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VII.-Capítulo 2
Métodos para el estudio de la
expresión de genes
Pessino, Silvina C.; Martelotto, Luciano G.
1 Introducción
La capacidad de secuenciar genomas completos desarrollada en la última década ha
impulsado a la investigación científica en la
dirección de definir la función de cada uno
de los genes identificados. Para contribuir
con ese objetivo se han diseñado técnicas
que permiten estudiar la expresión génica
global en un determinado tejido y en un
momento particular del desarrollo, posibilitando la identificación inicial y el agrupamiento en clases funcionales de secuencias nuevas con una actividad asociada.
Los procedimientos para esta evaluación
han progresado desde los métodos desarrollados para el análisis de genes únicos específicos (como el Northern slot y dot blotting,
la RT-PCR semicuantitativa y cuantitativa y los
ensayos de protección de nucleasas) hacia
otros enfocados en la identificación de múltiples transcriptos que difieren en su representación entre las diversas muestras experimentales (como la hibridación substractiva,
el display diferencial, el ADNc-AFLP ®, la
secuenciación de etiquetas expresadas o EST,
el análisis serial de la expresión de genes o
SAGE y la hibridación de microarreglos). La
organización de las secuencias dentro de grupos funcionales basada en los datos de expresión y de homología proporciona un marco básico para conducir nuevos estudios dirigidos a definir la actividad precisa de cada
producto génico.
2 Hibridación substractiva
Los métodos de hibridación substractiva
fueron creados a principios de la década que
comenzó en 1980 con el propósito de construir bibliotecas de ADNc para obtener sondas de genes expresados diferencialmente.
Fueron los primeros que se utilizaron de manera amplia con el propósito de identificar
genes regulados positiva o negativamente en
una escala global. Sus ventajas incluyen la
habilidad de aislar genes de función relacionada sin tener conocimientos previos de su
secuencia o identidad y el uso de técnicas
comunes de biología molecular que no requieren equipos especializados de detección y
análisis.
El procedimiento general consiste en la
hibridación de ADNc provenientes de una
muestra prueba (tester) con un exceso de
ARNm proveniente de una muestra control
(driver). Los transcriptos expresados en ambas muestras (tester y driver) forman moléculas de ARNm/ADNc híbridas, mientras que
las secuencias de ADNc que están presentes
únicamente en la muestra tester permanecen como hebras simples. Las moléculas de
hebras simples y dobles se separan usando
cromatografía en hidroxilapatita. Los ADNc
expresados diferencialmente pueden entonces ser recuperados y clonados o usados directamente como sondas para analizar una
biblioteca.
Dos limitaciones importantes del protocolo original son: i) el requerimiento de grandes cantidades de ARNm y ii) la tendencia a
una menor eficiencia en la identificación de
transcriptos poco abundantes.
La hibridación substractiva es aplicable
sólo a comparaciones de pares de muestras
y debe ser realizada por duplicado con el
tester y el driver invertidos para detectar tanto aumentos como disminuciones en los niveles de expresión. Además no genera una
medida cuantitativa y aunque es eficiente en
la identificación de genes que están completamente ausentes en el driver no revela fácilmente a aquellos que están presentes en
ambas muestras en distinta proporción.
A fin de mejorar el protocolo original se
realizaron modificaciones que incluyen la producción de ADNc con marcas de biotina u
oligo(dT)30-látex de manera de refinar la separación de las moléculas de cadena simple
y doble. También se incorporó la amplificación de ADNc selectos por PCR para disminuir la cantidad inicial de mARN requerido y
aumentar la eficiencia de clonado de los
transcriptos seleccionados. En la actualidad
se utiliza más comúnmente un protocolo ingenioso conocido como hibridación
substractiva de supresión (SSH) que fue diseñado para favorecer la detección de
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transcriptos raros expresados diferencialmente. Este incluye una normalización en la
representación de los transcriptos diferenciales basada en la inhibición de la amplificación
de aquellos que son más abundantes, eliminando también la necesidad de separar moléculas de cadena doble y simple (Fig.1).
3 Display diferencial y RAP-PCR
Las técnicas conocidas en general como
«huellas digitales genéticas de ARN» (ARN
fingerprinting) incluyen al display diferencial
(DD) y al fingerprinting de ARN con una PCR
cebada arbitrariamente (RAP-PCR). Ambos
métodos están basados en una
amplificación por PCR de
subgrupos al azar de transcriptos
a partir de dos o más muestras.
La primera etapa de ambos
procedimientos es común y consiste en generar ADNc haciendo
una transcripción reversa de una
fracción de las moléculas de
ARNm de una muestra. En el display diferencial esto se logra utilizando como cebador de la
transcripción reversa a un poliT
anclado con una o más bases adicionales al extremo 3´ del ARN
mensajero (por ejemplo (T)12AC).
Estos oligonucleótidos se fijan al
ARN mensajero a través de la
unión de las bases adicionales,
impidiendo que el poliT «resbale» sobre distintas zonas del poli
A. El único grupo de ARNm que
es transcripto en forma reversa
es el integrado por las moléculas
que llevan las bases complementarias a las bases adicionales del
poliT en el extremo del mensajero adyacente al poliA. En contraste, la RAP-PCR utiliza
oligonucleótidos de secuencia arbitraria para la transcripción
reversa. Estos cebadores tienen
normalmente 10 bases de largo
y se unen a sus secuencias com-
Figura 1: Esquema general que describe el procedimiento de hibridización substractiva de supresión (SSH). El
ADNc prueba (tester) se divide en dos porciones iguales que se ligan a dos adaptadores diferentes y son hibridizadas
por separado con un exceso de ADNc de la muestra control (driver), lo que conduce a la formación de los productos
de tipo a, b, c y d que se indican en la figura. Luego ambas muestras se mezclan y se rehibridizan en presencia de
un exceso adicional del driver desnaturalizado, lo que origina los productos a, b, c, d y e. Los extremos de las
hebras dobles se rellenan y los fragmentos se amplifican por PCR utilizando cebadores complementarios a los
adaptadores. El enriquecimiento en las moléculas e se logra durante la amplificación por PCR ya que: i) a y c pueden
unir un solo cebador por lo que se amplifican linealmente; ii) la amplificación de b está suprimida debido a la
complementariedad de unas terminaciones largas repetidas invertidas presentes en la secuencia del adaptador
que promueven la formación de estructuras secundarias internas en las hebras simples; iii) d no contiene sitios de
unión a los adaptadores. Los productos de PCR resultantes provendrán de transcriptos presentes esencialmente en
el tester y ausentes en el driver y además su representación estará normalizada ya que los fragmentos diferenciales
abundantes tendrán mayores posibilidades de formar moléculas de tipo b. Este esquema fue adaptado de Diatchenko
et al. 1996.
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plementarias permitiendo formar una hebra en los distintos tratamientos experimentade ADNc desde este sitio. En este caso el les representan potenciales transcriptos de
subgrupo de ARNms que sufre transcripción ARNm de expresión diferencial. Típicamenreversa estará integrado por aquellas molé- te, las bandas son evaluadas sólo si amplificulas que presenten la secuencia complemen- can en forma consistente en reacciones de
taria a la del cebador orientada en el senti- PCR duplicadas para cada muestra (Fig. 2).
do adecuado.
La fase final del display diferencial consisLuego de haberse realizado la síntesis de te en la identificación de la secuencia del
la primer hebra del ADNc, se amplifican seg- transcripto representado por el producto de
mentos de los transcriptos usando pares múl- PCR y la confirmación de que este realmente
tiples de cebadores de PCR. Tanto para el se expresa en forma contrastante. Estas etadisplay diferencial como para la RAP-PCR, el pas se logran localizando físicamente y
cebador superior es un oligonucleótido arbi- escindiendo la sección del gel de
trario de 10 pares de bases. El cebador infe- poliacrilamida que contiene al producto de
rior es el mismo oligonucleótido poliT
anclado (para el caso del display diferencial) o el decámero arbitrario (para
el caso de RAP-PCR) que se usaron alternativamente para hacer la transcripción reversa.
Se ha estimado que los productos
de PCR de 240 combinaciones particulares de pares de cebadores de display diferencial (por ejemplo todas las
combinaciones de 20 oligonucleótidos arbitrarios y 12 oligonucleótidos anclados) representan
estadísticamente a todos los ARNm
originalmente presentes en la muestra.
Los productos de PCR pueden ser
marcados por incorporación de un
nucleótido radiactivo o de una molécula que pueda ser detectada a través de su interacción con un anticuerpo conjugado a un sistema de detección (por ejemplo digoxigenina). También puede usarse un cebador unido
a un fluoróforo u optarse por no marcar los fragmentos amplificados y usar
luego una tinción con nitrato de plata para revelar los geles. La visualización de los productos de PCR se logra Figura 2: Representación gráfica del método de display diferencial.
luego de la electroforesis en geles de Las muestras de ARN son transcriptas en forma reversa usando
poliacrilamida seguida de la apropia- como cebador un oligonucleótido poliT de secuencia 5´T(T)nTXY
da generación y detección de imáge- 3´ (donde 10 Í n Í 12) que se fija en forma estable al extremo 3´de
transcriptos a través de la unión de las bases adicionales de
nes, que son evaluadas comparando los
secuencia arbitraria X e Y. Una vez sintetizada la primer hebra del
la intensidad relativa de las bandas ADNc, ésta se usa como molde para una reacción de PCR que
producidas a partir de diferentes utiliza como cebadores el mismo poliT anclado y un decámero de
secuencia arbitraria. Distintas combinaciones de poliTs y decámeros
muestras experimentales.
Los fragmentos que están presen- generan numerosos perfiles de amplificación a partir de diversas
subpoblaciones de ARN mensajeros. El patrón de bandas de las
tes en una muestra y ausentes en la muestras experimentales se compara en busca de diferencias de
otra o aquellos que están presentes tipo presencia-ausencia o alteraciones en la intensidad de las
con diferentes intensidades relativas bandas.
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interés. En la mayoría de los casos debe realizarse un alineamiento de las imágenes de
los fragmentos de amplificación con el gel de
poliacrilamida seco. En los casos en que se
utiliza tinción con nitrato de plata no es necesario realizar este paso, por lo cual la recuperación de la banda es mucho más eficiente. Los productos de PCR son purificados del
gel y reamplificados.
Se han utilizado varias estrategias para
confirmar la expresión diferencial de los
transcriptos, que incluyen el uso de los fragmentos como sondas de Northern, la siembra de los fragmentos en membranas para
someterlos a análisis de Northern inverso y
el clonado y secuenciación de los productos
para diseñar cebadores específicos que permitan realizar PCR semicuantitativas. Independientemente de cuál sea la táctica usada
para confirmar la expresión diferencial, las
secuencias de los fragmentos de los genes
expresados diferencialmente se requieren
siempre para comenzar a entender la función del gen. El aislamiento de la secuencia
completa de los genes involucrados puede
lograrse usando los clones diferenciales en
estudios de bibliotecas de ADNc o realizando experimentos de 5´RACE.
Dos ventajas importantes de los métodos de fingerprinting de ARN con respecto a
los de hibridización substractiva son la capacidad de comparar muestras experimentales
múltiples en forma simultánea y la de identificar genes que están regulados tanto positiva como negativamente en una muestra respecto de las otras. Sin embargo, los métodos de fingerprinting de ARN comparten con
el SSH la limitación de que no son cuantitativos. Además suelen aparecer numerosos falsos positivos, es decir, fragmentos de genes
que parecen estar diferencialmente expresados pero son artefactos de PCR. Otro problema es que estas técnicas deben aplicarse
en general a muestras provenientes del mismo individuo sometido a distintas condiciones o sobre individuos genéticamente idénticos (por ejemplo, isolíneas). Cuando se comparan los perfiles de ARNm de individuos diferentes genéticamente, pueden aparecer falsos positivos que son resultado de una amplificación diferencial debida a una variación
en la secuencia de los transcriptos más que a
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diferencias en su representación. Ese problema puede ser evitado utilizando estrategias
de análisis de segregantes en grupo (BSA)
aplicadas al estudio de perfiles de ARN.
Finalmente, la investigación de todos los
genes que potencialmente se expresan en
forma diferencial requiere el uso de
equipamiento de última generación y una
inversión extensiva de tiempo y trabajo para
detectar y confirmar la expresión diferencial
de cada uno de los genes individuales.
4 Polimorfismos en la longitud de los
fragmentos de ADNc amplificados
(ADNc-AFLP®)
La tecnología de AFLPÒ , generalmente
utilizada para producir huellas genéticas de
ADN genómico, puede ser aplicada también
a preparaciones de ADNc de doble hebra para
obtener un perfil del transcriptoma. Los patrones obtenidos por esta técnica son una
herramienta confiable y eficiente para la identificación de los ARNm expresados diferencialmente.
La técnica de ADNc-AFLPÒ detecta fragmentos de restricción de ADN por medio de
amplificación por PCR. Comprende las siguientes etapas: i) generación de ADNc, ii) restricción del ADNc con dos endonucleasas específicas, preferiblemente una que reconoce sitios de 6 bases y otra que reconoce sitios de
4 bases, iii) ligación de adaptadores de cadena doble a los extremos de los fragmentos
de restricción, iv) amplificación de un
subgrupo de los fragmentos de restricción
usando dos cebadores complementarios al
adaptador que llevan bases selectivas adicionales en el extremo 3´ v) electroforesis de
los fragmentos de restricción amplificados en
geles de poliacrilamida, vi) visualización de las
huellas digitales genéticas mediante el uso de
autorradiografías, fosfoimágenes y otros
métodos (Fig. 3, ver pág.7).
Las mayores ventaja del uso de la tecnología de ADNc-AFLPÒ son: i) no se requiere
información previa de secuencia; ii) se puede
estudiar una fracción muy grande de todos
los genes expresados, iii) es una técnica muy
sensible que permite la detección de
transcriptos de baja abundancia, iv) los fragmentos son extraídos fácilmente de los geles
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y las secuencias correspondientes pueden determinarse sin necesidad de clonados previos.
alterar la actividad de los diferentes dominios
de la proteína que codifica.
5 Etiquetas de secuencia expresadas
(«Expressed sequence tags, EST»)
6 Análisis serial de la expresión de genes
Los avances tecnológicos que facilitan la
secuenciación masiva condujeron a principios
de los años 90 a idear el concepto de las bibliotecas de etiquetas de secuencia expresadas (bibliotecas de ESTs). Las secuencias EST
son generadas tomando clones al azar de una
biblioteca de ADNc y realizando una sola reacción de secuenciación que abarca 300-500
pb del clon. Las diferencias en la expresión
de genes pueden ser identificadas considerando el número de veces en que aparece
representada una secuencia en particular. Sin
embargo, las secuencias EST a menudo se generan a partir de bibliotecas de ADNc que
han sido normalizadas para ecualizar la abundancia de clones que corresponden a los diferentes transcriptos. Los EST secuenciados
a partir de estas últimas pueden ser comparados para identificar transcriptos que se expresan en una biblioteca y están completamente ausentes en otra, pero si se pretende
obtener datos cuantitativos exactos que describan abundancia relativa se debe recurrir
indefectiblemente a bibliotecas de ADNc no
normalizadas. La posibilidad de detectar diferencias en la expresión de genes a través
de la comparación de la abundancia de secuencias en las bases de datos de EST se
incrementa con el crecimiento de estas bases.
La combinación de la información generada por los EST (nivel y localización espacio/
temporal de la expresión génica) y la de los
proyectos de secuenciación de genomas (secuencias completas de los genes y sus promotores) permite realizar asociaciones de
expresión y homología estructural que en
muchos casos facilitan la inferencia de la posible función de los genes identificados. Por
supuesto, esto constituye una instancia inicial en la identificación de la función de cada
gen. Para determinar su actividad precisa
deben hacerse estudios particulares en general dirigidos a bloquear o aumentar su expresión por ingeniería genética y a modificar
estructuralmente la molécula de manera de
El análisis serial de la expresión de genes
(SAGE) consiste esencialmente en una versión acelerada de la secuenciación de EST.
Está basada en el concepto de que una etiqueta corta de unas pocas bases es suficiente para identificar inequívocamente a un
transcripto, siempre y cuando esté ubicada
en una posición definida dentro de la secuencia del mensajero. Una etiqueta SAGE consiste típicamente en 9 bases de secuencia
ubicadas por debajo del último sitio de reconocimiento de una endonucleasa específica
en el transcripto blanco. Múltiples etiquetas
SAGE se ligan juntas en un vector de clonado
de manera que una reacción de secuencia de
300 a 500 pb genera las secuencias de 20 a
30 etiquetas al mismo tiempo (Fig. 4, ver
pág.7). Como cada etiqueta SAGE representa un único transcripto de ARNm, es posible
obtener una visión general de todos los
genes expresados en la muestra original. Las
diferencias en la expresión de genes entre
muestras experimentales pueden entonces
ser identificadas comparando la abundancia
relativa de etiquetas SAGE específicas en diferentes bibliotecas. Los genes o las secuencias EST representados por las etiquetas SAGE
son localizados en las bases de datos detectando aquellos transcriptos que tengan la etiqueta SAGE en la posición adecuada.
Una limitación del SAGE es la identificación de los genes representados por las secuencias de etiquetas. Este proceso está en
primer lugar restringido a secuencias que estén accesibles en las bases de datos. Sin embargo, esta limitación se tornará menos problemática a medida que se generen más secuencias EST y que a las secuencias existentes se les asignen asociaciones y función. Otra
limitación potencial es la identificación errónea de las etiquetas. Esto puede resultar de
errores de secuenciación y de la identificación
fallida de la región que corresponde al SAGE
en la base de datos de secuencia. Además,
ciertos transcriptos pueden estar ausentes en
la muestra, dependiendo de cuál sea la enzima específica usada para generar la biblioteca de SAGE. Otros ARNm por el contrario
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pueden estar representados por múltiples
etiquetas SAGE a causa de la existencia de
polimorfismos en un sólo nucleótido o el procesamiento alternativo de los transcriptos. Se
espera que muchos de esos problemas afecten a una porción relativamente pequeña de
los genes representados, pero no deberían
ser dejados de lado en la interpretación de
los resultados.
Por otra parte, dos ventajas importantes
del SAGE sobre la hibridación substractiva y
el display diferencial es que los datos obtenidos son cuantitativos y acumulativos. Si se
genera la suficiente cantidad de información
de secuencia se obtienen perfiles exactos de
la expresión de los transcriptos, que describen la abundancia de todos los genes expresados en una célula o tejido. Existe una base
de datos pública de expresión génica que ha
sido creada para el almacenamiento y análisis de secuencias de SAGE cuyo poder continuará creciendo a medida que se contribuya
con más información. Otra característica de
los datos de SAGE es que pueden complementar datos de ESTs generados a partir de
bibliotecas de ADNc normalizadas o
substraídas. Los EST brindan información de
secuencia mientras que el SAGE provee datos cuantitativos describiendo la abundancia
de los transcriptos.
Finalmente, a pesar de que el SAGE requiere capacidad de secuenciación de última
generación, la cantidad de datos que aporta
puede ser 20 veces mayor que el que posibilita la misma cantidad de secuenciación EST.
7 Hibridación de microarreglos o
micromatrices
La evaluación de la expresión de genes
usando la tecnología de micromatrices ha
demostrado ser un procedimiento muy efectivo para una variedad de aplicaciones. Los
tres tipos generales de micromatrices incluyen: i) «chips» de oligonucleótidos,
construídos realizando la reacción de síntesis
de cebadores cortos directamente sobre una
matriz de vidrio, ii) arreglos de oligonucleótidos, construídos depositando oligonucleótidos sobre placas de vidrio o membranas de nylon, iii) arreglos de ADNc, obtenidos depositando insertos amplificados por
PCR a partir de una biblioteca sobre placas
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de vidrio o membranas de nylon.
Uno de los aspectos más importantes de
la experimentación con micromatrices es la
selección de los fragmentos de ADN que
contendrá. Aún cuando el número de genes
representado suele ser grande (3000 a
10000), pueden faltar algunos que sean importantes para una cuestión experimental
particular. La selección de la biblioteca más
adecuada para una aplicación en particular y
la elección de los clones son factores críticos
que determinan el éxito de estos experimentos.
En algunas situaciones, puede ser más
efectivo enfocar los experimentos en un grupo pequeño de genes seleccionados por criterios más específicos como, por ejemplo,
perfiles de distribución de tejidos, clasificación
funcional o cambio de expresión conocidos.
Se pueden adquirir clones de fuentes comerciales u otras fuentes y/o clonar secuencias
específicas usando técnicas estándar de biología molecular.
Después de que los clones han sido seleccionados deben ser ensamblados y organizados para generar el arreglo de ADNc junto
con los controles apropiados. Típicamente,
el largo de los insertos será mayor a 500 bases, pero esto depende de los clones seleccionados.
Los productos de PCR son purificados y
luego depositados (o «impresos») en lugares precisos sobre una placa de vidrio o una
membrana de nylon. Los instrumentos usados para la producción de micromatrices han
mejorado en los últimos años. Las opciones
varían desde la construcción de un arreglo por
raspado hasta la compra del sistema completo.
Independientemente de cuál sea el origen de los clones, es esencial saber con seguridad la secuencia de cada sonda que está
siendo ubicada sobre la matriz para asegurar
una interpretación exacta de los datos resultantes. Por la tanto, puede ser necesario
secuenciar por duplicado todos o una porción de los fragmentos organizados (Fig. 5,
ver pág.8).
El ARNm que representa las muestras
experimentales se prepara para la hibridación
con las micromatrices de ADNc por transcripción reversa y marcado con nucleótidos
fluorescentes (Cye3 y Cye5 dUTP) o
radiactivos ([ 33 P] dCTP). Las moléculas
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Figura 3: Generación de una huella digital de ARN por
la técnica de ADNc-AFLP. El RNA mensajero se
transcribe en forma reversa utilizando un poliT como
cebador. Las hebras de ADNc se digieren con dos
enzimas de restricción, una de corte raro y otra de corte
frecuente. Se ligan adaptadores complementarios a
ambos extremos y se preamplifican por PCR los
fragmentos utilizando cebadores que reconocen la
secuencia de los adaptadores. Los fragmentos que
contienen adaptadores diferentes en los extremos son
amplificados preferentemente a causa de que en
general tienen un tamaño intermedio. Luego se realiza
una segunda amplificación utilizando cebadores
anclados con una o dos bases adicionales en el extremo
3´que amplifican una subpoblación de fragmentos. El
cebador correspondiente al adaptador para la enzima
de corte raro está marcado radiactivamente. La
combinación de diferentes cebadores anclados genera
perfiles provenientes de distintos subgrupos de
ARNms.
Figura 4: Procedimiento general para la obtención de etiquetas de secuencia SAGE. El ARN mensajero es
transcripto en forma reversa utilizando un poliT biotinilado como cebador. Luego es digerido con una enzima de
restricción ancla que reconoce sitios de 4 bases frecuentes en la secuencia de los mensajeros. Es probable que la
mayoría de los mensajeros sean digeridos por esta enzima en algún sector de su secuencia. Los extremos 3´de las
moléculas son recuperados por unión a esferas de estreptavidina. La muestra se divide en dos partes iguales que
se ligan alternativamente a dos adaptadores diferentes (A y B). A continuación son digeridas con una segunda
enzima de restricción (enzima de etiquetado) que reconoce un sitio dentro de la secuencia del adaptador pero
corta al transcripto unos 20 pares de base más abajo generando un extremo romo. Ambas muestras se mezclan,
se ligan y amplifican con dos oligonucleótidos A y B complementarios a los respectivos adaptadores. Los
amplicones se digieren nuevamente con la enzima ancla y los fragmentos se ligan como concatémeros y se
clonan. Este diagrama fue adaptado a partir del presentado por Velculescu et al. 1995.
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Figura 5: Expresión de genes controlada a través del uso de microarreglos de ADNc. Los clones amplificados por
PCR se imprimen sobre un soporte sólido. Las muestras a analizar se marcan con diferentes fluoróforos y se
hibridizan con la matriz. Un detector permite medir por separado la emisión de cada fluoróforo. La intensidad de
la señal de hibridización será proporcional al contenido de cada molécula particular de ARN en la muestra. Los
patrones de emisión de ambas muestras son comparados para detectar expresión diferencial.
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fluorescentes generalmente se usan para
marcar sondas con las que se hibridarán placas de vidrio, mientras que las radiactivas se
incorporan a sondas que se usarán sobre
membranas de nylon. Los fluoróforos Cye3 y
Cye5 presentan diferentes espectros de emisión, por lo tanto dos muestras experimentales pueden ser marcadas alternativamente con cada uno de ellos, hibridadas juntas
en una reacción única competitiva y luego
evaluadas en forma separada con un detector de fluorescencia. Por el contrario, las muestras radiactivas deben ser hibridadas individualmente en reacciones seriales y pueden
ser detectadas usando un sistema de
fosfoimágenes.
Independientemente del diseño experimental, el análisis de micromatrices se basa
en la premisa de que la intensidad de la señal de hibridación resultante para una secuencia es proporcional a la cantidad de ARNm
que corresponde a esa secuencia en la muestra original. La expresión relativa de cada secuencia representada en el microarreglo es
evaluada comparando las señales de intensidad de hibridación generadas por las diferentes muestras experimentales.
Cada experimento de micromatrices genera una gran cantidad de datos y es crítico
realizar un procesamiento apropiado de los
mismos. El análisis de la información obtenida puede ser dividido en tres componentes:
i) identificación y cuantificación de las intensidades de hibridación; ii) visualización de los
datos; iii) técnicas de agrupamiento.
El primer componente incluye la identificación exacta de los puntos de la imagen, la
normalización según el fondo, la cuantificación de las intensidades de hibridación y la
salida de los datos en una forma utilizable.
La visualización de los datos incluye su clasificación y presentación en una forma lógica y
su organización en diferentes formatos para
apuntar a la resolución de cuestiones múltiples. Finalmente, los algoritmos de agrupamiento permiten identificar conjuntos de
genes con patrones de expresión similar a
través de distintas muestras experimentales.
En base a la presunción de que la expresión
de los genes con funciones relacionadas están regulada en forma coordinada, el agrupamiento de datos de microarreglos se convierte en un método poderoso para asignar
posibles clasificaciones funcionales a genes
nuevos.
8 Conclusión
Los métodos descriptos en este capítulo
son tecnologías eficaces que expanden los
estudios de expresión desde los genes únicos hasta el nivel genómico. Ninguno de estos procedimientos per se es óptimo para
todas las aplicaciones y la mejor estrategia
para situaciones específicas puede ser crear
combinaciones de varios de ellos. El continuo
refinamiento de las técnicas genómicas y de
la bioinformática relacionada proporcionará
a los investigadores nuevas herramientas
para estudiar la expresión de la información
hereditaria y lograr un mejor entendimiento
sobre el control genético de los procesos fisiológicos.
9 Lecuras Recomendadas
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