UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS TESIS DE GRADO PREVIA A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO AGRÓNOMO TEMA: Identificación y evaluación de antagonistas del tizón temprano (Alternaria solani) en tomate (Lycopersicon esculentum Mill) AUTOR: MARIUXI ROCIO MOLINA YAURE Directora de tesis: Ing. Agr. MSc. Leticia Vivas Vivas MILAGRO - ECUADOR 2010 - 2011 UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS La presente tesis de grado titulada “Identificación y evaluación de antagonistas del tizón temprano (Alternaria solani) en tomate (Lycopersicon esculentum Mill)” realizada por la Egda. MARIUXI ROCIO MOLINA YAURE, bajo la dirección de la Ing. Agr. M.Sc. Leticia Vivas Vivas ha sido aprobada y aceptada por el Tribunal de Sustentación como requisito parcial para obtener el título de INGENIERO AGRÓNOMO. TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓN Q.F. MSc. Martha Mora Gutiérrez Presidenta Ing. Agr. MSc. Leticia Vivas Vivas Examinadora Principal Directora de Tesis Ing. Agr. Valeriano Bustamante García Examinador Principal Ing. Agr. MC. Eison Valdivieso Freire Examinador Alterno Guayaquil – Ecuador 2010 – 2011 ii DEDICATORIA A Dios, por haberme dado la vida y gracias a la ayuda de Él he podido culminar una etapa en mi vida universitaria. A mi madre Mariana Esther Yaure M., por su esfuerzo y apoyo constante en conseguir que pueda tener un futuro prometedor a mis hijos. A mi padre Germán Favio Molina P. por su apoyo incondicional. A mis hijos, David Joseph, Bryan Daniel y Daniela Mailyn, por darme las fuerzas para seguir adelante. A mi hermana Maritza y a mi sobrina Nallely, a mi familia y amigos en general que de manera directa e indirectamente apoyaron para cumplir mi meta. A la Ing. Leticia Vivas por su enseñanza, esfuerzo y dedicación que me ha brindado para culminar mi tesis. A todos mis profesores de la Universidad de Guayaquil Facultad de Ciencias Agrarias que me han enseñado y educado para el futuro. iii AGRADECIMIENTO La autora deja constancia de sus más sinceros agradecimientos a personas e instituciones que brindaron su cooperación para que se realice este trabajo de investigación. Primeramente a Dios, a mi madre y a mis hijos. A la Universidad de Guayaquil, especialmente a la Decana Dra. Martha Mora, al Consejo Directivo, Profesores, Secretarias y Trabajadores de la Facultad de Ciencias Agrarias. Al Departamento Nacional de Protección Vegetal, Sección Fitopatología, de la Estación Experimental del Litoral Sur “Dr. Enrique Ampuero Pareja” del Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias INIAP. De manera muy especial a la Ing. MSc. Leticia Vivas V. Directora del Proyecto FCI016 “Búsqueda de microorganismos antagonistas de fitopatógenos foliares en el cultivo de tomate en las provincias de Guayas y Santa Elena” y Directora de Tesis, por sus constantes consejos y motivación durante el transcurso del trabajo. A los señores agricultores de campos hortícolas de las provincias del Guayas y Santa Elena por dar las facilidades en la toma de muestras para el presente trabajo. A la Dra. Carmen Triviño Colíder del DNPV Departamento Nacional de Protección Vegetal de EELS, a la Ing. Agr. MSc. Myriam Arias Responsable de la Sección de Entomología, a los Ing. Ángel Jinés y Eison Valdivieso. A mis compañeros por brindarme su apoyo y colaboración a Diana Intriago, Rolando Capuz, Héctor Reyes, Nelson Moreano, Diego Portalanza, Bertín Osorio, Alexandra Tomalá, Sofía Gorotiza, Hugo Rivera, Pablo Zambrano, Sandra García, Sandra Mejía Álvaro Manzano, Wladimir Jiménez, Elena Corozo, Alex Delgado, Cristián A, Don Elvin León, Don Hugo Vaca, Don Rodolfo Veloz. Y a todo el personal Técnico y Administrativo de la EELS del INIAP, por brindarme su amistad y ayuda en todo lo que estuvo a su alcance. iv Las investigaciones, resultados, conclusiones y recomendaciones del presente trabajo, son de exclusiva responsabilidad de la autora. _______________________________ MARIUXI ROCIO MOLINA YAURE Email:[email protected] v Índice Contenido I II Portada ……………………………………………………………… i Página de aprobación……………………………………………….. ii Dedicatoria………………………………………………………….. iii Agradecimiento……………………………………………………... iv Responsabilidad de la autora.………………………………………. v Índice General………………………………………………………. vi Índice de Cuadros…………………………………………………… ix Índice de Figuras……………………………………………………. x Índice de Anexos……………………………………………………. xii INTRODUCCIÓN………………………………………………….. 1 Objetivo general……………………………………….......... 2 Objetivo específicos………………………………………… 2 REVISION DE LITERATURA…………………………………….. 3 A. Principales enfermedades foliares del tomate………….. 3 Tizón temprano (Alternaria solani)…...………………….. 3 2. Mancha corynespora (Corynespora cassiicola)…………. 4 3. Cenicilla (Oidiopsis sp = Leveillula taurica…………….. 5 4. Moho gris (Fulvia fulvum)………………………………. 6 Agentes biocontroladores……………………………..... 7 MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………... 9 3.1. Ubicación……………………………………………….. 9 3.2. Factores estudiados………………….………………….. 9 3.3. Materiales…………………………………..…………… 9 3.4. Fases de estudio y Manejo del Experimento………......... 9 a. Laboratorio…….……………………………………... 9 1. B. III Página Identificación de microorganismos antagonistas de A. solani……………………….…………………………. 9 Aislamiento de A. solani para pruebas de patogenicidad.. 10 Confrontación de cepas hongos antagonistas de A. solani………………………………………………….. vi 10 Inhibición del tubo germinativo de A. solani por efecto de cepas de hongos antagonistas……………………… 10 Tratamientos.……………………………….………… 11 Cuadro 1……………………………………………… 11 Diseño experimental………………………………….. 12 b. Invernadero………………………………………….. 12 Inoculación del fitopatógeno………………………... 12 Efecto de seis cepas de hongos antagonistas sobre A. IV solani………………………………………………... 13 Tratamientos y diseño experimental………………… 14 3.5. Variables registradas………………………………….. 14 a. Microorganismos antagonistas…….……………….. 14 b. Inhibición del crecimiento micelial…………………. 14 c. Inhibición de tubos germinativos………...………… 14 d. Incidencia y severidad……………………………… 15 d. Temperatura y humedad relativa…………………… 15 RESULTADOS…………………………………………………….. 16 4.1. 4.2. Identificación de hongos antagonistas de Alternaria solani… 16 Cuadro 2…………………………………………………….. 16 Pruebas de eficacia de seis cepas de hongos antagonistas de A. solani……………………………………………………... 16 a. Laboratorio………………………………………………….. 16 Confrontación de seis cepas de hongos antagonistas……….. 16 Cuadro 3…………………………………………………….. 17 Porcentaje de germinación de las cepas de hongos antagonistas y de A. solani………………………………….. 17 Cuadro 4…………………………………………………….. 17 Figura 1……………………………………………………… 18 Figura 2……………………………………………………… 18 Inhibición de tubos germinativos y daños en esporas de A. solani por efecto de antagonistas…………………………… 19 Cuadro 5…………………………………………………….. 19 Figura 3……………………………………………………… 19 vii b. Invernadero………………………………………………….. 20 Cuadro 6…………………………………………………….. 20 Cuadro 7…………………………………………………….. 21 4.3. Datos climáticos………………………………………………. 21 Cultivar Floradade…………………………………………... 21 Figura 4……………………………………………………… 21 Cuadro 8…………………………………………………….. 22 Figura 5……………………………………………………… 23 Figura 6……………………………………………………… 23 Figura 7…………………………………………………….... 24 Figura 8……………………………………………………… 24 Figura 9……………………………………………………… 25 Figura 10…………………………………………………….. 25 Figura 11…………………………………………………….. 26 Cultivar Miramar……………………………………………. 26 Figura 12…………………………………………………….. 26 Figura 13…………………………………………………….. 27 Figura 14…………………………………………………….. 27 Figura 15…………………………………………………….. 28 Figura 16…………………………………………………….. 28 V DISCUSIÓN………………………………………………………... 29 VI CONCLUSIONES.………………………………………………… 31 VII RECOMENDACIONES………...…………………………………. 32 VIII RESUMEN…………………………………………………………. 33 IX SUMMARY………………………………………………………… 34 X BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………… 35 XI ANEXO…………………………………………………………….. 37 Anexo 1…………………………………………………….. 38 Anexo 2…………………………………………………….. 39 Anexo 3…………………………………………………….. 39 Anexo 4…………………………………………………….. 40 viii Índice de Cuadros Cuadro 1. Identificación de hongos antagonistas de A. solani. 2011…….. 11 Cuadro 2. Confrontación de seis cepas de Trichoderma frente a Alternaria solani en condiciones de laboratorio. INIAP, EELS, 2011…….. 16 Porcentaje de germinación de seis antagonistas y de A. solani. INIAP, EELS, 2011. ………………………………………….. 17 Porcentaje esporas de A. solani sin daños al ser tratadas por antagonistas en condiciones de laboratorio INIAP, EELS, 2011 17 Porcentaje de foliolos con A. solani en el cultivar Floradade en condiciones de invernadero. INIAP, EELS, 2011. ……………. 19 Porcentaje de foliolos con A. solani en el cultivar Miramar en condiciones de invernadero. INIAP, EELS, 2011. ……….……. 20 Datos de temperatura y Humedad Relativa durante el estudio en condiciones de invernadero. INIAP, EELS, 2011……………… 21 Cuadro 3. Cuadro 4. Cuadro 5. Cuadro 6. Cuadro 7. ix Índice de Figuras Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Interacción del porcentaje de germinación de seis cepas de antagonistas en condiciones de laboratorio, INIAP, EELS, 2011.…………………………………………………………… 18 Porcentaje de germinación de A. solani frente a seis cepas de antagonistas en condiciones de laboratorio, INIAP, EELS, 2011…………………………………………………………… 18 Porcentaje de esporas de A. solani deshidratadas por efecto de seis cepas de antagonistas en condiciones de laboratorio, INIAP, EELS, 2011.…………………………………………. 19 Relación cuadrática de temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Pedro Carbo. INIAP, EELS, 2011. …...................................................................................... 21 Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Isidro Ayora. INIAP, EELS, 2011. …………………………………………………………... 23 Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa EELS, INIAP, EELS, 2011…. 23 Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Km 20. INIAP, EELS, 2011.. 24 Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa El Azúcar, INIAP, EELS, 2011. ………………………………………………………….. 24 Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Río Verde, INIAP, EELS, 2011……………………………………………………………. 25 Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con Timorex, INIAP, EELS, 2011…………………… 25 x Figura 11. Figura 12. Figura 13. Figura 14. Figura 15. Figura 16. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani en el testigo absoluto, INIAP, EELS, 2011…………………………. 26 Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Pedro Carbo, INIAP, EELS, 2011……………………………………………………………. 26 Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Isidro Ayora, INIAP, EELS, 2011……………………………………………………………. 27 Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa EELS, INIAP, EELS, 2011…………………………………………………………… 27 Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Km 20, INIAP, EELS, 2011……………………………………………………………. 28 Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con Timorex y testigo absoluto, INIAP, EELS, 2011……………………………………………………………. 28 xi Índice de Anexo Anexo 1. Esquema de la disposición de los tratamientos…………………… 36 Anexo 2. Confrontación del antagonista con A. solani……………………... 37 Anexo 3. Esporas germinadas y deshidratadas de A. solani………………… 37 Anexo 4. Identificación molecular de las cepas de antagonistas……………. 38 xii I. INTRODUCCIÓN El cultivo de tomate (Lycopersicon esculentum Mill) solanácea, originaria de América, es una de las plantas más populares e importantes a nivel mundial, tanto por su cultivo como por su consumo. En Ecuador existen alrededor de 2037 ha con una producción de 43025 Tm (MAGAP-SIGAGRO e INEC, 2010). Este cultivo es afectado por muchos ascomicetes y hongos imperfectos los cuales ocasionan primariamente enfermedades del follaje de las plantas, pero algunas de ellas afectan también las inflorescencias, tallos jóvenes, frutos e incluso raíces (Agrios, 2004). Entre los causales de enfermedades foliares en Guayas, Santa Elena y Manabí se mencionan a Alternaria solani, Corynespora cassiicola, Oídium sp, entre otros, para su manejo los productores utilizan agroquímicos de diferentes categorías toxicológicas con frecuencias de dos y tres aplicaciones semanales e incluso en la cosecha, lo que conlleva al aumento del costo de producción, afecciones en la salud de personas que laboran en campo y de los consumidores, deterioro del ecosistema. En la naturaleza existen microorganismos que reducen en forma natural el inóculo de fitopatógenos como es el caso de hongos y bacterias antagonistas. Estudios realizados en Costa Rica sobre el control microbiológico de Phytophthora infestans en tomate, determinaron que de 137 aislamientos 32 mostraron efecto antagónico y redujeron significativamente del tamaño de la lesión en condiciones de laboratorio, de los cuales se seleccionaron cinco los de mayor potencial (Sánchez, Bustamante y Shattock, 1999). En condiciones de invernadero los resultados mostraron que la cepa Trichoderma 069 y Penicillum 067 redujeron el número de lesiones y área foliar afectada por planta con relación a los tratamientos testigo (solo agua) y similar al uso de fungicida (Fernández - Larrea, 2001). Capuz (2009) reportó que las cepas G-08 y SE-034 de Trichoderma asperellum tuvieron efecto sobre la reducción de la severidad causada por Sclerotium rolfsii en los cultivos de tomate, pimiento y sandía. Por otra parte, Cevallos (2010) mencionó que al aplicar T. asperellum cepa G-08 redujo le severidad del complejo marchitez del tomate. 1 Cepas de Bacillus spp y Pseudomonas fluorescens aisladas de campo fueron evaluadas bajo condiciones de laboratorio por su antagonismo a Alternaria solani, varias de ellas disminuyeron el crecimiento del tubo germinativo y el número de ramificaciones del hongo. Algunos mostraron características de producir quitinaza que puede degradar la pared celular del hongo (Okumoto y Bustamante, 1993). Es importante destacar que la correcta identificación de antagonistas y la determinación de la eficacia de los mismos, se podrán incluirlas en programas de manejo integrado de enfermedades foliares en el cultivo de tomate. En base a lo expuesto el presente estudio tuvo los siguientes objetivos: OBJETIVO GENERAL Identificar microorganismos antagonistas eficientes para el manejo de fitopatógenos foliares en cultivos hortícolas. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Identificar microorganismos antagonistas que actúen en forma natural sobre fitopatógenos foliares en el cultivo de tomate. 2. Realizar pruebas de eficacia de él o los antagonistas sobre fitopatógenos foliares en condiciones de laboratorio e invernadero. 2 II. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1. Principales enfermedades foliares del tomate 2.1.1. Tizón temprano (Alternaria solani) El tizón temprano (A. solani) afecta principalmente a las hojas, tallos, flores y frutos, sus síntomas generalmente presentan afección foliar que aparece en forma de manchas irregulares constituidas por anillos concéntricos (Okumoto, 1992). A. solani a veces provoca daños en plántulas (chancros en el tallo), manchas concéntricas, pequeñas de color pardo e irregulares, cloróticas en su periferia sobre el foliolo, constituidas por anillos concéntricos que les confieren la apariencia de una diana, foliolo viejo recubierto de manchas pardas redondeadas de origen de su amarillamiento, sépalos necrosados, manchas cóncavas (deprimidas), situadas a nivel del pedúnculo del fruto, pequeñas manchas pardas alargadas en el tallo aclarándose en su centro (comienzo del ataque), manchas pardas en el raquis cuya parte central es gris. Este hongo, parásito del follaje y de los frutos, ocasiona también en los tallos manchas muy características. Son bien delimitadas, marrón oscuro y presentan anillos finos y concéntricos (Blancard, 2005). Los primeros síntomas en el follaje son pequeñas machas de color café a negro, rodeado de un halo amarillo, que aparecen en las hojas bajeras o más viejas. Cuando las lesiones miden aproximadamente 6 mm de diámetro se observan anillos concéntricos que le dan un aspecto de tabla de tiro al blanco. La infección del fruto ocurre generalmente en la base del pedúnculo y se pueden notar manchas hundidas, oscuras y acartonadas. Estas manchas también presentan los anillos concéntricos (Castaño, 1994). Los síntomas en las hojas más viejas aparecen manchas de color café rodeadas de zonas de color amarillo que crecen hasta 2 centímetros y muestran por lo general el aspecto de un blanco de tiro; pueden cubrir toda la hoja volviéndola de un color 3 amarillo. Las plantas muy atacadas pueden perder todas sus hojas, exponiendo los frutos a los rayos directos del sol, produciéndose escaldaduras. En los tallos se presentan zonas necróticas de forma alargada (con anillos concéntricos), causando en las plántulas lo que se denomina como “pudrición del collar”. Si la planta no muere, permanece pequeña y su producción es muy reducida (Suquilanda, 2003). El hongo también ataca al fruto, formando una depresión cerca al pedúnculo. La infección se presenta durante periodos lluviosos y de alta humedad, aunque también se ha observado que en periodos secos y cálidos se favorece su rápida expansión (Suquilanda, 2003). Por lo general, el color de las manchas foliares varía de café oscuro a negro, a menudo son numerosas y cuando se extienden casi siempre forman anillos concéntricos que adquieren la forma de un blanco. Por lo común, las hojas senescentes de la parte inferior de la planta son atacadas en primer término, pero la enfermedad asciende hacia la parte superior de aquélla y hace que las hojas afectadas se tornen amarillas y senescentes, se desequen y debiliten o desprendan. En las ramas y tallos de plantas de tomate, aparecen varias manchas oscuras, profundas y con frecuencia en forma de blanco. A veces las lesiones del tallo en las plántulas forman cancros que pueden extenderse, cubrir al tallo y matar a la planta (Agrios, 2004). 2.1.2. Mancha corynespora (Corynespora cassiicola) La sintomatología inicial consiste en pequeñas punteaduras en la superficie de las hojas. Estas lesiones se van extendiendo gradualmente, haciéndose circulares y de tonalidad marrón pálido. Las lesiones desarrollan halos amarillos llamativos de forma individualizada. La coalescencia de dos o más lesiones en un foliolo puede dar lugar al colapso rápido del tejido foliar, aunque este permanece unido al peciolo. En foliolos altamente susceptibles las lesiones pueden llegar a ser tan numerosas que son difíciles de contar (Blanquez, 2001). Las lesiones en el tallo y en los peciolos son de color castaño y de forma oblonga a elongada, recordando a aquellas que se producen en las hojas. Las lesiones 4 punteadas incrementan su tamaño rápidamente y pueden llegar a rodear el peciolo y el tallo, acelerando el colapso de los foliolos. La necrosis de los foliolos y hojas suele ocurrir de forma rápida, dando la apariencia de una muerte súbita, similar a la que ocurre en el moteado bacteriano (Blanquez, 2001). Las condiciones óptimas para el desarrollo de Corynespora es de 20 a 28 °C, pero la infección se produce entre 16 a 32 °C. Para el control se deben realizar tratamientos con fungicidas antes de presentarse los síntomas (Yánez, 2008). 2.1.3. Cenicilla (Oidiopsis sp. = Leveillula taurica) Los síntomas iniciales de Oidiopsis son lesiones de color verde claro a amarillo intenso que aparecen en el haz, en el centro se desarrollan puntos necróticos a veces con anillos concéntricos. En el envés de dichas lesiones se observa un crecimiento de aspecto polvoriento que corresponde a las estructuras reproductivas del hongo. Las hojas infectadas mueren pero rara vez caen de la planta. La temperatura óptima para la incidencia de la cenicilla es de 26 °C acompañada de una humedad relativa del 70 % (Paulus y Cornel, 2001). En control preventivo y técnicas culturales como la eliminación de malezas, restos de cultivo, utilización de variedades resistentes, trasplantes sanos y puede practicarse el control químico con fungicidas (Yánez, 2008). Los síntomas se presenta en forma semejante al mildiu polvoso, pero atacando el haz y el envés de las hojas. Las hojas atacadas se ponen amarillas y se caen. Esta enfermedad es más severa en épocas secas (Suquilanda, 2003). Los síntomas causados por L. taurica son similares a la Oidiopsis sp. los tejidos afectados se necrosan en el centro y muestra un vello blanco, manchas amarillas que presentan a veces un punteado de color marrón claro que les confiere un aspecto “sucio”, manchas amarillo pálidas cubierta de un discreto vello blanco, las manchas de oídium mas angulares permanecen blancas., manchas amarillas más difusas que se 5 recubren de fructificaciones primeramente blancas y posteriormente oliváceas (Blancard, 2005). Los síntomas sobre los haces foliares se presentan manchas de tipo aceitoso muy definidas, que luego se cubren de un polvillo muy fino de color amarillo que termina por necrosar las hojas y defoliar a la planta, causando finalmente frutos muy pequeños y un una baja sensible en la producción (Suquilanda, 2003). 2.1.4. Moho gris (Fulvia fulvum) Los síntomas del moho gris se presenta como manchas de color amarillo pálido difusas, recubierto de fructificaciones pardo oliváceas del hongo, muy visible primeramente blanco y posteriormente evolucionando a pardo oliváceo a fieltrado en la cara inferior de las hojas, a menudo invisible siempre blanco cuando está presente, las manchas de F. fulvum, más redondeadas, se colorean rápidamente de marrón oscuro por sus fructificaciones, manchas amarillas más difusas que se recubren de fructificaciones primeramente blancas y posteriormente oliváceas (Blancard, 2005). El moho de la hoja puede ser una enfermedad seria en lugares donde el tomate se cultiva bajo condiciones de alta humedad, como las siembras en invernadero. Usualmente los síntomas solo ocurren en el follaje. Atacan primero las hojas más viejas pero a medida que avanza la temporada ataca progresivamente en hojas más jóvenes. El primer síntoma en las hojas es la aparición de un área de aspecto verde pálido o amarillento con márgenes indefinidos en el haz. A medida que avanza la enfermedad el tejido invadido se torna de color amarillo obscuro, las hojas se arrugan, secan y caen prematuramente. La defoliación progresa hacia la parte superior de la planta. En el envés de estas hojas, correspondiendo con las áreas amarillas, se desarrollan un crecimiento verde oscuro de aspecto aterciopelado, compuesto por las estructuras reproductivas del patógeno (Castaño, 1994). 6 2.2. Agentes biocontroladores Estudios realizados en Costa Rica sobre el control microbiológico de Phytophthora infestans en tomate, determinaron que de 137 aislamientos 32 mostraron efecto antagónico y redujeron significativamente el tamaño de la lesión en condiciones de laboratorio, de los cuales se seleccionaron cinco los de mayor potencial (Sánchez, Bustamante y Shatottock, 1999). Posteriormente, se evaluaron en condiciones de invernadero cuyos resultados mostraron que la cepa Trichoderma 069 y Penicillum 067 redujeron el número de lesiones y el área foliar afectada por planta con relación a los tratamientos testigo (solo agua) y similar al uso de fungicida (Fernández – Larrea, 2001). Por otra parte, se menciona que el antagonista Trichoderma harzianum tiene efecto sobre Rhizoctonia solani (Reyes et al; 2002). Reportes sobre la actividad biocontroladora in Vitro de la cepa A34 de Trichoderma harzianum sobre Sclerotium rolfsii en tomate se observó la eficacia antagónica a partir de la ausencia de síntomas de la enfermedad en plantas protegidas (Okumoto y Bustamante, 1993). Cepas de Bacillus spp y Pseudomonas fluorescens aisladas de campo fueron evaluadas bajo condiciones de laboratorio por su antagonismo a Alternaria solani, varias de ellas disminuyeron el crecimiento del tubo germinativo y el número de ramificaciones. Algunos mostraron características de producir quitinaza que puede degradar la pared celular del hongo (Okumoto y Bustamante, 1993). En algunos casos Trichoderma actúa sobre algunos patógenos debido a su capacidad de colonizar rápidamente el follaje; también puede colonizar extensivamente una superficie foliar intacta (Fernández-Larrea, 2001). El hongo Trichoderma harzianum, ha sido estudiado mundialmente por sus excelentes características como biocontrolador de hongos del suelo, causantes de enfermedades en los cultivos, por lo cual determinaron la efectividad de este hongo 7 para el control de marchitez en tomate, causada por Pythium, Rhizoctonia solani, Fusarium (Perdomo et al., 2007). El género Trichoderma está integrado por un gran número de cepas fúngicas que actúan como agentes de control biológico y cuyas propiedades antagónicas se basan en la activación de mecanismos muy diversos; el biocontrol por competencias como la fungistasis, competencia por nutrientes, biofertilización y activación de los mecanismos de defensa de las plantas, modificación de la rizósfera, antibiosis, micoparasitismo, enzimas degradadoras de la pared celular como las quitinasas, glucanasas y proteasas. Resistencia a los compuestos tóxicos pueden estar asociados con la presencia de cepas de Trichoderma de los sistemas de transporte ABC (29); por esta razón, los preparados de cepas de este hongo son muy eficientes en el control de fitopatógenos varios (Benítez, et al., 2004). Los microorganismos con capacidad de hidrolizar celulosas y glucano presentan alto potencial como antagonistas de este género observaron la lisis de células fungosas por enzimas u otros compuestos producidos por Trichoderma harzianum (Sánchez, Bustamante y Shattock, 1998). Por otra parte, Michel-Aceves et al (2008) mencionan que especies de Trichoderma han demostrado su eficiencia en el control de fitopatógenos que atacan partes aéreas y de la raíz de las plantas de tomate. 8 III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Ubicación La colección de material vegetativo con síntomas de enfermedad del cultivo de tomate se realizó en campos de productores en las provincias de Guayas y Santa Elena. El aislamiento, identificación a nivel de género y pruebas de patogenicidad y eficacia se realizó en condiciones de laboratorio e invernadero del Departamento Nacional de Protección Vegetal, Sección Fitopatología, de la Estación Experimental del Litoral Sur “Dr. Enrique Ampuero Pareja” del Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias INIAP, ubicada en el km. 26, al este de Guayaquil en la vía Durán – Tambo, parroquia Virgen de Fátima, cantón Yaguachi, provincia del Guayas. Sus coordenadas son 2º 15′ 15″latitud sur y 79° 38′ 40″longitud occidental y a 17 msnm1/, con una pluviosidad de 1154.3 mm, temperatura media anual 26.5 ºC y 76.2 % de humedad relativa media anual2/. 3.2 Factores estudiados Cepas del antagonista Trichoderma y el hongo fitopatógeno Alternaria solani 3.3 Materiales Microscopio, higrotermógrafo, estufa, autoclave, cajas petri, matraces, vasos de precipitación, pipetas, jeringa descartables, mascarilla y guantes desechables, atomizadores manual, bandejas germinadoras, maceteros, cuadernos, marcadores, lápiz, cinta Scott, parafilm, semillas de tomate, y los medios de cultivos Papa dextrosa agar (PDA) y Agar agua (AA). 3.4. Fases de estudio y manejo del experimento Este estudio tuvo dos fases: laboratorio e invernadero. a. Laboratorio Identificación de microorganismos antagonistas de A. solani. En muestras procedentes de campos hortícolas de las provincias de Guayas y Santa Elena se realizaron aislamientos de hojas sanas de tomate; mismas que fueron lavadas y esterilizadas con una solución de hipoclorito de 9 sodio al 5% durante 5 minutos, se sembraron en medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) y agar nutritivo (AN); éstas se incubaron a temperatura ambiente y se observaron diariamente hasta que crecieron las colonias para su respectiva identificación a nivel de género, para determinar la especie se enviaron las muestras a un laboratorio especializado en secuenciación del acido desoxirribonucleico (ADN). Para este propósito se emplearon el método de CTAB modificado para la extracción del ADN, la identificación se realizó sobre las secuencias espaciadoras internas transcritas del ADN ribosomal (ITS1 e ITS2); se usaron secuencias del GenBank para comparar y establecer los árboles filogenéticos. Aislamiento de A. solani para pruebas de patogenicidad En los mismos campos también se colectaron hojas con necrosis para aislar al fitopatógeno, purificarlo y multiplicarlo para las pruebas de patogenicidad en laboratorio e invernadero. Estas muestras se sembraron en PDA previa desinfección con hipoclorito de sodio. Confrontación de cepas de hongos antagonistas de A. solani Con las colonias puras del fitopatógeno y las cepas de Trichoderma se procedió a efectuar la prueba de antagonismo in vitro. Se tomó un disco 5 mm de crecimiento micelial de ambos hongos, se procedió a colocarlo en un extremo de la caja petri que contiene medio de cultivo PDA, luego se dejó en incubación a temperatura ambiente. La evaluación se realizó cada 24 horas hasta que el antagonista cubrió totalmente al fitopatógeno y consistió en medir los diámetros mayor y menor del crecimiento micelial. Por cada antagonista se usaron diez cajas petri. Inhibición del tubo germinativo de A. solani por efecto de hongos antagonistas Con las cepas de Trichoderma en concentraciones de 1x106, 1x108 y 1x1010, se prepararon suspensiones con agar agua (AA) previamente esterilizado, luego se colocaron en cajas petri; el tejido infectados por A. solani se colocó en papel kraft para liberar los conidios. Después de 24 horas 10 se procedió a evaluar germinación y deformación de la espora de A. solani, los datos fueron transformados a porcentaje. Tratamientos Los tratamientos para la confrontación de antagonistas y A. solani fueron las seis cepas de los hongos seleccionados. De estas cepas se estudiaron tres dosis sobre la germinación de A. solani lo que constituyó 18 tratamientos, se incluyeron un testigo comercial y un absoluto que describen en el cuadro 1. Cuadro 1. Detalle de los tratamientos en la prueba de laboratorio INIAP, EELS, 2011. No. Combinación Descripción 1 PC D1 Pedro Carbo 1 x 10-6 2 PC D2 Pedro Carbo 1 x 10-8 3 PC D3 Pedro Carbo 1 x 10-10 4 IA D1 Isidro Ayora 1 x 10-6 5 IA D2 Isidro Ayora 1 x 10-8 6 IA D3 Isidro Ayora 1 x 10-10 7 Km D1 Kilómetro 20 1 x 10-6 8 Km D2 Kilómetro 20 1 x 10-8 9 Km D3 Kilómetro 20 1 x 10-10 10 EELS D1 Estación Experimental Litoral Sur 1 x 10-6 11 EELS D2 Estación Experimental Litoral Sur 1 x 10-8 12 EELS D3 Estación Experimental Litoral Sur 1 x 10-10 13 EA D1 El Azúcar 1 x 10-6 14 EA D2 El Azúcar 1 x 10-8 15 EA D3 El Azúcar 1 x 10-10 16 RV D1 Río Verde 1 x 10-6 17 RV D2 Río Verde 1 x 10-8 18 RV D3 Río Verde 1 x 10-10 19 Timorex Timorex (dosis comercial) 20 Testigo Sin aplicación 11 Diseño experimental Para la identificación de las cepas de hongos antagonistas se utilizó estadísticas descriptivas como barras de frecuencias. El porcentaje de germinación del antagonista y de A. solani se usó un diseño completamente al azar con arreglo factorial A x B + 2. Se usaron cinco repeticiones. El esquema del Andeva fue el siguiente: Fuente de variación Grados de libertad Total (tr-1) 99 Repeticiones (R-1) 4 Tratamientos (T-1) 19 Factor A (cepas antagonista) (C-1) 5 Factor B (Dosis antagonista) (B-1) 2 Interacción (C-1 x D-1) 10 Factorial vs. Testigos 2 Error experimental (T (r-1)) 80 La comparación de las medias se realizó con la prueba de rangos múltiples de Duncan p = 0.05 b. Invernadero Con los antagonistas se procedió a efectuar pruebas de invernadero. Inoculación del fitopatógeno Plántulas de tomate de los cultivares Miramar y Floradade de siete días después del transplante fueron inoculadas con A. solani. Para este propósito se realizó una suspensión de crecimiento micelial del hongo con agua destilada estéril, ésta se asperjo con un atomizador manual, luego se mantuvieron con humedad ambiental que para el efecto colocó un humificador dos horas en la mañana y dos en la tarde. 12 Efecto de seis cepas de hongos antagonistas sobre A. solani En macetas con capacidad de 8 kg de suelo se sembraron semillas de tomate de los cultivares Miramar y Floradade, las que se inocularon con el fitopatógeno y después de una semana se aplicó el antagonista. La dosis utilizada en cada cultivar fue 1 x 1010 esporas por mililitro. Para preparar la solución de los antagonistas se tomó crecimiento micelial de cada uno de ellos y diluyó en agua destilada estéril y con la ayuda de una cámara de Neubauer se contaron el número de esporas, luego se formuló de acuerdo a la concentración requerida. Las aspersiones se realizaron con los primeros síntomas visibles de la enfermedad y se aplicaron con un atomizador manual. Tratamientos y diseño experimental. En el cultivar Floradade se evaluaron seis cepas de antagonistas y cada una constituyó un tratamiento y se incluyeron dos testigos: un comercial (Timorex) y un absoluto, lo que totalizó ocho tratamientos y fueron los siguientes: 1. Cepa Pedro Carbo 2. Cepa Isidro Ayora 3. Cepa EELS 4. Cepa Km 20 5. Cepa Río Verde 6. Cepa El Azúcar 7. Testigo químico 8. Testigo absoluto Se utilizó un Diseño Completamente al Azar con 5 unidades experimentales (macetas). El esquema del análisis de varianza fue el siguiente: Fuente de variación Grados de libertad Total 39 Tratamientos 7 Error experimental 32 Para la comparación de la medias se utilizaron la prueba de rangos múltiples de Duncan p = 0.05 13 En el cultivar Miramar no se incluyeron las cepas El Azúcar y Río Verde, debido a la escasa semilla y solo tuvo seis tratamientos incluidos los testigos comercial y absoluto; se usaron 5 macetas por tratamiento. El esquema del análisis de varianza fue el siguiente: Fuente de variación Grados de libertad Total 30 Tratamientos 5 Error experimental 25 Para la comparación de la medias se utilizaron la prueba de rangos múltiples de Duncan p = 0.05 Con los datos de temperatura y humedad relativa se hicieron correlaciones con los porcentajes de foliolos afectados por A. solani en los cultivares Floradade y Miramar. 3.5. Variables registradas a. Microorganismos antagonistas. Se registraron cada uno de los antagonistas en muestras procedentes de campos productores de tomate en las provincias de Guayas y Santa Elena. b. Inhibición del crecimiento micelial Se determinó el crecimiento micelial del fitopatógenos y del antagonista cada 24 horas y se determinaron en porcentaje. c. .Inhibición de tubos germinativos A las 24 horas después de efectuar la liberación de las esporas se contó el número de esporas y de ellas el número que germinaron. Esta información se expresó en porcentaje. 14 d. Incidencia y severidad En condiciones de invernadero se contaron el número de plantas con síntomas de la enfermedad. Para severidad se utilizaron la escala de Horsfall-Barratt modificada por Large (1996), donde: 0 = planta sana, 1 = 0 – 1 % de área foliar afectada, 2 = 1 – 3 %, 3 = 3 - 9 %, 4 = 9 – 24 %, 5 = 24 – 50 % 6 = 50 – 76 %, 7 = 76 – 91 %, 8 = 91 – 99 % del área foliar afectada y 9 = planta muerta. e. Temperatura y humedad relativa Se registraron la temperatura (ºC) y humedad relativa (%). Para este propósito se instaló un Higrotermógrafo en el invernadero. 15 IV. RESULTADOS 4.1. Identificación de hongos antagonistas de Alternaria solani Mediante el análisis de secuencias de regiones ITS1 e ITS2 de los genes rRNA (18S y 28S) las cepas de Isidro Ayora, El Azúcar y Río Verde fueron identificadas como Trichoderma asperellum, la cepa Km 20 como Hypocrea lixii (teleomorfo de Trichoderma harzianum); las cepas EELS y Pedro Carbo no fueron identificadas (Cuadro 2) debido a la variabilidad en su secuencia (Anexo 4). Cuadro 2. Identificación de hongos antagonistas de A. solani. 2011. Cepa Microorganismo identificado Pedro Carbo (Guayas) No identificada Isidro Ayora (Guayas) Trichoderma asperellum EELS (Guayas) No identificada Km 20 (Guayas) Hypocrea lixii (Teleomorfo de T. harzianum) Río Verde (Santa Elena) Trichoderma asperellum El Azúcar (Santa Elena) Trichoderma asperellum 4.2. Pruebas de eficacia de seis cepas de hongos antagonistas de A. solani a. Laboratorio Confrontación de seis cepas de hongos antagonistas Las seis cepas de hongos antagonistas confrontadas frente a A. solani, todas mostraron su máximo crecimiento a las 48 horas de iniciado el estudio, las cepas de mayor crecimiento fueron El Azúcar y EELS con 30,65 y 30,55 en su orden (Cuadro 3). 16 Cuadro 3. Confrontación de seis cepas de Trichoderma frente a Alternaria solani en condiciones de laboratorio. INIAP, EELS, 2011. Tiempo Horas Pedro Carbo Isidro Ayora EELS KM 20 Río Verde Anta Alter Anta Alter Anta Alter Anta Alter 24 5,80 6,23 4,30 0,25 14,10 0,00 48 21,48 3,05 23,38 3,13 30,55 2,20 26,30 72 21,48 2,83 24,00 2,68 21,25 96 20,75 2,65 20,33 120 8,50 0,90 El Azúcar Anta Alter Anta Alter 9,85 1,40 6,25 1,25 3,70 26,05 4,05 30,65 3,35 3,20 22,40 3,95 23,95 4,20 26,85 4,30 1,73 16,80 2,45 13,25 2,25 10,80 2,15 10,75 1,10 5,95 0,83 11,55 1,10 0,60 11,75 1,75 0,75 Total 78,01 11,33 79,89 Anta = Antagonista Alter = Alternaria 9,70 84,45 9,20 85,00 10,50 82,40 13,55 83,10 10,75 1,90 1,33 8,95 8,60 Porcentaje de germinación de las cepas de hongos antagonista y de A. solani En cepa Km 20 tuvo el mayor porcentaje de germinación del antagonista en las tres dosis, seguido de la cepa EELS en las dos dosis 1 x10-8 y 1 x 10 -10, los menores valores fueron para las cepas río Verde y El Azúcar. Los menores porcentajes de esporas de A. solani germinada fueron en las cepas EELS y Río Verde (Cuadro 4). Cuadro 4. Porcentaje de germinación de seis antagonistas y de A. solani. INIAP, EELS, 2011. Porcentaje de germinación Antagonistas Alternaria solani -6 -8 -10 10 10 10 10-6 10-8 10-10 Cepas Pedro Carbo Isidro Ayora Km 20 EELS El Azúcar Río Verde Timorex* Testigo absoluto** C. V. (%) 60,00 22,00 100,00 65,00 8,33 24,71 86,00 47,00 100,00 97,00 15,79 26,07 1,13 *solo se usó la dosis comercial **sin aplicación 17 54,00 98,00 100,00 100,00 28,20 23,13 14,90 15.00 37,16 15,25 27,86 10,82 40,00 20,00 37,60 15,00 26,11 10,25 50 85 3,02 40,00 20,00 38,20 15,00 26,40 18,89 Las interacciones entre las cepas y dosis muestran que, la cepa Km 20 en las tres dosis tuvieron el mayor porcentaje de germinación e igual a las dosis mayores de la cepa EELS (Figura 1). Figura 1. Interacción del porcentaje de germinación de seis cepas de antagonistas en condiciones de laboratorio, INIAP, EELS, 2011. Las interacciones entre cepas y la germinación de esporas A. solani muestran que la cepa Km 20 en las tres dosis tuvo los valores más altos; los menor es porcentajes de germinación fue con la cepa Río Verde en las dosis más bajas (Figura 2). Figura 2. Porcentaje de germinación de A. solani frente a seis cepas de antagonistas en condiciones de laboratorio, INIAP, EELS, 2011. 18 Inhibición de tubos germinativos y daños en esporas de A. solani por efecto de los antagonistas. El efecto de las cepas del antagonistas sobre las esporas de A. solani no mostraron interacción entre las dosis, solamente entre cepas, por lo que se analizaron entre ellas tomando a las dosis como repeticiones. La cepa de El Azúcar fue la de menor efecto con 43,76% de esporas sin daños y estadísticamente diferente; las cepas Pedro Carbo e Isidro ayora tuvieron los menores valores y fueron iguales entre sí (Cuadro 5). Cuadro 5. Porcentaje de esporas de A. solani sin daños al ser tratadas por antagonistas en condiciones de laboratorio. INIAP, EELS, 2011. Cepas Pedro Carbo Isidro Ayora EELS Km 20 El Azúcar Río verde C.V. (%) 1x 10 6 4,65 1,45 2,90 0,00 31,19 8,33 Dosis 1x 10 8 1x 1010 Promedio 100,00 85,00 100,00 63,00 73,89 92,52 0,00 20,00 15,00 46,00 26,19 13,33 34,88 b1/ 35,48 b 39,30 ab 36,33 ab 43,76 a 38,06 ab 12,12 1/ Cifras de las columnas con la (s) misma (s) letra (s) son iguales estadísticamente de acuerdo a la prueba de rangos múltiples de Duncan P=0,05 El efecto de las cepas de antagonistas y sus dosis sobre esporas de A. solani deshidratadas mostraron interacciones. Las cepas Isidro Ayora y Río Verde tuvieron los mayores porcentajes de esporas deshidratadas (Figura 3). Figura 3. Porcentaje de esporas de A. solani deshidratadas por efecto de seis cepas de antagonistas en condiciones de laboratorio, INIAP, EELS, 2011. 19 b. Invernadero El efecto de seis cepas de hongos antagonistas de A. solani en el cultivar Floradade muestran un comportamiento variable durante la evaluación; en las cepas El Azúcar y Río Verde aunque se notó reducción del porcentaje de foliolos infectados, tuvieron los mayores valores, en la primera con 10,77%, la segunda con 9,33 fue igual estadísticamente al testigo absoluto. Las cepas de menor valor fueron la cepa Pedro Carbo con 2,94% diferente de las demás, seguida de la cepa EELS con 3,12% igualmente diferente estadísticamente. Los mayores porcentajes fueron con las cepas de El Azúcar, Río Verde y el testigo absoluto siendo estos dos últimos iguales entre (Cuadro 6). Cuadro 6. Porcentaje de foliolos con A. solani en el cultivar Floradade en condiciones de invernadero. INIAP, EELS, 2011. Fechas Pedro Isidro EELS Carbo Ayora Cepas Km El Río Timorex Testigo 20 Azúcar Verde 14-jun 3,09 6,27 2,97 2,73 24,02 18,62 2,43 6,16 21-jun 1,94 3,76 3,53 4,44 7,10 7,48 2,45 5,30 28-jun 2,45 3,78 3,64 4,19 5,98 6,31 2,10 6,10 05-jul 4,26 2,74 2,36 3,20 5,98 4,91 12,23 19,60 Media 2,94 g 4,14 d 3,12 f 3,64 e 10,77 a 9,33b 4,80 c 9,29b C.V. 2,19 % 1/ Cifras de las columnas con la (s) misma (s) letra (s) son iguales estadísticamente de acuerdo a la prueba de rangos múltiples de Duncan P=0,05 En efecto de cuatro cepas de antagonistas de A. solani en el cultivar Miramar durante las evaluaciones muestran reducción del porcentaje de foliolos afectados por el patógeno. En el porcentaje promedio general se observa diferencias significativas entre tratamientos, siendo las cepas de Pedro Carbo e Isidro Ayora la de mayor valor con 10,68 y 10,43% en su orden, mismas que fueron iguales estadísticamente entre sí; la cepa EELS con 7,10 y el tratamiento testigo comercial con 7,54 tuvieron los menores valores e iguales entre sí (Cuadro 7). 20 Cuadro 7. Porcentaje de foliolos con A. solani en el cultivar Miramar en condiciones de invernadero. INIAP, EELS, 2011. Fechas 14-jun-11 21-jun-11 28-jun-11 05-jul-11 Promedio C.V. Pedro Carbo 21,71 5,15 4,61 10,26 10,43 a 4,26% Cepas EELS Km 20 Isidro Ayora 23,94 5,63 5,08 8,08 10,68 a 22,30 2,79 3,00 0,33 7,10 c Timorex Testigo 20,13 2,34 2,11 5,60 7,54 c 21,24 2,48 3,08 8,28 8,77 b 25,29 3,60 4,32 2,81 9,01 b 1/ Cifras de las columnas con las misma letra son iguales estadísticamente de acuerdo a la prueba de rangos múltiples de Duncan P=0,05 4.3. Datos climáticos Los promedios de temperatura mínima durante el experimento fluctuaron entre 19,92 y 28,00 ºC y la máxima 29,67 y 42,42 ºC; la humedad relativa mínima 29,71 y la máxima 69,64% (Cuadro 8). La ecuación de la regresión entre los tratamientos de los cultivares Floradade y Miramar con las variables de temperatura y humedad relativa mostraron en la mayoría significancia. Cultivar Floradade La cepa Pedro Carbo con la temperatura mínima (Figura 4A) y la humedad relativa (Figura 4B) tuvieron efecto sobre el incremento del porcentaje de foliolos infectados por A. solani; los valores de la relación cuadrática fueron r2 = 1 y r2=-0,98, en su orden. 14 y = 588,01 - 50,41 + 1,08 r2 = 1,00 12 y = 917,68 - 31,09 + 0,26 r2 = 0,98 12 % foliolos afectados por A. solani % foliolos afectados por A. solani 14 10 8 6 4 A 2 10 8 6 4 2 B 0 0 -2 22 23 24 25 26 27 Temperatura mínima (ºC) 54 56 58 60 62 64 66 68 Humedad Relativa (%) Figura 4. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Pedro Carbo. INIAP, EELS, 2011. 21 Cuadro 8. Datos de temperatura y Humedad Relativa durante el estudio en condiciones de invernadero. INIAP, EELS, 2011. SEMANAS TEMPERATURA (ºC) HUMEDAD RELATIVA (%) máxima Mínima media máxima mínima media 2 - 9 abril 29,07 19,92 24,50 63,42 29,71 46,57 10 - 16 abril 40,79 27,29 34,04 89,29 42,57 65,93 17 - 23 abril 40,86 27,21 34,04 77,71 36,43 57,07 24 - 30 abril 39,50 28,00 33,75 60,29 44,57 52,43 1 - 7 mayo 41,93 27,71 34,82 60,00 37,57 48,79 8 - 14 mayo 39,64 27,36 33,50 60,43 40,71 50,57 15 - 21 mayo 41,79 26,43 34,11 63,00 35,57 49,29 22 - 28 mayo 42,42 25,86 34,14 64,43 33,57 49,00 29 mayo - 4 de junio 38,14 26,21 31,18 67,00 45,43 56,21 5 junio - 11 junio 37,29 22,29 31,57 68,86 41,29 55,07 12 - 18 junio 33,46 24,25 28,86 55,00 71,00 63,00 19 - 25 junio 29,64 22,50 26,07 62,29 49,86 56,07 26 junio - 2 julio 33,64 26,43 30,04 73,00 59,43 66,21 3 - 9 julio 35,42 25,93 30,68 73,71 53,43 53,57 10 - 16 julio 31,64 25,64 28,64 75,57 63,71 69,64 17 - 23 julio 34,57 26,50 30,54 75,29 58,43 66,86 24 - 30 julio 33,14 25,79 29,46 76,43 57,14 66,79 31 julio - 6 agosto 33,50 24,64 29,07 78,00 56,14 67,07 7 - 13 agosto 34,71 25,71 30,21 76,28 49,57 62,93 14 - 20 agosto 34,86 25,00 29,93 76,43 49,00 62,71 21 - 27 agosto 28 agosto - 3 septiembre 33,64 25,00 29,61 72,86 47,43 60,14 34,29 24,50 29,39 77,29 51,57 64,43 Media general 35,10 24,68 29,94 68,72 45,40 56,60 La cepa Isidro Ayora muestra un comportamiento similar tanto con la temperatura mínima (Figura 5A) y humedad relativa (Figura 5B) sobre el 22 incremento de los porcentajes de foliolos infectados por A. solani. Los valores de la relación cuadrática fueron r2=0,99 y 0,97, respectivamente. 25 22 y = 943,76 - 80,18 + 1,71 r2 = 0,99 18 % foliolos afectados por A. solani % foliolos afectados por A. solani 20 16 14 12 10 8 6 A 4 y = 1372,84 - 46,30 + 0,39 R2 = 0,97 20 15 10 5 0 B 2 22 23 24 25 26 54 27 56 58 Temperatura mínima (ºC) 60 62 64 66 68 Humedad Relativa (%) Figura 5. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Isidro Ayora. INIAP, EELS, 2011. La cepa EELS en las dos variables climáticas mostró disminución en el porcentaje de foliolos afectados por A. solani; la temperatura superior a 23 ºC (Figura 6A) y más de 56 % tiende a decrecer la enfermedad (Figura 6B); los valores de la relación fueron r2=0,51 y 0,56 en su orden. 25 y = 1043,22 - 82,30 + 1,62 r2 = 0,51 20 % foliolos afectados por A. solani % foliolos afectados por A. solani 25 15 10 A 5 0 y = 1016,62 - 32,30 + 0,26 r2 = 0,56 20 15 10 B 5 0 -5 -5 22 23 24 25 26 27 Temperatura mínima (ºC) 54 56 58 60 62 64 66 68 Humedad Relativa (%) Figura 6. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa. EELS, INIAP, 2011. La cepa Km 20 mostró disminución del porcentaje de foliolos infectados por A. solani a 24 ºC (Figura 7A), similar comportamiento la humedad relativa con más de 58 % (Figura 7B); los valores de la relación cuadrática fueron r2= 0,50 y 0,57 respectivamente. 23 30 y = 1287,82 - 102,36 + 2,03 r2 = 0,50 25 % foliolos afectados por A. solani %foliolos afectados por A. solani 30 20 15 A 10 5 0 25 y = 1300,33 - 41,65 + 0,33 r2 = 0,57 20 15 B 10 5 0 -5 -5 22 23 24 25 26 54 27 56 58 Temperatura mínima (ºC) 60 62 64 66 68 Humedad Relativa (%) Figura 7. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Km 20. INIAP, EELS, 2011. La cepa El Azúcar con temperaturas entre 24 y 25 ºC muestran los mayores porcentajes de foliolos infectados por A. solani (Figura 8A), mientras que la humedad relativa fue 60 a 62 % (Figura 8B); los valores de la relación cuadrática fueron r2=0,91 y 0,77 en su orden. 26,0 26,0 % foliolos afectados por A. solani 25,6 % foliolos afectados por A. solani y = - 148,55 + 14,18 - 0,20 r2 = 0,91 25,8 25,4 25,2 25,0 24,8 24,6 24,4 A 24,2 y = - 144,60 + 5,57 - 0,05 r2 = 0,77 25,5 25,0 24,5 B 24,0 24,0 23,8 23,5 22 23 24 25 26 27 54 Temperatura mínima (ºC) 56 58 60 62 64 66 68 Humedad Relativa (%) Figura 8. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa El Azúcar, INIAP, EELS, 2011. La cepa Río Verde con temperaturas superior a 25 ºC y humedad relativa superior a 62 % tiende a decrecer el porcentaje de foliolos infectados por A. solani, los valores de la relación cuadrática fueron r2=0,47 y 057 en su orden (Figura 9 A y B). 24 66 66 y = - 727,26 + 63,54 - 1,27 r2 = 0,47 64 % foliolos afectados por A. solani % foliolos afectados por A. solani 64 62 60 58 A 56 54 52 y = -777,84 + 27,25 - 0,22 r2 = 0,57 62 60 58 56 B 54 52 50 50 22 23 24 25 26 27 54 56 58 Temperatura mínima (ºC) 60 62 64 66 Humedad Relativa (%) Figura 9. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Río Verde, INIAP, EELS, 2011. El testigo químico tanto con la temperatura y humedad relativa (Figura 10 A y B) tuvieron el mismo comportamiento con respeto a la disminución de los porcentajes de foliolos infectados por A. solani; los valores de la relación fueron r2=0,40 y 0,53 en su orden. El testigo absoluto mostró el mismo comportamiento (Figura 11 A y B) y los valores de la relación cuadrática fueron r2=0,43 y 0,58 respectivamente. 25 y = 1275,63 - 103,04 + 2,08 r2 = 0,40 20 % foliolos afectados por A. solani % foliolos afectados por A. solani 25 15 10 5 0 A y = 1446,60 - 47,12 + 0,38 r2 = 0,53 20 15 10 5 0 B -5 22 23 24 25 26 27 Temperatura mínima (ºC) 54 56 58 60 62 64 66 68 Humedad Relativa (%) Figura 10. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con Timorex INIAP, EELS, 2011. 25 68 25 y = 1506,47 - 122,34 + 2,48 r2 = 0,43 20 % foliolos afectados por A. solani % foliolos afectados por A. solani 25 15 10 5 A 0 y = 1726,90 - 56,49 + 0,46 r2 = 0,58 20 15 10 5 0 B -5 22 23 24 25 26 27 54 56 58 Temperatura mínima (ºC) 60 62 64 66 68 Humedad Relativa (%) Figura 11. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani en el testigo absoluto, INIAP, EELS, 2011. Cultivar Miramar La cepa Pedro Carbo con temperatura superior a 25 ºC mostró incremento del porcentaje de foliolos infectados por A. solani (Figura 12A), igualmente con la humedad relativa mayor a 62 % (Figura 12B); los valores de la relación cuadrática fueron r2= 0,94 y 0,99, en su orden. 4,5 y = 223,74 - 18,54 + 0,39 r2 = 0,94 4,0 % foliolos afectados por A. solani % foliolos afectados por A. solani 4,5 3,5 3,0 2,5 2,0 A 1,5 y = 280,39 - 9,31 + 0,08 r2 = 0,99 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 B 1,0 22 23 24 25 26 27 Temperatura mínima (oC) 54 56 58 60 62 64 66 68 Humedad Relativa (%) Figura 12. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Pedro Carbo, INIAP, EELS, 2011. La cepa Isidro Ayora con temperatura superior a 24 ºC disminuyó el porcentaje de foliolos infectados por A. solani (Figura 13A), igualmente con la humedad relativa alta (Figura 13B); los valores de la relación cuadrática fueron r2=0,61 y 0,62 en su orden. 26 6,5 6,0 % foliolos afectados por A. solani 5,5 y = 68,85 - 1,94 + 0,01 r2 = 0,62 6,0 y = 94.61 - 6,89 + 0,13 r2 = 0,61 5,0 4,5 4,0 3,5 A 5,5 5,0 4,5 4,0 B 3,5 3,0 3,0 2,5 2,5 22 23 24 25 26 27 54 56 58 Temperatura mínima (oC) 60 62 64 66 68 Humedad Relativa (%) Figura 13. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Isidro Ayora, INIAP, EELS, 2011. La cepa EELS cuando la temperatura y humedad relativa son mayores a º 24 C y 60 % en su orden disminuyen del porcentaje de foliolos infectados por A. solani (Figura 14A y B); Los valores de la relación cuadrática fueron r2= 0,84 y 0,94 respectivamente. 4,2 3,8 y = - 143,31 + 4,93 - 0,04 r2 = 0,94 4,0 % foliolos afectados por A. solani 3,6 % foliolos afectados por A. solani % de foliolos afectados por A. solani 6,5 3,4 y= -99,20 + 8,65 - 0,18 r2 = 0,84 3,2 3,0 A 2,8 2,6 2,4 3,8 3,6 3,4 3,2 B 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,2 22 23 24 25 26 27 Temperatura mínima (ºC) 54 56 58 60 62 64 66 68 Humedad Relativa (%) Figura 14. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa EELS, INIAP, EELS, 2011. La cepa Km 20 con temperatura mayor a 24 ºC y humedad relativa mayor a 60 % muestran disminución del porcentaje de foliolos infectados por A. solani, los valores de la relación cuadrática fueron r2= 0,61 y 0,79 respectivamente (Figura 15A y B). 27 5,5 5,0 % foliolos afectados por A. solani % foliolos afectados por A. solani y = -180,13 + 15,19 -0,31 r2 = 0,62 4,5 4,0 3,5 3,0 A y = 214,82 + 7,25 -0,06 r2 = 79 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 B 2,5 2,5 22 23 24 25 26 54 27 56 58 Temperatura mínima (ºC) 60 62 64 66 68 Humedad Relativa (%) Figura 15. Relación cuadrática de la temperatura (A) y humedad relativa (B) con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con el antagonista cepa Km 20, INIAP, EELS, 2011. Los testigos químico (Figura 16A y B) y absoluto (Figura 16 C y D) en el cultivar Miramar tanto con la temperatura y humedad relativa mostraron el mismo comportamiento con respeto a la disminución de los porcentajes de foliolos infectados. 25 y = 942,26 -74,48 + 1,48 r2 = 0,42 25 % foliolos afectados por A. solani % foliolos afectados por A. solani 30 20 15 A 10 5 y = 306,16 - 10,95 + 0,10 r2 = 0,97 20 15 B 10 5 0 0 22 23 24 25 26 27 40 45 Temperatura mínima (ºC) 20 55 60 20 18 18 y = 502,49 - 38,75 + 0,75 r2 = 0,45 16 % foliolos afectados por A, solani % foliolos afectados por A. solani 50 Humedad Relativa (%) 14 12 10 8 C 6 y = 504,64 - 15,72 + 0,12 r2 = 0,49 16 14 12 10 D 8 6 4 4 22 23 24 25 26 27 Temperatura mínima (ºC) 54 56 58 60 62 64 66 68 Humedad Relativa (%) Figura 16. Relación cuadrática de la temperatura y humedad relativa con el porcentaje de foliolos afectados por A. solani tratados con Timorex (A y B) y Testigo absoluto (C y D), INIAP, EELS, 2011. 28 V. DISCUSIÓN Identificación de antagonistas de A. solani La identificación de T. asperellum en tres muestras de follaje de tomate en campos de Guayas y Santa Elena indican que esta especie está presente en forma nativa, pues coincide con los resultados de Capuz (2009) quien la reporta en muestras de suelo cultivado con tomate, pimiento y sandía; aisladas a partir de muestras de la rizósfera en campos hortícolas de estas dos provincias. Con respecto a Hypocrea lixii (teleomorfo de T. harzianum) en Ecuador hasta ahora no existe ningún reporte de ésta especie como antagonista de Alternaria solani en el cultivo de tomate; en México los estudios de Aceves et al. (2008) mencionan que en aislados de suelos se identificaron varias especies de Trichoderma entre ellas T. harzianum, T. longibrachiatum y T. koningii, mismas que fueron seleccionadas por su efecto antagónico contra A. solani. Pruebas de eficacia antagonistas La inhibición del crecimiento micelial de A. solani fue aproximadamente en un relación 8:1 con respecto al antagonista, sin embargo, las cepas EELS y Km 20 fueron las de mayor crecimiento numérico; resultados similares obtuvieron Michel-Aceves et al. (2008). El mayor crecimiento micelial de la cepa Km 20 con respecto a las demás por tratarse de T. harzianum coincide con lo reportado por Torres, Iannacone y Gómez (2008); además, mencionan que esta especie fue similar a T. viride a las 120 horas. Con respecto al porcentaje de esporas de A. solani deshidratadas por efecto de seis cepas antagonistas muestran que la Río Verde en las tres dosis evaluadas tuvo el mismo comportamiento, seguido de la cepa Isidro Ayora con las dos primeras dosis, posiblemente se deba al efecto de micoparasitismo o de antibiosis, pues, Torres, Iannacone y Gómez (2008) mencionan que ciertas especies de Trichoderma ejercen sobre el patógeno tres tipos fundamentales como son competencia directa por espacio y nutrientes, producción de metabolitos antibióticos de naturaleza volátil o no y parasitismo directo. 29 En condiciones de invernadero la cepa km 20 que es Hypocrea lixii (teleomorfo de T. harzianum) que tuvo un mejor resultado con respecto al porcentaje de foliolos afectados por A. solani, similar respuesta obtuvieron Torres, Iannacone y Gómez (2008) quienes reportan que Trichoderma harzianum fue más eficiente que las otras tres especies de Trichoderma debido que redujo la severidad de la enfermedad. En cuanto a la temperatura si bien, donde se efectuó el estudio la temperaturas fluctuaron entre 24 y 35 °C, el análisis de la relación entre el porcentaje de foliolos infectados por A. solani, muestran en los dos cultivares similar comportamiento, pues la temperatura favorable para este patógeno es de 24 °C; mientras que óptima para el crecimiento de especies de Trichoderma fluctúan entre 25 a 30 °C, como lo reportan Torres, Iannacone y Gómez (2008). 30 VI. 1. CONCLUSIONES Se identificaron en hojas de tomate a Hypocrea lixii que corresponde al teleomorfo de T. harzianum en la muestra del km 20 y Trichoderma asperellum de muestras de tomate de Isidro Ayora en la provincia de Guayas, este último también en El Azúcar y Río Verde en Santa Elena; en las muestras de Pedro Carbo y EELS no se pudieron identificar debido a posibles mezclas. 2. En pruebas de antagonismo las cepas km 20 y EELS tuvieron el mejor efecto sobre crecimiento micelial de A. solani, así como el mayor porcentaje de germinación de las esporas. 3. El daño más evidente de los hongos antagonistas sobre esporas de A. solani fue la deshidratación lo que no le permitió una germinación normal especialmente con la cepa Río Verde. 4. En invernadero el cultivar Floradade los menores porcentajes de foliolos infectados por A. solani fueron en los tratamientos con las cepas de antagonistas de Pedro Carbo y EELS y el mayor con la de El Azúcar. 5. En el cultivar Miramar los menores porcentajes de foliolos afectados por A. solani fueron en los tratamientos EELS y testigo comercial. 6. Las condiciones de temperatura y humedad relativa favorables para el desarrollo de la enfermedad estuvieron entre 24 a 26 °C y 60 %. 31 VII. RECOMENDACIONES En base a los resultados se recomienda: 1. Realizar muestreos en otras áreas productoras de hortalizas para determinar si existen otras cepas nativas con efecto antagónico sobre Alternaria solani. 2. Evaluar en condiciones de campo estas cepas de hongos antagonistas para determinar dosis, frecuencias y épocas de aplicación. 32 VIII. RESUMEN El tizón temprano Alternaria solani en el cultivo de tomate es uno de los problemas fitosanitarios de importancia, para su manejo los productores utilizan productos químicos cuyos efectos repercuten en la salud de las personas y del ecosistema, por lo que la búsqueda de agentes biocontroladores eficaces es necesaria. El presente estudio tuvo los siguientes objetivos: 1) Identificar microorganismos antagonistas que actúen en forma natural sobre fitopatógenos foliares en el cultivo de tomate y 2) realizar pruebas de eficacia de él o los antagonistas sobre fitopatógenos foliares en condiciones de laboratorio e invernadero. El muestreo se realizó en campos de productores de las provincias de Guayas y Santa Elena. La identificación de los antagonistas se realizó mediante el método de CTAB modificado para la extracción del ADN, se emplearon secuencias espaciadoras interna transcritas del ADN ribosomal (ITS 1 e ITS2). Se identificó a Trichoderma asperellum en las cepas Isidro Ayora, Río Verde y El Azúcar; Hypocrea lixii en la Km 20, las cepas Pedro Carbo y EELS no fueron identificadas. La prueba de patogenicidad consistió en confrontar micelio de A. solani y las cepas de antagonistas, se evaluaron cada 24 horas hasta 120 horas. Las seis cepas mostraron su máximo crecimientos a las 48 horas de iniciado el estudio, se destacaron El Azúcar y EELS como las de mayor crecimiento. Para determinar el efecto de las seis cepas de hongos antagonistas se utilizaron las dosis 1x106, 1x108 y 1x1010 conidios/ml sobre la germinación de conidios de A. solani, los tratamientos fueron tres dosis y seis cepas y dos testigos (químico y absoluto) lo que totalizó 20, para el análisis de varianza se uso un DCA con arreglo factorial A X B + 2. Se usaron cinco unidades experimentales. Las cepas EELS y Río Verde tuvieron el mejor efecto sobre la germinación de A. solani, igualmente los muestra la interacción; mientras que la inhibición de los tubos germinativos y deshidratación de esporas fue con la cepa Río Verde. En invernadero se usaron seis y cuatro cepas de antagonistas y dos testigos en los cultivares Floradade y Miramar, totalizando ocho y seis tratamientos en su orden. En Floradade los menores porcentajes de foliolos infectados por A. solani fueron con las cepas Pedro Carbo y EELS y en Miramar la cepa EELS y testigo comercial. La temperatura y humedad relativa favorable para el desarrollo de la enfermedad fluctuó entre 24 y 26 ºC y 60% de humedad relativa. 33 IX. SUMMARY The early blight of tomatoes Alternaria solani is one of the main phytosanitarian problems, for its management the producers use chemical products that affect people’s and ecosystem’s health, so the search of biocontrol agents is necessary. The present research had the following objectives: 1) Identify microorganisms’ antagonists that will act in a natural form on phytopathogens of leaves in the tomato crop and 2) Testing the efficacy of it or the antagonists on phytopathogens of leaves in a laboratory or greenhouse conditions. The sampling was performed in producing fields of Guayas and Santa Elena province. The identification of the antagonists was realized through CTAB method modified for the extraction of DNA, were used internal transcribed spacer sequences of ribosomal DNA (ITS 1 e ITS2). Trichoderma asperellum in the Isidro Ayora, Río Verde and El Azúcar strains was identified; Hypocrea lixii in the 20km, the Pedro Carbo and EELS strains were not identified. The pathogenicity test consisted in confront mycelium of A. solani and the antagonists strains; they were evaluated every 24 hours to 120 hours. The six strains showed their maximum growths on the 48 hours and El Azúcar and EELS were highlighted as the fastest. To determine the effect of the six antagonist strains, the doses 1x106, 1x108, 1x1010 conidia/ml on the conidia germination of A. solani were used, the treatments were three doses, six strains, and two controls (chemical and absolute) that totalized 20, for the variance analysis was used an DCA with A X B + 2 factorial arrangement. There were used five experimental units. The EELS and Rio Verde strains had the best effect on the A. solani germination, also shows the interaction, whereas inhibition of germ tubes and spore dehydration was with the Rio Verde strain. In the greenhouse were used six and four antagonist strains and two controls in the Floradade and Miramar crops, totalizing eight and six treatments in their order. In Floradade the minor percentages of infested leaves by A. solani were Pedro Carbo and EELS strains, and in Miramar the EELS strain and the comercial control. The temperature and the relative moisture favorable for the disease development ranged between 24 and 26°C and 60% of the relative moisture. 34 X. BIBLIOGRAFÍA AGRIOS, G. N. 2004. Fitopatología. México. Limusa S.A. p 358. BENITEZ, T.; RINCÓN, A.; LIMÓN, M.; CODÓN, A. 2004. Mecanismos de Biocontrol de cepas de Trichoderma. Rev. International Microbiology. V.7 n.4. Madrid. (en línea). 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Esporas normales (A) y deshidratadas (B) de Alternaria solani por efecto de hongos antagonistas en condiciones de invernadero. 2011. B A 39 Anexo 4. Identificación molecular de las cepas de antagonistas Guayaquil, 29 de noviembre del 2011 Ing. Leticia Vivas INIAP - Estación Experimental Boliche DIRECCIÓN: Km 26 Vía Durán -Tambo Mariuxi Molina Estudiante de la Universidad de Guayaquil Objeto: Identificación molecular en 6 cepas de hongos. 1- Extracción del ADN cromosómico. 2- Amplificación mediante PCR de diferentes regiones genómicas, dependiendo de la naturaleza del agente a identificar. Para la identificación de hongos, se trabajo sobre las secuencias espaciadoras internas transcritas del ADN ribosomal (ITS1 y ITS2). 3- Purificación de los amplicones 4- Secuenciación 5- Análisis de las secuencias en bancos de datos (GenBank, EMBL etc…), mediante alineamiento de homología usando el BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), alineamiento y árbol filogenético mediante el programa MEGA4 y CLUSTALW. 6- Entrega del informe. Por medio de la presente, le hago entrega del informe correspondiente al análisis molecular para la identificación de las cepas hongos entregadas. Agradeciendo por su interés en nuestros servicios, quedo de Ud., para cualquier información adicional que se requiera. Atentamente, Emmerik Motte, Ph.D. Director de Investigación Conceptazul S.A. Cdla. Vernaza Norte, Mz. 10, V. 34, Box 09 02 142 A, G UAYAQUIL – ECUADOR Telefax: (593 04) 2 284 066 - 2 284 615 / email: [email protected] 40 Identificación molecular de cepas de Hongos Objetivo. Identificación molecular de 6 cepas de hongos aislados en el INIAP- Estación experimental Boliche, correspondiente a un trabajo de Tesis con la Facultad de Biología de la Universidad de Guayaquil. Metodología. Cepas. Fueron entregadas por el INIAP las cepas de hongos INI-AZ (El Azúcar), INI-EELS, INI-IA, INI-KM (Km200), INI-PC, INI-RV (Río Verde). Extracción de ADN. Para las cepas bacterianas obtenidas se procedió a extraer su ADN genómico mediante los protocolo para bacterias “TENS” y .para hongos se empleo el método de CTAB modificado permitiendo así la extracción del ADN correspondiente. Amplificación por PCR. Para la identificación de hongos, se trabajo sobre las secuencias espaciadoras internas transcritas del ADN ribosomal (ITS1 y ITS2). Secuenciación y análisis de secuencias. Las secuencias fueron purificadas mediante el Wizard PCR Clean Up System de Promega y enviadas a secuenciar. El alineamiento de las secuencias se realizó empleando el software online Blast (Basic Local Alignment Search Tool), se determinó la homología mediante comparación de las secuencias en el GenBank, y se desarrollo la construcción de arboles filogenéticos de acuerdo a la homología mediante el programa Mega 4 y CLUSTALW. Resultados. Las secuencias amplificadas presentaron fragmentos con su respectivo en tamaño. Secuenciación. Los productos de las regiones ITS amplificados para cada hongo fueron secuenciados y analizados en los bancos de datos, obteniéndose los siguientes resultados: Análisis de las cepas de hongos. Analizando las secuencias de las regiones ITS1 e ITS2 de los genes rRNA (18S y 28S) se identifico como Trichoderma asperellum las cepas AZ, IA y RV. La cepa RV sin embargo solo presento 92% de identidad y a que la secuencia obtenida no era pura, lo cual indica que la muestra poseía más de un tipo de hongo. La cepa KM fue identificada como Hypocrea lixii (teleomorfa de Trichoderma harzianum). Las cepas EELS y PC no pudieron ser identificadas ya que las secuencias presentaron demasiada variabilidad a lo largo de la secuencia, producto de una mezcla de cepas en la muestra. Secuencias obtenidas con las diferentes cepas de Hongos: >INI-AZ-ITS CTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTAGGGGCCGGCACCCG TGTGAGGGGTCCCGATCCCCAACGCCGATCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAA ATGACGCTCGGACAGGCATCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAA AGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTNATCGCATTTCGCTGC GTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTGAAAGTTTTGATTCATTTT GAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAAGAAATACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAGA GTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGG CGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTG TAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGA 41 INI-EELS-ITS No interpretable… >INI-IA-ITS GAAACTTGGNTGTTTTACGGANGTGGGCGCGCCACGCTCCCGGTGCGAGTTGTG CAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTAGGGGCCG GCACCCGTGTGAGGGGTCCGATCCCCAACGCCGATCCCCCGGAGGGGTTCGAGG GTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGAGCAATGT GCGTTCAAAGATTCNATGATTCACTGAATTCTGCAATTACATTACTTATCGCATT TCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGA TTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAAGAAATACGTCCGCGAGGGGACTAC GAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCA CCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTG GGAGTTGTAAACTCGGTAAGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGA >INI-KM-ITS CATTTCAGANAGTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCCCGGTGCG AGTTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTC GGGGCCGGCACCCGTGTGAGGGTCCCGATCCCCAACGCCGATCCCCCGGAGGGG TTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGC GCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCGCAATTCACATTACTTA TCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAA GTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAAATACGTCCGCGAGGG ACTACAGAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGC GACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTG GGTTTGGGAGTTGTAAACTGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGA >INI-RV-ITS No interpretable 42 >INI-RV-ITS AGGTCACTTTCNGAANGTTGGTTGNTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCNNNANTTCCGA GTTGTGCCNCTACTGCGCAGGAGAGGTTGCCGCTATACCGCCACTGTATTTANGGGCCGG CACCCGTTGAGGGGTCCCTATCCCCCTCCCCGATCNCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAC TGACGCTCGGACAGGTTTGCCCGCCAGAATACTGGNGGTCGCNATGTGCNTTCAAAGATT CGATGATTCACTGATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGA TGCCNGAACCAAGAGATCCGTTGTTCAAACTTTTGATTCCTTTTGAATTTTTGCTCAGAGC TGTAAAGAAATANGTCCGNAGGGGACTACAGAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGG CGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCGTGATCCCGCCGAGGCAACAGTTTGG TAACGTTCACATTGNGTTTGGGAGTTGTAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCT ACGGA Dendrograma filogenético producto del alineamiento de las secuencias Conclusiones Los resultados permitieron identificar a Trichoderma asperellum como cepa dominante de las muestras entregadas, con una alta homología entre AZ y KM, y una variante correspondiente a la cepa IA. La cepa RV fue identificada como Hypocrea lixii asociado con Trichoderma harzianum. Las secuencias KM y AZ comparten 99% de similitud, y a su vez tienen un 98% y 91% de similitud con IA y RV respectivamente. IA y RV comparten un 94% de similitud. Cdla. Vernaza Norte, Mz. 10, V. 34, Box 09 02 142 A, G UAYAQUIL – ECUADOR Telefax: (593 04) 2 284 066 - 2 284 615 / email: [email protected] 43