito
167
279
446
Negativo
Canal de marea La Envidia
378
298
676
Negativo
Canal de marea Matanzas
387
129
516
Negativo
1477
930
2407
Estación de muestreo
22
Investigaciones en Patobiología y Sanidad Acuícola
PERSONAL PARTICIPANTE
1. Colección de muestras, procesamiento, análisis de la información y elaboración del
informe
Mblgo. Rubén Alfaro Aguilera
Ing. Pesq. Mervin Guevara Torres
2. Apoyo en el procesamiento de muestras
Ing. Pesq. Karina Coronado Lupú
Tec. Pesq. María Serna Cruz
Tec. Susana Velis Duque
3. Apoyo en la colección demuestras
Sr. Víctor Carbajal Tocto
Sr. Leoncio Hisbes Rugel
4. Revisión del informe y supervisión general
Dr. Jorge Llanos Urbina.
23