METODO LOWRY PARA DETERMINAR PROTEINA (antes Rick, 1956) Preparación de las soluciones Solución prestock: Disuelve 4 g de NaOH + 30 g de Na2CO3. Afora con agua destilada a 1 L (guardar a temperatura ambiente). Tartrato de Sodio y Potasio 4% (wv): Disuelve 4g de KNaC4H4O6 . 4H2O y afora con agua destilada a 100ml (guardar en refrigerador). Sulfato cúprico 2% (wv): Disuelve 2g de CuSO2 y afora con agua destilada a 100ml (guardar a temperatura ambiente). Solución estandar: Albumina de suero bovino (BSA) 0.2 mg/ml. Disuelve 20 mg y afora a 100 ml con agua destilada.Dividir alicuotas y guardar en tubos pequeños en el congelador. Reactivo de Folins: Producto comercial METODO LOWRY PARA DETERMINAR DE PROTEINA (antes Rick, 1956) cont. Solución Lowry A: Mezcla 1 ml de solución de tartrato de NaK + 1 ml de solución CuSO2 afora con solución pre-stock a 100 ml. Nota: respeta el orden de adición de las soluciones para evitar formación de precipitados. La cantidad de nuestra a preparar es de acuerdo al número de muestras a procesar. Solución Lowry B: Diluir Reactivo Folin 1:1 con agua destilada. Calcular la cantidad a preparar según las muestras procesadas diarias. Esta solución se dura solo un día. Espectrofotómetro: Prender el espectrofotómetro 45min con anterioridad. Coloca los datos para lectura: Task/Quantification/Set-up WAVELENGTHS Use wavelength 660 nm Background correction none CALIBRATION Analytic name bsa Calibration curve type Lineal Off Set ENTER CONCENTRATION • Concentration ug Units Weigth & Volume Weigth_/_ Volume Units _Prompt for standard information _Prompt for standard information DATA TYPE DISPLAY SPECTRUM Absorbance From_nm To_nm Una vez incluido todos los datos presiona OK para que queden registrados. Preparación de la muestra: Cuenta y lava las larvas (mínimo 10) con agua destilada (almacenar a -20ºC o procesar inmediatamente) Homogeniza la muestra con tris buffer (500ml*2), en baño frío. Centrifugar a 12000rpm, 4ºC, 3 min Separar sobrenadante (975µl) Colocarlo en tubos eppendorf y almacenalos en congelación (-20ºC) o procesarlo. No almacenar por más de 6 meses. Esta muestra puede ser de la misma que se uso para determinar Tripsina. Leer por triplicado METODO LOWRY PARA DETERMINAR DE PROTEINA (antes Rick, 1956) cont. Curva estandar: Número tubo Vol (µl) BSA 0.2 mg/ml Vol (µl) agua dest. Vol (µl) Lowry A Vol (µl) Lowry B 1 0 250 1000 125 * 2 0 250 1000 125 * 3 25 225 1000 125 * 4 25 225 1000 125 * 5 50 200 1000 125 * 6 50 200 1000 125 * 7 75 175 1000 8 75 175 1000 9 100 150 1000 10 100 150 1000 125 * 11 125 125 1000 125 * 12 125 125 1000 125 * 13 150 100 1000 125 * 14 150 100 1000 125 * 15 175 75 1000 125 * 16 175 75 1000 125 * 17 200 50 1000 125 * 18 200 50 1000 125 * * Agitar y dejar reposar por 10 min 125 * 125 * 125 * Dejar un lapso de 30 seg* entre muestras µg proteína Al agregarle al último tubo se dejan reposar a completar 20 min* Ejm: con el estandar al agregar Soln B al último tubo el primero lleva 17 min, entonces solo reposará 3 min para leer el primer tubo. Leer las muestras cada 30 seg 0 0 5 5 10 10 15 15 20 20 25 25 30 30 35 35 40 40 Una vez leidas todas las muestras del estandar se escriben µg proteína en la columna de bsa (µg) y se presiona Calibrate. Si algun punto sale de la recta se puede eliminar. No se deben eliminar más de tres puntos. Show Coefficient muestra el comportamiento de la curva estandar: Calibration Results Summary _______________________________________ _______________________________________ Analytical Name bsa Coefficient k1 483.36000 Number of Standards 18 Std. Dev of k1 7.86500 Calibration Curve C=k0+(k1*A) Std. Dev of Calibrat 4.44680 Coefficient k0 -16.13300 µg Correl. Coeff. (Rˆ2) 0.99578 _______________________________________ _______________________________________ El valor de Correl. Coeff. (Rˆ2) debe acercarse lo más posible a 1 sin rebasarlo. Despues de esto se pueden correr las muestras Leer por triplicado METODO LOWRY PARA DETERMINAR DE PROTEINA (antes Rick, 1956) cont. Lectura de las muestras: Diluir 1:0.5 (muestra:buffer) para completar a 300 µl de muestra (sobrenadante). Para leer por triplicado. El proceso de preparación es igual que el de la curva estandar. El valor del blanco (buffer [tris base pH 8] con el cual se hizo la dilución arriba mencinada) se restará de las lecturas de las muestras para corregir los resultados. Solución Vol (µl) muestra Vol (µl) agua dest. Vol (µl) Lowry A Muestra sobrenadante 100 150 1000 Blanco buffer 100 250 1000 Agitar y dejar reposar por 10 min Vol (µl) Lowry B * 125 * 125 ** * Dejar un lapso de 30 seg* entre muestras. Al agregarle al último tubo se dejan reposar a completar 20 min*. Leer las muestras cada 30 seg. El software da directamente la cantidad de proteína en la alícuota medida. Para obtener la concentración en mg/ml hay que dividir la lectura entre la alícuota y multiplicar por el factor de dilución. Para salvar los valores: File/Print to file/Current View/nombre.txt Para imprimir: File/Print /Current View