Transcripción y Procesamiento del RNA

SÍNTESIS DE RNA o TRANSCRIPCIÓN
Facultad de Química, UNAM
1630 Genética y Biología Molecular
Transcripción y Procesamiento
del RNA
• Es el proceso mediante el cual se sintetiza RNA a partir de DNA.
• El RNA que se sintetiza puede ser el ribosomal, el de transferencia o
el mensajero
• Se requiere el DNA porque de su secuencia se sintetiza la del RNA,
la cual es complementaria
Se requieren:
•La enzima RNA polimerasa.
Hebra molde 3’-5’
•DNA Señales de iniciación (promotor) y de terminación
Unidad 6
Secuencias intensificadoras.
•Ribonucleótidos (trifosfatados) ATP, GTP, CTP, UTP.
•Proteínas o factores de transcripción.
Dogma Central de la Biología Molecular.
Producto de la transcripción: RNA de transferencia
Flujo de la Información Genética
Región
aceptora
Replicación
Transcripción.
Síntesis de RNA
Traducción
Síntesis de
Proteínas
Asa
anticodón
Tamaño: 75 – 80 nucleótidos
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Producto de la transcripción: RNA mensajero
Estructura y Función del RNAt
Los RNAt son las moléculas adaptadoras (traductoras) que
decodifican la información en el RNAm acarreando al
aminoácido correspondiente.
Los RNAt se sintetizan como precursores que son procesados
para generar moléculas de 75 a 80 nts de longitud.
La estructura de los RNAm
es variable y depende de
la secuencia.
Generalmente tienen bases modificadas como:
Ribotimidina
Dihidrouridina
Pseudouridina
Inosina
El tamaño de los RNAs
mensajeros es variable y
depende del tamaño del
gen que se transcribe.
Inosina
Producto de
transcripción:
El proceso de transcripción es la síntesis de RNA
siguiendo un molde de DNA
RNA ribosomal
PROCARIONTES:
RNAr 23S: 2,904 nts.
RNAr 16S: 1,542 nts.
EUCARIONTES:
RNAr 28S: 4,718 nts.
Micrografía electrónica de la síntesis de RNA ribosomal
RNAr 18S: 1,874 nts.
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A diferencia de la replicación del DNA, en
la transcripción...
La enzima que sintetiza RNA es la RNA POLIMERASA
La enzima de E. coli está formada por 4 subunidades
• Solamente un fragmento de DNA, que corresponde
a un gen, es copiado en RNA.
• Una de las dos cadenas de DNA es copiada a RNA.
DNA Cadena codificante:
5’-ATTCCGATGTACGAGG-3’
DNA
3’-TAAGGCTACATGCTCC-5’
RNA
Cadena molde:
5’-AUUCCGAUGUACGAGG-3’
La secuencia de la molécula de RNA que se sintetiza es
complementaria y antiparalela a la cadena molde.
La molécula de RNA que se sintetiza tiene la misma dirección y
secuencia (U -> T) que la cadena codificante.
Solamente un fragmento de DNA, que
corresponde a un gen, es copiado a RNA.
Una de las dos cadenas de DNA es copiada a RNA.
Subunidad α: ensamblaje de las
unidades y unión al promotor
Subunidad β: Sitio catalítico
Subunidad β’: Se une al DNA y parte
de la subunidad catalítica
Subunidad σ: Reconocimiento del
promotor específico
La subunidad α sirve como nodo para ensamblar la RNA
polimerasa holoenzima y esta función reside en el dominio Nterminal de la proteína.
• ¿Cómo sabe la RNA polimerasa cuál de las dos
cadenas usará como molde?
• ¿Cómo sabe la RNA polimerasa dónde comenzar
a sintetizar?
• ¿Cómo sabe la RNA polimerasa donde terminar
de sintetizar?
• ¿Quíen abre la doble hélice de DNA?
El domino C-terminal de la subunidad α interactúa con la
región UP de los promotores que la tengan.
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La estequiometría de subunidades en la
holoenzima es α2ββ'σ
Modelo de la RNA polimerasa de E. coli a partir de los datos
cristalográficos
Núcleo de la enzima
Cuando la subunidad σ
se asocia al núcleo se
forma la holoenzima
Núcleo de la enzima α2ββ
Estructura de los promotores procariontes.
Secuencias que se encuentran “corriente arriba” del sitio de inicio
de la transcripción. Hay secuencias muy conservadas en los
promotores procariontes.
Núcleo
RNA pol
Holoenzima
5 –8 pb
Complejo
cerrado
Complejo
abierto
Holoenzima α2ββσ
Formación del complejo abierto
El factor sigma permite la iniciación de
la transcripción permitiendo que la RNA
polimerasa se una fuertemente al
promotor.
Esta unión depende de la apertura de
la doble hélice en esa región para
formar un complejo de promotor
abierto.
El factor sigma se disocia de este
complejo.
• Secuencia -10 o caja Pribnow TATAAT Apertura de la cadena.
• Secuencia –35 TTGTCA
Es la región de reconocimiento e
interacción con el factor σ de la RNA polimerasa.
Complejo de
elongación.
La RNA polimerasa tiene un canal
abierto al cual se une el DNA. Una vez
que se unen al DNA, los “dedos” de la
enzima se cierran alrededor del DNA.
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Las funciones de la subunidad σ
El factor sigma selecciona los genes a transcribirse al facilitar la
unión entre la RNA polimerasa y el promotor. Esta unión depende
de la denaturalización local del DNA que permite la formación de
un complejo de promotor abierto
Elongación.
RNA polimerasa
Rebobinado
Desenrollado
Hebra codificadora
El factor σ se recicla, i.e. cuando se disocia puede ser usado
por otra RNA polimerasa.
Al unirse al promotor, la RNA polimerasa causa la apertura de
al menos 10 - 17 pb de la doble cadena de DNA. Esta “burbuja”
de transcripción se mueve con la polimerasa exponiendo la
cadena molde, de tal manera que puede ser transcrita.
σ
ESTRUCTURA DE UNA
CADENA DE RNA
Hebra molde
3
5
3
5
Hélice híbrida
RNA - DNA
5’ ppp
RNA
naciente
3
Punto de
elongación
Desplazamiento de
la polimerasa
4.- La “burbuja de transcripción” va avanzando, por un lado se abre el DNA
duplex y por el otro se re-bobina.
5.- El RNA sintetizado va formando un híbrido (transitorio), con la
cadena 3’ – 5’ del DNA
BURBUJA DE TRANSCRIPCIÓN
Se añaden ribonucleótidos
polimerizándose la cadena a
través de enlaces fosfodiéster (la
cadena va creciendo en la
dirección
5’ –> 3’)
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ELONGACIÓN.
2. Mecanismo independiente de la proteína Rho
La subunidad β contiene el sitio activo de la RNA polimerasa
donde se forman los enlaces fosfodiéster
La secuencia al final del gen contiene repeticiones invertidas
que permiten la formación de una estructura de horquilla en
el RNA. Hay una región rica en Adeninas, de tal forma que el
híbrido DNA-RNA que se forma es débil y se disocia.
Hay dos sitios en el DNA que interactúan con la RNA polimerasa:
1. Un sitio de unión débil que involucra la zona del DNA
desnaturalizada y el sitio activo en la subunidad β de la
polimerasa. La interacciones son principalmente
electrostáticas.
2. Un sitio de unión fuerte que involucra al DNA río abajo del
sitio activo y lo conforman las subunidades β y β‘ de la
enzima.
La subunidad β‘ une dos átomos de Zn2+ que participan en la
catálisis.
Esta subunidad se une fuertemente al DNA.
Terminación:
Inhibición de la transcripción en procariontes.
1. Mecanismo dependiente de la proteína Rho
La rifampicina bloque la transición
de iniciación-elongación. Se une a la
subunidad β en el complejo RNApolimerasa promotor una vez que se
han incorporado dos o tres
nucleótidos a la cadena de RNA.
La proteína rho es un hexámero que hidroliza ATP en presencia de
RNA.
Se une al RNA que se está sintetizando y se mueve en dirección al sitio
de síntesis. Desestabiliza al híbrido DNA – RNA, facilitando así la
terminación de la transcripción.
La rifampicina es producida por Streptomyces sp.
La estreptolidigina inhibe a la
RNA polimerasa durante la
elongación.
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Transcripción en eucariontes. Hay tres actividades de
RNA polimerasas
RNA polimerasas eucariontes purificadas en una columna de
DEAE-Sephadex. RNA pol I, RNA pol II y RNA pol III
Las RNA polimerasas eucariontes sintetizan distintos
RNAs y difieren en su sensibilidad a inhibidores.
INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIÓN
α-amanitina
La α−amanitina inhibe a la RNA polimerasa II (Kd =10 nM) y un poco a la III.
Inhibe la fase de elongación de la Transcripción
Amanita phaloides, hongo
venenoso que contiene
α - amanitina
La RNA polimerasa II eucarionte está formada por 12
subunidades. (P.M. aproximado de 550 kDa)
Tres de estas subunidades son homólogas a las subunidades de
la RNA polimerasa procarionte.
Rpb1 =>β’
Rpb2 =>β
Rpb3 =>α
Actividad de RNA
polimerasa
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Los promotores de los genes eucariontes son más complejos
que los procariontes. Muestran menor conservación en los
elementos de reconocimiento de las RNA polimerasas.
Inicio de la
transcripción
18 - 25 nts
Caja TATA: TATA(A/T)A(A/T)
Modificaciones posttranscripcionales de RNAs
eucariontes
*URE (Elementos regulatorios “río arriba”). Son sitios de unión de otras
proteínas (factores de transcripción) que facilitan la unión de la RNA
polimerasa y la transcripción de ese gen. De 100 a 200 pb del inicio.
Enhancers (Sec. Intensificadoras). Regiones en el DNA que
están alejadas por más de 1000 pb del sitio de inicio y que activan al
promotor para que ocurra una transcripción más eficiente.
La caja TATA funciona como señal para la unión de la proteína
TBP (TATA-binding protein). La unión de TBP al DNA causa una
torsión de éste, facilitando la apertura de la doble hélice.
Cada tipo de RNA sufre una forma diferente de
PROCESAMIENTO POST-TRANSCRIPCIONAL o MADURACIÓN
El factor de transcripción IID (TFIID) se une a promotores que
contienen la caja TATA a través de la proteína TBP.
RNAt
Se forma un complejo multiproteíco en el promotor que permite
la asociación de proteínas que están unidas a otras regiones en el
promotor.
PROCESAMIENTO
o MADURACIÓN
RNAm
Euc.
RNAr
Remoción de los extremos
Modificación de la ribosa
Modificación de las bases
Empalme o splicing
Adición del CAP en el extremo 5’
Adición del poliA en el extremo 3’
Metilación de la ribosa
Remoción de partes intermedias
de un pre-RNAr largo que origina
varios RNAr más cortos
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RNA ribosomales. Son sintetizados por la RNA pol I.
Los RNA ribosomales 28S, 18S, y 5.8S se sintetizan como un transcrito
largo de 13,000 nucleótidos que es procesado para generar los RNAr
maduros.
PreRNA
45S
18S
5.8S
RNAm Eucarionte:
Adición del CAP
28S
• Antes de 20 nucleotidos de largo
Metilación en el 2’-OH de
la ribosa
• Residuo
7-metil
guanosina,
añadida por una guanililtransferasa
• Puente 5´-5´ trifosfato
18S
5.8S
corte
28S
RNAr
maduros
RNAr18S
RNAr 5.8S
Los RNA de transferencia también son procesados
• El “capuchón” o “capping” puede
estar metilada en O(2´) (1 o dos
nucleósidos terminales) o no (cap0).
RNAr 28S
RNAm eucarionte: Adición de la cola de poliA
La RNAsa P hace un corte y genera el extremo 5’-OH
Señal de corte
Hidrólisis por una
endonucleasa específica
Secuencias consenso
PABP
La RNAsa P es un ribozima.
Contiena una subunidad de
proteína y otra de RNA.
Adición de adeninas (50300) por una poli-A
polimerasa
RNAm poliadenilado
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RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing
RNAm eucarionte: Corte y empalme/ “splicing”
DNA
Transcripción
RNAm
heteronuclear
Procesamiento: eliminación
de intrones.
Empalme de exones
RNAm
maduro
RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing
RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing
Las dos últimas bases del intron son AG
Sitio de ramificación
Las dos primeras bases del intron son GU
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El “splicing” del RNAm es catalizado por snRNP (small nuclear
RiboNuclear Particles)
Comparación de la expresión génica entre eucariontes y procariontes
snRNP: Moléculas de RNA ricas en uracilo asociadas a proteínas.
U1, U2, U4, U5, U6. La subunidad de RNA forma puentes de
hidrógeno con las bases en los sitios de reconocimiento de los
intrones (3’, 5’ y la rama).
“Spliceosome” = espliceosoma
RNA autocatalítico.
Algunos intrones se pueden eliminar de transcritos
heteronucleares sin el requerimiento de proteínas.
En este mecanismo hay un ataque en el sitio 5’ de splicing y la
ruptura, y no se forma el lazo (lariat).
“Splicing” alternativo.
Los RNAhn de algunos genes pueden ser procesados (splicing) de
manera diferencial generando dos RNAm maduros distintos.
Splicing alternativo
Traducción
Proteína A
Proteína B
Por lo general, el resultado del “splicing” alternativo son proteínas
relacionadas estructuralmente. Generalmente se obtienen isoformas de
una proteína.
A partir de un gen, se produce más de una proteína.
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