TUMBACOPibaqueDARLIN.pdf

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
TESIS DE GRADO PREVIA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
INGENIERO AGRÓNOMO
TEMA:
ANDROGÉNESIS INDUCIDA, EN VARIAS POBLACIONES F1 DE ARROZ
(Oryza sativa L.) PARA GENERACIÓN DE PLANTAS DOBLE HAPLOIDES.
AUTOR:
DARLIN SAÚL TUMBACO PIBAQUE
DIRECTOR DE TESIS:
ING. AGR. RICARDO GUAMÁN JIMÉNEZ MSc.
GUAYAQUIL – ECUADOR
2015
UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
La presente tesis de grado titulada “ANDROGÉNESIS INDUCIDA, EN VARIAS
POBLACIONES F1 DE ARROZ (Oryza sativa L.) PARA GENERACIÓN DE
PLANTAS DOBLE HAPLOIDE”; realizada por el Egdo. Darlin Saúl Tumbaco
Pibaque, bajo la dirección del Ing. Agr. Ricardo Guamán Jiménez MSc; ha sido
aprobada y aceptada por el Tribunal de Sustentación, con la calificación de: 10 – 10 – 10
puntos, equivalentes a sobresaliente, como requisito previo para obtener el título de:
INGENIERO AGRÓNOMO
TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN
Ing. Agr. Leticia Vivas Vivas, MSc.
Ing. Agr. Eison Valdiviezo Freire, MSc.
Presidenta
Examinador Principal
Ing. Agr. Carlos Becilla Justillo, Mg. ed.
Examinadora Principal
Guayaquil, 12 de febrero de 2015
CERTIFICADO DE GRAMATOLOGÍA
Ing. Agr. Leticia Vivas Vivas, MSc., con domicilio ubicado en la ciudad de Guayaquil,
por el presente Certifico: Que he revisado la tesis de grado, elaborada por el señor
DARLIN SAÚL TUMBACO PIBAQUE, previa a la obtención del título de
INGENIERO AGRÓNOMO, cuyo tema es: “ANDROGÈNESIS INDUCIDA, EN
VARIAS POBLACIONES F1 DE ARROZ (Oryza sativa L.) PARA
GENERACIÓN DE PLANTAS DOBLE HAPLOIDES”.
La tesis de grado arriba señalada, ha sido escrita de acuerdo a las normas gramaticales y
de sintaxis vigentes de la Lengua Española.
ING. AGR. LETICIA VIVAS VIVAS, MSc.
C.C. No. 1304384546
Registro SENESCYT: 1009-02-211813
DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD
Darlin Saúl Tumbaco Pibaque
Declaro que:
La Tesis de Grado denominada “ANDROGÉNESIS INDUCIDA, EN VARIAS
POBLACIONES F1 DE ARROZ (Oryza sativa L.) PARA GENERACIÓN DE
PLANTAS DOBLE HAPLOIDES”,
ha
sido desarrollado
con
base
a una
investigación exhaustiva, respetando derechos intelectuales de terceros, conforme las
citas que constan al pie de las páginas correspondientes, cuyas fuentes se incorporan
en la bibliografía. Consecuentemente este trabajo es de mi autoría.
En virtud de esta declaración, me responsabilizo del contenido, veracidad y
alcance científico del proyecto de grado en mención.
Guayaquil, Febrero de 2015
Darlin Saúl Tumbaco Pibaque
092192915-4
AUTORIZACIÓN
Yo, Darlin Saúl Tumbaco Pibaque autorizo a la Universidad de Guayaquil, la
publicación, en la biblioteca virtual de la Institución de la tesis de grado titulada
“ANDROGÉNESIS INDUCIDA, EN VARIAS POBLACIONES F1 DE ARROZ
(Oryza sativa L.) PARA GENERACIÓN DE PLANTAS DOBLE HAPLOIDES”, cuyo
contenido, ideas y criterios son de exclusiva responsabilidad y autoría.
Guayaquil, Febrero de 2015
Darlin Saul Tumbaco Pibaque
092192915 -4
DEDICATORIA
Este trabajo representa para mí un esfuerzo de superación tanto en mi vida
profesional como personal y está dedicado a mi Dios quien supo guiarme por el buen
camino, darme fuerza para seguir adelante y no desmayar en los problemas que se
presentaron sin perder nunca la dignidad ni desfallecer en el intento.
A mis padres, quienes a lo largo de mi vida han velado por mi bienestar y
educación siendo mi apoyo en todo momento. A Jasmile mi esposa, a pesar de nuestra
distancia física, siento que está conmigo cuidándome desde el cielo siempre y aunque
nos faltaron muchas cosas por vivir, sé que este momento hubiera sido tan especial
como lo es para mí. Ahora puedo decir que esta tesis lleva mucho de ella.
Y en especial a mi querida hija zharickcita mi mayor motivación, inspiración,
felicidad, corazón y la razón para seguir luchando.
“Cada persona que pasa por nuestra vida es única. Siempre deja un poco
de sí y se lleva un poco de nosotros.”
AGRADECIMIENTO
Con fiel e infinito agradecimiento a mi Dios por bendecirme para llegar hasta donde
he llegado, porque hizo realidad este sueño anhelado.
Una gratitud sincera a la Universidad de Guayaquil, Facultad de Ciencias
Agrarias, al Decano y Sub Decano, docentes en especial y reconocimiento a un gran
guía y excelente persona como en vida fue el Ing. Agr. Francisco Andrade España MSc.
(+) gestor e idealista del proyecto, al Ing. Ricardo Guamán Jiménez MSc., catedrático y
director de la presente tesis de la Universidad de Guayaquil; por su tiempo,
colaboración y conocimientos compartidos. Personal administrativo y de servicios
quienes de una u otra forma cooperaron en la formación profesional del ejecutante.
Al Laboratorio de Biotecnología - Programa de arroz
Experimental
del
Litoral
Sur EELS,
del
Instituto
de la Estación
Nacional Autónomo de
Investigaciones Agropecuarias INIAP. Agradecimientos especiales Ing. Agr. M,Sc.
Leticia Vivas Vivas, al Ing. Agr. M.Sc. PhD. Walter Oswaldo Reyes Borja,
Responsable del Laboratorio de Biotecnología, Ing. Agr. María Eugenia Romero R,
Ing. Agr. Lenin Arana Vera. Quienes facilitaron y depositaron su confianza para
poder ejecutar la presente investigación; por su apoyo, consejos, motivación y ayuda
profesional.
A mi pequeña familia formada en el Laboratorio. Egdos. Jesús Cárdenas y Alex
Valarezo, don Jesús Farías, señora Mónica por brindarme su apoyo. A todos mis
amigos, y compañeros de salón de clases, Juan S. Quintero, Junior Villafuerte, Jhon
Riascos y a mi gran amigo Juan Carlos Macías ya que sin él y el equipo que formamos
no hubiéramos logrado esta meta. Personal Técnico y Administrativo de la EELS INIAP que indirectamente ayudaron para la culminación de la Tesis.
Y, gratitud infinita a mis padres Saúl Tumbaco y Neyda Pibaque, Marisol Martinez y mi
querida hija Zharick por saberme esperar en momentos que no pude pasar con ellos por
motivos de superación, mis hermanos, por su apoyo incondicional, consideración y
amor.
Las
investigaciones,
conclusiones
presente
y
trabajo,
resultados,
recomendaciones
son
de
del
exclusiva
responsabilidad del autor.
Darlin Saúl Tumbaco Pibaque
[email protected]
REPOSITORIO NACIONAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
FICHA DE REGISTRO DE TESIS
TÍTULO: “ANDROGÉNESIS INDUCIDA, EN VARIAS POBLACIONES F1 DE ARROZ (Oryza
sativa L.) PARA GENERACION DE PLANTAS DOBLE HAPLOIDES”
AUTOR:
TUTOR:
Ing. Ricardo Guamán Jiménez, MSc.
REVISORES:
DARLIN SAÚL TUMBACO PIBAQUE
Ing. Leticia Vivas Vivas, MSc.
Ing. Eison Valdiviezo Freire, MSc.
Ing. Carlos Becilla Justillo, Mg. Ed.
INSTITUCIÓN: Universidad de Guayaquil
FACULTAD: Ciencias Agrarias
CARRERA: Ingeniería Agronómica
FECHA DE PUBLICACIÓN:
No. DE PÁGS:
TÍTULO OBTENIDO: Ingeniero Agrónomo
ÁREAS TEMÁTICAS: Agricultura, Biotecnología, Mejoramiento genético.
PALABRAS CLAVE: Androgénesis, Cultivo de anteras, Generación de plantas doble haploides,
mejoramiento genético.
RESUMEN:
La presente investigación tuvo como objetivo la obtención de plantas doble haploides homocigóticas
de arroz a partir de 12 generaciones F1 provenientes de cruzamientos simples. Las actividades
realizadas fueron siembras de anteras en los medios de inducción de callos MS. En este medio se
desarrollaron microcallos que luego fueron transferidos cuando median 2mm aproximadamente a un
medio de regeneración de plantas, observando que comenzaron a desarrollar cloroplastos y
pigmentación verde iniciando sus estructuras más organizadas como embriones, raíces y brotes;
llegando a inducir a la androgénesis y obtener plantas doble haploides determinadas por citometría de
flujo a partir del contenido de ADN de las plantas regeneradas. En potencial callogenico la mejor
respuesta se encontró en los tratamientos INIAP 12 x GO 38063 (372 callos); INIAP 14 x INIAP 12
(415 callos); F 50 x GO 3840 (581 callos). Demostrando que estos cruces tienen una gran capacidad
para producir callos. Sin embargo, la mejor respuesta androgénica para regeneración de plantas
pertenece al cruce GO 38404 x INIAP 16. Logrando regenerar un total de cinco plantas las cuales se
les determino su ploidía por citometro de flujo descubriendo que 2 plántulas eran doble haploides y 3
plántulas haploides. En regeneración de plantas verdes se obtuvo buena respuesta en los tratamiento
INIAP 12 x JAPÓN (DH); INIAP 14 x INIAP 12 (TP), (TP); INIAP 16 x GO38063 (DH), (DH), (DH),
(TP); GO38404 x INIAP 16 (DH), (DH), (H), (H), (H); JAPÓN x INIAP 16 (H), logrando aclimatarse y
adaptarse en el vivero. Las plántulas albinas permanecieron en el laboratorio debido a que en las
pruebas preliminares de aclimatación realizadas no se adaptaron al cambio y fenecieron.
No. DE REGISTRO (en base de datos):
DIRECCIÓN URL (tesis en la web):
ADJUNTO PDF:
CONTACTO CON AUTOR:
Darlin Saúl Tumbaco Pibaque
CONTACTO EN LA INSTITUCIÓN:
Ciudadela Universitaria “Dr. Salvador
Allende” Av. Delta s/n y Av. Kennedy
Guayaquil-Ecuador
No. DE CLASIFICACIÓN:
x SI
NO
Teléfono:
Email:
0994309425 [email protected]
Nombre: Abg. Isabel Zambrano
Teléfono: (03)2848487 Ext. 123
E-mail: www.ug.edu.ec/facultades/cienciasagrarias
ÍNDICE DE CONTENIDOS
I. INTRODUCCIÓN ----------------------------------------------------------------------------- 1
Objetivos. ------------------------------------------------------------------------------------- 3
II. REVISIÓN DE LITERATURA ------------------------------------------------------------ 4
2.1. Descripción del cultivo. ------------------------------------------------------------------- 4
2.1.1. Morfología de la inflorescencia del arroz. ------------------------------------- 4
2.1.2. La antera. ---------------------------------------------------------------------------- 4
2.2. Mejoramiento genético Vegetal. --------------------------------------------------------- 5
2.2.1. Mejoramiento genético en el cultivo de arroz. ------------------------------- 5
2.2.2. Hibridación. ------------------------------------------------------------------------- 6
2.2.3. Métodos de hibridación. ---------------------------------------------------------- 7
2.3. Cultivo in vitro de anteras de arroz. ----------------------------------------------------- 7
2.4. El cultivo de anteras aplicado al fitomejoramiento. ---------------------------------- 8
2.4.1. Ventajas. ----------------------------------------------------------------------------- 9
2.4.2. Desventajas. ----------------------------------------------------------------------- 11
2.4.3. Eficiencia de la técnica. --------------------------------------------------------- 12
2.4.4. Determinación de niveles de ploidía de plantas regeneradas. ----------- 14
III. MATERIALES Y MÉTODOS ---------------------------------------------------------- 15
3.1. Ubicación del ensayo. -------------------------------------------------------------------- 15
3.2. Descripción de la ubicación geográfica. ---------------------------------------------- 15
3.3. Material, equipo de laboratorio y reactivos.------------------------------------------ 15
3.4. Tratamientos estudiados. ---------------------------------------------------------------- 16
3.5. Características de los progenitores utilizados. -------------------------------------- 17
3.7. Manejo del ensayo. ---------------------------------------------------------------------------18
3.7.1. Colecta de macollas donantes para la siembra del cultivo de antera. - 18
3.7.2. Esterilización superficial de las panículas. ---------------------------------- 18
3.7.3. Separación, selección y desinfección de flores. ---------------------------- 19
3.7.4. Formulación de los medios de cultivos MS (MURASHIGE & SKOOG)
para inducción de callos – regeneración de plantas. -------------------------------- 20
ix
3.7.5. Inducción de callos: Aislamiento y siembra de las anteras en medio de
cultivo. ------------------------------------------------------------------------------------- 21
3.7.6. Regeneración de plantas: Transferencia de callos al medio RP.
regeneración de plantas----------------------------------------------------------------- 22
3.7.7. Aclimatación de plántulas regeneradas (laboratorio – vivero). --------- 23
3.7.8. Determinación de niveles de ploidía en plántulas regeneradas por
citometría de flujo. ---------------------------------------------------------------------- 24
3.8. Análisis estadístico. ----------------------------------------------------------------------- 25
3.9. Variables registradas. --------------------------------------------------------------------- 26
3.9.1. Potencial Callogénico (%). ----------------------------------------------------- 26
3.9.2. Diferenciación de órganos (%). ----------------------------------------------- 26
3.9.3. Potencial de Regeneración (%). ----------------------------------------------- 26
3.9.4. Aclimatación de plantas (%). -------------------------------------------------- 26
3.9.5. Plántulas albinas (%). ----------------------------------------------------------- 26
3.9.6. Nivel de ploidía en plántulas aclimatadas. ---------------------------------- 27
3.9.7. Relación panícula / microsporas. ---------------------------------------------- 27
3.9.8. Callos por tratamiento en frío. ------------------------------------------------- 28
3.9.9. Callos a partir de condiciones ambientales (cuarto oscuro). ------------- 28
3.9.10. Crecimiento de callos en los medios de inducción líquido y sólido. -- 29
IV. RESULTADOS Y DISCUSION. ------------------------------------------------------- 30
4.1. Potencial Callogénico (%).-----------------------------------------------------------------30
4.2. Diferenciación de órganos (%).------------------------------------------------------------32
4.3. Potencial de Regeneración (%). -----------------------------------------------------------34
4.4. Aclimatación de plantas (%). -------------------------------------------------------------- 35
4.5. Plántulas albinas (%). ------------------------------------------------------------------------36
4.6. Nivel de ploidía en plántulas aclimatadas. ----------------------------------------------39
4.7. Relación panícula / microsporas. ----------------------------------------------------------40
4.8. Callos por tratamiento en frío -------------------------------------------------------------- 41
4.9. Callos por condiciones ambientales (cuarto oscuro). -------------------------------- 42
x
V. CONCLUSIONES -------------------------------------------------------------------------- 45
VI. RECOMENDACIONES. ----------------------------------------------------------------- 46
RESUMEN --------------------------------------------------------------------------------------- 47
SUMMARY -------------------------------------------------------------------------------------- 49
LITERATURA CITADA --------------------------------------------------------------------- 51
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.
Selección y colecta de panículas F1 donantes de anteras:
condición óptima para la siembra (A); eliminación de hojas para
evitar deshidratación (B); etiquetado y mantenimiento delas
macollas colectadas en el tubo de papel prensado (C). EELS/UG,
2014.
18
Figura 2.
Esterilización de la panícula con etanol 70 % (A) Panículas listas
para proceder a retirar la flor (B). EELS/UG, 2014.
19
Figura 3.
Separación, selección y desinfección de flores para cultivo de
anteras; extracción de panícula de la vaina, tomándose de la base
de forma invertida (A); selección de las flores óptimas y
eliminación con tijeras de las no deseadas (B); materiales
utilizados para el protocolo de desinfección (C); Sellado del frasco
con las muestras (D). EELS/UG, 2014.
20
Figura 4. Formulación de los medios de cultivos MS. Soluciones
concentradas (macronutrientes – micronutrientes), vitaminas y
hormonas (A); Medición del pH en el medio de cultivo (B);
dispensado el medio de cultivo en envases de plástico (C).
EELS/UG, 2014.
21
Figura 5.
Corte de las flores por su base para inducción de callos (A);
siembra de la antera con la pinza mediante golpes continuos en el
borde interior del envase (B); incubación de anteras en la
oscuridad (C). EELS/UG, 2014.
22
Figura 6. Transferencia de los callos al medio sólido para regeneración de
plantas (A); estantería con luces fotoperiodo (B); plántulas
regeneradas con diferenciación de órganos a partir de los
callos(C). EELS/UG, 2014.
23
Figura 7.
Aclimatación de plántulas regeneradas: Plántulas regeneradas en
laboratorio con desarrollo foliar y radicular (A); Plántulas lista
para su respectiva aclimatación (B); plántulas aclimatadas y
sembradas en el fango para cumplir con su ciclo de desarrollo (C).
EELS/UG, 2014.
23
Figura 8.
Determinación de niveles de ploidía en plántulas regeneradas por
citometría de flujo; colecta de las muestras, rotulado y transporte
del material (A); muestra lista para el proceso de extracción de
núcleos (B);
muestra de ADN filtrándose (C); muestra
procesándose para el análisis de ploidía por el citómetro de flujo
(D). ). EELS/U, 2014.
25
xii
Porcentaje del potencial callogénico determinadas en 12
poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014.
32
Figura 10. Porcentaje de diferenciación de órganos determinadas en 12
poblaciones F1 de arroz. EELS.UG, 2014.
33
Figura 11. Porcentaje de regeneración de plántulas verdes (PV) y albinas
(PA), determinadas en 12 poblaciones F1 de arroz. EELS.UG,
2014.
35
Figura 12 Porcentaje de regeneración de plántulas verdes aclimatadas,
determinadas en 12 poblaciones F1 de arroz. EELS.UG, 2014
36
Figura 13. Porcentaje de regeneración de plántulas albinas, determinadas en
12 poblaciones F1 de arroz. EELS.UG, 2014.
38
Figura 14. Respuesta de los doce cruces de arroz a las diferentes fases del
38
Figura 9.
Cultivo de Anteras (CA) EELS.UG, 2014.
Figura 15. Comparación visual del análisis de citometría de flujo con
respuestas a las diferentes ploidía presentadas; Haploide (A) Doble
haploide (B) Triple haploide (C). EELS/UG, 2014.
40
Figura 16. Relación panículas/ microsporas; Observación de la distancia de
funciónpanículas
del mediocolectadas
de cultivoprevio a la selección de las flores o
cuatro
Muerte
de
callos:
con necrosis
parcial
a los
glumas (A). Color Callo
y consistencia
de las
glumas
de 30
lasdías
cuatro
en medio colectadas
de regeneración
(A); callodecon
totaldentro
a los de
panículas
(B); desarrollo
las necrosis
microsporas
60
en (C);
medio
de regeneración
las días
anteras
estado
uninucleado(B)
medio de las microsporas (D);
uninucleado tardío de las microsporas (E). EELS/UG, 2014.
41
Figura 17 Callos por tratamiento en frío: flores expuestas a un pre
tratamiento en frío (A); Callos obtenidos del tratamiento en frío
(B). EELS/UG, 2014.
42
Figura 18. Análisis de respuesta del cruce INIAP 16 x GO3806 al uso de dos
temperaturas en la fase de inducción (Cuadro) - Callos por
condiciones ambientales: formación de callos blancos disgregables
recomendables para transferir los en el medio de de regeneración
de plantas (A); desarrollo de callos de color cafés y friables (B).
EELS/UG, 2014.
Figura 19. Crecimiento de los callos en los medios líquido y sólido ; Callos
regeneración de plantas (A); desarrollo de callos de color caf
pequeños en medio líquido listo para ser dispensado en los medios
és y friables (B). EELS/UG, 2014.
sólidos (A) desarrollo de los callos pequeños en el medio sólido
(B) callos disgregándose formando cuerpos amorfos.(C);
Crecimiento parcial listo para poder ser transferido en el medio de
regeneración de plantas (B). EELS/UG, 2014.
43
xiii
44
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1.
Materiales utilizados en el cultivo de anteras en arroz. EELS/UG,
2014.
Equipo de laboratorio utilizado para el cultivo de anteras en arroz.
EELS/UG, 2014.
Reactivos utilizados para el cultivo de anteras de arroz. EELS/UG,
2014.
15
Cuadro 4.
Población F1 proveniente de varios cruces. EELS/UG, 2014.
17
Cuadro 5.
Características de los progenitores utilizados para cruzamientos
simples. EELS/UG, 2014.
17
Cuadro 6.
Niveles de ploidía posibles en arroz. EELS/UG, 2014.
27
Cuadro 7.
Valores de anteras sembradas en medio de inducción de callos,
números de callos obtenidos y potencial callogénico determinadas
en 12 poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014
31
Valores de callos sembrados y diferenciación de órganos vegetales,
determinadas en 12 poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014
Cuadro 9. Valores de regeneración de plántulas
verdes y albinas,
determinadas en 12 poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014.
Cuadro 10. Valores de regeneración de plántulas
verdes aclimatadas,
determinadas en 12 poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014
Cuadro 11. Valores de regeneración de plántulas albinas, determinadas en 12
poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014.
Cuadro 12. Análisis de niveles de ploidía determinadas en las plántulas
regeneradas. EELS/UG, 2014.
33
Cuadro 2.
Cuadro 3.
Cuadro 8.
16
16
34
36
37
39
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1.
Anexo 2.
Anexo 3.
Anexo 4.
Anexo 5.
Niveles de ploidía descubiertos por citometría de flujo marca
(PARTEC) en plántulas regeneradas obtenidas por Cultivo de
anteras. EELS/UG, 2014.
Preparación de soluciones stocks y medio de cultivo M1, para la
inducción de callos. (Fuente: CIAT/2012)
Preparación de soluciones stocks y medio de cultivo L1, para la
inducción de callos. (Fuente: CIAT/2012)
Preparación de soluciones stocks y medio de cultivo MS, para
regeneración de plantas RP. (Fuente: CIAT/2012).
Proceso de formación de plantas bajo condiciones in vitro:
Diferenciación de órganos vegetales (A); Regeneración de plantas
(B); Aclimatación de plantas (C). EELS/UG, 2014.
xiv
58
95
61
63
65
I. INTRODUCCIÓN
El cultivo de arroz (Oryza sativa L.), comenzó hace aproximadamente 10.000
años, en muchas regiones húmedas de Asia tropical y subtropical. Es considerado como
uno de los principales cereales a nivel mundial debido a su importancia económica y
alimentaria (Sica, 2003).
En Ecuador la producción de arroz depende de las estaciones climáticas, las zonas
de cultivo y grado tecnificación. Debido a las características climatológicas la
producción se divide en dos ciclos: época lluviosa (secano) y época seca (riego)
(MAGAP, 2012). La superficie cosechada en el 2012 fue aproximadamente de 371,170
ha con una producción de 1,565.535 TM/ha (INEC, 2014).
El grano de arroz está conformado por tres componentes básicos: almidón,
proteínas y lípidos que constituyen el 98,5% de la materia seca (Academic Publishers.
Norwell MA., USA; 1999). El 49 % de las calorías consumidas por la población
mundial es aportado por el arroz que es la primera fuente de alimentación para más de
un tercio de la población mundial (FAO, 2013) .
El arroz es un producto que constituye la base de la dieta en Ecuador. Sus
componentes principales son los hidratos de carbono y el 7% de proteínas, es
importante en la nutrición, ya que esta gramínea es la que mayor aporte de calorías
brinda de todos los cereales. Un ecuatoriano consume en promedio 53,2 kilogramos de
arroz al año, según cifras del Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca
(MAGAP, 2013).
En Ecuador, el mejoramiento genético en arroz luego de las hibridaciones se
utiliza la selección por el método de pedigrí para la obtención de nuevas variedades;
este método tiene la desventaja de ser muy tardío y presentar una expresión recesiva de
las características agronómicas de las cruzas, aunque permite más oportunidades que
cualquier otro método para evaluar los resultados del cruzamiento si el mejorador
conoce bien el cultivo y es lo suficientemente habilidoso para estimar el
comportamiento en campo de cada planta en particular (Arana, Celi y Reyes, 2012).
1
Por otra parte, el cultivo de anteras es una técnica para la producción de plantas
haploides, diploides y triploides. Las anteras inmaduras (n) que contienen polen en una
etapa específica de desarrollo se colocan en medios de cultivos donde este polen
inmaduro se divide mitóticamente para formar embriones o callos, que transferidos a
medios de generación, se da la conversión en plantas completas. En la mayoría de los
casos se producen plantas haploides estériles, pero en algunas especies, como el arroz,
ocurre una duplicación espontánea de los cromosomas en las etapas del desarrollo del
callo y posterior regeneración de la planta (Arana, Celi y Reyes, 2012). Esta técnica
permite aislar homocigotos de interés agronómico y fijar características deseables en
tiempos más cortos, ahorrando tiempo y dinero en el proceso de mejoramiento genético
(Franquet, 2006).
Entre las técnicas actualmente utilizadas para determinar el grado de ploidía
destacan la citometría de flujo (CMF) y la citogenética. La CMF permite cuantificar los
componentes celulares tales como ácidos nucléicos, lípidos, proteínas, polisacáridos,
entre otros. Mientras que la citogenética se define como una rama de la genética a nivel
celular, dedicada al estudio del número y la morfología de los cromosomas (Velásquez
et al., 2005).
La constante evolución agrícola y la alta demanda de alimentos con aporte
nutricional por parte de la población, conduce a la búsqueda de alternativas de
investigación e integración de las metodologías, como es: el mejoramiento genético
tradicional, el cultivo de anteras, la caracterización bioquímica y molecular, entre otras.
En el caso del arroz, el cultivo de anteras es una herramienta de gran utilidad en el
proceso de mejoramiento genético, lo cual permite acortar el tiempo demandado para la
fijación de caracteres de interés agronómico generando variedades diferenciadas, con el
propósito de contribuir en el proceso de mejoramiento genético del cultivo del arroz,
durante la presente investigación se realizaron actividades de cultivo de tejidos y
análisis de ploidía en 12 poblaciones F1 provenientes de cruzamientos simples.
Por lo señalado anteriormente los objetivos del presente trabajo fueron los
siguientes:
2
Objetivo general:
Obtener plantas homocigóticas de arroz, mediante el cultivo in vitro de anteras a
partir de 12 poblaciones F1.
Objetivos específicos:
 Obtener microcallos de arroz a partir del cultivo in vitro de anteras en 12
poblaciones F1.
 Regenerar plántulas de arroz a partir de los microcallos obtenidos en el cultivo
in vitro de anteras.
 Determinar niveles de ploidía por citómetro de flujo y seleccionar plantas doble
haploides homocigóticas de arroz.
3
II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1.
Descripción del cultivo
El arroz es una monocotiledónea de la familia de gramináceas. Las raíces son
delgadas, fibrosas, fasciculadas. El tallo erguido, cilíndrico, nudoso, glabro (lisobrillante), de 60 – 120 cm. Hojas alternas envainadoras, limbo lineal, agudo, largo,
plano. Flores de color verde blanquecino dispuestas en espiguillas cuyo conjunto
constituyen una panoja grande, terminal, estrecha, colgante después de la floración.
Cada espiguilla es uniflora y esta provista de una gluma con dos valvas pequeñas, algo
cóncavas, aquilladas y lisas; la glumilla tiene igualmente dos valvas aquilladas. El fruto
es una cariópside (Universidad Católica de Temuco, 2002).
2.1.1. Morfología de la inflorescencia del arroz
La inflorescencia del arroz es una panícula compuesta de unidades florales
denominadas espiguillas. La espiguilla consta de raquillas, dos lemas estériles y la flor.
La raquilla es el eje que sostiene la flor y a las lemas estériles o glumas rudimentarias,
son las brácteas alargadas del pedicelo que envuelven la flor por debajo de la raquilla
(Lentini, 1997).
Lentini (1997), indica que en la base de la flor se encuentran dos lodículas,
protuberancias redondeadas y transparentes responsables de la apertura floral. Durante
la antesis, las lodículas se ponen turgentes logrando que la lema y la palea se separen;
simultáneamente, los estambres se alargan y las anteras emergen. La dehiscencia de las
anteras se puede efectuar antes de que se abran las glumas, o al mismo tiempo, con una
tendencia a la cleistogamia.
2.1.2. La antera
Gonzales (2013), menciona que los estambres son antófilos compuestos por
filamento y antera. Cada antera está formada por dos tecas, cada una con dos sacos
polínicos, o sea que cada antera tiene cuatro sacos polínicos o microsporangios.
4
Al hacer un corte transversal en la antera joven se aprecia un tejido conectivo,
por donde se conecta el filamento y cuatro cavidades denominadas sacos polínicos; dos
anteriores y dos posteriores. Cuando ya se han formado los granos de polen, los sacos
anteriores hace una sola cavidad con el respectivo saco posterior, de manera que la
antera queda compuesta por solo dos cavidades, denominadas tecas. La zona más
importante de la estructura de las anteras es el arqueosporio, parte interna de los sacos
polínicos, en donde se forman los granos de polen a partir de las células madres. El
arqueosporio está recubierto con un tejido glandular; conocido como el tapete, que
produce
enzimas,
nutrimentos
y
materiales
estructurales
críticos
para
la
microsporogenesis (Lentini, 1997).
2.2.
Mejoramiento genético Vegetal
El mejoramiento genético puede definirse como la modificación de materiales
genéticos con fines productivos. Esta modificación se basa en la identificación y
explotación de las diferencias genéticas entre los individuos en los rasgos de interés,
incrementando la frecuencia de aquellos individuos deseables para su posterior
masificación. Para que cumplan estos fines es necesario definir básicamente tres
elementos: La estrategia de mejoramiento, esto es, la declaración de los pasos a seguir
para alcanzar el progreso genético esperado; los rasgos objetivos de selección y el
conjunto de ensayos y técnicas estadísticas para predecir el valor genético de cada
individuo (Torres, 2002).
2.2.1. Mejoramiento genético en el cultivo de arroz
Según CIAT (1981), los métodos de mejoramiento genético en arroz comprende
la selección masal, mejoramiento por retrocruzamiento y mejoramiento genealógico o
por pedigrí.
Los métodos convencionales para el mejoramiento de los cultivos han
contribuido considerablemente al mejoramiento de las cosechas de las variedades
cultivadas. Tecnologías de avanzada para complementar las técnicas de mejoramiento
convencional pueden ser empleadas para superar con los incrementos las demandas de
5
producción de altos rendimientos, alto contenido de proteínas y arroces resistentes a
diferentes estreses bióticos y abióticos (Sasson, 1985).
Poehlman y Allen (2003), mencionan que los métodos geotécnicos para mejorar
el arroz son similares a los que se utilizan para mejorar
trigo y otros cultivos
autógamos: 1) introducción basada en colecciones de recursos genéticos, 2) selección,
3) hibridación, 4) obtención de variedades híbridas F1. El mejoramiento genético por
mutación ha contribuido con genes mutantes que determinan caracteres específicos
como baja altura, precocidad y endospermo con cera.
Pérez (2006), afirma que el crecimiento de la producción de arroz ha dependido,
casi exclusivamente, de los métodos tradicionales de mejoramiento; sin embargo, los
avances logrados en la biotecnología representan nuevas herramientas de investigación,
con las cuales el fitomejorador podrá desarrollar mejores variedades que aseguran una
alta y estable producción. El cultivo de células y tejidos haploides garantiza la
homocigosis en una sola generación y por ende reduce considerablemente el ciclo de
mejora. Esto se puede lograr mediante el cultivo de anteras.
Los programas de mejora genética se basan en la producción de plantas de arroz
haploides, mediante el cultivo de anteras de plantas obtenidas a partir de cruzamientos
previos. El empleo de líneas haploides incrementa la eficiencia de selección de
caracteres de orígen poligénico y facilita la detección de mutaciones recesivas. El
cultivo in vitro continuado de líneas de cultivo de anteras origina variaciones génicas,
en este caso denominadas gametoclonales, que han dado lugar a nuevas variedades de
arroz (Bernis, 2004).
2.2.2. Hibridación
Poehlman y Allen (2003), señalan las técnicas de hibridación en plantas, la
autopolinización y el cruzamiento son procedimientos básicos en el mejoramiento
genético de las plantas cultivadas. Los procedimientos exactos utilizados dependerán de
la especie cultivada, la estructura de los órganos florales y el mecanismo normal de la
polinización.
6
Según Suárez (2006), el objetivo de la hibridación en especies de
autopolinización como el arroz, es combinar en un genotipo los caracteres deseados que
se encuentran en dos o más genotipos. Los mejoradores siempre esperan obtener
genotipos que sean superiores a los padres. La selección de los progenitores es un punto
crítico ya que determina el potencial del programa de mejoramiento. Usualmente uno de
los padres es seleccionado por su comportamiento y aprobado en el área o para las
condiciones en que se cultivará; el otro padre (s) generalmente tiene algunos atributos
que no posee o no expresa el primer progenitor. Según el CIAT (1981), las
hibridaciones en arroz pueden ser mediante cruzamiento simple, cruzamiento triple
(topcross) y cruzamiento doble.
2.2.3. Métodos de hibridación
Existen muchos métodos de mejoramiento genético y cada uno de ellos tiene sus
puntos fuertes y puntos flojos. El método de mejoramiento a elegir dependerá de la
naturaleza del carácter o caracteres de interés, el modo de herencia y la variabilidad
presente o disponible. En algunos casos los factores económicos influyen en el método
seleccionado (Suárez, 2006).
La utilización del sistema propuesto para producir arroz hibrido implica obtener
y mantener líneas A con androesterilidad citoplásmica y sus líneas B mantenedora,
obtener y mantener líneas restauradores de la fertilidad y cruzar las líneas A x las líneas
R para producir semilla hibrida comercial (Poehlman y Allen, 2003).
2.3.
Cultivo in vitro de anteras de arroz
Noguera (2005), menciona que esta técnica biotecnológica ofrece a los
programas de mejoramiento genético la posibilidad de desarrollar la metodología
dirigidas a reducir el tiempo necesario para la obtención de un cultivar o hibrido, siendo
el cultivo de anteras una herramienta de gran utilidad en el mejoramiento genético. Esta
técnica permite la producción de plantas haploides y doble haploides, las cuales son
utilizadas para la generación de líneas homocigotas, permitiendo acortar el tiempo
demandado para la fijación de caracteres de interés agronómicos y la optimización de
7
recursos económicos, con la ventaja adicional de permitir incrementar la variabilidad de
un cultivo de estrecha base genética.
Desde el punto de vista técnico, esto consiste en colocar las anteras, que son las
que contienen los granos de polen inmaduros, mantenido en un ambiente estéril y
proveer al material de un medio nutricional y de regímenes de temperatura, luz, entre
otros apropiados para el crecimiento y desarrollo del tejido (Lentini et al., 1997).
Mientras que CIAT (1991), menciona que mediante esta técnica, las anteras
inmaduras que contienen polen en una etapa específica de desarrollo se colocan en
medio donde el polen inmaduro se divide para formar embriones o callos. Transferidos
estos a medios de regeneración, se forman plantas. En la mayoría de los casos se
producen plantas haploides estériles, pero en algunas especies ocurre una duplicación
espontanea de los cromosomas en las etapas de desarrollo del callo y de regeneración de
la planta.
El método de embriogénesis de la microsporas o androgénesis se basa en la
capacidad que tienen las microsporas (espora masculina que se divide por mitosis para
producir un grano de polen, gameto masculino), de cambiar su patrón de desarrollo de
la vía gametofítica a la vía esporofítica, para dar lugar a un embrión. Esto se logra
mediante el cultivo de anteras o de microsporas aisladas (Maluszynski et al., 2003).
2.4.
El cultivo de anteras aplicado al fitomejoramiento
CATIE (1991), indica que normalmente en la producción de haploides se trabaja
con la antera en su totalidad, no con granos de polen en particular. De una yema de flor
se coge una antera antes de que se abra y se hace un cultivo; bien por embriogénesis u
organogénesis. La embriogénesis forma células (poliembriones) y la organogénesis
forma una estructura de callo que puede venir o bien de tejidos de la antera (diploide) o
bien del grano de polen (haploide).
CATIE (1991) indica que mediante esta técnica, las anteras inmaduras que
contienen polen en una etapa específica de desarrollo se colocan en medios donde el
polen inmaduro se divide para formar embriones o callos. Transferidos estos a medios
8
de regeneración, se forman plantas. En la mayoría de los casos se producen plantas
haploides estériles, pero en algunas especies ocurre una duplicación espontanea de los
cromosomas en las etapas de desarrollo del callo y regeneración de la planta.
El potencial que posee el cultivo de anteras surge de la constitución genética de
las células del polen. Las células del polen de los híbridos F1 contienen la dotación
genética de las plantas paternas y las recombinaciones esperadas según las proporciones
mendelianas. Estas células son haploides y permiten por ello al mejorador seleccionar
eficazmente los recombinantes deseables; además, una vez duplicadas esas células, se
establecen rápidamente líneas homocigóticas. Alcanzar rápidamente homocigocidad
constituye una de las aplicaciones más importantes del cultivo de anteras en el
desarrollo de variedades nuevas porque, gracias a él, el tiempo, el espacio y los costos
necesarios para desarrollar las líneas “verdaderamente mejoradas” disminuirían
considerablemente. Las líneas homocigóticas (R2) manifestarán la variabilidad
inherente a la generación (F2), añadiendo una ventaja en cada individuo, debido a que
habrá fijado su genotipo y no sufrirá segregación adicional. Dado que en los haploides
duplicados no hay dominancia; es decir, el fenotipo equivale al genotipo; la eficiencia
de la selección aumenta cuando el mejoramiento se vale del cultivo de anteras (CIAT,
1991).
2.4.1. Ventajas
El cultivo de anteras ha demostrado ser una técnica útil para acelerar la
introgresión (movimiento de genes) de características deseables en poblaciones de
mejoramiento (Lentini, 1994). La haploidía acelera notablemente los programas de
selección después del cruzamiento (Bouharmont, 1989).
Lentini et al., (1997), mencionan que el cultivo de anteras mejora la eficiencia
de la selección, en comparación con la selección en las generaciones tempranas
efectuada en el sistema de pedigrí. Tal aumento en la eficiencia ocurre tanto para
caracteres cualitativos como para caracteres cuantitativos, y eso facilita la identificación
de los genotipos superiores.
9
Según Jansen (1992), indica que cada grano de polen proveniente de plantas
hibridas F1 representan un gameto diferente, la población de las plantas DH (doble
haploides) exhibe la variabilidad genética que se encontrará en una población F2 con la
ventaja adicional que cada individuo tendrá un genotipo homocigoto, es decir, fijado
definitivamente.
El cultivo de anteras nos facilita el proceso, ya que las líneas así obtenidas son
homocigotas y en los países que son sembrado inmediatos en ensayos preliminares de
rendimiento, para evaluarlas y seleccionarlas bajo sus propias condiciones, de acuerdo
con los problemas locales de esta forma acortar el tiempo requerido para desarrollar una
variedad, cuando se aplica la técnica del cultivo de anteras se pueden obtener líneas
homocigotas en solo 8-9 meses, contabilizados a partir de la siembra de una generación
hibrida F1 o F2, mientras que la misma estabilidad se logra generalmente en el sistema
estándar de mejoramiento estándar de mejoramiento después de cinco a seis
generaciones de autopolinización. Por consiguiente, las evaluaciones en ensayos de
rendimientos pueden hacerse mucho antes (Bernis, 2004).
La mayor eficiencia de la selección mediante el cultivo de anteras (CA), ha
permitido el desarrollo de cultivares de arroz, a partir de poblaciones de doble haploides
(DH) más pequeñas que las poblaciones normalmente requeridas al usar por el método
de pedigrí. Se ha estimado que para los propósitos de selección de los genotipos
deseables, son suficientes cerca de 150 plantas provenientes del CA de una F1, en lugar
de 4.000 a 5.000 plantas F2 (Shen et al., 1983).
La producción de DH en combinación con técnicas de biotecnología como la
mutagénesis o la transformación, facilita la obtención de nuevas fuentes de variabilidad
que quedan fijadas en las primeras generación (Muñoz, 2007).
La combinación de la producción de DH con la selección asistida por
marcadores moleculares constituye una herramienta muy poderosa para la obtención de
nuevas variedades. Una población DH a partir de una F1 de un cruzamiento es también
ideal para el mapeo genético, ya que ha sufrido solo una ronda de recombinación y por
lo tanto muestra una expresión máxima de las relaciones de ligamento (Forster y Powell
1997). Los DH son especialmente útiles para estudios genéticos, análisis de QTLs
10
("Quantitative Trait Loci") y en combinación con mutagénesis y transformación
(Thomas et al., 2003).
2.4.2. Desventajas
Según Sanint y Col (1993) citado por Pérez (2004), entre las desventajas se
puede mencionar una alta dependencia del genotipo. Los genotipos índicos han
demostrado hasta ahora poca repuesta a la inducción de callos, observándose la necrosis
temprana de las anteras y un desarrollo pobre de los callos, mientras que los japónica de
secano presentan generalmente bajo porcentaje de regeneración de plantas verdes
(factible de superar si se utiliza el medio adecuado). Además, el costo inicial de
equipamiento de un laboratorio de cultivo de anteras puede ser relativo alto. Sin
embargo, a mediano plazo, esta inversión puede ser recuperada si se considera la
reducción de alrededor de 30 % en costo de desarrollo de un material empleando cultivo
de anteras versus usando el método pedigrí solamente.
La producción de DH a través del CA es mucho mayor a partir de las japónicas
que de las indicas; tal vez ello se deba no solo a la mayor respuesta de las japónicas sino
además al hecho de que la gran mayoría de los laboratorios en sus investigaciones han
utilizado como modelos a las japónicas. El CIAT en trabajos recientes muestra que es
posible obtener un incremento substancial en las respuesta de las indicas (Lentini et al.,
1993).
Morejón et al. (2001) mencionan que el uso de la técnica del cultivo de anteras
se ha visto limitada por la baja frecuencia de producción de callos y regeneración de
plantas verdes en genotipos pertenecientes a la especie índica. Varios investigadores
han notado que la inducción de callos y la regeneración de plantas verdes están
influenciados por el genotipo utilizado, el estado de desarrollo de la microsporas, las
condiciones de desarrollo de los padres donantes (fotoperiodo e intensidad de la luz),
tratamiento físico de las anteras antes de su inoculación, medio definido. En
consecuencia, las condiciones que llevan a la haploidía en las plantas cultivadas
importantes necesitan desarrollarse o mejorarse (Roca, 1991).
11
Debido a un gran número de microsporas presentes en una sola antera, y un gran
número de anteras por espiga, la expectativa razonable de que aparece el número de
plantas androgénicos generados a partir de un único pico estaría en las decenas de miles.
Sin embargo, en una planta como la cebada, el número de plantas regeneradas verdes
por 100 anteras respuesta puede variar desde cero a varios cientos, dependiendo del
genotipo. Las razones de tal disparidad son debido a una variedad de factores,
incluyendo la capacidad de microsporas para alterar su vía de desarrollo, las tasas de
supervivencia de los cultivos in vitro, la eficiencia de la producción de embriones
androgénica y la capacidad de regeneración para formar plantas verdes, como así como
el fenómeno altamente importante de albinismo Jacquard et al., (2009); Li y Devaux
(2005).
Las plantas de arroz albinos derivados de polen contienen genomas de plástidos
que han sufrido deleciones a gran escala (Harada et al., 1992). Una deleción, en
genética, es un tipo especial de anomalía estructural cromosómica que consiste en la
pérdida de un fragmento de ADN de un cromosoma. Esta pérdida origina un
desequilibrio, por lo que las deleciones están incluidas dentro de las reordenaciones
estructurales desequilibradas. El portador de una deleción es monosómico respecto a la
información génica del segmento correspondiente del homólogo normal.
2.4.3. Eficiencia de la técnica
Las investigaciones sobre la fisiología de las anteras, los efectos benéficos del
tratamiento con frío y en la oscuridad se deben a que dicho tratamiento reduce la
actividad respiratoria de las anteras, disminuyendo el consumo de reservas de la pared
de la antera, prolongando la actividad biológica del arquesporio que alberga los granos
de polen, manteniendo la viabilidad de los mismos, evitando la dehiscencia prematura
de las anteras en el cultivo y retrasando la senescencia del polen (Lentini, 1997).
El estado de desarrollo del polen en el momento de la inoculación es crítico para
la inducción de la androgénesis. En el arroz, la formación de embriones es posible si las
anteras se cultivan cuando sus granos de polen están en el estado uninucleado
(temprano, medio o tardío), pero ello no ocurre cuando se cultivan granos binucleados;
12
además, en este último caso la mayoría de las plantas regeneradas son albinas (Roca,
1993).
Mediante el uso de un medio líquido es posible reducir al mínimo la
competencia entre los granos de polen en desarrollo, y se permite que el callo formado
dentro de la antera se sumerja en el medio de cultivo. El medio líquido tiene además
otras ventajas, como la de permitir una dispersión más rápida de cualquier compuesto
nocivo que produzcan los granos de polen muertos, disminuyendo su efecto, y la de
facilitar la entrada de los nutrimentos. El agar comercial contiene contaminantes que
pueden impedir el desarrollo del polen (Lentini, 1997).
Touraev et al., (1997) mencionan que la aplicación de un tratamiento de estrés es
necesaria para la reprogramación de microsporas. El tratamiento de estrés reprime la vía
gametofitica normal de microsporas al polen fértil, que conduce a una fase intermedia
de la des diferenciación y totipotencia celular (Shariatpanahi et al., 2006). Cabe recalcar
en esta etapa de transición permite a las microsporas que se encuentran en condiciones
de cultivo adecuadas; puedan dividir, convertirse en embriones, y regenerar plantas
completas. Una variedad de tensiones se sabe para accionar androgénesis, pero el tipo
de esfuerzo aplicado depende de las especies de plantas o incluso el genotipo
En la cebada, la más alta eficiencia de regeneración se obtiene con microsporas
uninucleada sometidas a inanición y estrés osmótico, provocada por la incubación de las
anteras en un medio que contiene manitol Hoekstra et al., (1992); Cistué et al., (1994).
El tratamiento en estrés no sólo es necesaria para cambiar el destino de desarrollo, sino
que también condiciona los números de las divisiones y de los embriones, la
regeneración de las plantas verdes y albino, y duplicación espontánea (Cistué et al.,
1994, 1999; Hoesktra et al., 1997; Kasha et al., 2001; Li y Devaux 2003; Wojnarowiez
et al., 2004; Oleszczuk et al., 2006; Shariatpanahi et al., 2006).
El arroz japónica de riego tiene una respuesta al cultivo de anteras mayor que la
japónica de secano y los materiales tipo índica (Lentini et al., 1997).
13
2.4.4. Determinación de niveles de ploidía de plantas regeneradas
Cuando las plantas regeneradas (R1) han alcanzado la madurez, se puede
determinar el nivel de ploidía evaluando las plantas morfológicamente. Las plantas
haploides (n = x) son, por lo general, pequeñas, débiles, con problemas de crecimiento y
estériles. Las doble haploides (n = 2x) son plantas fértiles con un desarrollo similar al de
las plantas derivadas de semilla. Las plantas poliploides generalmente muestran un
mayor crecimiento, con estructuras florales más desarrolladas, granos con aristas largas
y parcialmente estériles (Lentini et al., 1997).
Entre las técnicas actualmente utilizadas para determinar el grado de ploidía
destacan la citometría de flujo (CMF) y la citogenética. La CMF permite cuantificar los
componentes celulares tales como ácidos nucleicos, lípidos, proteínas, polisacáridos,
etc.; mientras la citogenética se define como una rama de la genética a nivel celular,
dedicada al estudio del número y la morfología de los cromosomas (Velásquez. et al.,
2010).
La CMF utilizada para determinar el contenido de ADN de una muestra puede
llevarse
a
cabo
empleando
colorantes
que
se
combinan
específica
y
estequiométricamente (cálculo de las relaciones cuantitativas entre los reactivos y
productos en el transcurso de una reacción química) al ADN (Marie y Brown, 1993;
Álvarez, 2000). Estos colorantes, denominados fluorocromos, son moléculas que se
intercalan cuantitativamente entre pares de bases nitrogenadas de ácidos nucleicos,
caracterizándose por absorber luz a una determinada longitud de onda y emitir a otra
longitud diferente (Velásquez. et al., 2010).
La cuantificación de ADN nos informa sobre la existencia o no de anomalías
clónales de ADN (aneuploidías de ADN) y por otra parte, permite conocer la
distribución de una población celular determinada a lo largo de las distintas fases del
ciclo celular (Alvares, 2000).
14
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1.
Ubicación del ensayo
La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de la
Estación Experimental Litoral Sur (E.E.L.S) del Instituto Nacional Autónomo de
Investigaciones Agropecuarias (INIAP).
3.2.
Descripción de la ubicación geográfica
La Estación Experimental Litoral Sur (E.E.L.S), está ubicada entre las
coordenadas geográficas 2º15’15’’, latitud Sur y 79º30’40’ ’de longitud occidental a 17
msnm., precipitación promedio anual de 1342,0 mm y 81% de humedad relativa media,
y temperaturas promedio de 25,1 ºC. en el km. 26 al este de Guayaquil en la vía Durán–
Tambo, parroquia Virgen de Fátima, cantón Yaguachi, provincia del Guayas.1
3.3.
Material, equipo de laboratorio y reactivos
Los materiales, equipo de laboratorio y reactivos utilizados en la presente
investigación se señalan en los Cuadros 1, 2 y 3 respectivamente.
Cuadro 1.
Materiales utilizados en el cultivo de anteras en arroz. EELS/UG, 2014.
MATERIALES
Bandejas metálicas
Macetas
Bandejas plásticas
Mascarilla 3M
Cajas Petri
Mangos para Bisturí
Cajas plásticas (250 ml)
Mecheros de alcohol
Cobertores de zapatos estériles
Papel aluminio
Envases de vidrio
Papel craft
Espátulas
Papel filtro
Erlenmeyers (125, 250, 500, 1000 ml)
Papel toalla
Frascos de vidrio con tapas (10 x 10 cm) Pinzas largas de punta gruesa
Fundas para esterilizar grandes
Pinzas medianas de punta gruesa
Filtro 0,50 (micrómetros)
Pipetas graduadas (1, 2, 5, 10 ml)
Hojas de afeitar cromadas
Porta y cubre objetos
Gasa hidrófila
Probetas (25, 50, 100, 500, 1000 ml)
Gorros
Rollo de algodón grande
Guantes de látex libre de polvo
Tarrinas transparentes con tapa
Guantes de Nitrilo (S)(M)
Tubos plásticos de muestras
Hojas para Bisturí No. 11-10
Vasos graduados (100, 250, 500, 1000 ml)
1
Fuente: Datos obtenidos en la Estación Agrometereológica de la EELS del INIAP
15
Cuadro 2.
Equipo de laboratorio utilizado para el cultivo de anteras en arroz.
EELS/UG, 2014.
EQUIPOS DE LABORATORIO
Autoclave simple
Refrigerador
Balanzas (para pesar pequeñas y grandes) Potenciómetro
Cámara de doble flujo laminar
Plato agitador y calentador
Citómetro de flujo PARTEC
Sorbona
Esterilizador de pinzas
Shaker
Estereoscopio binocular
Ice maker scotmars
Cuadro 3.
Reactivos utilizados para el cultivo de anteras de arroz. EELS/UG, 2014.
REACTIVOS PARA CULTIVO IN VITRO
2,4-D
Glicina
Acetocarmin
H2MoO4
Ácido ascórbico
KC1
Ácido Fenil Acético AFA
KH2P 04
Ácido giberelico
KI
Ácido Indol Acético AIA
KNO3
Ácido Naftalenacetico ANA
Maltosa (gilt)
AgN03
MgSO4.7H20
Alcohol
MnSO4.4H20
Arginina
Myo-inositol
Acido de Na
Na2EDTA
Benzil Aminopurina
Na2Mo04.2H20
Biotina
NH4NO3
CaC12.2H20
Phytagel (gilt)
Cinetina
Picloramo
Cleaning solution
Piridoxina-HC1
CoC12.6H20
Sacarosa (gilt)
Cu S04.5H20
SO4 (NH4)2
Cysteine
Solución hipoclorito de
Descontamination solution
Staining buffer
sodio NaCLO
Extraction buffer
Tiamina-HC1
FeSO4.7H20
Tween 20
3.4.
Tratamientos estudiados
El material vegetal donante de anteras fueron 12 poblaciones segregantes F1
(Cuadro 4) cultivadas en invernadero. Los progenitores utilizados fueron: LINEA GO38063; GO-38404; GO-38242; JAPON; FEDEARROZ-50; INIAP-12; INIAP-14;
INIAP -16. Estas líneas y variedades son procedentes de INIAP (especie índica); FLAR
(especie índica); FEDEARROZ (especie índica); JAPON (especie japónica) y se
encuentran en el banco de germoplasma del Programa Nacional de Arroz de la Estación
Experimental del Litoral Sur.
16
Cuadro 4.
Población F1 proveniente de varios cruces. EELS/UG, 2014.
No
CRUCE
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
3.5.
INIAP-12 x JAPÓN
INIAP-12 x GO-38063
INIAP-14 x INIAP-12
INIAP-16 x GO-38063
INIAP-16 x GO-38242
GO-38404 x INIAP-16
GO-38063 x JAPÓN
GO-38063 x FEDEARROZ-50
GO-38063 x GO-38404
FEDEARROZ-50 x GO-38404
FEDEARROZ-50 x INIAP - 14
JAPÓN x INIAP - 16
Características de los progenitores utilizados
Las características agronómicas de las 12 poblaciones F1 provienen de
cruzamientos simples y se presentan a continuación. Cuadro 5.
Cuadro 5.
Características de los progenitores utilizados para cruzamientos simples.
Pyricularia7/
P
P
P
P
P
--P
---
Hoja blanca6/
EL
L
EL
EL
L
--L
---
Manchado de grano5/
TF
TF
TF
TF
TF
--TF
---
Pudrición de vaina4/
5000
5800
5000
5607
8460
--6958
---
Índice de pilada %
Rendimiento (kg/ha)
100
99
93
116
108
--127
---
Centro blanco3/
Altura de planta ( cm )
95
113
106
118
127
--140
---
descascarado 2/
Ciclo vegetativo (dias)
60
78
71
83
97
--108
---
Longitud del grano
Floración (dias)
INIAP-12
INIAP-14
INIAP-16
GO-38063
GO-38242
G0-38404 *
FEDEARROZ
JAPON
-50 *
Volcamiento1/
Progenitores
EELS/UG, 2014.
71
66
68
67
70
--61,34
---
MS
MR
MS
T
T
--MR
---
MS
MR
T
T
T
--MR
---
MS
MR
T
R
T
--MR
---
R
MS
T
R
T
--MR
---
* El germoplasma “JAPON” y “GO-38404” son materiales introducido del exterior e identificados en INIAP con el
nombre del país de origen, se desconoce sus características agronómicas con exactitud, sin embargo se la utilizó por
conocerse que pertenece a la subespecie japónica, es decir, posee buena calidad de grano, altura baja y precocidad.
1/: TF= tallos fuertes sin volcamiento
2/: L= grano largo; EL= grano extra largo
3/: P= centro blanco pequeño; M= centro blanco mediano
4/, 5/, 6/, 7/: R= resistente; MR= medianamente resistente; T= tolerante; MT= medianamente tolerante; MS=
medianamente susceptible.
17
3.7.
Manejo del ensayo
3.7.1. Colecta de macollas donantes para la siembra del cultivo de antera
Se seleccionó las macollas de las plantas donantes para el cultivo de anteras, las
cuales debían cumplir características morfológicas, dependiendo el genotipo y
condiciones ambientales, la edad entre un rango de 60 - 75 días como mínimo y
máximo en su orden. En esta etapa de embuchamiento la flor se encuentra aun dentro de
la panícula y nos garantiza que aún no comienza la antesis es decir que el estado de
desarrollo de las microsporas aún no se encuentra en las fases uninucleado, medio o
tardío. De tal manera se la identifico cuando a partir de la hoja bandera y la última
aurícula se encontraba a una distancia de 2 a 5 cm, las flores se las observó en el
laboratorio de color amarillo verdoso y consistencia frágil. La colecta de panículas se la
realizó en el vivero o cuarto de mallas del programa de arroz en las primeras horas de la
mañana de 8 a 10 aprovechando la temperatura fría para que las muestras no se
deshidraten cortándolas al ras del suelo con tijeras colocándolos luego en un tubo de
papel prensado con tapa para su respectiva transportación al laboratorio (Figura 1).
D. TUMBACO/UG, 2014.
A
D. TUMBACO/UG, 2014. B
D. TUMBACO/UG, 2014. C
Figura 1. Selección y colecta de panículas F1 donantes de anteras: condición óptima para la siembra
(A); eliminación de hojas para evitar deshidratación (B); etiquetado y mantenimiento de las
macollas colectadas en el tubo de papel prensado (C). EELS/UG, 2014.
3.7.2. Esterilización superficial de las panículas
Las panículas colectadas son sometidas a una esterilización superficial
sumergiéndolas con etanol al 70 % en un recipiente de vidrio y así evitar futuras
contaminaciones por el ambiente en el que se encontraba, para luego pasar a la cámara
18
de flujo laminar colocándolas en una bandeja plástica y procediendo a retirar las flores
de las panículas (Figura 2).
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
A
B
Figura 2. Esterilización de la panícula con etanol 70 % (A) Panículas listas para proceder
a retirar la flor (B). EELS/UG, 2014.
.
3.7.3. Separación, selección y desinfección de flores
Con el fin de conseguir una buena asepsia esta labor se realizó sobre la cámara
de flujo laminar, una vez lista las panículas en la bandeja de plástico se tomó por su
base abriendo la vaina hasta llegar al último cubrimiento de la inflorescencia
sosteniendo de forma invertida se cortó la tercera parte es decir la sección de interés de
la inflorescencia.
El material seleccionado se colocó en envase de vidrio para desinfectarlo
inmediatamente sumergiéndolo en etanol al 70 % por un minuto agitándolo para cubrir
toda la inflorescencia. Luego se realizó el enjuague por tres veces con agua destilada
estéril. Las panículas desinfectadas quedan en el envase de vidrio retirando el exceso de
agua destilada estéril sellándolo con parafilm y se conservó a una temperatura 12 °C
(Figura 3).
19
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
Figura 3. Separación, selección y desinfección de flores para cultivo de anteras; extracción de panícula
de la vaina, tomándose de la base de forma invertida (A); selección de las flores óptimas y
eliminación con tijeras de las no deseadas (B); materiales utilizados para el protocolo de
desinfección (C); Sellado del frasco con las muestras (D). EELS/UG, 2014.
3.7.4.
Formulación de los medios de cultivos MS (Murashige & Skoog) para
inducción de callos – regeneración de plantas
La formulación y preparación de medios para
inducción de callos y
regeneración de plantas se realizó con una primera solución concentrada (solución
madre) que consistió en sales minerales, macro y micro elementos, vitaminas y
hormonas. Mientras, que para el caso de formulación del medio regeneración de plantas
se le agregó gelrite un agente gelificante que sirve como base al momento de transferir
los callos, para que éstas permanezcan ancladas al momento de diferenciar órganos
como raíz y evitar volcamiento. Luego se mide el pH, el óptimo debe ser 5,8 y se
autoclava en envases, posteriormente se dispenso el medio en la cámara de flujo
laminar para evitar contaminación (Figura 4).
20
D. TUMBACO/UG, 2014.
A
D. TUMBACO/UG, 2014. B
D. TUMBACO/UG, 2014.
C
Figura 4. Formulación de los medios de cultivos MS. Soluciones concentradas (macronutrientes –
micronutrientes), vitaminas y hormonas (A); Medición del pH en el medio de cultivo (B);
dispensado el medio de cultivo en envases de plástico (C). EELS/UG, 2014.
3.7.5. Inducción de callos: Aislamiento y siembra de las anteras en medio de
cultivo
Para separar las anteras de los filamentos se procedió a cortar las flores por su
base con un bisturí estéril numero 10 sobre una caja Petri, se toma el extremo que no
fue cortado con una pinza larga de 10 a 15 flores, luego se siembran golpeando con la
pinza las flores contra el borde interior del envase de plástico que contenía medio de
cultivo para la inducción de callos, se usaron cuatro flores por cada flor y de ella caen
en promedio de 100 a 150 anteras por envases en el medio.
Cada envase contenía 20 ml de medio de cultivo para inducir los microcallos,
después de la siembra se procedió a sellar los envases plásticos para evitar
contaminación con cinta transparente adherente (parafilm). Estos envases fueron
guardados en un cuarto oscuro para inducir la androgénesis por medio de la división
mitótica de la microspora a temperatura de 24 °C (Figura 5).
21
D. TUMBACO/UG, 2014.
A
D. TUMBACO/UG, 2014.
B
D. TUMBACO/UG, 2014.
C
Figura 5. Corte de las flores por su base para inducción de callos (A); siembra de la antera con la pinza
mediante golpes continuos en el borde interior del envase (B); incubación de anteras en la
oscuridad (C). EELS/UG, 2014.
3.7.6. Regeneración de plantas: Transferencia de callos al medio R (regeneración
de plantas)
Los envases que contenían las anteras fueron sometidos durante 45 dias en
oscuridad para inducir la formación de callos, éstos fueron transferidos a otro medio de
regeneración sólido para diferenciación de órganos como raíces y puntos verdes. La
transferencia de los callos se realizó vaciando un poco del medio líquido de inducción
que contiene los callos seleccionando así los que tenían en promedio 2mm blancos se
utilizó un bisturí y una pinza larga para esparcirlos y separarlos a una distancia
aproximada de 0.5 cm entre sí. Se cultivó un máximo de 08 a 10 callos por frasco para
garantizar una alta diferenciación de plantas.
Los frascos estuvieron en penumbra por 8 días (incubación), es decir con luz
indirecta a temperatura de 24 °C, colocados en una estantería. Luego fueron transferidos
a luz directa de 80 a 100 με.m-2.s-1, la cual se logra con lámparas fluorescentes tipo luz
día buscando la manera de realizar un fotoperiodo de 12 horas/día (Figura 6).
22
D. TUMBACO/UG, 2014.
A
D. TUMBACO/UG, 2014.
B
D. TUMBACO/UG, 2014.
C
Figura 6. Transferencia de los callos al medio solido para regeneración de plantas (A); estantería con
luces fotoperiodo (B); plántulas regeneradas con diferenciación de órganos a partir de los
callos(C). EELS/UG, 2014.
3.7.7. Aclimatación de plántulas regeneradas (laboratorio – vivero)
Cuando las plantas alcanzaron suficiente desarrollo foliar y radical entre los 50 –
60 días, fueron retiradas manualmente del frasco, se lavaron las raíces para eliminar el
medio solido con agua estéril, se las sumergió en agua por dos días. Esta labor se
realizó en el laboratorio.
Luego fueron llevadas al invernadero donde se trasplantó en macetas con suelo
estéril y sobresaturado tipo fango o lodo, allí permanecieron hasta culminar su ciclo de
vida con su respectivo rótulo y buenas prácticas agrícolas(Figura 7).
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
Figura 7. Aclimatación de plántulas regeneradas: Plántulas regeneradas en laboratorio con desarrollo
foliar y radicular (A); Plántulas lista para su respectiva aclimatación (B); plántulas aclimatadas
y sembradas en el fango para cumplir con su ciclo de desarrollo (C). EELS/UG, 2014.
23
3.7.8. Determinación de niveles de ploidía en plántulas regeneradas por citometría
de flujo
Una semana después que las plántulas fueron aclimatadas, se procedió a realizar
el análisis de ploidía, se colecto las hojas tiernas en el invernadero y se mantuvieron
frescas para que no se deshidraten al momento de volver a llevar al laboratorio. Se
comparó con una muestra control procedente de planta de arroz que contiene ploidía
natural.
Se procedió a una previa limpieza del citómetro de flujo CMF marca PARTEC
con el siguiente protocolo.
1.- Solución hipoclorito de sodio NaCLO
(1min)
2.- Descontamination solution (Descontaminante).
(1min)
3.- Sheath fluid (Azida de Na – tween)
(1min)
4.- Cleaning solution (Limpieza)
(1min)
5.- Sheath fluid (Azida de Na – tween)
(1min)
El kit que se utilizó fue Cystain UV precise P, el cual contenía extraction buffer
125 ml – staining buffer 500 ml. Para la preparación de las muestras (extracción de
núcleos) se procedió a cortar sobre una caja petri esterilizada tres muestras de 0,5 cm de
cada una y del de control. Se colocó 400 µl (microlitros) de extraction buffer
(extracción) con la micropipeta para romper el núcleo se repicó con una hoja de bisturí
durante 30 segundos, se dejó reposar y luego se transfirió a un tubo por un filtro de
0,50 µm (micrómetros) se le adicionó 700 µl (microlitros) de staining fluid (tinción). Se
dejó encubar por 60 segundos en oscuridad, se procedió a procesar por el citómetro de
flujo (Figura 8).
24
D. TUMBACO/UG, 2014.
A
D. TUMBACO/UG, 2014.
B
D. TUMBACO/UG, 2014.
C
D. TUMBACO/UG, 2014.
D
Figura 8. Determinación de niveles de ploidía en plántulas regeneradas por citometría de flujo; colecta
de las muestras, rotulado y transporte del material (A); muestra lista para el proceso de
extracción de núcleos (B); muestra de ADN filtrándose (C); muestra procesándose para el
análisis de ploidía por el citómetro de flujo (D). ). EELS/UG, 2014.
3.8.
Análisis estadístico
Durante el desarrollo del ensayo en condiciones del laboratorio ( in vitro ), se
realizó la determinación de plantas doble haploides mediante el cultivo de anteras,
partiendo para ello del conteo de anteras sembradas; el potencial callogénico, potencial
de regeneración, número de plantas verdes regeneradas, número de plantas albinas,
número de plantas verdes aclimatadas y niveles de ploidía.
Debido a la naturaleza del ensayo, el análisis estadístico de las variables
evaluadas se realizó mediante el uso de medidas de tendencia central y de dispersión
así como gráficos.
25
3.9.
Variables registradas
3.9.1. Potencial Callogénico (%)
El potencial callogénico se promedió con el número total de callos obtenidos a
partir del total de envases sembrados de anteras en el medio de inducción, por cada
cruce con un aproximado de 45 a 55 días.
3.9.2. Diferenciación de órganos (%)
Se expresó el porcentaje de regeneración a partir de los callos transferidos a
medio de regeneración de plantas. En esta fase de regeneración los microcallos
comenzaron a diferenciar órganos vegetales como fue desarrollo foliar y radicular.
3.9.3. Potencial de Regeneración (%)
Se calculó el porcentaje de plántulas totales regeneradas; verdes y albinas que
regeneraron a partir de los callos mantenidos en el medio MS (Murashige y Skoog)
modificado.
3.9.4. Aclimatación de plantas (%)
Se evaluó el total de plantas que continuaron adaptándose en el invernadero
después que fueron sometidas al cambio que se realizó desde el laboratorio.
3.9.5. Plántulas albinas (%)
Se valoró el porcentaje de plántulas albinas regeneradas a partir de los callos
embriogénicos mantenidos en el medio de regeneración. Estas plantas albinas no fueron
transferidas al vivero quedando solo en laboratorio.
26
3.9.6. Nivel de ploidía en plántulas aclimatadas
Se evaluó el nivel de ploidía determinando el contenido de ADN por citometría
de flujo en las plántulas aclimatadas en invernadero y mediante descriptores
morfológicos. La suspensión de núcleos se hace circular por el circuito de microtubos
de un analizador de ploidía (Partec PA-II Ploidy Analyser) equipado con una lámpara
de mercurio que emite luz ultravioleta de 366 nm de longitud de onda. La corriente de
núcleos en suspensión pasa por una cámara de cuarzo (conducto de 10μm que no
permite el paso simultáneo de dos unidades), mientras es iluminada por la luz
ultravioleta; en respuesta, el fluorocromo DAPI fijado al ADN emite una fluorescencia
proporcional a la cantidad de ADN en el núcleo, que es reconocida y captada por un
foto receptor. El sistema informático que lleva incorporado el citómetro convierte cada
señal fluorescente en un punto sobre la pantalla, situado en distintas posiciones, de
acuerdo con su intensidad. El gráfico resultante ordena los datos según el contenido
nuclear de ADN en el eje de abscisas, y contabiliza el número de núcleos de cada tipo
en el eje de ordenadas.
Para realizar el análisis de ploidía se colectó una planta de campo abierto
(planta normal o control) y la plántula inducida a la androgénesis que seria las plántulas
que lograron desarrollarse en invernadero (plántula obtenida in vitro). Los niveles de
ploidía se describen a continuación (Cuadro 6).
Cuadro 6.
Niveles de ploidía posibles en arroz. EELS/UG, 2014.
PLOIDIA
NATURAL
INDUCIDA
CROMOSOMAS
H
MONOPLOIDE
HAPLOIDE
1n
DH
DIPLOIDE
DOBLE HAPLOIDE
2n
TP
TRIPLOIDE
TRIPLE HAPLOIDE
3n
3.9.7. Relación panícula / microsporas
Se identificó la relación panícula microsporas por medio de características
morfológicas en las plantas donantes de anteras. Una de las características fue la
longitud en que se encontraba la aurícula de la hoja bandera y la aurícula de la hoja
27
anterior; la consistencia frágil, color de las glumas y florecillas, las cuales nos indicó el
estado óptimo de desarrollo de los granos de polen. Las distancias entre aurícula y hoja
bandera estudiadas fueron 2, 3, 4, 5 y 6 cm.
Para identificar el adecuado estado de desarrollo de las microsporas se realizó
con análisis citológico y tinción. Se sumergieron las flores de interés en baño de María
a 70 °C por 30 minutos, sobre una solución fijadora compuesta por tres partes de etanol
absoluto y una parte de ácido acético glacial, al cual se le agregó cloruro férrico al
0,5%. Luego se montaron 4 placas para cada panícula, presionando las anteras sobre un
porta objetos para permitir que salgan las microsporas, con dos a tres gotas de
acetocarmín al 0,5%. Se colocó el cubre objeto procediendo a observar en el
microscopio con lente de 40x. Finalmente se relacionó el estado de crecimiento de la
panícula con los estados de desarrollo de las microsporas y dándonos las características
morfológicas indicadoras de la panícula óptimas para el cultivo de anteras.
3.9.8. Callos por tratamiento en frío
Se expresó en función de los días que fueron separadas de la panícula las flores
esterilizadas, colocadas en un envase de vidrio con agua estéril, selladas con parafilm y
guardadas en refrigeración, dándole un efecto de pre tratamiento en frío a 12°C por 1, 2,
3, 4, 5 y 6 días. Previo a la siembra en el medio de inducción de callos, se promedió el
número total de callos obtenidos por el total de envases sembrados de anteras incubadas
3.9.9. Callos a partir de condiciones ambientales (cuarto oscuro)
Se procedió a evaluar las condiciones ambientales a partir de las anteras
sembradas en el medio de inducción en dos tipos de cuartos oscuros donde inicio su
división mitótica. El primero estuvo ubicado en el cuarto de crecimiento a temperatura
entre los 30 a 32 °C, mientras que el otro se encontraba entre los 22 a 24°C, se los
mantuvo en estas temperaturas durante 8 horas al día.
28
3.9.10. Crecimiento de callos en los medios de inducción líquido y sólido
Se observó el efecto que produjo en dos clases de medios; el medio de inducción
líquido (desarrollado y utilizado actualmente en el CIAT) y el medio de inducción
sólido (Inducción liquido modificado). La formulación por cada litro de medio se
detalla en el Anexo 1 y la preparación de los mismos en los Anexos 2 y 3
respectivamente.
29
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1.
Potencial Callogénico (%)
Los valores correspondientes a la variable indicada con que se refiere a anteras
sembradas, callos producidos y potencial callogénico se presentan en el Cuadro 7. En
anteras sembradas los tratamientos INIAP 12 x JAPÓN (1994 anteras); INIAP 16 x GO
38063 (3004 anteras) y GO 38063 x GO 38404 (1620 anteras) fueron los que
presentaron valores más altos; en cambio, los cruces INIAP 14 x INIAP 12 (900
anteras); GO 38063 x F50 (960 anteras); JAPÓN x INIAP16 (300 anteras), el menor
número de anteras sembradas. El promedio general fue de 1390 unidades.
En callos producidos la mejor respuesta se encontró en los tratamientos INIAP
12 x GO 38063; INIAP 14 x INIAP 12; F 50 x GO 38404, en su orden, con 1372, 415
y 581 unidades; mientras que los menores valores correspondieron a los tratamientos
INIAP 12 x JAPON; INIAP 16 x GO 38242; F 50 x INIAP 14 con 21, 4 y 2 callos,
respectivamente. El promedio general fue de 297 callos.
En el potencial callogénico, como producto de la relación de callos producidos
con anteras sembradas se determinaron los valores más altos en los tratamientos INIAP
12 x GO 38063 (132,8%); INIAP 14 x INIAP 12 (46,11%); en tanto que el menor
potencial obtenido se dio en los cruces INIAP 16 x GO 38242 (0,33%); F 50 x INIAP
14 (0,17%). La respuesta obtenida en esta variable se presenta en la Figura 9.
Los resultados obtenidos en la presente variable se pueden considerar que no
guardan una relación directamente proporcional entre las anteras sembradas y los
callos producidos,
lo cual se refleja en potencial callogénico, como sucede
principalmente en los tratamientos 1, 2, 4 y 11. Lo obtenido probablemente se deba al
insuficiente número de anteras sembradas que en promedio fue de 1390 anteras. De
acuerdo a CIAT (1997), se debe sembrar un número no menos de 10000 anteras. Otro
30
motivo que puede influenciar en los resultados obtenidos es la constitución genética de
cada cruce y los medios utilizados.
Varias investigaciones deducen que las respuestas al cultivo de anteras dependen
del genotipo de los parentales. El resultado de este trabajo se debe a cruzamientos
simples, teniendo como parentales materiales índicos y japónicos. Mientras que Lentini
et al., (1995) menciona que, la respuestas morfogénicas para la regeneración in vitro de
plantas de arroz a través del cultivo de anteras dependen del genotipo utilizado,
encontrándose una alta variabilidad dentro de cada subespecie, siendo los genotipos de
la subespecie japónica de mejor respuesta que los de la subespecie indica; Velázquez et
al., (2010) concluyen que el cultivo de anteras en arroz ha sido ampliamente utilizado
en la subespecie japónica; sin embargo, su aplicación en la subespecie indica ha sido
poco exitosa. En el año 2005 se desarrolló un protocolo de inducción de callos y
regeneración de plantas haploides en genotipos de la subespecie indica, donde los
resultados obtenidos fueron muy alentadores, pero la eficiencia de regeneración de
plantas verdes fue muy baja.
Cuadro 7.
Valores de anteras sembradas en medio de inducción de callos, números
de callos obtenidos y potencial callogénico en 12 poblaciones F1 de
arroz. EELS/UG, 2014.
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
CRUCE
INIAP 12 /JAPON
INIAP 12 / GO 38063
INIAP 14 / INIAP 12
INIAP 16 / GO 38063
INIAP 16 / GO 38242
GO 38404 / INIAP 16
GO 38063 / JAPON
GO 38063/ F50
GO 38063 / GO 38404
F 50 / GO 38404
F 50 / INIAP 14
JAPON / INIAP 16
Σ
X
S
ANTERAS
SEMBRADAS
1994
1038
900
3004
1224
1390
1537
960
1620
1511
1200
300
16678
1390
665
31
CALLOS
PRODUCIDOS
21
1372
415
222
4
246
251
127
207
581
2
116
3564
297
379
POTENCIAL
CALLOGÉNICO%
1,05
132,18
46,11
7,39
0,33
17,70
16,33
13,23
12,78
38,45
0,17
38,67
324
27
37
Porcentaje Callogénico
140,00
120,00
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
Figura 9.
132,18
46,11
1,05
7,39 0,33 17,70 10,21 13,23 12,78
38,67
38,45
0,17
Porcentaje del potencial callogénico en 12 poblaciones F1 de
arroz. EELS/UG, 2014.
4.3.
Diferenciación de órganos (%)
El mejor resultado para la diferenciación de órganos se presentó en el cruce
INIAP 16 x GO 38242 donde se obtuvo un 50% de regeneración, mientras que el cruce
F 50 x INIAP 14 con un 0,17 % no mostró respuesta en diferenciación ni regeneración.
Los porcentajes de respuesta de los doce cruces se muestran en el Figura 10.
En relación a la respuesta de regeneración de plantas se pudo considerar a los
callos embriogénicos que diferenciaron órganos vegetales (hojas y raíces), los cuales
inicialmente alcanzaron un crecimiento 2 a 3 mm de diámetro manifestándose en ellos
puntos de color verde y pequeñas raíces.
Relacionado con lo que propone (Collin, 1987), para la evaluación de
diferenciación de órganos (cultivo de tejidos vegetales) está asociada con incremento en
la producción de metabolitos secundarios,
al presentarse un incremento en la
agregación celular, la producción de tipos específicos de células, desarrollo de
cloroplastos y pigmentación verde e iniciación de estructuras más organizadas como
embriones, raíces y brotes.
32
Por otro lado, en los callos que no llegaron a prosperar solo se observó
crecimiento continuo de masa callogénica llegando en algunos casos a necrosarse el
tejido. (Cuadro 8).
Cuadro 8.
Valores de callos sembrados y diferenciación de órganos vegetales
en 12 poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014.
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
CRUCE
INIAP 12 /JAPON
INIAP 12 / GO 38063
INIAP 14 / INIAP 12
INIAP 16 / GO 38063
INIAP 16 / GO 38242
GO 38404 / INIAP 16
GO 38063 / JAPON
GO 38063/ F50
GO 38063 / GO 38404
F 50 / GO 38404
F 50 / INIAP 14
JAPON / INIAP 16
Σ
X
S
C.S.*
14
174
73
174
4
246
157
127
207
144
2
21
1343
112
86
* CS: callos sembrados
D.O.**
2
7
8
33
2
8
4
4
8
1
0
10
87
7
9
% D.O.
14,29
4,02
10,96
18,97
50,00
3,25
2,55
3,15
3,86
0,69
0,00
47,62
159,36
13
18
** DO: Diferenciación de órganos
Porcentaje de Diferenciación Órganos
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
Figura 10.
50,00
14,29
4,02
10,96
47,62
18,97
3,25 2,55 3,15 3,86 0,69 0,00
Porcentaje de diferenciación de órganos en 12 poblaciones F1 de
arroz. EELS/UG, 2014.
33
4.4.
Potencial de Regeneración (%)
La información concerniente al potencial de regeneración y su porcentaje
correspondiente se expresan en la Figura 11. Los valores correspondientes a la variable
indicada con que se refiere a diferenciación de órganos, total de plantas regeneradas
albinas y verdes demuestra que en los tratamientos fueron INIAP 16xGO 38063 (25
plantas regeneradas), GO 38404xINIAP 16 (8 plantas regeneradas) y JAPÓNxINIAP16
(8 plantas regeneradas) los que presentaron valores más altos en regeneración de plantas
entre verdes y albinas; en cambio, los cruces INIAP 16xGO 38242 y F 50xGO 38404
fueron los que presentaron el menor número de plantas regeneradas (Cuadro 9).
El proceso de regeneración se presentó a partir de los ocho días de transferidos
los callos. Para brindarle a las plántulas en formación las condiciones óptimas, éstas
permanecieron en una estantería de luz directa, con lámparas fluorescentes tipo luz día,
proporcionando un fotoperiodo de 16 horas, indispensable para la emisión y desarrollo
foliar y radicular. Relacionándolo con los resultados de Quintero (2003), no coincide al
realizar ensayos preliminares para evaluar el efecto de los niveles de luz durante la
inducción de callos sobre el potencial de regeneración de plantas verdes. No observó
efecto del medio de inducción ni de las condiciones de luz sobre la regeneración.
Cuadro 9.
Valores de regeneración de plántulas verdes y albinas, determinadas en
12 poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014.
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
D.O*
2
7
8
33
2
8
4
4
8
1
0
10
87
7
9
CRUCE
INIAP 12 /JAPON
INIAP 12 / GO 38063
INIAP 14 / INIAP 12
INIAP 16 / GO 38063
INIAP 16 / GO 38242
GO 38404 / INIAP 16
GO 38063 / JAPON
GO 38063/ F50
GO 38063 / GO 38404
F 50 / GO 38404
F 50 / INIAP 14
JAPON / INIAP 16
Σ
X
S
* DO: Diferenciación de órganos
PV/PA**
1
6
5
25
1
8
2
2
4
1
0
8
63
5
7
PV/PA %
50
86
63
76
50
100
50
50
50
100
0
80
754
63
28
* PV/PA: Plantas Verdes/ Plantas Albinas
34
Figura 11.
Porcentaje de regeneración de plántulas verdes (PV) y albinas (PA),
determinadas en 12 poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014.
4.5.
Aclimatación de plantas (%)
El total de plantas verdes resultaron de seis cruces entre las cuales el cruce
INIAP 16 x GO 38242 no logró aclimatarse (Cuadro 10). La mayor cantidad de plantas
(5) pertenece al cruce GO 38404 x INIAP 16. Por otro lado el resultado de estas
plantas es decir su producto final (la espiga) que se obtiene de esta investigación se
denominaron R1.
Las plantas aún en condiciones in vitro fueron sometidas a una elevada
intensidad luminosa, un fotoperiodo más corto y una temperatura inferior a la normal,
esto favorecía la lignificación y el desarrollo cuticular y estomático de los órganos
vegetales permitiendo su trasplante directo en condiciones controladas de humedad, luz
y nutrientes; dándole este tratamiento a las plántulas verdes esta continuaron
adaptándose en el invernadero alcanzando un buen desarrollo foliar
y radicular
mostrándose erguida y con buen aspecto de adaptarse al medio ambiente; afirmando lo
que menciona Boutherin y Bron (1994), que las raíces desarrolladas in vitro son
extremadamente frágiles y que, al ser colocadas en el sustrato, mueren. Por lo tanto, es
necesario esperar la formación y el crecimiento de nuevas raíces para que la planta se
alimente.
35
Cuadro 10.
Valores de regeneración de plántulas verdes aclimatadas, determinadas
en 12 poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014.
No
D.O*
P.V.R**
% PV.
1
CRUCE
INIAP 12 /JAPON
2
1
50
2
3
4
5
6
7
8
INIAP 12 / GO 38063
INIAP 14 / INIAP 12
INIAP 16 / GO 38063
INIAP 16 / GO 38242
GO 38404 / INIAP 16
GO 38063 / JAPON
GO 38063/ F50
7
8
33
2
8
4
4
0
3
4
1
5
0
0
0
38
12
50
63
0
0
9
10
11
12
GO 38063 / GO 38404
F 50 / GO 38404
F 50 / INIAP 14
JAPON / INIAP 16
8
1
0
10
0
0
0
2
0
0
0
20
87
7
16
1
232
19
Σ
X
s
9
2
24
* PVR: Plantas verdes regeneradas
* D.O: Diferenciación de órganos
En la Figura 12 se expresan los resultados de los doce cruces de arroz en función
del porcentaje de plantas verdes aclimatadas.
Figura 12.
Porcentaje de regeneración de plántulas verdes aclimatadas,
determinadas en 12 poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014.
4.6.
Plántulas albinas (%)
Se contabilizó el total de plántulas albinas alcanzando alrededor de 54,02 %
(Cuadro11), lo cual indica que hay superioridad en regenerar plántulas albinas. Estas
36
plántulas permanecieron en el laboratorio debido a que en las pruebas preliminares de
aclimatación realizadas no se adaptaron al cambio y fenecieron.
Los resultados de la Figura 13 muestran que el cruce F 50 x GO 38404 guarda
una proporción 1:1 de albinismo,
INIAP 16 x GO 38063 en función de la
diferenciación de órganos tiene una proporción de 2:3 de albinismo, mientras los cruces
INIAP 12 x JAPON e INIAP 16 x GO 38242 no presentaron plantas albinas.
Varios autores indican que el albinismo se presenta en la mayoría de los cereales
como el trigo (Andersen y Col. 1987), cebada (Knudsen y Col. 1989), arroz (Guiderdoni
y Col. 1992), centeno (Immonen 1999) y avena (Kiviharju y Pehu 1998), afectando a
muchos genotipos de interés agronómico. En la cebada, el porcentaje de plantas albinas
varía desde el 1 al 99,7% dependiendo del genotipo (Caredda y Col. 2000, Castillo y
col.2000). Cabe recalcar que las plántulas de arroz albinos derivados de polen contienen
genomas de plástidos que han sufrido deleciones a gran escala (Harada, et al., 1992).
Cuadro 11.
Valores de regeneración de plántulas albinas, determinadas en 12
poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014.
No
1
2
3
4
Σ
X
D.O*
2
7
8
33
2
8
4
4
8
1
0
10
87
7
P.A.**
0
6
2
21
0
3
2
2
4
1
0
6
47
4
% PA
0
86
25
64
0
38
50
50
50
100
0
60
522
43
s
9
6
33
CRUCE
INIAP 12 /JAPON
INIAP 12 / GO 38063
INIAP 14 / INIAP 12
INIAP 16 / GO 38063
5
6
7
8
9
10
11
INIAP 16 / GO 38242
GO 38404 / INIAP 16
GO 38063 / JAPON
12
JAPON / INIAP 16
GO 38063/ F50
GO 38063 / GO 38404
F 50 / GO 38404
F 50 / INIAP 14
* D.O: Diferenciación de órganos
37
* *PA: Plantas albinas
Figura 13.
Porcentaje de regeneración de plántulas albinas, determinadas en 12
poblaciones F1 de arroz. EELS/UG, 2014.
Adicionalmente se ha realizado la comparación de la respuesta de los doces
cruces; la formación de callos, diferenciación de órganos y regeneración de pantas. Los
resultados se muestran en la Figura 14.
Figura 14.
Respuesta de los doce cruces de arroz a las diferentes fases del Cultivo de
Anteras (CA) EELS/UG, 2014.
38
4.7.
Nivel de ploidía en plántulas aclimatadas
En el análisis que se estableció para determinar el nivel de ploidía a las plántulas
aclimatas fue por citometría de flujo, observando el contenido de ADN a partir de la
muestra control y la muestra de las plántulas aclimatadas descubriendo tres niveles de
ploidía: haploide, doble haploides y triple haploides. Varios autores deducen que la
duplicación cromosómica de plantas androgénicas en cereales como el trigo, la cebada o
el arroz, ocurre espontáneamente. Las observaciones de las plántulas versus el análisis
de Citometría de flujo se muestran en la Figura 15.
Se comprobó por varias repeticiones que del mismo cruce suelen aparecer
niveles variados de ploidía esto se refleja en el cuadro 12. Estos resultados permiten
deducir que las plántulas que en el análisis se determinaron como haploide según
(López y Larkins, 1993; Farnham et al., 1998) estas plantas son producto de la ausencia
de los mecanismos de diploidización cromosómica o del estado uninucleado temprano
de algunas de las microsporas. Las plántulas que en el análisis resultaron doble haploide
fueron fértiles y se desarrollaron con total normalidad, mientras que las haploides y
triple haploide en el vivero resultaron ser pequeñas y estériles.
Cuadro 12.
Análisis de niveles de ploidía determinadas en las plántulas regeneradas.
EELS/UG, 2014.
PLANTAS
TOTAL
CRUCE
ACLIMATADAS CRUCES
INIAP 12 / JAPÓN
1
1
INIAP 14 / INIAP 12
2
2
INIAP 14 / INIAP 12
3
INIAP 16 / GO38063
4
3
INIAP 16 / GO38063
5
INIAP 16 / GO38063
6
INIAP 16 / GO38063
7
GO38404 / INIAP 16
8
4
GO38404 / INIAP 16
9
GO38404 / INIAP 16
10
GO38404 / INIAP 16
11
GO38404 / INIAP 16
12
JAPÓN / INIAP 16
13
5
39
PARTÍCULAS
DAP
1693
906
1576
1668
1667
1266
689
1923
1770
1344
1849
1947
513
NIVEL DE
PLOIDÍA
DH
TP
TP
DH
DH
DH
TP
DH
H
DH
H
H
H
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
Figura 15.
Comparación visual del analisis de citometría de flujo con respuestas a las diferentes
ploidía presentadas; Haploide (A) Doble haploide (B) Triple haploide (C). EELS/UG,
2014.
4.8.
Relación panícula / microsporas
En el presente estudio de investigación se determinó mediante análisis citológico
y por tinción observada por microscopio, el estado de desarrollo de la microsporas
relacionándolo con características morfológicas de las panículas que fueron colectadas
en vivero.
El desarrollo óptimo de la microsporas se presentó cuando la lígula de la hoja
bandera era visible y la vaina engrosada aproximadamente a una distancia de 2 a 5 cm
entre la última aurícula y la aurícula de la hoja bandera en especies Indicas, mientras
que en las especies japónicas la distancia fue de 1 a 4 cm (Figura 16 A). Coincidiendo
con (Lentini, Martínez y Roca, 1997) y Quintero (2003) al seleccionar las panículas
para el cultivo de anteras, se tomó en cuenta que la distancia entre las aurículas de las
dos últimas hojas estuviera en un rango de 3 a 5 cm.
40
Otro factor indicador fueron las glumas (flores) ya que ellas se mostraban de
color amarillo verdoso y consistencia frágil (Figura 16 B) en el estado óptimo de las
microsporas dentro de las anteras (Figura 16 C), dicho efecto deducían el estado
uninucleado medio (Figura 16 D) y tardío (Figura 16 E), óptimo para regenerar
D. TUMBACO/UG, 2014.
plántulas a partir del cultivo de anteras in vitro.
Figura 16.
Relación panículas / microsporas; Observación de la distancia de cuatro panículas
colectadas previo a la selección de las flores o glumas (A). Color y consistencia de las
glumas de las cuatro panículas colectadas (B); desarrollo de las microsporas dentro de
las anteras (C); estado uninucleado medio de las microsporas (D); uninucleado tardío
de las microsporas (E).
4.9.
EELS/UG, 2014.
Callos por tratamiento en frío
Inicialmente, las flores fueron esterilizadas, sacadas de las panículas y guardadas
en envase de vidrio con agua estéril, luego fueron expuestas a un pre tratamiento en frío
a 12ºC previo a la siembra de anteras.
Trejo et al., (2002) determinó que el tratamiento óptimo de las panículas previo
a la siembra de las anteras es a 4°C durante 7 días; y Lentini, Martínez y Roca (1997)
quienes indican que la inducción óptima se consigue con un pretratamiento de 8 a 10°C
durante 7 días, mientras que, Arana (2012) estudió los mejores resultados en la
41
inducción de callos obteniendo la siembra de anteras provenientes de panículas sin
tratamiento en frío, dándole mejor respuestas en la inducción de callo.
Se evidenció la favorable respuesta a formar callos. Los mejores resultados en la
inducción de callos en esta investigación se dieron al quinto día, produciendo 1372
callos a partir de 1038 anteras sembradas en el cruce INIAP 12 x GO 38063. Se obtuvo
buena respuesta androgénica en formación callos embriogénicos (Figura 17).
D. TUMBACO/UG, 2014.
Figura 17.
4.10.
D. TUMBACO/UG, 2014.
Callos por tratamiento en frio: flores expuestas a un pre tratamiento en frio (A); Callos
obtenidos del tratamiento en frio (B). EELS/UG, 2014.
Callos por condiciones ambientales (cuarto oscuro)
Adicionando a las variables evaluadas, para el cruce INIAP 16 x GO38063, se
consideró la temperatura en la fase de inducción, calculando la respuesta de cinco
repeticiones en cada ambiente. La exposición a temperatura de 22 ºC por 8 horas al día
facilitaron la respuesta al cultivo de anteras, formándose callos de color blancos
disgregables y óptimos para desarrollarse en el medio de regeneración de plantas,
mientras que los callos que estuvieron a temperatura de 28 ºC se formaron de color café
y friables al final siguieron creciendo hasta que comenzaron a fenolizarse con poca
respuesta a la diferenciación de órganos vegetales (Figura 18 A-B). Los resultados del
efecto a temperatura en la formación de callos, diferenciación de órganos y
regeneración tanto de plantas verdes como albinas se presentan en la Figura 18. Toledo,
et al., (1998) mencionan que la reducción de temperaturas ha sido el recurso más
comúnmente utilizado para disminuir el crecimiento de los cultivos. La mayoría de los
cultivos in vitro son mantenidos a temperaturas entre 120 y 20ºC; a temperaturas más
bajas, la tasa de crecimiento disminuye, pero esta reducción depende de especies. Lo
que corresponde a usar este tipo de ambiente propicio para la inducción de callos.
42
Análisis de respuesta al CA en funcion de la
temperaturas
150
103
100
50
40
27,00
5,00
2,00 2,00
20,00
0,00
D.O
PV
PA
0
CALLOS
28ºC
D. TUMBACO/UG, 2014.
Figura 18.
22ºC
D. TUMBACO/UG, 2014.
Análisis de respuesta del cruce INIAP 16xGO3806 al uso de dos temperaturas en la fase
de inducción (Cuadro) – Callos por condiciones ambientales: formación de callos
blancos disgregables recomendables para transferir los en el medio de regeneración de
plantas (A); desarrollo de callos de color cafés y friables (B). EELS/UG, 2014.
4.11. Crecimiento de callos en los medios líquidos y sólido
El medio líquido de inducción promueve la formación de abundantes callos
pequeños. Se comprobó que al vaciar estos a un medio sólido, su desarrollo se mejora,
facilitando así la transferencia al medio de regeneración (Figura 19 A y B). La mejor
respuesta para la inducción de callos se reflejó en el medio de inducción solido MS
(gelrite); estableciendo un promedio de 50 callos embriogénicos. Se observaron
estructuras o aglomeraciones formadas de células no diferenciadas a manera de masa
amorfa que se formaron a los 35 días de inducción sobre la superficie de la antera o
alrededor de ella, estos callos miden aproximadamente 1mm y de consistencia dura.
(Figura 19 C).
En este medio sólido, los callos embriogénicos presentaron un color blanco y de
aspecto manejable (Figura 19 D). Una mejor propagación se dio entre los 35 y 40 días;
para entonces su tamaño fue de 2 mm de diámetro, siendo ese el momento indicado
para transferirlos al medio de regeneración para la diferenciación de órganos vegetales.
43
Dichas estructuras embriogénicas posteriormente se tornaron de color verde y
finalmente formaron un abundante sistema radicular; lo que coincide con Lentini,
Martínez y Roca (1997) y Quintero (2003), quienes expresan que los callos empiezan
aparecer alrededor de los 20 días de cultivo y alcanzan una inducción masiva entre los
40 y 50 días.
.
D.TUMBACO/UG, 2014.
Figura 19.
Crecimiento de los callos en los medios líquido y solido ; Callos pequeños en medio liquido
listo para ser dispensado en los medios solidos (A) desarrollo de los callos pequeños en el
medio solido (B) callos disgregándose formando cuerpos amorfos.(C); Crecimiento parcial
listo para poder ser transferido en el medio de regeneración dé plantas (B). EELS/UG,
2014.
44
V. CONCLUSIONES
De los doce cruces estudiados el potencial callogénico se dió en los materiales
índicos a partir de cruces simples, el mejor resultado se presentó en el cruce INIAP 12 x
GO 38063 donde se obtuvieron 1372 callos a partir de 1038 anteras sembradas (132%
de respuesta Callogénico).
El proceso de regeneración de órganos diferenciados, se presentó a partir de los
ocho días de transferidos los callos al medio de regeneración sólido, se observó el
desarrollo de cloroplastos y pigmentación verde iniciando sus estructuras más
organizadas como embriones, raíces y brotes.
Al sembrar las anteras directas al medio sólido con temperatura de 22 °C se
obtuvo una respuesta favorable al momento de crecimiento de los callos a partir de las
microsporas.
Los resultados obtenidos en esta investigación revelaron tres tipos de niveles de
ploidía en las plántulas regeneradas estas son; haploides, doble haploides y triple
haploides. Además, estos niveles ploidía se encontraron también en las plántulas
albinas.
45
VI. RECOMENDACIONES
Para futuras investigaciones se recomienda trabajar con los materiales que
presentaron mayor potencial de regeneración a mayor escalas, es decir mientras más
anteras sembradas más posibilidad de obtener callos para diferentes estudios.
Dado que inducción de callo se presenta mejor en un medio líquido pero estos
son pequeños difíciles de transferirlos, para poder lograr su crecimiento se recomienda
una segunda transferencia al mismo medio de inducción pero con agentes gelificantes
como sería el gelrite usados en esta investigación.
El medio ambiente optimo en estas regiones del litoral los callos responden a
temperaturas de 22°C, y un fotoperiodo de luminosidad de 16 horas luz con reflectores
tipo led. Los cuales no ejercen mucho calor. Por lo tanto, se recomienda tomar en
cuenta el protocolo utilizado en esta investigación.
Al tener aislado los callos en la estantería, estos inducen calor por la luz que
emite las fluorescentes y los envases sudan es necesario evitar este tipo de reacción ya
que las plántulas que se logran regenerar son más débiles. Esto se puede corregir con
equipos humificadores que no permitan que los envases den este aspecto de
transpiración.
Se sugiere que en los envases de medio de regeneración de plantas se adicione
carbón activo pues este absorbe los fenoles producidos por la diferenciación de tejidos.
46
RESUMEN
La presente investigación tuvo como objetivo la obtención de plantas doble
haploides homocigóticas de arroz a partir de 12 generaciones F1 provenientes de
cruzamientos simples. Las actividades realizadas fueron siembras de anteras en los
medios de inducción de callos MS. En este medio se desarrollaron microcallos que
luego fueron transferidos cuando median 2mm aproximadamente a un medio de
regeneración de plantas, observando que comenzaron a desarrollar cloroplastos y
pigmentación verde iniciando sus estructuras más organizadas como embriones, raíces y
brotes; llegando a inducir a la androgénesis y obtener plantas doble haploides
determinadas por citometría de flujo a partir del contenido de ADN de las plantas
regeneradas.
En potencial callogenico la mejor respuesta se encontró en los tratamientos
INIAP 12 x GO 38063 (372 callos); INIAP 14 x INIAP 12 (415 callos); F 50 x GO
3840 (581 callos). Demostrando que estos
cruces tienen una gran capacidad para
producir callos. Sin embargo, la mejor respuesta androgénica para regeneración de
plantas pertenece al cruce GO 38404 x INIAP 16. Logrando regenerar un total de cinco
plantas las cuales se les determino su ploidía por citometro de flujo descubriendo que
2 plántulas eran doble haploides y 3 plántulas haploides.
La mejor respuesta para inducción de callos se consiguió sembrando anteras
directo al medio de inducción sólido adicionándole agente gelificante (Gelrite), estos
callos se formaron más duros que los del medio líquido. También con anteras
sembradas en el medio de inducción líquido produjo muchos callos pequeños, éstos
fueron transferidos a otro medio de inducción de callos solido ayudando a formarse y
desarrollarse mejor.
Cabe destacar que el efecto con el estado de desarrollo de la microspora fue
favorable determinando así el estado uninucleado medio o tardío preciso para inducir
callos mediante la técnica de cultivo de anteras; descubriendo relación con la planta
donante, la hoja bandera debe de estar emergida y a una distancia de 2 a 5 cm, desde la
aurícula de esta hoja y la aurícula de la hoja anterior mientras que, el medio ambiente
47
para su incubación en el cuarto de crecimiento funcionó con temperatura de 22°C
durante 8 horas diarias.
En regeneración de plantas verdes se obtuvo buena respuesta en los tratamiento
INIAP 12 x JAPÓN (DH); INIAP 14 x INIAP 12 (TP), (TP); INIAP 16 x GO38063
(DH), (DH), (DH), (TP); GO38404 x INIAP 16 (DH), (DH), (H), (H), (H); JAPÓN x
INIAP 16 (H), logrando aclimatarse y adaptarse en el vivero. Las plántulas albinas
permanecieron en el laboratorio debido a que en las pruebas preliminares de
aclimatación realizadas no se adaptaron al cambio y fenecieron.
48
SUMMARY
The present study aimed to obtain homozygous doubled haploid rice plants from
12 generations F1 from single crosses. The activities included anther callus induction in
MS media (Murashige & Skoog). In that medium, Microcalli were developed and
transferred to plant regeneration medium when they measured 2mm approximately .
After that, chloroplasts and green pigmentation were observed, starting their structures
more organized as embryos, roots and shoots, thus, androgenesis induced reached
double haploid plants and finally flow cytometric DNA from the contents of the
regenerated plants were determined.
The best response to the callogenic potential was found in the INIAP 12 x GO
38063 (1372 calluses) treatments; INIAP 14 x INIAP 12 (415 callus); F 50 x GO 3840
(581 calluses). These crosses have a great capacity to produce callus. However the best
androgenic response to regeneration of plants belongs to the crossing GO 38404 x
INIAP 16., achieving a total of five regenerated plants which their ploidy were
determined by flow cytometer and discovering that two seedlings were double haploid
and 3 plantlets were haploid.
The best response for callus induction was achieved through direct anthers
culture in the solid medium with Gelrite, those calluses were formed harder than in
liquid medium (they do not easily disintegrated). This process also resulted in liquid
medium culture anthers producing many small calluses. Those ones were transferred to
another solid medium for induction and there callus were well formed and develop
better.
Note that the effect with the state of development of the microspore was
favorable, determining the average or late uninucleate state to induce callus by anther
culture technique. The relation with the donor plant and the flag leaf must be already
emerged a distance of 2-5 cm from the atrium of this sheet and the atrium of the
previous sheet. The temperature of 22 ° C for 8 hours per day were used for incubation
in the growth room and in that conditions thecalluses were not phenolized.
49
In regeneration of green plants, the good response was obtained in INIAP 12 x
JAPAN (DH); LNlAP 14 x lNlAP 12 (TP), (TP); INIAP 16 / GO38063 (DH), (DH),
(DH), (TP); GO38404 / INIAP 16 (DH), (DH), (H), (H), (H); JAPAN x INIAP 16 (H),
achieving acclimate and adapt in the nursery. The albino seedlings were kept in the
laboratory because in preliminary tests, they did not adapt to climate changes.
50
LITERATURA CITADA
Álvarez, B. A. (2000). Unidad de Citometría. Centro Nacional de Investigaciones
Cardiovasculares. ISCIII, Madrid.
Arana, L., Celi, R., Reyes, W. (2012). Cultivo in vitro de anteras en arroz (Oryza sativa
L.) para inducir plantas doble haploides homocigóticas. Plegable. INIAP,
E.E.L.S. Ecuador 2012.
APN, (Academic Publishers Norwell MA. USA) (1999). Biotechnology Department
Center for the Development of Biotic Products. IPN. Zacatepec. Experimental
Field, Plant Biotechnology, INIFAPPO 24. Yautepec, Morelos 62731. Mexico.
http://132.248.9.34/hevila/Biotecnologiaaplicada/2005/vol22/no1/6.pdf
Bernis, J. M. (2004) Variedades y mejora del arroz ( Oryza sativa L.) Universidad
Internacional de Cataluña España: pp. 462.
http://books.google.es/books?id=6BXxlGGUXewC&printsec=frontcover&hl=es
#v=onepage&q&f=false
BOUTHERIN, D. y BRON, G. 1994. Multiplicación de plantas hortícolas. Primera
edición. Zaragoza, Acribia. 225 p.
CATIE, (1991). Centro Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza. Informe
anual 1991. Programa I: Mejoramiento de cultivos tropicales (cacao, café y
plátano). Turrialba, Costa Rica. pp. 08- 09-12.
http://books.google.com.ec/books?id=Cx8OAQAAIAAJ&pg=PA8&dq=cultivo
+de+anteras+aplicadas+al+fitomejoramiento&hl=es&sa=X&ei=TVaLU7nvN7f
LsQSQwYCgDQ&ved=0CDwQ6AEwBA#v=onepage&q=cultivo%20de%20ant
eras%20aplicadas%20al%20fitomejoramiento&f=false
CIAT,
(1981).
Improved
rice
germoplasm
Latin
America
and
the
Caribbean.Annualreport. Centro de Investigación en Agricultura Tropical
(CIAT):pp. 86.
CIAT, (1981). Mejoramiento del arroz. (Centro Internacional de Agricultura Tropical,
CO) P.R. Jennings, W.R. Coffman, y H.E. Kauffman. Cali, CO. (09SR-3) ISBN
89206-06-6,pp. 236.
CIAT (1989). El cultivo de anteras en el mejoramiento del arroz. (Centro Internacional
de Agricultura Tropical, CO) Contenido científico: V.M. Núñez, W.M. Roca, y
C.P v. Martínez, Producción: Liliana Bejarano. Cali, CO. (04SR-07.02).pp.60 .
51
http://books.google.com.ec/books?id=i5zRon0BiucC&printsec=frontcover&dq=
protocolo+para+el+cultivo+de+anteras&source=gbs_similarbooks_s&cad=0#v=
onepage&q&f=false
CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, CO). 1991. Cultivo de tejidos en
la
agricultura: Fundamentos y aplicaciones. Roca, W. M. y Mroginski, L. A.
Cali, CO. pp.280
http://books.google.com.ec/books?id=EXijYNw55DUC&pg=PA283&dq=cultiv
o+de+anteras+en+arroz&hl=es&ei=fDHITM2TDoKs8AaB7aRB&sa=X&oi=bo
ok_result&ct=result&resnum=4&ved=0CDkQ6AEwAw#v=onepage&q=cultivo
%20de%20anteras%20en%20arroz&f=false
Cistué L, Ramos A, Castillo AM, Romagosa I (1994) Production of large number of
doubled haploid plants from barley anthers pretreated with high concentrations
of mannitol. Plant Cell Rep 13:709–712 [PubMed]
COLLIN, H. A. (1987); Determinants for yield of secondary products in plant tissue
cultures. En: Advances in Botanical Research. Vol 13; P.145-185.
Devaux P, Pickering R. Haploids in the improvement of Poaceae. In: Don Palmer CE,
Keller W, Kasha K, editors. Haploids in crop improvement II. Berlin: Springer;
2005. pp. 215–242.
FAO (2013).Food and Agriculture Organization of the United Nations.OCDE/FAO
2013), OCDE-FAO Perspectivas Agrícolas 2013-2022, Texcoco, Estado de
México, (en línea). Consultado el 20 de mayo del 2014.
http://www.fao.org/docrep/018/i3307s/i3307s.pdf
Forster, B.P. y Powell, W. (1997). Haploidy in barley. En In vitro haploid production in
higher plants, Jain, S.M., Sopory, S.K., Veilleux, R.E. (eds). Kluwe, Dordrecht,
pp. 99-115.
Franquet, J. y Borrás, C., 2006, “Variedad y mejora del arroz (Oryza sativa, L.)”,
Universidad Internacional de Cataluña y la Asociación de Ingenieros
Agrónomos de Cataluña, pp. 5-9.
Gonzales, A. M. (2013). Morfología de Plantas Vasculares - Facultad de Ciencias
Agrarias, Sgto. Cabral 2131. Argentina
http://www.redalyc.org/pdf/1932/193215872004.pdf
52
Harada T1, Ishikawa R, Niizeki M, Saito K. (1992). Pollen-derived rice calli that have
large deletions in plastid DNA do not require protein synthesis in plastids for
growth. Faculty of Agriculture, Hirosaki University, Japan.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1603057/
Hoekstra S, van Zijderveld MH, Louwerse JD, Heidekamp F, van der Mark F (1992)
Anther and microspore culture of Hordeum vulgare L. cv. Igri. Plant Sci 86:89–
96
Hoekstra S, van Bergen S, van Brouwershaven IR, Schilperoort RA, Wang M (1997)
Androgenesis in Hordeum vulgare L.: effects of mannitol, calcium and abscisic
acid on anther pretreatment. Plant Sci 126:211–218
INEC. (2014), Instituto Nacional de Estadística y Censos. Encuesta de Superficie y
producción Agropecuaria Continua ESPAC 2002-2011.
Instituto of Crop Science, (2004) Anther and microspore culture. International Training
course on Application of Induced Mutation &Biotechnology for Crop Salt
Tolerance Improvement (Aug 2-6: Beijing), 2004. (en linea). disponible:
http://www.redalyc.org/pdf/1932/193215872004.pdf
Janshen, R. C. (1992). On the selección for specific genes in doubled haploids. Here
dity 69: 92-92.
Jacquard C, Nolin F, Hecart C, Grauda D, Rashal I, Dhondt-Cordelier S, Sangwan RS,
Devaux P, Mazeyrat-Gourbeyre F, Clemént C. Microspore embryogenesis and
programmed cell death in barley: effects of copper on albinism in recalcitrant
cultivars. Plant Cell Rep. 2009;28:1329–1339. doi: 10.1007/s00299-009-0733-z.
[PubMed]
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3921450/
Jennings, PR; Coffaman , WR; Kauffam, HE. 1979. Rice improvement. International
Rice ResearchInstitute . Los Baños, Philippines. 02 p.
Lentini, Z., Martínez, C., y Roca, W. (1997). Cultivo de anteras de arroz en el desarrollo
de germoplasma. Cali, CO. Centro Internacional de Agricultura Tropical
(Publicación CIAT; № 293) ISBN 958-9439-92-6. 57 p.
http://www.fao.org/sd/erp/toolkit/BOOKS/cultivo_anteras.pdf
MAGAP (2012). Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca.
Subsecretaría de Comercialización. Dirección de Estudios Técnicos de
53
Comercio. INFORME SITUACIONAL DE LA CADENA DEL ARROZ. No: 1
Periodo: Enero – Diciembre (Ecuador 2012).
MAGAP (2013). Diario El Universo. Economía. (Ecuador 2013). Un promedio de 117
libras de arroz al año consume cada ecuatoriano. p 16.
http://www.eluniverso.com/noticias/2013/09/19/nota/1462276/promedio-117libras-arroz-ano-consume-cada-ecuatoriano
Maluszynski, M., Kasha, K.J., Forster, B.P. y Szarejko, I. (eds) (2003a). En Doubled
Haploid Production in Crop Plants: A Manual. Kluwer, Dordrecht.
http://zaguan.unizar.es/TAZ/EPSHUES/2014/16943/TAZ-PFC-2014-509.pdf
Morejón, R., Díaz, S. H., & Pérez, N. (2001). Aplicación de técnicas multivariadas en la
clasificación morfoagronómica de genotipos de arroz obtenidos en la estación
experimental “Los Palacios”. Cultivos Tropicales,22(1), 43-48.
Muñoz-Amatriaín, M. (2007). Control genético y variación transcripcional de la
embriogénesis de la microspora en cebada.
http://digital.csic.es/bitstream/10261/12467/1/2007TesisMar%C3%ADaMu%C3%B1oz.pdf
Noguera A., (2005). Cultivo de anteras de arroz (Oryza sativa L.) en cuatros cultivares
de los grupos indica y japónica. Trabajo de grado. Facultad de Agronomía.
Universidad Central de Venezuela. Maracay – Venezuela. p 83.
Paca, C. (2011). Producción de arroz en el Ecuador. MAGAP (Ecuador 2011).
Pérez P., AV., (2006). Desarrollo y uso de las técnicas in vitro en el mejoramiento
genético del arroz: cultivo de anteras en arroz. In: Curso de capacitación en
mejoramiento genético en arroz. Sanoti Spiritu, CU. 8 p.
http://agr.unne.edu.ar/fao/Cuba-ppt/3cultivo%20invitro-Padron.pdf
Poelhlman, JM.; Allen., D. (2003). Mejoramiento genético de las cosechas 2ed distrito
(DF), Federal México, pp. 17, 33, 62, 174, 281.
Quintero M., MA. 2003. Ajuste del Sistema Rita® para la Inducción de Callo
Embriogénico y Regeneración de Plantas a partir del Cultivo de Anteras de
Arroz. Tesis de Ingeniero Agrónomo. Universidad Nacional de Colombia,
Facultad de Ciencias Agropecuarias, CO 107 p.
Roca, W. M., & Mroginski, L. A. (Eds.). (1991). Cultivo de tejidos en la agricultura:
fundamentos y aplicaciones (No. 151). Ciat.
http://books.google.com.ec/books/about/Cultivo_de_tejidos_en_la_agricultura.ht
ml?id=EXijYNw55DUC&redir_esc=y
54
Shariatpanahi ME, Bal U, Heberle-Bors E, Touraev A (2006) Stresses applied for the
re-programming of plant microspores towards in vitro embryogenesis. Physiol
Plantarum 127:519–534
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2700865/
Sasson, A. (1985). Desarrollo y uso de las técnicas in vitro en el mejoramiento genético
del arroz.
I curso de capacitación en el mejoramiento genético en arroz:
noviembre 1985. La Habana. Cuba: IDEA, 2004. (Informes IDEA) (Boletín
IDEA; n. 6).
Sica. 2003. (Servicio de información y censo agropecuario del Ministerio de
Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca, Ec.). Importancia del arroz.
http://www.sica.gov.ec.
Shen,; Fang, L. M.; Quan, C, ; y Hua, Z. Z. (1983). Improving rice by anther culture. In
: Cell and tissue culture techniques for cereal crop improvement. Science Press,
Beijin, China.
Suarez, C, E, (2006). Principios del mejoramiento genético en el arroz. Habana, CU
Instituto de investigación del arroz (IIRROZ) (en línea). Disponible en:
http://agr.unne.edu.ar/fao/Cuba-ppt/1MEJORAMIENTO%20GENeTICO.pdf
Consultado el 24 de mayo del 2014
Szarejko, I. (eds). Kluwer, Dordrecht, pp. 337-349.
Thomas, W.T.B., Forster, B.P. y Gertsson B. (2003). Doubled haploids in breeding. En
Doubled Haploid Production in Crop Plants: A Manual, Maluszynski, M.,
Kasha, K.J., Foster, B.P.
Toledo, J; Espinoza, N; Golmirzae ,A; (1998).Cultivo de tejidos. Manejo de plantulas in
vitro en la produccion de semilla de papa.Centro Internacional de la papa CIP.
98 pg.
Torres, J. (2002). Apuntes de Genética forestal. Catedra de Mejoramiento Genético
Forestal. Facultad de Ciencias Forestales, Universidad de Chile. 132pp.
http://fcf.unse.edu.ar/archivos/biblioteca/Trabajo%20final%20%20Carla%20Salt
o.pdf
Touraev A, Vicente O, Heberle-Bors E (1997) Initiation of microspore embryogenesis
by stress. Trends Plant Sci 2:297–302
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2700865/
55
Universidad Católica de Temuco (2002). Introducción a las Ciencias Agrarias.
Documento de apoyo a la docencia. P 48.
Velásquez, R., Noguera, A., Blanca, I., & Mata, J. (2005). Evaluación de dos
metodologías para la determinación del nivel de ploidía en plantas de arroz
(Oryza sativa L.) regeneradas por cultivo de anteras. Revista de la Facultad de
Agronomía, 36(1), 36-1.
http://www.revistaagronomiaucv.org.ve/revista/articulos/2010_36_1_1.pdf
56
ANEXOS
Anexo 1.
Niveles de ploidía descubiertos por citometría de flujo marca (PARTEC) en
plántulas regeneradas obtenidas por Cultivo de anteras. EELS/UG, 2014.
58
Anexo 2. Preparación de soluciones stocks y medio de cultivo M1, para la inducción de callos. (Fuente: CIAT/2012)
SOLUCIÓN
STOCK/LITRO
DE MEDIO
(mL)
COMPONENTES
CANTIDAD
(mg)
(NH4)2SO4
KNO3
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
Na2MoO4.2H2O
H3BO3
MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2
Kl
Tiamina-HCl
Acido nicotínico
Piridoxina-HCl
Glicina
2320
31340
1860
1500
25
600
1690
1000
2,5
1,4
100
125
125
125
125
4
KH2PO4
5400
100
10
5
Na2EDTA
Fe2SO4.7H2O
750
550
100
5
SOLUCIÓN
1
2
3
H2O
(mL)
1000
100
Disolver en agua destilada y deionizada. Mantener en
refrigeración máximo un mes
1
Disolver en agua destilada y deionizada. El CuSO4.5H2O se
disuelve previamente en 1 mL de agua destilada y deionizada, de
igual forma se disuelve CoCl2 antes de incorporarse a la
solución stock. Mantener en refrigeración hasta por 5 meses
100
50
PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE
SOLUCIONES STOCKS
1
59
Disolver en agua destilada y deionizada. Cuando al preparar la
solución con Tiamina-HCl, este producto no se disuelve bien, se
debe calentar ligeramente. Esta solución se puede guardar
durante 1 ó 2 meses, en refrigeración.
Disolver en agua destilada y deionizada. Mantener en
refrigeración hasta por 5 meses.
Para preparar la solución fuente de hierro, se disuelven por
separado en agua destilada y deionizada, el Na2EDTA y el
Fe2SO4.7H2O, en la cuarta parte del volumen final de la
solución, al disolver el Na2EDTA se debe calentar un poco en
baño de María. Posteriormente se mezclan los dos volúmenes, se
agitan bien y se deja enfriar, para luego completar con el agua el
volumen final. La solución se debe envasar en un frasco oscuro,
y se almacena a temperatura ambiente, donde puede mantenerse
hasta por 5 meses.
6
7
8
2,4-D
AFA
Cinetina
50
100
100
100
100
100
4
La solución 2,4-D se prepara adicionando los 50 mg del
compuesto a 5 mL de etanol de 50% calentado levemente al
baño de María. Luego se ajusta el volumen final a 100 mL, con
agua previamente calentada a la misma temperatura. Almacenar
en refrigeración.
10
Disolver 100 mg de AFA en 50 mL de agua destilada, calentar
suavemente, ajustar el volumen final a 100 mL con agua
destilada y filtrar utilizando filtros de 0,22 micras; debe hacerse
en cámara con extractor de aire. Almacenar en refrigeración en
frasco oscuro.
0,5
La solución de Cinetina se prepara disolviendo los 100 mg del
compuesto en aproximadamente 5 mL de HCl 0,5 N. Se calienta
a baja temperatura hasta que se disuelva, y entonces se ajusta el
volumen a 100 mL. Esta solución se divide en alícuotas de
aproximadamente 10 mL cada una, para almacenar en el
congelador a 0oC. Antes de usar cada alícuota se debe
descongelar en baño de María, y el remanente se almacena a 4oC
(refrigerador) por un máximo de 1 mes.
Preparación de 1 litro de medio M1 para inducción de callos:
1. Colocar 500 mL de agua destilada y deionizada en el recipiente donde va a preparar el medio
2. Adicionar las cantidades de las soluciones madres, siguiendo el mismo orden y con agitación continua; excepto el AFA.
3. Adicionar 80 g de maltosa
4. Completar el volumen a 1 litro
5. Ajustar el pH a 5,8
6. Esterilizar el medio en un autoclave a 122 ºC de temperatura y 20 psi de presión, durante 15 minutos
7. Enfriar, adicionar el AFA en cámara (esterilizado con filtro 0,22 micras), dispensar y almacenar en refrigeración, donde puede permanecer hasta
por 2 meses
60
Anexo 3.
SOLUCIÓN
1
2
Preparación de soluciones stocks y medio de cultivo L1, para la inducción de callos. (Fuente: CIAT/2012)
COMPONENTES
KNO3
NH4NO3
KH2PO4
MgSO4.7H2O
MnSO4.H2O
H3BO3
CuSO4.5H2O
ZnSO4.7H2O
H2MoO4
CoCl2
Fe2SO4.7H2O
CANTIDAD H2O
(mg)
(mL)
38000
33250
3400
7400
1690
620
50
1050
50
5
500
100
100
Na2EDTA
278
374
4
CaCl2.2H2O
1760
100
5
KI
20
3
25
SOLUCIÓN
STOCK/LITRO PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE
DE MEDIO (mL) SOLUCIONES STOCKS
25
Disolver en agua destilada y deionizada. Mantener en
refrigeración hasta por 1 meses
1
Disolver en agua destilada y deionizada. El CuSO4.5H2O se
disuelve previamente en 1 mL de agua destilada y deionizada,
de igual forma se disuelve CoCl2 antes de incorporarse a la
solución stock. Mantener en refrigeración hasta por 5 meses
Para preparar la solución fuente de hierro, se disuelven por
separado en agua destilada y deionizada, el Na2EDTA y el
Fe2SO4.7H2O, en la cuarta parte del volumen final de la
solución. Al disolver el Na2EDTA se debe calentar un poco en
baño de María. Posteriormente se mezclan los dos volúmenes,
se agitan bien y se deja enfriar, para luego completar con el
agua el volumen final. La solución se debe envasar en un frasco
oscuro, y se almacena a temperatura ambiente, donde puede
mantenerse hasta por cinco meses.
Disolver en agua destilada y deionizada. Mantener en
refrigeración hasta por cinco meses.
10
2,9
Disolver en agua destilada y deionizada. Mantener en
refrigeración hasta por un meses
1
61
6
7
8
9
Acido nicotínico
Piridoxina
Thiamina Glicina
Arginina
Biotina
50
50
100
200
1,25
170
1000
Acido Indol Acético
25
1000
Cinetina
25
100
2,4-D
25
25
Disolver en agua destilada y deionizada. Cuando al preparar la
solución con Tiamina-HCl, este producto no se disuelve bien,
se debe calentar ligeramente. Esta solución se puede guardar
durante uno ó dos meses, en refrigeración.
10
La solución AIA se prepara adicionando los 25 mg del
compuesto a 2.5 mL de etanol al 50% calentado levemente al
baño de María. Luego se ajusta el volumen final a 1000 mL,
con agua previamente calentada a la misma temperatura.
Almacenar en refrigeración.
La solución de Cinetina se prepara disolviendo los 25 mg del
compuesto en 1 mL de HCl 0.5 N. Se calienta a baja
temperatura hasta que se disuelva, y entonces se ajusta el
volumen a 100 mL. Almacenar en refrigeración.
La solución 2.4-D se prepara adicionando los 25 mg del
compuesto a 2.5 mL de etanol al 50% calentado levemente al
baño de María. Luego se ajusta el volumen final a 100 mL, con
agua previamente calentada a la misma temperatura.
Almacenar en refrigeración.
2
2
1
Preparación de 1 litro de medio MS para inducción de callos:
1. Colocar 500 mL de agua destilada y deionizada en el recipiente donde va a preparar el medio
2. Adicionar las cantidades de las soluciones madres, siguiendo el mismo orden y con agitación continua
3. Adicionar 100 mg de Myo-Inositol
4. Adicionar 50 mg de Acido Ascórbico
5. Adicionar 30 g de sacarosa
6. Adicionar 100 mL de agua de coco
7. Completar el volumen a 1 litro, Ajustar el pH a 5.8 y adicionar 3 g de Gellan Gum
8. Esterilizar el medio en un autoclave a 122 ºC de temperatura y 20 psi de presión , durante 15 minutos
9. Dispensar en cámara de flujo, enfriar y almacenar en refrigeración, donde puede permanecer hasta por 2 meses
62
Anexo 4.
SOLUCIÓN
1
2
Preparación de soluciones stocks y medio de cultivo MS, para regeneración de plantas RP. (Fuente: CIAT/2012).
COMPONENTES
NH4NO3 KNO3
MgSO4.7H2O
KH2PO4
Na2MoO4.2H2O
H3BO3 MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2
CANTIDAD H2O
(mg)
(mL)
82400
95200
18400
8400
25
620
1692
860
2.5
1.4
SOLUCIÓN
STOCK/LITRO
DE MEDIO (mL)
1000
20
100
1
3
Kl
83
100
1
4
CaCl2.2H2O
1500
100
29
750
550
100
5
5
Na2EDTA
Fe2SO4.7H2O
PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE SOLUCIONES
STOCKS
Disolver en agua destilada y deionizada. Mantener en
refrigeración hasta por 1 meses
Disolver en agua destilada y deionizada. El CuSO4.5H2O se
disuelve previamente en 1 mL de agua destilada y deionizada, de igual
forma se disuelve CoCl2 antes de incorporarse a la solución stock.
Mantener en refrigeración hasta por 5 meses
Disolver en agua destilada y deionizada. Mantener en
refrigeración hasta por 5 meses
Disolver en agua destilada y deionizada. Mantener en
refrigeración hasta por 5 meses
Para preparar la solución fuente de hierro, se disuelven por separado
en agua destilada y deionizada, el Na2EDTA y el Fe2SO4.7H2O, en la
cuarta parte del volumen final de la solución. Al disolver el
Na2EDTA se debe calentar un poco en baño de María. Posteriormente
se mezclan los dos volúmenes, se agitan bien y se deja enfriar, para
luego completar con el agua el volumen final. La solución se debe
envasar en un frasco oscuro, y se almacena a temperatura ambiente,
donde puede mantenerse hasta por 5 meses
63
6
Tiamina-HCl Acido
nicotínico
Piridoxina-HCl
Glicina
10
50
50
200
100
1
7
myo-Inositol
5000
500
10
8
9
ANA
Cinetina
200
500
200
500
1
4
Disolver en agua destilada y deionizada. Cuando al preparar la solución con
Tiamina-HCl, este producto no se disuelve bien, se debe calentar ligeramente.
Esta solución se puede guardar durante 1 ó 2 meses, en refrigeración.
Disolver en agua destilada y deionizada. Mantener en refrigeración
hasta por 2 meses
La solución de ácido naftalenacético (ANA) se prepara disolviendo 200 mg
del compuesto en aproximadamente 5 mL de KOH 0,5 N. Luego se
calienta a temperatura baja hasta disolver y se completa con agua el
volumen final a 200 mL. Es aconsejable preparar esta solución semanalmente.
La solución de Cinetina se prepara disolviendo los 500 mg del compuesto
en aproximadamente 25 mL de HCl 0.5 N. Se calienta a baja temperatura
hasta que se disuelva, y entonces se ajusta el volumen a 500 mL. Esta
solución se divide en alícuotas de aproximadamente 10 mL cada una, para
almacenar en el
o
congelador a 0 C. Antes de usar cada alícuota se debe descongelar en
baño de María, y el remanente se almacena a 4oC
(refrigerador) por un máximo de 1 mes.
Preparación de 1 litro de medio MS para regeneración de plantas:
1. Colocar 500 mL de agua destilada y deionizada en el recipiente donde va a preparar el medio
2. Adicionar las cantidades de las soluciones madres, siguiendo el mismo orden y con agitación continua
3. Adicionar 30 g de sacarosa
4. Completar el volumen a 1 litro
5. Ajustar el pH a 5.8
6. Adicionar 3 g de Gellan Gum
7. Esterilizar en un autoclave a 122oC de temperatura y 20 psi de presión , durante 15 minutos
8. Dispensar en cámara de flujo, enfriar y almacenar en refrigeración, donde puede permanecer hasta por 2 meses.
64
Anexo 5. Proceso de formación de plantas bajo condiciones in vitro: Diferenciación de órganos
vegetales (A); Regeneración de plantas (B); Aclimatación de plantas (C). EELS/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
D. TUMBACO/UG, 2014.
65