Clase 22 Fitorremediacion.doc

Agrobiotecnología.
Clase 22: Fitorremediación
Alternativas actuales para eliminar contaminaciones de metales pesados
Transparencias 3-6
La contaminación ambiental con metales pesados y radionucleótidos es un serio
problema tanto para la salud humana como para la agricultura. La fitorremediación es
una de las tecnologías emergentes que podrá solucionar, al menos parcialmente, este
problema. Tanto la contaminación de suelos como la de aguas ponen en riesgo la
salud y la calidad de vida humana. Por ejemplo, el níquel puede producir desde
irritación en la piel hasta daños pulmonares, del sistema nervioso y de las mucosas, y
es además un agente carcinogénico. Por otro lado, el plomo puede producir anemia,
enfermedades del hígado y riñones, daño cerebral y hasta la muerte. La transparencia
4 muestra los rangos de concentración comúnmente hallados y los límites permitidos
para algunos contaminantes metálicos y para los radionucleótidos más importantes
La actividad industrial ha crecido enormemente desde los comienzos del siglo XX.
Este crecimiento fue acompañado con el aumento de desechos tóxicos, nocivos tanto
para el ambiente como para los organismos que en él habitan, incluyendo al hombre.
La necesidad de disminuir el impacto ambiental de los subproductos industriales ocupa
un lugar creciente en la agenda pública. Paralelamente, comienza a divisarse un
nuevo mercado económico, dirigido hacia el tratamiento de efluentes y
descontaminación ambiental. La transparencia 5 presenta algunos datos referidos al
costo actual de los procesos de descontaminación en Estados Unidos.
Existen diversas alternativas tecnológicas para el tratamiento de suelos y aguas
contaminados, pero su alto costo hace que muchas de éstas resulten poco factibles
desde el punto de vista económico. Recientemente, se ha generado un gran interés en
utilizar especies vegetales capaces de crecer en suelos altamente contaminados en
técnicas de biorremediación (transparencia 6). Muchas de estas especies acumulan
las sustancias contaminantes en su parte aérea y esto permite utilizarlas como
extractores de bajo costo de una variada categoría de sustancias tóxicas.
Fitorremediación
Transparencias 7-24
Existe una abundante literatura sobre la remediación de suelos y aguas mediante el
uso de plantas. Esta tecnología, aún emergente, se vuelve cada vez más prometedora
dadas las grandes ventajas que presenta respecto de las tecnologías tradicionalmente
utilizadas en descontaminación. Dependiendo de los autores, pueden encontrarse
distintas definiciones de “fitorremediación”. En la transparencia 8 se presentan dos de
ellas a modo de ejemplo. La transparencia 9 enumera algunos ejemplos de
contaminantes orgánicos y las formas más frecuentes utilizadas para degradarlos por
fitorremediación. La transparencia 10 hace lo propio para el caso de los contaminantes
inorgánicos.
Se conocen hasta el momento más de 400 especies vegetales capaces de acumular
sustancias tóxicas con distintos grados de eficiencia. La fitorremediación ofrece una
serie de ventajas importantes en comparación con las técnicas tradicionales de
descontaminación ambiental, algunas de las cuales se enumeran en la transparencia
12. Sin duda, el mayor beneficio que deriva de los métodos de fitorremediación es de
tipo económico. Por ejemplo, en Estados Unidos, el costo para remediar un acre de
suelo hasta 50 cm de profundidad ronda los U$S 400.000 si se aplican tecnologías de
excavación, mientras que si se utilizan plantas para el mismo propósito el costo
desciende a U$S 60.000. Esta diferencia se debe principalmente a que no se
necesitan maquinarias costosas ni personal altamente calificado.
En muchos casos, la fitorremediación se utiliza como paso final para la
descontaminación de algún sitio que fue previamente tratado mediante el uso de otras
tecnologías. A pesar de las grandes ventajas listadas en la transparencia anterior, al
encarar un proceso de fitorremediación deben considerarse también las limitaciones
de este enfoque, las cuales se enumeran en la transparencia 13. Un riesgo que debe
ser correctamente evaluado es el efecto potencial sobre la cadena alimentaria. Por
ejemplo, si algún herbívoro se alimenta de plantas utilizadas en un proceso de
fitorremediación, ello podría tener efectos nocivos y hasta letales sobre él y/o sobre
sus predadores. Aunque se está trabajando activamente en el análisis de efectos de
este tipo, se requiere aún más investigación para que se puedan establecer métodos
de manejo adecuados.
Pueden distinguirse distintos tipos de fitorremediación según el modo en que la planta
capta o metaboliza la sustancia contaminante (transparencia 14). Una de las formas
más importantes, la fitoextracción, involucra el uso de plantas terrestres para absorber
metales pesados desde el suelo, para luego transportarlos hacia el tallo y las hojas.
Una vez fitoextraídos, los metales pueden acumularse en la porción aérea de la planta
y cosecharse para luego reducir su volumen por incineración. Los compuestos tóxicos
pueden también liberarse como especies volátiles menos tóxicas.
El diseño del sistema a utilizar para la descontaminación variará según el o los
compuestos contaminantes, la concentración de dichas sustancias y las condiciones
del sitio a remediar (transparencias 15 y 16). El tipo de fitorremediación que será
utilizado es muy importante, ya que el diseño del sistema dependerá de ello. Algunos
factores clave a tener en cuenta son:
Selección de la especie vegetal: en general se utilizan plantas de rápido crecimiento,
fáciles de crecer y mantener. No debe olvidarse el requerimiento de agua de las
plantas en el terreno en que serán ubicadas. Algunos diseños utilizan especies
autóctonas para no modificar demasiado la flora local. Obviamente, la especie
seleccionada deberá descontaminar eficientemente la sustancia tóxica. Pueden
utilizarse plantas, árboles, pastos o algas.
Datos de toxicidad y de degradación de contaminantes: es necesario analizar el tipo
de contaminación para asegurar la correcta elección del sistema. Probablemente
deben realizarse ensayos a pequeña escala para comparar la efectividad de
descontaminación de distintas especies. También es necesario analizar la cantidad y
características de los compuestos que la planta produce y/o libera.
Esquema y densidad de las plantaciones: la densidad de plantación dependerá de la
planta utilizada y del tipo de aplicación. Debe estimarse la cantidad de biomasa
producida lo largo del tiempo por unidad de superficie. Además, en algunos casos será
necesario realizar plantaciones sucesivas a lo largo de un período preestablecido.
Irrigación, insumos agronómicos y mantenimiento: en aplicaciones de fitorremediación
terrestre debe incluirse el costo de irrigación. La frecuencia y cantidad de las lluvias y
las características del clima regional son factores que podrán modificar el
requerimiento de agua de riego. Otros costos importantes que deben incluirse en el
plan son las plantaciones sucesivas, el mantenimiento y monitoreo, la cosecha y la
fertilización, entre otros.
Zona de captura de agua y tasa de transpiración: Debe analizarse el movimiento del
agua y su destino final. Un árbol maduro es capaz de liberar más de 760 L de agua por
año a través de la transpiración. En algunos casos, las plantas liberarán al medio
productos menos tóxicos que aquellos que les dieron origen mediante el proceso de
transpiración.
Tasa de captación del contaminante y tiempo de limpieza requerido: existen varias
ecuaciones para determinar la tasa de descontaminación.
Análisis de riesgos contingentes: no debe excluirse la posibilidad de que se presenten
eventos inesperados (plagas, sequía, vientos, animales, etc.) que pongan en peligro el
sistema de fitorremediación planteado. Es recomendable considerar esto y disponer de
estrategias de contingencia para asegurar el éxito del programa.
La fitoextracción, uno de los tipos de fitorremediación más utilizados, es empleada
comercialmente para la descontaminación de ciertos metales. En la tabla de la
transparencia 17, se presentan ejemplos de pruebas de campo realizadas para
descontaminar distintos compuestos. Sin embargo, aún se requiere un mayor
desarrollo de la tecnología para optimizar la capacidad de las especies fitoextractoras.
Una posibilidad a considerar es la aplicación de técnicas mixtas combinando
fitorremediación con tecnologías tradicionales.
Pueden distinguirse tres grandes pasos durante el proceso de acumulación de metales
pesados en las plantas: a) la captación por las raíces; b) el transporte y; c) los
mecanismos de evasión y de tolerancia (transparencia 18).
Captación por las raíces: los metales pueden presentarse disueltos en el agua
superficial del suelo o adsorbidos a componentes del mismo. En el primer caso, la
planta será capaz de absorberlos directamente de la solución en la que se encuentran.
En el segundo, deberá solubilizar previamente los metales mediante la secreción
radicular de fitosideróforos, proteínas quelantes (fitoquelatinas y metalotioneínas), y
protones que acidifican el medio. Una vez solubilizados, los iones metálicos podrán
ingresar a la raíz por vía apoplástica (extracelular) o por vía simplástica (intracelular).
Transporte: una vez que los metales se encuentran dentro de la planta, pueden ser
acumulados en las raíces o exportados hacia el tallo. La exportación hacia el tallo se
realiza a través del xilema y la redistribución dentro del mismo de realiza por el floema.
Finalmente, los metales son almacenados dentro de la vacuola celular.
Mecanismos de evasión y de tolerancia: la planta debe contar con mecanismos que
eviten que los metales pesados la afecten severamente. La evasión, es decir, la
limitación en la captación de los metales, puede ser uno de los sistemas utilizados. La
detoxificación o la resistencia metabólica a los metales pesados son otras alternativas
para evitar los efectos tóxicos.
Las transparencias 19 a 23 presentan algunos de los procesos biológicos que afectan
a la fitorremediación y que deben ser estudiados en mayor profundidad para poder
hacer más eficientes los procedimientos basados en esta técnica.
La transparencia 24 presenta algunos ejemplos de las especies más utilizadas en
fitorremediación. En particular, los álamos han sido utilizados para la remoción de
suelos contaminados con diversos compuestos. Entre ellos, pueden citarse como
ejemplos la atrazina, el tricloroetileno y el selenio.
Tipos de fitorremediación
Transparencias 25-62
La fitorremediación puede aplicarse tanto al tratamiento de contaminaciones con
compuestos orgánicos como con sustancias inorgánicas. Los agentes contaminantes
pueden a su vez, estar presentes en un sustrato sólido (suelo), líquido (agua), o en el
aire. Tomando en cuenta estos factores, los procesos de fitorremediación puede
dividirse en distintos tipos: fitoextracción, rizofiltración, fitoestimulación,
fitoestabilización, y fitotransformación. En las transparencias 26 a 28 se resumen los
aspectos esenciales de cada tipo de proceso. La transparencia 29 resume y
complementa la información anterior. Se enumeran los distintos tipos de
fitorremediación y se presentan algunos ejemplos de las contaminaciones más
frecuentes para los que han sido utilizados.
La planta ideal para su utilización en procesos de fitoextracción debería tolerar y
acumular altas concentraciones de metales en las partes cosechables, tener una alta
tasa de crecimiento y una alta producción de biomasa. Thlapsi caerulescens,
perteneciente a la familia Brassicaceae, es una de las plantas identificadas como
hiperacumuladora de metales. Sin embargo, su reducido tamaño limita la utilización de
esta especie en aplicaciones a campo. Brassica juncea es otra especie prometedora
para su utilización en este proceso. Es capaz de acumular distintos metales pesados
en su tallo, y produce mayor cantidad de biomasa que T. caerulescens. Sin embargo,
para la mayoría de los casos citados en la tabla, T. caerulescens acumula niveles más
altos de metales pesados que B. juncea. En consecuencia, al elegir la especie para un
sistema de fitoextracción, es muy importante establecer la relación entre la biomasa
producida y la capacidad de acumular sustancias tóxicas. En la transparencia 31, se
enumeran algunas plantas típicas que han sido empleadas en procesos de
fitoextracción. T. caerulescens es una de las especies más estudiadas por su
capacidad hiperacumuladora. Esta especie puede acumular hasta 40 mg de zinc por
gramo de tejido foliar seco. También puede acumular niveles considerables de cadmio.
Sin embargo, es una planta de crecimiento lento y genera poca biomasa, por lo que se
la usa principalmente como un modelo experimental.
La biodisponibilidad de los metales para su captación por la planta es un factor
determinante de la efectividad de la remediación (transparencia 32). Los metales en
estado iónico o adsorbidos a constituyentes inorgánicos del suelo pueden ser
captados por la planta para comenzar el proceso de fitoextracción. El manejo de la
biodisponibilidad de los metales es crítico para el éxito de cualquier plan de
fitorremediación, existiendo varios métodos para incrementar la misma. Por ejemplo, el
agregado de quelantes origina la formación de complejos quelante-metal y permite que
los metales estén disponibles para su captación. En suelos con bajo pH, la adsorción
de los metales se halla disminuida y aumenta la concentración de las formas solubles.
En este caso, manteniendo un pH levemente ácido, se puede incrementar la
biodisponibilidad de los metales y, por lo tanto, su captación. Muchos metales pesados
están unidos a óxidos, y su disolución es otra forma de aumentar la biodisponibilidad.
Algunas plantas exudan agentes reductores por sus raíces, lo que modifica el estado
redox del suelo y permite disociar los óxidos metálicos. Es sabido también que los
microorganismos presentes en la rizosfera facilitan la captación de nutrientes por la
planta. El enriquecimiento de la rizosfera con microorganismos capaces de favorecer
la captación de metales pesados puede contribuir a facilitar la biodisponibilidad. La
transparencia 33 muestra gráficos que representan dos estrategias de fitoextracción:
fitoextracción continua y fitoextracción asistida por quelantes.
Fitoextracción continua: se basa en la capacidad natural de algunas plantas de
hiperacumular metales a lo largo de su ciclo de vida. La desventaja de este sistema
deriva de que muchas plantas hiperacumuladoras son de bajo crecimiento, producen
poca biomasa, y no son capaces de acumular los principales metales contaminantes
(cadmio, plomo, uranio). En el esquema de la transparencia 32 se muestra la
captación del metal a lo largo del tiempo a medida que las plantas crecen. La cosecha
de las mismas se efectúa una vez que alcanzan su tamaño óptimo y la máxima
incorporación del metal
.
Fitoextracción asistida por quelantes: debido a que los metales más problemáticos no
están bajo formas disponibles en el suelo, se utilizan quelantes, como EDTA, para
favorecer la biodisponibilidad de dichos compuestos e incrementar la acumulación en
la planta. El esquema de la transparencia 33 muestra las dos etapas del proceso. En
la primera, se deja crecer la planta hasta el tamaño deseado, siendo mínima la
incorporación del metal. En la segunda, se aplica el quelante y se produce la máxima
captación del metal. Finalmente, se efectúa la cosecha. El gráfico de barras muestra
un ejemplo en que la aplicación de EDTA permite aumentar la captación de plomo. En
este caso, se midió la concentración del metal en los tallos de B. juncea tras haber
tratado el suelo con distintas concentraciones del quelante. Se observa que a medida
que se incrementa la cantidad de quelante aplicado, aumenta significativamente la
captación de plomo por la planta.
Una posible forma de incrementar la acumulación de metales en las plantas es
mediante la sobrexpresión constitutiva de proteínas que intervienen en el transporte de
éstos a la vacuola celular. En las transparencias 34 y 35, se muestran experimentos
realizados con células de Saccharomyces cereviciae y plantas de Nicotiana tabacum
transformadas con el gen de Arabidopsis thaliana cax2, el que codifica una proteína
transportadora de Ca2+. Los ensayos realizados se explican parcialmente en las
propias transparencias. Todas las cepas de la levadura se cultivaron hasta saturación
y luego se diluyeron 500 veces en medio conteniendo distintas concentraciones de
MnCl2. Las incubaciones se realizaron por 1 día a 30oC. La tolerancia al Mn2+ está
cuantificada mediante la densidad óptica de los cultivos de S. cereviciae. Como puede
observarse en la gráfica, la sobrexpresión de CAX2 en S. cereviciae aumenta la
tolerancia a Mn2+, tanto en la cepa mutante cnb como en la cepa salvaje. Panel
superior de la transparencia 35: los ensayos se realizaron complementando el medio
con 10 mM CaCl2, 0,1 M CdCl2 o 0,1 mM MnCl2. El contenido de iones se determinó
por espectrometría de absorción atómica. Las plantas transgénicas para CAX2 son
capaces de acumular mayor cantidad de iones. Estos resultados son más notorios si
se analiza el contenido de iones de las raíces. Panel inferior de la transparencia 35:
para los tres iones analizados, puede observarse que la expresión de CAX2 en ambas
líneas transgénicas (curvas en anaranjado y azul) aumenta al transporte de iones
comparado con la línea control (curva verde).
La contaminación con cadmio de los suelos se debe principalmente al excesivo uso de
fertilizantes fosfatados, desechos domiciliarios y deposición ambiental. Muchos
cultivos de interés agronómico captan el metal. Por lo tanto, dicho problema alcanza la
alimentación humana y las tierras cultivables. Algunos organismos resisten
naturalmente al estrés causado por metales pesados mediante proteínas quelantes del
metal en cuestión (metalotioneínas y fitoquelatinas). Aumentando la expresión de
dichas proteínas en la especie vegetal a utilizar mediante la sobrexpresión de los
respectivos genes, se podría desarrollar resistencia frente al metal pesado. Como se
muestra en la tabla de la transparencia 36, el gen que codifica la proteína de interés
puede derivar de una especie vegetal o de otros organismos.
Las algas y plantas acuáticas constituyen una alternativa de elección cuando se trata
de descontaminar aguas o tierras inundadas. Lemna minor es una planta que posee
una alta tasa de multiplicación. La fitorremediación de aguas contaminadas con esta
especie hace uso de esta ventaja para generar una gran cantidad de biomasa en un
corto período de tiempo. La transparencia 37 presenta los dos mecanismos principales
que utilizan las especies acuáticas para remover contaminantes de aguas
polucionadas.
La transparencia 38 presenta un ejemplo de fitoextracción de níquel y plomo realizado
con L. minor. Las figuras muestran ensayos realizados en presencia de ambos
metales con el fin de establecer la presencia o ausencia de efectos antagónicos o
sinérgicos. Figura superior: se observa la remoción de níquel a partir de un nivel inicial
alto (5 mg/L) para tres concentraciones diferentes de plomo. La remoción del metal es
rápida, y luego de las 5 h permanece constante. Se logra remover hasta un 87% del
níquel presente. Figura inferior: se muestra la remoción del plomo a partir de un nivel
inicial alto (10 mg/L) para tres concentraciones distintas de níquel. Se observa una
remoción del 83%. Puede concluirse que la presencia de cada uno de estos metales
no incide sobre la captación del otro, por lo cual se deduce que los mecanismos
involucrados son independientes.
El uso de raíces de plantas para absorber, concentrar y precipitar metales tóxicos de
aguas o napas contaminadas se denomina rizofiltración (transparencia 39). Este
sistema permite el tratamiento in situ de los contaminantes, minimizando su impacto
en el entorno. En una primera etapa, plantas con raíces bien desarrolladas se ponen
en contacto con agua contaminada a modo de aclimatación. Luego, las mismas son
implantadas en el sitio contaminado para colectar los compuestos tóxicos. Una vez
que las raíces se saturan con los mismos, se lleva a cabo la cosecha de las plantas.
Estudios realizados con este tipo de métodos demostraron que algunas plantas tienen
la capacidad de remover hasta el 60% de su peso seco en forma de metal tóxico.
Se han realizado estudios para analizar la capacidad de distintas plantas acuáticas
para descontaminar sustancias tóxicas presentes en su ambiente mediante
rizofiltración (transparencia 40). Por ejemplo, se ha demostrado que Myriophyllum
aquaticum puede degradar trinitrotolueno (TNT). Esta planta posee la habilidad de
tomar TNT de su medio y metabolizarlo, formando productos de oxidación. Los
productos de degradación se acumulan en el tejido vegetal. A pesar de que aún no se
han determinado los niveles de toxicidad del TNT ni de sus derivados para la planta,
se están llevando a cabo numerosos estudios para dilucidar este interrogante.
Un posible enfoque para la rizofiltración de radionucleótidos es la utilización de
tumores de raíces obtenidos por transformación con Agrobacterium rhizogenes. Las
transparencias 41 y 42 muestran ensayos realizados con raíces transformadas de B.
juncea y Chenopodium amaranticolor para la captación de uranio. El panel inferior de
la transparencia 43 muestra estudios de captación de uranio (bajas concentraciones;
25-500 M) realizados con las raíces de ambas especies. La relación entre la
concentración de uranio en el medio y la cantidad de uranio captado por el tejido
radicular resulta lineal: a medida que aumenta la concentración del metal en el medio,
aumenta proporcionalmente la cantidad de uranio captado por las raíces. La
transparencia 44 muestra estudios de captación de uranio (altas concentraciones; 5005000 M) realizados por las raíces de las especies mencionadas anteriormente. Se
observa captación lineal para el caso de las raíces de C. amaranticolor. Por el
contrario, los ensayos con raíces de B. juncea muestran que el sistema llega a
saturación a partir de una determinada concentración de uranio.
La fitotransformación, que abarca los procesos de fitodegradación y fitosolubilización,
es la conversión de contaminantes orgánicos dentro de la planta mediante procesos
metabólicos propios de la misma. Los tóxicos son degradados en compuestos más
simples, que se integran a algún tejido de la planta. La transparencia 43 enumera los
factores que deben considerarse al implementar este tipo de fitorremediación. La
liberación de contaminantes volátiles a la atmósfera mediante la transpiración de la
planta se conoce con el nombre de fitovolatilización, y es una forma de
fitotransformación. A pesar de que la liberación de contaminantes a la atmósfera no
sea el objetivo principal de la remediación, la fitovolatilización puede ser deseable, ya
que se reduce el riesgo de contaminación de las napas de aguas subterráneas. Se ha
demostrado que algunos álamos híbridos son capaces de transformar el tricloroetano
(TCE) en tricloroetanol, ácido tricloroacético, y ácido dicloroacético, con mineralización
parcial de TCE a CO2. También se ha observado que el pesticida atrazina es
transformado por esta especie.
Las especies vegetales son capaces de metabolizar distintas familias de compuestos
orgánicos porque poseen rutas metabólicas que no están presentes en otros
organismos. La transparencia 45 muestra ejemplos de procesos de degradación que
pueden ser realizados por las plantas. La identificación de estas rutas en distintas
especies permitirá extender el uso de este tipo de fitorremediación.
Los trabajos previos de remediación de explosivos se basaban en la capacidad de
hongos y microorganismos para degradar compuestos tales como TNT
(trinitroglicerina), RDX (1,3,5-trinitro-1,3,5- triazina), TETRYL (N-metil-N,2,4,6tetranitroanilina), y HMX (octahidro-1,3,5,7-tetrazocina). Estos enfoques presentan
como desventaja el requerimiento de excavar la tierra contaminada para su
procesamiento posterior en biorreactores, lo que equipara los costos de este método a
los de la incineración tradicional. Una posible solución a esta clase de contaminantes
es la utilización de especies vegetales capaces de asimilar y modificar los compuestos
mencionados. Aunque hasta el presente la fitotransformación de explosivos por esta
vía ha resultado parcial (transparencia 46), se trabaja intensamente para optimizar el
proceso.
El TNT es uno de los explosivos más tóxicos y peligrosos. Durante los últimos 100
años se ha estado acumulando en depósitos y arsenales, y su eliminación se ha
convertido en un gran problema desde el punto de vista ambiental. Actualmente, la
incineración es el único método disponible para el tratamiento de suelos contaminados
con TNT, pero este proceso produce cenizas sin ninguna posible utilidad y contamina
el aire. En los procesos de fitotransformación de compuestos orgánicos debe
contemplarse no sólo la degradación del compuesto original, sino también la
producción de compuestos intermedios y productos finales. La transparencia 47
muestra la ruta de degradación del TNT. Como se puede observar, en los sucesivos
pasos de esta vía se generan distintos productos intermediarios. Resulta de suma
importancia analizar la toxicidad de los mismos, ya que si estos resultan almacenados
en las plantas podrían ingresar en la cadena alimentaria y causar efectos nocivos, y
aún mortales, en los animales que se alimentan de ellas.
En general, los explosivos son compuestos fitotóxicos, aunque algunas especies
vegetales poseen mecanismos para su detoxificación. Por otra parte, la enzima
bacteriana nitroreductasa (NR) de Enterobacter cloacae resulta activa para la
degradación del TNT. En el ejemplo que se ilustra en las transparencias 48 a 51 se
transformaron plantas de Nicotiana tabacum con el gen de NR de esta bacteria y se
analizaron los efectos tóxicos del TNT sobre plantas transgénicas (NR 3-2) y plantas
control no transformadas (NT). Para realizar los ensayos, se cultivaron plantas de 14 d
de edad en medio con o sin TNT durante 7 d adicionales y se midió su peso para
establecer la variación en biomasa. La variación de este parámetro fue tomada como
indicativa de fitotoxicidad. Panel superior de la transparencia 48: se esterilizaron
superficialmente 50 semillas, se germinaron y se crecieron durante 14 d en medio sin
TNT (figura izquierda). Luego se incubaron los brotes de semillas no transformadas y
transgénicas con 0,25 mM de TNT en agua estéril por 7 d adicionales (figura derecha).
En medio conteniendo 0,25 mM de TNT, los brotes de semillas sin transformar
perdieron 34% del peso fresco respecto de los controles sin TNT. Los brotes de
semillas transformadas aumentaron un 18% su peso fresco respecto de los mismos
controles. Panel inferior de la transparencia 48: se sembraron 4 semillas de cada tipo
en placas y se registró el crecimiento de las raíces a los 20 d. En presencia de 0,05
mM de TNT, los brotes de semillas no transformadas mostraron atrofia radicular,
mientras que los brotes de semillas NR 3-2 desarrollaron raíces similares a las de los
brotes cultivados en medio libre de TNT. En medio con 0,1 mM de TNT, los brotes de
semillas no transformadas mostraron un retardo notable en el desarrollo. En contraste
con esto, los brotes de semillas transgénicas sufrieron mínimos efectos fitotóxicos.
Las transparencias 49 y 50 muestran resultados del mismo trabajo. Se midió la
longitud de las raíces de brotes NT y NR 3-2, y se utilizó este parámetro para calcular
un índice de tolerancia (longitud de las raíces de brotes tratados con TNT/longitud de
raíces de brotes control x 100) en cada concentración de TNT ensayada. Como puede
observarse, las raíces de los brotes transformados exhiben mayor longitud que las
raíces de los brotes no transformados, efecto que se observa tanto en el tratamiento
de 0,05 mM como de 0,1 mM de TNT, lo que se refleja en los respectivos índices de
tolerancia. Los resultados que se muestran son un promedio de las mediciones
realizadas sobre 10 brotes individuales. La tabla de la transparencia 50 muestra las
variaciones registradas en el peso de brotes expuestos a dos concentraciones
distintas de TNT. En medio con 0,1 mM de TNT, los brotes transgénicos mostraron
una mayor ganancia en peso que los brotes de plantas sin transformar. Cuando ambos
tipos de plantas se cultivaron en presencia de 0,25 mM de TNT, se observaron
reducciones de peso en ambos casos. Sin embargo, la pérdida de peso resultó menor
en el caso de los brotes transgénicos.
Las transparencias 51 a 53 muestran otro ejemplo de degradación de explosivos, en
este caso la hexahidro 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX). Este explosivo es tóxico para
todo tipo de organismos (incluyendo las plantas) y un posible carcinógeno. Su
degradación ambiental es muy lenta y su presencia en suelos y napas de agua
constituye un problema grave. El hongo Phanerochaete chrysosporium y las bacterias
del género Rhodococcus son capaces de degradar RDX, pero no desarrollan
suficiente biomasa para ser utilizados en procesos de biodegradación. La molécula
responsable de la degradación es un citocromo P450. Como prueba de concepto, se
aisló el gen de citocromo P450 XplA de Rhodococcus rhodocochrous y se lo expresó
en plantas de A. thaliana. Las plantas fueron utilizadas en ensayos de detoxificación
de suelos contaminados con RDX. Los resultados obtenidos se muestran en las
transparencias mencionadas.
Las flechas del diagrama presentado en la transparencia 54 muestran las principales
interconversiones del mercurio en el medio ambiente. El mercurio elemental, Hg(0), y
el mercurio unido a azufre, RSHg, se convierten lentamente en mercurio iónico libre,
Hg(II), el cual actúa como sustrato de las reacciones de metilación. El producto
resultante, metilmercurio, es una grave amenaza ambiental debido a su tendencia a
entrar en la cadena alimentaria acuática y a biomagnificarse. Se ha estimado que el
metilmercurio se concentra en los peces entre 6 y 7 órdenes de magnitud sobre la
concentración presente en las aguas contaminadas y que constituye entre el 90 y el
100% del mercurio total. Por comparación, el mercurio iónico se bioconcentra mucho
menos eficientemente y se elimina con más rapidez. El Hg ha sido utilizado en
diversas industrias cuyos efluentes pudieron contaminar los cuerpos de agua con
dicho metal. Este proceso provocó dos epidemias de envenenamiento en Japón en los
años 60.
No se conocen plantas que detoxifiquen al mercurio. Para poder desarrollar un planteo
de fitorremediación a nivel experimental, se transformaron plantas de A. thaliana con
los genes responsables de la conversión de metilmercurio a mercurio elemental, los
que se aislaron de la bacteria Desulfovibrio desulfuricans. La transparencia 55 muestra
los pasos involucrados en la conversión de metilmercurio a mercurio elemental.
La transparencia 56 muestra ensayos de crecimiento realizados con plantas de A.
thaliana transformadas con cada uno de los genes mencionados anteriormente
(plantas merA y merB) o con ambos en forma simultánea (plantas merA/merB). Por
otro lado, se evaluó si la tolerancia al mercurio orgánico se relaciona con la tasa de
volatilización de Hg(0) utilizando 6 líneas de plantas merA/merB. Los ensayos se
realizaron en ausencia o presencia de 5 M de acetato de fenilmercurio (PMA). Sólo 2
de las líneas (merA/B-1 y merA/B-2) fueron capaces de crecer normalmente en estas
condiciones. Panel superior: se compararon las tasas de crecimiento de plantas
transgénicas (merA9-1, merB-4 y merA/merB-1) y controles no transformadas (NT) en
medio conteniendo mercurio orgánico. Las plantas se cultivaron verticalmente durante
3 semanas para observar el desarrollo radicular. En ausencia de mercurio, las plantas
transgénicas y no transgénicas crecen de manera similar. Las plantas merA no
toleraron la concentración mínima de mercurio orgánico. Las plantas merB crecieron
vigorosamente en presencia de 1 M de mercurio orgánico, pero su crecimiento fue
notablemente menor en 5 M y exhibieron una marcada clorosis en 10 M. En cambio,
las plantas merA/merB-1 germinaron y crecieron sostenidamente aún en 10 M de
mercurio orgánico. Panel inferior: las plantas transgénicas y control se cultivaron en
una cámara cerrada en medio suplementado con 25 M de acetato de metilmercurio
(MeHg). Se realizaron mediciones del contenido de Hg(0) en el aire de la cámara cada
2 min. Los datos están expresados en pg de Hg(0) por mg de peso fresco de tejido. Se
graficaron los totales acumulativos de 10 min en promedios de Hg(0) por minuto. Las
plantas no transformadas (NT), merA y merB exhibieron valores basales. Las plantas
doble transgénicas son poblaciones F2 y por lo tanto, el nivel de volatilización
observado representa el promedio de las plantas portadoras de ambos transgenes.
Las líneas merA/B-1 y merA/B-2 son las que muestran mayor tasa de volatilización de
Hg(0). Las líneas merA/B-3 y merA/B-5 presentaron una volatilización intermedia y
crecieron (aunque lentamente) en medio con 5 M de PMA. Las líneas merA/B-4 y
merA/B-6 no lograron germinar. Estos resultados sugieren que la resistencia a
metilmercurio está relacionada directamente con la conversión del compuesto a
mercurio elemental.
Una estrategia similar a la del trabajo presentado en las transparencias 55 y 56
anteriores se siguió en tabaco, pero introduciendo los genes responsables de la
reducción de metilmercurio en el genoma de los cloroplastos (transparencia 59). Se
germinaron semillas in vitro en medio conteniendo espectinomicina 500 mg/L. Las
plántulas (10 d post-germinación) fueron transferidas a invernadero y cultivadas en
tierra por 6 d adicionales. Luego, las plantas fueron tratadas con 0,50, 100, y 200 M
de acetato de fenilmercurio (PMA). Las fotografías de la transparencia 57 se tomaron
14 d después del tratamiento. Las líneas transgénicas crecieron normalmente en suelo
conteniendo hasta 100 M de PMA y sobrevivieron a 200 M PMA. Ambas
concentraciones de PMA resultaron letales para las plantas no transformadas.
El selenio (Se) es un elemento esencial para muchos organismos, pero resulta tóxico
en altas concentraciones. La toxicidad se basa en la incorporación inespecífica del Se
en algunas proteínas en reemplazo del grupo azufrado (S) de los residuos de cisteína
(Cys). Existen varios mecanismos de tolerancia al Se, y la mayoría de ellos se basan
en evitar la incorporación de Se-Cys en las proteínas (el Se se puede volatilizar como
dimetildiselénido, de baja toxicidad, o acumular en forma de aminoácidos que no se
incorporan a las proteínas). Dado que las plantas acumulan y volatilizan
eficientemente Se del suelo y/o del agua, se ha propuesto utilizarlas para el
tratamiento de ambientes contaminados con este compuesto. Se ha planteado la
posibilidad de sobrexpresar en plantas la enzima selenocisteína liasa (SL) para
aumentar su capacidad de acumular este elemento. En el trabajo que se presenta en
las transparencias 58 y 59 se sobrexpresó el gen de la SL de ratón (que posee alta
actividad frente a Se-Cys y baja frente a Cys) en A. thaliana y se analizó la
incorporación de Se en las proteínas, su acumulación in planta, y la tolerancia
desarrollada en las plantas transgénicas.
La transparencia 59 muestra resultados del trabajo presentado anteriormente. Las
construcciones genéticas utilizadas para la transformación con el gen de
selenocisteína liasa permitieron la acumulación de la proteína a nivel del citoplasma o
del cloroplasto. Panel superior: se analizó la incorporación de Se a proteínas de la
planta. Para ello se cultivaron plantas de A. thaliana en medio conteniendo 0,5 M de
selenito durante 14 d. Se observó que tanto las plantas que expresaban la
selenocisteína liasa en el citoplasma (citSL) como en cloroplastos (cpSL) contenían en
promedio un 42% menos de Se incorporado en las proteínas respecto de las plantas
control no transgénicas (NT). Esto demuestra que la expresión de la enzima previene
la incorporación no específica de Se-Cys en las proteínas. Panel inferior: se estudió la
tolerancia a Se. Para ello se cultivaron plantas de Arabidopsis en medio conteniendo
50 M de selenato, 25 M de selenito o 50 M de Se-Cys. Como parámetro
representativo de la tolerancia, se midió la longitud de las raíces. Estos ensayos
mostraron que las plantas citSL son más tolerantes que las plantas NT. Las plantas
cpSL resultaron menos tolerantes (notar las diferentes escalas utilizadas para la
medición de la longitud de las raíces). Las plantas transgénicas citSL resultan
prometedoras como fitorremediadoras, dado que toleran altas concentraciones de Se y
son capaces de acumularlo en el tallo. Podría utilizarse este modelo para generar
plantas transgénicas de otras especies con el fin de aplicarlas en ensayos de campo
en ambientes contaminados. Actualmente, se está trabajando en la obtención de B.
juncea transgénicas para SL.
La fitoestimulación, también conocida como biodegradación estimulada por la
rizosfera, rizodegradación o biorremediación asistida por plantas, es la degradación de
contaminantes orgánicos presentes en el suelo a través del estímulo de la actividad
microbiana en la zona cercana a las raíces de la planta (rizosfera). La actividad
microbiana se ve estimulada mediante compuestos liberados por las plantas
(azúcares, carbohidratos, aminoácidos, acetatos, enzimas). Además, el sistema
radicular oxigena la rizosfera y así se asegura la transformación aeróbica. Por otro
lado, la biomasa de las raíces aumenta el carbono orgánico disponible. Los hongos
micorríticos que crecen en las inmediaciones de las raíces pueden también degradar
contaminantes orgánicos. La transparencia 61 enumera las características de las
especies utilizadas en fitoestimulación. Este enfoque está siendo ensayado para
reducir la contaminación por combustibles utilizando plantas de alfalfa. También se
realizaron estudios con álamos para combatir la contaminación con atrazina.
La fitoestabilización se basa en la inmovilización de metales pesados del suelo. Ello
tiene importantes consecuencia en minimizar la erosión, reducir la solubilidad de los
contaminantes y su biodisponibilidad en la cadena alimentaria. La aplicación de
materia orgánica, fosfatos, agentes alcalinos, entre otros, puede disminuir la
solubilidad de los metales en el suelo, minimizando su pasaje a las napas de aguas
subterráneas. La planta puede acumular los contaminantes en las raíces o causar la
precipitación de los mismos en las inmediaciones de las raíces. La transparencia 62
enumera los principales contaminantes tratados por este método, las características
buscadas en las plantas candidatas y algunos ejemplos de plantas utilizadas para este
fin.
Plantas transgénicas para detectar compuestos inorgánicos tóxicos en el medio
ambiente
Transparencias 63-67
Las plantas también pueden ser usadas como “indicadoras” para detectar la presencia
de compuestos tóxicos en el medio ambiente. La estrategia utilizada en el ejemplo que
se presenta en las transparencias 64 a 66 se basa en la transformación de plantas de
A. thaliana con una versión del gen reportero uidA conteniendo una mutación puntual
(sustrato de mutación) o copias truncadas del mismo parcialmente superpuestas
(sustratos de recombinación). En ambos casos, la transcripción del gen uidA y, por
ende, la síntesis de la proteína GUS, está inhibida. El gen sólo se expresará en
aquellas células en las que hayan ocurrido una reversión puntual en el sustrato de
mutación o una recombinación homóloga entre los sustratos de recombinación. Estas
plantas se utilizan para la medir genotoxicidad inducida por compuestos tóxicos
inorgánicos. Con cierta frecuencia, las mutaciones inducidas por estos agentes puede
producir la reversión del gen al estado funcional. La tasa de reversión (medible por la
aparición de actividad GUS) es proporcional a la concentración del agente genotóxico.
La transparencia 65 muestra resultados del trabajo mencionado. La frecuencia de
reversión del gen reportero al estado funcional se mide mediante un ensayo
histoquímico de actividad de -glucuronidasa, lo que se visualiza como la aparición de
puntos de coloración azul en el tejido de la planta. Panel superior: cuantificación de las
frecuencias de reversión por mutación en función de la concentración de distintos
metales pesados. Los asteriscos muestran diferencias significativas entre las plantas
cultivadas en distintas concentraciones de contaminante y las plantas cultivadas en
ausencia del mismo (Ct). Como regla general, se observa que al aumentar la
concentración de la sustancia contaminante, también aumenta el número de puntos,
es decir, la frecuencia de mutación. El zinc no parece causar el mismo efecto que las
otras sustancias, por lo menos a bajas concentraciones. Las barras de distintos
colores representan mediciones realizadas en dos líneas transgénicas diferentes.
Panel inferior: en este caso, se realizaron ensayos similares a los anteriores, pero
analizando la frecuencia de recombinación homóloga. Los resultados obtenidos son
similares a los comentados en el panel superior. La tabla de la transparencia 66
compara la sensibilidad de distintos sistemas de biomonitoreo. Entre los ensayos
mencionados, se encuentra el Microtox. El mismo se basa en la detección de la
luminiscencia emitida naturalmente por las bacterias Vibrio fischeri como subproducto
de la respiración celular. El metabólismo de la bacteria es afectado directamente por
agentes tóxicos y, en consecuencia, también lo es la emisión de luminiscencia. El
ensayo MetPlate™ se basa en la inhibición por agentes tóxicos de la enzima galactosidasa de Escherichia coli en muestras acuosas. Se utiliza una microplaca de
96 pocillos y se determina la absorbancia a 575 nm. El ensayo con ratones
transgénicos mencionado se basa en un ratón que porta el gen de la hormona de
crecimiento humana (hGH) bajo el promotor de la hsp70 humano, inducible por estrés.
Cuando cultivos primarios de las células de dicho ratón son tratados con compuestos
tóxicos, o cuando los ratones son inyectados con los mismos, se observa la
producción de hGH. Otros ensayos convencionales utilizan organismos que son muy
sensibles a distintos compuestos tóxicos como indicadores de su presencia en
muestras ambientales, ya sea porque producen su mortandad o alteraciones genéticas
y fenotípicas varias. Utilizando datos provenientes de diferentes estudios, se comparó
la sensibilidad del sistema basado en plantas transgénicas con otros ensayos de
genotoxicidad mencionados. Se observa que este nuevo sistema propuesto resulta
más sensible que los otros para varios contaminantes de gran interés.