Pacheco, Solange - Universidad Católica del Norte

VARIACIÓN DE FUCANOS EN DOS ECOMORFOS DE MACROCYSTIS PYRIFERA
(LINNAEUS) C. AGARDH (LAMINARIALES, PHAEOPHYCEAE) EN CHILE.
S. Pacheco-Ortiz1, N. P. Chandía2 & E. Macaya1
1
Universidad de Concepción, Concepción, Chile; 2Universidad Católica del Norte, Coquimbo, Chile.
[email protected]
INTRODUCCIÓN
Las algas marinas son una fuente natural de diversos tipos de polisacáridos (Mayer et al., 1987). Debido a las
singulares propiedades físico-químicas de éstos, la mayoría, son aislados para ser utilizados en la industria
farmacéutica, alimentaria, biomédica y consumo humano (Renn, 1997; Gupta & Abu-Ghannam, 2011;
Wijesinghe & Jeon, 2012). En particular, las algas pardas presentan una amplia variedad de polisacáridos de gran
interés en la biomedicina, y uno de los grupos ampliamente estudiados son los polisacáridos sulfatados (Pomin &
Maurao, 2008). Éstos tienen la característica principal de estar formados por monosacáridos de L-fucosa
sulfatados (Pomin & Maurao, 2008). Los cuales varían en su composición y estructura química dependiendo de la
especie del alga que se extraiga, de la parte del alga, de la época del año o del estado reproductivo. Son
polisacáridos altamente heterogéneos, pueden presentar monosacáridos de fucosa unidos por distintos tipos de
enlaces y presentar distintos grados de sulfatación (Berteau & Mulloy, 2003; Vishchuk et al., 2013a,b). Si
presentan otros monosacáridos unidos a la cadena, son polisacáridos de la familia de los fucanos, en cambio, sí
sólo presentan monosacáridos de fucosa pertenecen a los fucoidanos (Berteau & Mulloy, 2003). Se ha sugerido
que ésta variabilidad afecta la eficacia de los polisacáridos en su bioactividad, estableciendo en distintos estudios
que hay una relación estructura-actividad biológica (Vishchuk et al., 2013b).
Chile es uno de los grandes exportadores de harinas de algas pardas principalmente para la obtención de ácido
algínico. Para esto, son utilizadas talos completos de las especies Lessonia spp, Durvillaea antarctica y
Macrocystis pyrifera (Vázquez, 2008). En cuanto a los polisacáridos sulfatados, estudios químicos en Lessonia
spp y Durvillaea antactica han determinado la presencia de polisacáridos del tipo fucano y fucoidano, donde
éstos exhiben actividad anticoagulante y elicitora en plantas de tabaco (Matsuhiro et al., 1996; Chandía &
Matsuhiro, 2008). Sin embargo, para Macrocystis pyrifera, un alga con alta complejidad morfológica, no se ha
realizado la caracterización química de polisacáridos sulfatados presentes. Para Chile se ha reportado la presencia
del ecomorfo integrifolia en la zona norte (entre los 6-33°S) y el ecomorfo pyrifera en la zona sur (entre los 3356°S), los cuales presentan diferencias tanto en la morfología de disco-láminas cómo en el patrón reproductivo
(Buschmann et al., 2004; Demes et al., 2009). Por tanto, en éste trabajo se caracterizó la composición de
polisacáridos sulfatados de tres partes del alga (Lámina reproductiva, lámina vegetativa y estipe) para dos
ecomorfos de M. pyrifera, en dos localidades distintas ubicadas en el Norte y Sur de Chile.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se recolectaron aleatoriamente individuos de M. pyrifera en dos localidades del país. Las muestras del
ecomorfo integrifolia se obtuvieron de la localidad de Caleta Talquilla, Región de Coquimbo (30°52’37.55”S;
71°40’57.95”O), mediante buceo apnea a 4 metros de profundidad en un lugar expuesto en el mes de Enero.
Mientras que, las muestras del ecomorfo pyrifera se obtuvieron de la localidad de Caleta Chome (36°45’43.10”S;
73°11’48,10”O), mediante apnea a 1-2 metros de profundidad en el mes de Enero. Esta localidad está ubicada al
extremo sur de la península de Hualpén, siendo una zona rocosa semi-expuesta. Se recolectó 1 kg de alga húmeda
de cada parte del alga: lámina reproductiva (LR), lámina vegetativa (LV) y estipe (E). En el laboratorio se
lavaron inmediatamente con agua dulce para eliminar epifitos y restos de sedimento.
De las muestras limpias, secas y molidas, se sumergieron en una solución de Etanol-Formaldehído por 3 días.
Posteriormente, se trataron con éter de petróleo hasta no obtener ningún residuo sólido en el concentrado. Se
sometieron 20 g de cada muestra pre-tratada a extracciones sucesivas con CaCl2 al 2% en baño de agua a 85°C,
en agitación constante. Luego el extracto se centrifugó por 20 minutos y se dializó por 72 horas contra agua
destilada. Finalmente, las muestras se liofilizaron (Chandía, 2005). Para la caracterización química de cada
extracto se determinaron los azúcares totales por el método de fenol-sulfúrico (Dubois et al 1965). El peso
molecular fue determinado por el método de extremos reductores (Kolender, 2003). El contenido de grupos
sulfatos fue analizado por el método turbidimétrico de Dodgson & Price (1962). El contenido de ácidos urónicos
siguiendo la metodología de Filisetti-Cozzi y Carpita (1991), usando ácido gulurónico como estándar.
Finalmente, los grupos funcionales se determinaron mediante Espectroscopía de Infrarrojo con Transformada de
Fourier (FT-IR).
RESULTADOS
El análisis de rendimiento porcentual, el contenido de azúcares totales, proteínas, ácidos urónicos, grupos
sulfato y peso molecular se muestran en la tabla 1. El rendimiento porcentual en base seca del polisacárido
obtenido de LV (Lámina Vegetativa), E (Estipe) y LR (Lámina Reproductiva) mostraron diferencias
significativas (ANOVA, f= 1099414, P>0,01) en una misma localidad y entre localidades, donde el mayor
contenido de polisacárido lo presentó LV de Caleta Talquilla con un 8,2 ± 0,0014%. Además, LR (7,0%)
presentó mayor rendimiento que LV (6,2%) en Caleta Chome, por el contrario en Caleta Talquilla LV (8,8%)
presentó mayor rendimiento que LR (7,7%) (Tukey, p>0,001). El porcentaje de proteínas fue bajo en ambas
localidades, menor a un 0,004 ± 0,003%. En cuanto al contenido de hidratos de carbono, el contenido porcentual
varió entre 13,7-23%, entre todas las muestras analizadas. Por otro lado, todos los extractos de polisacáridos
mostraron la presencia de ácidos urónicos, pero no se observaron diferencias significativas (ANOVA, F= 0,5040,
p>0,05), tanto entre estructuras como entre localidades. Del mismo modo, no se obtuvieron diferencias
significativas en el peso molecular (ANOVA, F= 0,00706, p>0,05). Por último, estipes presentaron un mayor
contenido porcentual de sulfatos que LV y LR (Tukey, p>0,001), tanto en una misma localidad como entre
localidades (Tukey, p>0,001), en cambio, LV y LR no mostraron diferencias significativas (Tukey, p>0,05). En
cuanto a los resultados de la Espectroscopía de Infrarrojo con Transformada de Fourier (FT-IR), en los espectros
se observó que todas las muestras analizadas tuvieron las mismas propiedades de absorción de infrarrojos (figura
1). Se identificaron señales características en la región entre 4000-400cm-1, donde se observaron bandas
asociadas a grupos sulfatos y grupos que caracterizan la estructura (Tabla 1) (Matsuhiro et al., 1996;
Zvyagintseva et al., 2003; Chandía & Matsuhiro, 2008; Dantas-Santos et al., 2012; Gomaa, 2014).
Tabla 1: Composición química y peso molecular promedio numérico del polisacárido obtenido por extracción
de cloruro de calcio al 2% del ecomorfo integrifolia y el ecomorfo pyrifera de la localidad de Caleta Talquilla y
Caleta Chome, respectivamente. (* % peso seco de alga seca; ** % peso extracto).
Contenido**
Rendimiento
Peso
Localidad Muestra
(%)*
molecular
C. Talquilla
(Ecomorfo
integrifolia )
C. Chome
(Ecomorfo
pyrifera )
Ácidos
urónicos
(%)
S ulfatos
(NaS O3%)
Azúcares
totales (%)
Proteínas (%)
15,6 ± 6,0 29,8 ± 4,7
21,4 ± 6,4
0,004 ± 0,003
LV
8,2 ± 0,0014
145.920,0
LR
7,7 ± 0,0004
144.316,5
9,1 ± 3,1 32,3 ± 1,8
20,9 ± 1,9
0,005 ± 0,006
E
4,7 ± 0,0039
226.427,6
13,2 ± 4,6 58,0 ± 2,3
23,0 ± 1,3
0,004 ± 0,018
LV
6,2 ± 0,0013
95859,9
11,2 ± 2,8 27,8 ± 1,5
20,9 ± 1,60 0,003 ± 0,001
LR
7,0 ± 0,0012
120484,4
8,8 ± 2,3 30,9 ± 2,6
22,7 ± 5,92 0,005 ± 0,002
E
6,2 ± 0,0003
211819,4
9,1 ± 3,2 61,0 ± 4,5
13,7 ± 3,86 0,002 ± 0,000
Tabla 2: Señales del espectro de TF-IR y segunda derivada de polisacáridos obtenidos por extracción con
cloruro de calcio 2% de la Lámina vegetativa (LV) de Caleta Talquilla de M. pyrifera. Mismas señales obtenidas
para todas las estructuras de ambas localidades.
A
B
Figura 1: Espectro de IR-FT del polisacárido obtenido por extracción con cloruro de calcio al 2% de la lámina
vegetativa del ecomorfo integrifolia recolectadas en Caleta Talquilla. A: Normal; B: Segunda derivada.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN
Los resultados de éste trabajo registraron la presencia de polisacáridos sulfatados en Macrocystis pyrifera con
un rendimiento entre 4,74-8,75 %, mostrando que hay una variación en la composición química intra-alga en
ambos ecomorfos. Rendimientos similares se han registrado para otras especies de algas pardas de importancia
comercial que se encuentran en Chile (Lessonia spp.: 2,6-6,8%; Durvillaea antarctica: 2,4%) (Matsuhiro &
Zambrano, 1990; Matsuhiro et al., 1996; Chandía & Matsuhiro, 2008). Por otra parte, estudios que evaluaron la
variación de polisacáridos sulfatados intra-alga, determinaron que láminas reproductivas presentan mayores
rendimientos que láminas vegetativas, similar a lo determinado en este trabajo para láminas de M. pyrifera de la
localidad de Caleta Chome (Anastyuk et al., 2012; Scriptsova et al., 2012). En cambio, en Caleta Talquilla, las
láminas vegetativas presentaron mayores rendimientos que láminas reproductivas. Se ha sugerido que el rol de
los polisacáridos sulfatados en la liberación de esporas puede explicar ésta diferencia, donde láminas
reproductivas de Caleta Chome podrían haber estado en plena etapa de liberación de esporas y láminas
reproductivas de Caleta Talquilla en la etapa posterior a la liberación de esporas (Black et al., 1954; Evans et al.,
1973; McCully, 1968; Speransky et al., 2001). En relación a lo anterior, Buschmann et al. (2004) evaluaron los
patrones reproductivos de M. pyrifera en diferentes latitudes de Chile, determinando que láminas reproductivas
del ecomorfo integrifolia de la zona norte de Chile (28-30°S), en la estación de verano, presentaron soros
esporangiales en la etapa posterior a la liberación de esporas. En cambio, en láminas reproductivas del ecomorfo
pyrifera en la zona sur de Chile (40-41°S), en la misma estación, se encontraban en plena etapa de liberación de
esporas, concordando con los rendimientos obtenidos.
Los extractos obtenidos mediante CaCL2 al 2% muestran contenido de hidratos de carbono para ambas
localidades, indicando que los extractos obtenidos corresponden a polisacáridos. Además, se determinó la
presencia de ácidos urónicos en un alto porcentaje (8,8-15,5%), indicando que contiene otro tipo de
monosacáridos además de fucosa, por ésta razón se puede establecer que los polisacáridos obtenidos para ambas
localidades son del tipo fucano (Berteau & Mulloy, 2003). En cuanto al contenido de sulfatos, estipes muestran el
doble de contenido porcentual que láminas vegetativas y reproductivas, dentro de una misma localidad y entre
localidades, presentando un entre 57,9-60,9%. Estos valores son mayores a los registrados para otras algas pardas
(Anastyuk et al., 2012; Jin et al., 2013). Se sugiere que mayor contenido de grupos sulfato generan geles más
viscosos, y esta característica físico química podría ayudar con la resistencia mecánica contra el oleaje al estipe.
Del mismo modo, se ha determinado mediante un modelo hidrodinámico que los estipes de M. pyrifera soportan
grandes tensiones mecánicas producidas por la acción del oleaje (Utter & Denny, 1996). En relación al peso
molecular, no se determinan diferencias significativas, pero se observa una tendencia de mayores pesos
moleculares en Caleta Talquilla, una zona más expuesta. También se ha indicado que mayores pesos moleculares
dan mayor viscosidad al polisacárido, sugiriendo que éste fucanos ayudarían a las estructuras de ésta localidad
contra la mecánica del oleaje (Evans et al., 1973). En cuanto al análisis de FT-IR, esta técnica es muy utilizada
para identificar grupos orgánicos característicos de polisacáridos, además la segunda derivada de éstos espectros
dan señales más resueltas, proporcionando mayor información al aumentar el número de bandas (Liu et al.,
2014). En éste trabajo, los extractos obtenidos mediante CaCl 2 al 2%, muestran tres señales características que ya
han sido identificadas para polisacáridos sulfatados del grupo de los fucanos (ver tabla 2) (Zvyagintseva et al.,
2003; Chandía & Matsuhiro, 2008; Dantas-Santos et al., 2012). Además, se sugiere mediante las señales
encontradas que los monosacáridos de fucosa estarían sulfatados en la posición C2 y C4 (Matsuhiro et al., 1996;
Chandía, 2005; Jin et al., 2013). La información que se obtuvo sobre su composición química, en cuanto a la
presencia de ácidos urónicos, grupos sulfatos y la posible posición de éstos últimos en C2 y C4, podrían indicar
que los polisacáridos obtenidos tendrían una alta potencialidad en actividades biológicas como anticoagulante y
anticancerígenos (Matsuhiro et al., 1996; Jin et al., 2013; Vishchuk et al., 2013b), y la eficacia de los
polisacáridos obtenidos dependerían de la estructura del alga que se aísle.
En conclusión, este trabajo reporta la composición química de los polisacáridos sulfatados de Macrocystis
pyrifera, evidenciando que ambos ecomorfos presentan polisacáridos del tipo fucano. Además, la composición
química del ecomorfo integrifolia es similar al ecomorfo pyrifera, indicando que se puede obtener un
polisacárido con una composición química similar en dos localidades ubicadas en la zona norte (Talquilla) y sur
(Chome) de Chile. Por otra parte, cabe destacar que hay variación en su composición intra-alga, donde estipes
presentaron mayor contenido de grupos sulfatos en ambos ecomorfos, contribuyendo probablemente a la
resistencia contra el oleaje. De forma similar, el mayor rendimiento de fucanos en láminas reproductivas de caleta
Chome, podrían relacionarse con su rol en la liberación de esporas en la época de reproducción. Los resultados
proveen información útil para evidenciar que del alga comercial M. pyrifera se pueden aislar fucanos que podrían
tener distintas propiedades biológicas de interés biomédico como anticoagulante y anticancerígeno, dependiendo
de la parte del alga de que se aísle. Por ello, es importante tener conocimiento de la composición y estructura
química de los polisacáridos de las algas que se exportan como materia prima en Chile.
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