Nota corta: Método rápido de evaluación del efecto del

Nota corta: Método rápido de evaluación del efecto del herbicida
dalapon en cereales
I. Loureiro, N. Avendaño, M.C. Escorial, J.M. García-Baudin, M.C. Chueca *
Dpto. de Protección Vegetal. Instituto Nacional Investigaciones Agrarias
Carretera La Coruña Km. 7,5 Madrid 28040
[email protected]
RESUMEN
Se describe un método rápido que permite evaluar en cuatro días la respuesta de cereales al herbicida dalapon (ácido 2,2-dicloropropiónico). Este método de germinación en solución herbicida se ha puesto a punto utilizando cuatro cultivares de trigo y cuatro de cebada. Se ha comprobado que existe una buena correlación entre la
respuesta de los cultivares en germinación in vitro y la respuesta por pulverización en plántula.
PALABRAS CLAVE:
Trigo
Cebada
Germinación
INTRODUCCIÓN
Los ensayos de respuesta a herbicidas tanto en cultivos como en malas hierbas pueden ser realizados tanto en laboratorio como en invernadero o en campo. El método más
utilizado para la detección de una respuesta a herbicida en laboratorio implica crecer las
plantas en condiciones controladas y tratarlas, cuantificando el efecto del herbicida varias
semanas después de su aplicación (Moss, 1995). Esto hace que sean necesarias entre cuatro y seis semanas para la realización de un ensayo, que además de ser laborioso, necesita
espacio e infraestructura. Diferentes autores han puesto a punto bioensayos más cortos,
rápidos y baratos para evaluar el efecto herbicida, basados en determinar la respuesta midiendo diferentes parámetros, como la longitud del coleoptilo (Heap y Knigh, 1986; Sixto
et al., 1997), de la raíz (Beckie et al., 1990), de las hojas (Letouzé y Gasquez., 1999; De
* Autor para correspondencia
Recibido: 9-3-01
Aceptado para su publicación: 20-7-01
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la Carrera et al., 1999) o la actividad enzimática (Reade et al., 1999) después de la aplicación herbicida. Estos ensayos han permitido detectar respuestas diferenciales entre biotipos sensibles y resistentes para algunos herbicidas como diclofop-metil (Gill, 1990; Letouzé y Gasquez., 1999), trifluralina (Beckie et al., 1990) inhibidores de acetil-coenzima
A carboxilasa (Murray et al., 1996) o glifosato (Sixto et al., 1997).
El dalapon (ácido 2,2-dicloropropiónico) es un herbicida total de postemergencia con
actividad por contacto, penetración y translocación, usado para el control de malas hierbas gramíneas. Afecta al metabolismo de carbohidratos, de lípidos y del nitrógeno, así
como a otros procesos, probablemente respuestas secundarias debidas a uno o varios sitios de acción primarios desconocidos (Ashton y Crafts, 1981).Estas características hacen
que este herbicida se haya propuesto como un buen candidato para el control de gramíneas en cereales, aunque es necesaria la creación previa de cultivares resistentes (Gressel,
2000). Para ello se ha transferido a trigo un gen que codifica para un enzima dehalogenasa que confiere resistencia a dalapon (Buchanan-Wollaston et al., 1992). El posterior estudio e identificación de individuos resistentes a dalapon hace que sea de gran utilidad disponer de una forma sencilla y rápida de detectar la resistencia.
Este trabajo muestra un método rápido y sencillo que nos permite detectar respuestas
diferenciales a dalapon en cereales, trigo y cebada, mediante un ensayo de germinación en
placa que se correlaciona con la respuesta tradicional de pulverización en plántula.
MATERIAL Y MÉTODOS
El material vegetal utilizado para el estudio fueron cuatro cultivares de trigo: dos de
trigo blando (Triticum aestivum L.), cultivares «Pavon» y «Chinese Spring» (CS) y dos de
trigo duro (Triticum turgidum var. durum L.), cultivares «Anton» y «Nita» y cuatro cultivares cebada: (Hordeum vulgare L.): «Beka», «Amaji Nijo» (AN), «Barbarrosa» y «Manitou».
Ensayos de germinación en placa Petri
Se estudió la respuesta de las plantas mediante la germinación de las semillas en placas Petri con diferentes concentraciones del herbicida dalapon (85 % sal sódica). En cada
placa se colocaron diez semillas sobre dos discos de papel de filtro sobre los que se añadieron previamente 9 ml de diferentes concentraciones de la solución herbicida: 0, 25, 50,
100, 300, 500 y 1.000 µg m.a. (materia activa) ml–1. En cada ensayo se utilizaron tres placas por cada una de las concentraciones empleadas. Las placas se mantuvieron cerradas
24 horas transcurridas las cuales se abrieron y se pasaron a una bandeja con papel de filtro
humedecido, que se cubrió con plástico transparente para que se mantuviera la humedad y
para que el coleoptilo tuviera espacio para su crecimiento. Al cuarto día desde el inicio
del ensayo se midió la longitud del coleoptilo. Se realizaron tres repeticiones en el tiempo
para cada cultivar. El ensayo se llevó a cabo en una cámara en condiciones controladas,
con un fotoperíodo de 16 horas de luz (100 m E m–2s–1 PAR) a 22 ± 1 ° C y 8 horas de oscuridad a 14 ± 1 ° C.
EVALUACIÓN RÁPIDA DEL EFECTO DE DALAPON
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Ensayos de pulverización en plántula
Semillas de cada cultivar se pregerminaron en placas sobre discos de papel de filtro
empapados en agua, siendo trasplantadas a los cuatro días a vasos de plástico con una
mezcla de mantillo-tierra-arena (1:1:1) con cinco semillas por vaso y tres vasos por tratamiento. Cuando las plantas se encontraban en estado fenológico de dos hojas correspondiente al estadío 12 (Zadoks et al., 1974), se trataron con un pulverizador automático de
boquilla plana Teejet 8003 en una cinta sin fin, con dosis de dalapon (85 % sal sódica) de
0; 0,31; 0,62; 1,25; 2,5; 5 y 10 kg m.a. ha–1. A la solución herbicida se añadió un surfactante no aniónico 1 (1,25 g L–1). La parte aérea de la planta se cortó 15 y 30 días después
de la pulverización y se pesó (peso fresco). Las plantas cortadas se secaron en la estufa
a 80 ± 2 ° C durante 48 horas (peso seco). El ensayo se realizó en una cámara de condiciones controladas con un fotoperíodo de 16 horas de luz (250-300 m E m–2s–1 PAR) a
22 ± 1 ° C y 8 horas de oscuridad a 16 ± 1 ° C.
Análisis de datos
Los datos, después de llevar a cabo la transformación arco seno raíz cuadrada de x, se
analizaron mediante un análisis de varianza factorial tomando como factor la especie. Las
medias se separaron mediante una prueba de Newman Keuls con nivel de significación
P = 0,05.
La respuesta de la planta a las diferentes dosis de herbicida se calculó mediante el
ajuste a un modelo log-logístico que sigue la formula y = f(x) = C + (D - C)/(1 + (x/I50)b),
donde C es el límite inferior que corresponde a la dosis mayor de herbicida, D es el límite
superior que corresponde al testigo, b es la pendiente de la curva en la zona de ID50, siendo esta la dosis que produce una inhibición del 50 % del testigo. Los parámetros se estimaron por un ajuste por iteración usando el modelo PROC NLIN del programa SAS (Seefeldt et al., 1995).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En los ensayos de germinación, el herbicida penetra en la semilla por imbibición.
Esta imbibición de las semillas no afectó a su germinación que fue en todos los casos similar a la de los testigos no tratados. El efecto herbicida se puso de manifiesto fundamentalmente en la inhibición del crecimiento del coleoptilo, que se vio severamente reducido,
siendo este efecto menos apreciable sobre el crecimiento de la raíz (datos no presentados).
La respuesta al herbicida dalapon de la semilla germinada en medio adicionado de
herbicida se evaluó mediante la longitud del coleoptilo que se expresa en porcentaje del
testigo, calculando la curva de respuesta mediante un ajuste de regresión no lineal.
1
Tween-20 (polyoxyethylensorbitanmonolaurat); de MERCK, Schuchard, 8011 Hohenbrunn bei München.
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A las concentraciones más elevadas de herbicida, no existieron diferencias entre los
cultivares de cebada y los cultivares de trigo (Fig. 1a). A concentraciones inferiores a 100
mg L–1, los cuatro cultivares de trigo mostraron una mayor sensibilidad al herbicida que
los cuatro cultivares de cebada. Un análisis de varianza llevado a cabo tomando como factor la especie nos mostró que la cebada fue significativamente diferente del trigo para la
respuesta al herbicida dalapon.
Estos datos pusieron de manifiesto que este tipo de ensayo de germinación en placa
permite detectar respuestas diferenciales al herbicida dalapon, que aunque es un herbicida
cuya principal vía de penetración es foliar, es capaz de penetrar por otras vías y de translocar rápidamente del floema al xilema (Wilkinson, 1956; Maroder, 1973).
Longitud coleoptilo (% testigo)
120
a
100
CS
Pavon
Anton
Nita
Beka
Manitou
AN
Barbarrosa
80
60
40
20
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Dosis dalapon (mg/l)
120
b
Peso seco (% testigo)
100
CS
Pavon
Anton
Nita
Beka
Manitou
AN
Barbarrosa
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Dosis dalapon (kg/ha)
Fig. 1.–Curva de respuesta de dosis al herbicida dalapon de cuatro cultivares de trigo y cuatro
cultivares de cebada
a.- respuesta en germinación en placa (longitud del coleoptilo 4 días de tratamiento).
b.- respuesta a pulverización en plántula (peso seco 30 días después del tratamiento).
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EVALUACIÓN RÁPIDA DEL EFECTO DE DALAPON
Ensayos de pulverización en plántula llevados a cabo con los mismos cultivares de
trigo y cebada presentaron una respuesta similar en peso tanto seco como fresco, 15 y 30
días después del tratamiento, a la que presentaron los ensayos de germinación en placa.
La Figura 1b muestra la respuesta en peso seco de las plantas 30 días después de efectuado el tratamiento herbicida. En todos los casos la respuesta de los cultivares de cebada fue
más tolerante que la respuesta de los cultivares de trigo, lo que como en el caso anterior,
se confirmó por un análisis de varianza.
Las curvas de respuesta calculadas nos permitieron comparar la respuesta de los diferentes cultivares mediante las dosis que inhibieron el crecimiento en un 50 % (ID50, Tabla 1) y en un 30 % (ID30, Tabla 2) en relación al testigo. Tomamos para llevar a cabo la
Tabla 1
ID50 calculado para cada uno de los cultivares en los tres parámetros evaluados:
Longitud de coleoptilo (mg L–1), peso seco de la parte aérea de la planta 15 y 30
días después del tratamiento (g L–1)
Especie
Cultivar
ID50
Coleoptilo
Peso 15 días
Peso 30 días
Trigo
Nita
Anton
Pavon
CS
38
67
102
185
1,16
1,55
1,21
1,23
0,93
0,97
0,75
0,83
Cebada
AN
Beka
Barbarrosa
Manitou
145
167
175
194
3,23
3,14
6,11
4,18
2,58
2,09
4,62
2,96
Tabla 2
ID30 calculado para cada uno de los cultivares en los tres parámetros evaluados:
Longitud de coleoptilo (mg L–1), peso seco de la parte aérea de la planta 15 y 30
días después del tratamiento (g L–1).
Especie
Cultivar
ID30
Coleoptilo
Peso 15 días
Peso 30 días
Trigo
Nita
Anton
Pavon
CS
27
38
26
45
0,69
0,87
0,55
0,62
0,52
0,58
0,49
0,49
Cebada
AN
Beka
Barbarrosa
Manitou
67
77
78
83
1,46
1,55
2,81
1,92
1,29
1,29
2,20
1,65
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comparación entre las diferentes formas de tratamiento estos dos valores por dos motivos.
En primer lugar, ID50 es el dato considerado como el más adecuado para evaluar el efecto
de un tratamiento. En segundo lugar y en el caso especial del tratamiento con dalapon, observamos que incluso a las dosis elevadas empleadas en el ensayo de germinación, se produjo en el coleoptilo un crecimiento inicial anterior al efecto herbicida que hizo que, después de un principio de elongación, el crecimiento se viera detenido por el dalapon y la
inhibición en porcentaje del testigo no fuera en ningún caso inferior a 40 % en ensayos de
germinación en placa en el corto tiempo en que son válidos este tipo de ensayos. Por ello
tomamos como valor de comparación más adecuado el ID30.
La relación entre la respuesta de las plantas en un ensayo rápido como es el que presentamos y su respuesta por pulverización en plántula fue buena. La correlación entre los
ID30 en ensayo in vitro y en pulverización en plántula fue de 0,86 para la respuesta en
peso 15 días después del tratamiento y de 0,91 para la respuesta en peso 30 días después
del tratamiento. Esta correlación fue menor en nuestros ensayos para ID50, pero ello es sin
duda debido a la elongación inicial del coleoptilo y a que no existe una tolerancia a este
herbicida lo suficientemente efectiva dentro de los cultivares de cereal, dado que este herbicida es antigramíneo. Sin olvidar que en algunos casos entre los que se encuentra el dalapon y los arilfenoxipropionatos (Gill, 1990) los ensayos en placa pueden subestimar el
efecto herbicida.
Estos resultados pusieron de manifiesto que este tipo de ensayo permite evaluar en
cuatro días respuestas diferenciales al herbicida dalapon. Dado que este tipo de ensayo, de
gran interés práctico, necesita ser validado para cada caso, se está estudiando su adecuación para otras especies gramíneas y para trigos transgénicos resistentes a dalapon, con el
fin de utilizarlo de forma sistemática en el seguimiento de un transgen y en el estudio de
la variabilidad poblacional de malas hierbas gramíneas.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue financiado por el proyecto IC18-CT98-0391 dentro del programa INCO de la Unión Europea.
SUMMARY
A rapid method to evaluate the effect of dalapon herbicide on cereals
A method to evaluate the response of cereals to the herbicide Dalapon (2,2-dichloropropionic acid) in four
days is described. The method is based on the germination of seeds in a herbicide solution. It was developed using four wheat and four barley cultivars. For these cultivars, a good correlation was found between the germination response in herbicide solution and the response observed in sprayed seedlings.
KEY WORDS:
Wheat
Barley
Germination
EVALUACIÓN RÁPIDA DEL EFECTO DE DALAPON
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