Mentaberry 5 Metabol. 2arios en Biorreactores.pdf
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Conceptos y Técnicas de Biotecnología Curso 2010 Producción de metabolitos secundarios en biorreactores Alejandro Mentaberry Departamento de Fisiología, Biología Celular y Molecular FCEN-UBA Sumario Potencial económico de los metabolitos secundarios Estrategias para incrementar la producción de metabolitos secundarios. - Selección de especies vegetales apropiadas - Selección de líneas celulares mejoradas - Optimización de las condiciones de cultivo - Agregado de precursores - Suspensiones, órganos y células inmovilizadas - Uso de elicitores microbianos y de estreses abióticos - Permeabilización y remoción in situ Ingeniería metabólica y biotransformación Diseño de procesos. Ejemplos Referencias Potencial económico de los metabolitos secundarios Cultivo de tejidos y metabolismo secundario Concepto general El metabolismo secundario regula muchas de las relaciones de la planta con el medio circundante • La producción de metabolitos secundarios está estrechamente relacionada con el proceso de desarrollo de la planta. - Generalmente no está asociada al crecimiento. - Depende de condiciones determinadas de control hormonal. - Es paralela al desarrollo de tejidos especializados y órganos (raíces, tallos, hojas y glándulas). - La biosíntesis y acumulación suele estar fuertemente compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidos y de órganos. • Los metabolitos secundarios se producen ante situaciones de estrés o enfermedad. - Factores bióticos - Factores abióticos Las plantas como fuente de metabolitos secundarios de interés comercial - Insecticidas - Saborizantes - Colorantes - Fragancias - Antimicrobianos - Enzimas - Medicinas - Herbicidas - Proteasas • Potencial - 75% de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de las plantas. - Sólo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000300.000 especies vegetales que se creen existentes en el planeta. - 25% de los medicamentos de las industrias farmacéuticas son de origen vegetal. - 75% de la población mundial utiliza la medicina tradicional que consiste principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas. - Desarrollo creciente de fitoterapéuticos y nutracéuticos Ejemplos de terpenoides producidos en plantas Azadiractina AzadiractinaAA (antinutrientede insectos) (antinutrientede insectos) α-Ecdisona (disruptor de lamuda de insectos) Hecogenina (aglicona de una saponina; detergente) Taxol Taxol (droga anticancerígena) (droga anticancerígena) Se conocen unos 25.000 terpenoides presentes en plantas Digitoxigenina (aglicona de digitoxina; tratamiento de congestiones cardíacas) Forbol Forbol (irritante y cocarcinogénico) (irritante y cocarcinogénico) Costunólido Costunólido (repelente de inserctos; (repelente de inserctos; antinutriente de mamíferos) antinutrientede mamíferos) Ejemplos de alcaloides producidos en vegetales Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina Cinchona officinalis Cocaína Quinina Erythroxylon coca Coffea arabica Cafeína Se han caracterizado unos 12.000 alcaloides en plantas Ejemplos de fenólicos derivados de fenilpropanoides Rizoma de ginger gingeroles Pimiento rojo y negro Unos 8.000 fenólicos se forman en las plantas por las rutas del ácido shikimico o del malonato/acetato norhidrocapsaicina capsaicina Granos de café piperina ácido clorogénico Corteza de canela cinnamaldehido Algunas de las medicinas más importantes o sus precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002 Nombre Tipo Origen Uso terapéutico Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 millones US$ Hiosciamina, Alcaloides del tropano Anticolinérgicos Solanaceas escopolamina Camptotecina Alcaloide indólico Antineoplásico Camptotheca acuminata Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgésico local Codeína, morfina Alcaloide opiáceo Papaver somniferum Analgésico Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota Galantamina Alcaloide isoquinolinico Inhibidor coliesterasa Leucojum aestivum Pilocarpina Alcaloide imidazólico Pilocarpus jaborandi Colinérgico Nicotina Alcaloide pirrolidínico Terapia antitabaco Nicotiana spp. Quinina Alcaloide quinolínico Antimalárico Cinchona spp. Quinidina Alcaloide quinolínico Cardiotónico Cinchona spp. Reserpina Alcaloide indólico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrópico Vinblastina, Alcaloide indólico Catharanthus roseus Antineoplásico vincristina Yohimbina Alcaloide indólico Afrodisíaco Apocynaceae, Rubiaceae Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2002: 12400 millones US$ Artemisinina Lactona sesquiterpénica Artemisia annua Antimalárico Diosgenina, Esteroides Hormonas esteroidales Dioscorea spp. Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Antitumoral Glicósidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 millones US$ Digoxina, digitoxina Glicósidos esteroidales Cardiotónico Digitalis spp. Sennósidos A y B Antracenos Laxante Cassia angustifolia Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millones US$ Ipecac Mezcla de alcaloides de Cephaelis Emético ipecacuana ipecacuanha Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplásico Producción de metabolitos secundarios por cultivo in vitro de células y órganos vegetales: ¿por qué? - Independizarse de factores externos, tales como: cambios de temperatura, sequías, plagas, variabilidad de la producción, factores políticos y sociales, etc. - Evitar la extinción de especies vegetales. - Disponer de condiciones controladas en el proceso de producción y extracción. - Hacer viable la producción de compuestos complejos con uno o más C quirales en forma más económica respecto de la síntesis química - Posibilitar la obtención de nuevos compuestos no presentes en la planta madre. - Establecer procesos de biotransformación sólo realizables por enzimas provenientes de plantas. Procesos industriales Tipo de compuesto Producto Compañía Shikonina Mitsui Petrochemical Ind. Berberina Mitsui Petrochemical Ind. Sanguinarina Vigont Researol Lab. Gingsenósidos Nitto Denko Co. Taxol Phyton USA Pigmentos Cartamina Kibun Kyoto University Fragancias Geraniol Kanedo Co. Citronerol Kanedo Co. Saborizantes Vanillina Kanedo Co. Depigmentadores Arbutina Mitsui Petrochemical Ind. Farmacéuticos Productos comerciales potenciales y rendimientos de algunos cultivos de células vegetales Especie Aplicación Rendimiento (%) Precio (U$S/kg) Cloeus blumei Antiinflamatorio 21-36 - Morinda citrifolia Pigmentos 18 - Shikonina Lithospermun erythrorhizon Antibacteriano, colorante 12,4 4.500 Berberina Thalictrum minus Antibacteriano 10,6 3.250 Antocianinas Perilla frutescens Pigmento 8,9 n/a Diosgenina Dioscorea deltoidea Esteroide 3,8 1.000 Morfina Papaver somniferum Analgésico 0,025 340.000 Sanguinarina Papaver somniferum Antibiótico 2,5 4.800 Taxus brevifolia Anticancerígeno 0,06 0,6 M Catharanthus roseus Antileucémico 0 20 M Producto Acido rosmarínico Antraquinonas Paclitaxel (Taxol) Vincristina Tomado de: Scragg. Agricultural Biotechnology, 1998. Viabilidad de un proceso para su escalado a nivel industrial • Condiciones económicas: - Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg) - Alto rendimiento y productividad del cultivo comparado con la planta entera - Buen crecimiento en biorreactores - Crecimiento lento de la planta entera como fuente alternativa • Parámetros principales: - Productividad: g de producto/L/día - Concentración máxima de producto: g de producto/L - Rendimiento: g producto/g sustrato Estrategias para incrementar la producción de metabolitos secundarios Cuantificación y cinética de un proceso Esquema del patrón de crecimiento de una suspensión celular vegetal Td: tiempo de duplicación de la biomasa µ: velocidad específica de crecimiento del organismo Rendimiento de biomasa en sustrato Y: rendimiento X: biomasa S: sustrato Patrones de formación de producto Asociado al crecimiento No asociado al crecimiento Metodologías utilizadas para optimizar la producción de metabolitos secundarios • Selección de especies vegetales apropiadas • Selección de líneas celulares mejoradas • Optimización de las condiciones de cultivo • Agregado de precursores • Tipo de cultivo: suspensiones, órganos o células inmovilizadas • Uso de elicitores microbianos y estrés abiótico • Permeabilización y remoción in situ Metodologías utilizadas para optimizar la producción de metabolitos secundarios • Screening y selección de líneas sobreproductoras - Se facilita cuando el metabolito de interés es un pigmento, ya que puede hacerse una selección visual. - Es importante contar con un método rápido y sencillo para seleccionar líneas más productoras (por ejemplo, ELISA). • Optimización del medio de cultivo (variables más ensayadas) - Fuente de carbono - Limitación en nitrógeno - Limitación en fosfato - Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas) - Relación C/N • Agregado de precursores - Bajo costo - Baja toxicidad - No muy alejado del producto final en la ruta metabólica Diferencias entre suspensiones de células vegetales y de células microbianas Caracterización Células microbianas Células vegetales Consecuencias para cultivos a gran escala Células Individuales 2-10 µm Agregados de 10-200 µm y de hasta 2 mm de diámetro Sedimentación rápida; sensibilidad a fuerzas de corte; formación de gradientes; dificultad para tomar muestras Velocidad de crecimiento Rápida; td ~ 1-2 h Lenta; td ~ 2-5 días Largos tiempos de proceso; baja productividad Densidad de inoculación Pequeña 5-20% Necesidad de grandes cantidades de inóculo; escalado más largo Sensibilidad a fuerzas de corte Insensible Sensible / Tolerante Bajas velocidades de agitación Alta Baja Baja demanda de oxígeno: fermentadores con baja transferencia de oxígeno Extracelular Intracelular / a veces extracelular Permeabilización; remoción in situ Tamaño y morfología Aireación Acumulación del producto Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Cultivos en suspensión • Problemas a considerar: - Tasa de crecimiento - Volumen del inóculo - Tamaño y agregación de las células - Oxigenación - Agitación Ejemplos de tasas de crecimiento de suspensiones de células vegetales en biorreactores Bioreactores Tasa de crecimiento específica µ(d-1) Tiempo de duplicación (d) Nicotiana tabacum 600 L (AG) 0,42 1,7 Nicotiana tabacum 15, 30, 130 L (AG) 0,96 0,72 Nicotiana tabacum 15, 500 L (AG) 1,10 0,63 Morinda citrifolia 10 L (EA) 0,48 1,4 Catharanthus roseus 30 L (EA) 0,32 2,2 Helianthus annuus 80 L (EA) 0,30 2,3 Picrasma quassioides 7 L (EA) 0,12 5,9 Quassia amara 7 L (EA) 0,13 5,2 Línea celular AG: bioreactor con agitación EA: bioreactor de elevación por aire (airlift) Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. La densidad el inóculo y del diseño del biorreactor inciden en el desarrollo de las suspensiones celulares Efecto de la densidad de inóculo en el crecimiento de cultivos de Picrasma quassiodides. Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Tamaño y distribución de agregados de Helianthus annuus en varios biorreactores y en Erlenmeyer Tomado de: Scragg. Secondary products from plant tissue culture, 1990. Tamaño de agregado y acumulación de metabolitos secundarios Porcentaje de callos de Vitis vinifera que contienen pigmentos de acuerdo con el tamaño de los agregados Tomado de: Nagamori et al., Biochemical Engineering Journal, 2001. Distribución del tamaños obtenido en biorreactores con medio en presencia de carboximetilcelulosa (círculos cerrados) y en medio control (círculos abiertos) Tomado de: Honda et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002. Patrón de flujo de dos diseños de propulsor Agitador de paletas planas o de Rushton (flujo radial) deflector Agitador de paletas inclinadas (flujo axial) deflector Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998. Diseños de distintos propulsores Adaptado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles,1998. Biorreactores de agitación neumática Columna de burbujeo Airlift con tubo interno Airlift con loop externo El biorreactor más grande del mundo es de tipo air-lift ICI, Ltd. factory, Billingham, UK Instalada en 1980, produce 6.000 Tm de proteína bacteriana (Methylophilus methylotrophus) por mes. Diseños alternativos para biorreactores con agitación mecánica Biorreactor de tambor rotatorio Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Biorreactor de membranas Tomado de: Böhme et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997. Cultivo de órganos: raíces transformadas Propiedad Forma de crecimiento Patrón de crecimiento Tiempo de duplicación Biomasa final (peso seco/L) Background genético Formación inicial de producto Medio de crecimiento Localización del producto Tipo de proceso Suspensiones Raíces transformadas Células simples-agregados Desorganizado; cada célula puede dividirse y expandirse Red de ramificaciones División celular localizada; crecimiento linear con ramificaciones laterales 36 h-días 30-60 g 15 h-días 30-60 g Heterogéneo Usualmente bajo Complejo; hormonas y vitaminas Intracelular- extracelular Batch; continuo, deben ser inmovilizadas Fenotipo de raíz transformada con Agrobacterium rhizogenes Euploide Similares a la planta madre Simple, sales y azúcar Intracelular- extracelular Batch o continuo, no hay necesidad de inmovilizar Algunos metabolitos secundarios producidos por raíces transformadas Metabolito Género Alcaloides Alcaloides piridínicos Indoles Tropano Otros Betalaina Sesquiterpenos Beta Lippia Artemisia Coreopsis, Bidens Tagetes Poliacetilenos Tiofenos Glicósidos cardioactivos Antraquinonas Saponinas Polyines Lignanos Naftoquinonas Esteroides Nicotiana Catharanthus Cinchona Duboisia Datura Digitalis Cassia Panax Chaenactis Podophyllum Linum Lithospermum Solanum Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997. Biorreactores para el cultivo de raíces Biorreactor de lecho de goteo con malla para inmovilizar a las raíces Biorreactor de lecho de niebla (nutrient mist reactor) Inóculo Salida de aire Malla de inmovilización Bomba peristáltica Rotámetro Adición de nutrientes Filtro de aire Bomba de aire Generador de niebla Aire Aire Reservorio Intensidad On Condensador de niebla Off Controlador Bomba Tomado de:Hairy Roots, Culture and Applications, 1997. Cámara de cultivo Cultivo de tallos • Ventajas - Cultivos genética y bioquímicamente estables - Productos sintetizados y/o acumulados en tejidos presentes en tallos y hojas (glándulas, epidermis, etc.); caso de los aceites esenciales - Niveles similares a los de la planta (no siempre se cumple). • Desventajas - Sólo para productos sintetizados en tallos y hojas - Vitrificación Compuesto Planta Piretrinas Cardenólidos Artemisinina Aceites esenciales Aceites esenciales Chrysanthemum spp. Digitalis spp. Artemisia annua Mentha spp. Pelargoium spp. Cultivo de tallos de Artemisia annua para la producción de artemisinina Tomado de: Liu et al., Process Biochemistry, 2003. Airlift modificados: A: airlift con placas para sostener los cultivos de tallos; B: Igual que A, pero con alimentación por goteo; C: Igual que A, pero con alimentación por niebla. Producción de artemisinina en los distintos bioreactores Inmovilización La inmovilización se define como el confinamiento de un biocatilizador, enzimático o celular, dentro o sobre una matriz sólida para favorecer la liberación del producto y la reutilización del propio biocatilizador. Unión a una matriz: - Covalente - Iónica - Por crosslinking - Por adsorción • Entrampamiento: - Geles o polímeros - Membranas: microencapsulación o reactores de membrana Inmovilización • Ventajas - Posibilita la reutilización del biocatalizador y una rápida separación del medio de cultivo. - Las células vegetales permanecen viables por largos períodos de tiempo. - Es posible establecer sistemas de cultivo continuo, con el consiguiente aumento en la productividad. - Es posible establecer cultivos de alta densidad permitiendo el uso de biorreactores más pequeños. - La inmovilización favorecería la interacción entre las células, favoreciendo cierto grado de diferenciación con el consiguiente incremento en la producción. . - Es compatible con otras estrategias de optimización (elicitación, permeabilización y remoción de producto) - En muchos casos, la misma inmovilización induce la secreción del producto al medio de cultivo. Inmovilización • Desventajas - Se agrega una etapa más al proceso, con el consiguiente aumento en los costos operativos. Esto incluye el costo de la matriz y de toda la maquinaria necesaria para la inmovilización. - Al agregar un barrera más al sistema, aumentan los problemas relacionados con la transferencia de nutrientes y de oxígeno. - El agregado de otra etapa en el proceso aumenta los riesgos de contaminación. Inmovilización Efectos de la inmovilización en la producción de metabolitos secundarios Especie Capsicum frutescens Capsicum frutescens Cofffea arabica Catharanthus roseus Tagetes patula Producto Incremento Tipo de inmovilización Capsaicina Capsaicina Metilxantinas Ajmalicina Tiofenos > 100 > 100 13 3,5 20 Poliuretano Gel Gel Gel Agregados naturales Efectos de la inmovilización en la liberación de metabolitos secundarios % Producto en el medio Compuesto Planta Células Libres Inmovilizadas Ferruginol Solasodina L-DOPA Capsaicina Salvia miltiorrhiza Solanum surattense Mucuna pruriens Capsicum frutescens 26 7 Trazas 45 47-59 90 100 Tomado de: Payne et al., Plant cell and tissues culture en liquid ssytem. 1991. Biorreactores para células inmovilizadas Agitación mecánica Lecho empaquetado Lecho fluidizado La inmovilización en el contexto de distintas opciones de cultivos de tejidos Tomado de: Payne et al. Plant cell and tissue culture in liquid systems, 1991. Elicitación • Agentes bióticos - Extractos de paredes de hongos o bacterias - Acido araquidónico - Quitosano - Metil jasmonato • Agentes abióticos - Metales pesados - Radiación UV - Presión osmótica - Ultrasonido Incremento de la producción de metabolitos secundarios por elicitación en diferentes cultivos in vitro Producto Especie Elicitor Concentración del elicitor Producto en control Producto después de elicitación Alcaloides indólicos Catharanthus roseus (suspensiones) Phytium aphanidermatum (extracto crudo) 10 ml / 50 mL de cultivo 50 µmol / L 75 µmol / L Alcaloides del tropano Datura stramonium (suspensiones) Phytophtora megasperma (extracto crudo) 55 mg / L de cultivo 0,85 mg / g peso seco 4,27 mg / g peso seco Capsidiol Capsicum annum (suspensiones) Trichoderma virideae (extracto crudo) 20 µg / mL 0 1 mg / frasco Berberna Thalictrum rugosum (suspensiones) Saccaromyces cereviseae (extracto crudo) 0,2 mg / g peso fresco 0,5% peso seco 2% peso seco Dopamina Sanguinaria canadensis (suspensiones) Verticilium dahliae (extracto crudo) 1 ml / 15 mL de cultivo 3 mg / g peso fresco 15 mg / g peso fresco Shikonina Lithospermum erythrorizon (suspensiones) Endógeno (extracto crudo) 1 mg / mL 0 28 µg / 10 mL Alcaloides indólicos Catharanthus roseus (raíces transformadas) Penicilinum spp. (extracto crudo) 0,01 g / L peso seco 3 mg / g peso seco Isoflavonoides Lotus corniculatus (raíces transformadas) Glutation abiótico 10 mM 0 Tiofenos Tagetes patula (raíces transformadas) Fusarium conglutanis (extracto crudo) 0,2 mg / mL de medio 0,2 g /100 g peso seco 9 mg / g peso seco 160 µg / g peso fresco 0,55 g / 100 g peso seco Tomado de: Singh. Hairy Roots, Culture and Applications, 1997. Efecto de la configuración del biorreactor sobre el proceso de elicitación Dosaje de elicitor necesario para biorreactor en columna de burbujeo y para biorreactores de lecho de goteo o de niebla en función de la constante de equilibrio entre el elicitor y receptor Gastos de elicitor por biorreactor para biorreactor en columna de burbujeo y para biorreactor de lecho de goteo o niebla. Tomado de: Singh, Hairy root Culture and Applications, 1997. Liberación del producto al medio • DMSO • Shock térmico • Cambios de pH • Limitación de fosfato y oxígeno • Elicitación • Detergentes y aceites de siliconas • Electropermeabilización Remoción de producto in situ • Líquido-líquido: Compuestos inmiscibles en agua: Se utilizan solventes orgánicos o lípidos (sistemas de dos fases agua-orgánico). Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano. Compuestos miscibles en agua: Se utilizan sales o soluciones de polímeros (sistemas de dos fases acuosas). Ejemplos: DEAE, PEG. • Sólido-líquido: La segunda fase es un material sólido como resinas u otros absorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc. • Requerimientos: - Autoclavables - No tóxicos - Fácil separación del producto de interés de la segunda fase - No modificación del medio de cultivo - Permanencia de las células en la fase acuosa Adaptaciones para la extracción in situ del producto Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997. Diagrama de un tanque de agitación mecánica modificado para operar con remoción in situ del producto 1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar raíces; 3: sensor de oxígeno; 4: malla acero inoxidable; 5: medidor DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador; 12: marco de la malla Diagrama de un biorreactor de agitación por líquido con loop externo Extracción in situ de alcaloides con aceite de silicona a partir de un cultivo de células de Eschscholtzia californica A: partición de alcaloides con diferentes cantidades de polimetilsilanos. Los alcaloides se acumulan en la fase superior. B: Extracción in situ de alcaloides en la parte superior de un fermentador de elevación por aire de 2 L. Secuencia en la optimización de un proceso para la producción de metabolitos secundarios Selección de la planta por su contenido de metabolitos secundarios para iniciar cultivos in vitro Establecimiento de cultivos in vitro Estabilización y selección de cultivos in vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto, liberación al medio Optimización de medio de cultivo para producción por diseño factorial: nutrientes, precursores, elicitación, liberación y remoción in situ Optimización en biorreactores: escalado Sistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusión, en dos etapas. Extracción y purificación del producto Ingeniería metabólica y biotransformación Estrategias para modificar el metabolismo secundario mediante manipulación genética • Completar rutas metabólicas mediante inserción de genes heterólogos • Amplificar rutas normales • Bloquear rutas alternativas • Bloquear rutas normales • Modificar la regulación de rutas normales • Modificar los mecanismos de secreción y exportación • Bloquear rutas de degradación Ingeniería metabólica del metabolismo secundario Especie Enzima Producto Observaciones Peganum harmala (suspensiones y raíces) Triptofano decarboxilasa (TDC) Serotonina Incremento de 10-20 veces en producto Hyosciamus muticus (raíces transformadas) Hiosciamina-6-hidroxilasa (H6H) Escopolamina Contenido de producto 4 veces superior a planta control Catharanthus roseus (suspensiones) Triptofano decarboxilasa (TDC) y estrictosidina sintasa (STR) Alcaloides indólicos (TIAs) Contenido de TIAs de 300 mg/L comparado con control 50mg/L. Líneas inestables Catharanthus roseus (suspensiones) ORCA3 (factor De transcripción) Alcaloides indólicos (TIAs) Incremento de la concentración de TIAs de 3 veces después de agregar el precursor secologanina Coptis japonica (suspensiones) (S)-esculerina 9-Ometiltransferasa (SMT) Berberina Incremento del flujo hacia la producción de berberina de 15% Mentha spp. (planta) Desoxixilulosa fosfato reductoisomerasa (DXR) Aceites esenciales Incremento del 50% ene l contenido de aceites esenciales Zea mays (callos) C1 y R (factores de transcripción) Antocianinas Producción de antocianinas y fenoles que no se producían en los callos sin transformar. Ingeniería metabólica del metabolismo secundario • Problemas - Clonado de genes - Estabilidad de líneas transgénicas - Compartimentalización de productos - Transporte y acumulación de productos - Limitaciones y arquitectura de la ruta metabólica - Canales metabólicos (limitación del flujo metabolico por la capacidad de las enzimas participantes) Biotransformación La biotransformación es la conversión de un sustrato (natural o sintético) por medio de un biocatalizador (enzima, célula, tejido, órgano, células inmovilizadas) en un producto complejo. Generalmente involucra uno o pocos pasos enzimáticos. Requerimientos: - Se requiere la presencia de las enzimas necesarias en la células y de sus cofactores. - La velocidad de formación del producto debe ser mayor que su metabolización. - El cultivo debe tolerar al precursor y al producto formado. - El precursor debe poder ingresar en la célula y el producto debe ser preferentemente secretado. - El precursor debe tener un valor mucho menor al del producto formado. Planta Capsicum frutescens (células inmovilizadas) Catharanthus roseus (células inmovilizadas) Daucus carota (células inmovilizadas) Mucuna puriens (células inmovilizadas) Rauwfolia serpentina (células inmovilizadas) Mentha spp. (células inmovilizadas) Coffea arabica (células inmovilizadas) Precursor Acido protocatecuico y ácido cafeico Vinblastina Producto Vainillina y capsaicina Codeinona Codeína Tirosina L-DOPA Hidroquinona Arbutina Mentona Neomentol Teobromina Cafeína Vincristina Adaptado de: Giri et al., Biotechnology Advances, 2001. Ejemplos de diseño de procesos Relación entre el sistema de cultivo y el patrón de síntesis del metabolito secundario Operación Batch Batch alimentado Batch alimentado repetitivos En dos etapas Continuo Perfusión Producto asociado + + + Producto no-asociado + + + + - + + Esquema de un proceso completo para la producción de un metabolito secundario por cultivo in vitro de células y órganos vegetales Producción de shikonina por suspensiones celulares de Lithospermum erythrorhizon Shikonina Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery • Planta entera - La extracción se realiza en plantas de aproximadamente 3 años. • Suspensiones celulares - 2,4-D estimula el crecimiento pero no la producción. - Las bajas concentraciones de nitrógeno y la elicitación inducen la producción de shikonina. - Se utilizan fermentadores de agitación mecánica y tambor rotatorio. - La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera. Proceso para la producción de shikonina a partir de células de Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind. Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Producción del alcaloide berberina por suspensiones celulares de Coptis japonica Berberina Tomado de: Yamasaki Plant Photo Gallery • Planta entera - La extracción se realiza en plantas de aproximadamente de 5-6 años. • Suspensiones celulares . - Las líneas celulares productoras se seleccionaron a través de protoplastos y screening de por fluorescencia. . - El sistema de cultivo utilizado es el de batch alimentado y el producto está asociado al crecimiento. Producción de ginsenósidos por Panax ginseng Ginsenósidos Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery • Planta entera - La extracción se realiza en plantas de aproximadamente 5-7 años . - Se requieren períodos prolongados de cuidado que exponen a los cultivos a riesgos de pestes y cambios drásticos de clima. - La concentración de saponinas es de 0,5 % peso seco. • Suspensiones celulares - La concentración de saponinas es de 0,65 % peso seco. - La productividad de biomasa es de 700 mg/L/día. - El medio de cultivo contiene bajas concentraciones de amonio. - A gran escala se emplean tanques agitados mecánicamente a bajas velocidades. • Raíces transformadas - La concentración de saponinas es de 0,95 % peso seco. - El medio de cultivo requiere del agregado de 2 mg/L de IBA y de 0,1 mg/L de quinetina. - A gran escala se emplean tambores rotatorios. Producción de taxol por Taxus spp Tomado de: Schoepke Plant Image Gallery Taxol • Planta entera - La edad de los árboles para extraer el producto es de 50-100 años. . . - La concentración de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco. - Este método de producción podría llevar a la extinción de la especie. - Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difícil la purificación del taxol. - El material vegeta empleado presenta variación en la concentración de precursores. - Las plantas empleadas crecen lentamente. Producción de taxol por Taxus spp Taxol Schoepke Plant Image Gallery • Suspensiones celulares de T. brevifolia - Se emplean metiljasmonato o extractos fúngicos como elicitores. - La composición óptima de gases es 10% (v/v) oxígeno, 0,5% (v/v) dióxido de carbono y 5 ppm de etileno. - El incremento de la presión osmótica, sacarosa (60 g/L), estimula la producción. - Los precursores como la fenilalanina y el ácido benzoico incrementan la productividad. - El taxol puede ser removido in situ con resinas como XAD y el solvente dibutilftalato. - El sistema de operación se realizan en dos etapas: la primera para el crecimiento y la segunda en un medio de producción con elicitación. - Los reactores que se utilizan son de tipo airlift, columna de burbujeo u otros que produzcan poco estrés hidrodinámico (escalado hasta 75.000 L). Producción de alcaloides indólicos de Catharantus roseus: vincristina y vinblastina Vinblastina Tomado de: Manhart Plant Image Gallery • Planta entera - La planta tiene bajas concentraciones de alcaloides. - La purificación y extracción son costosas. • Suspensiones celulares - La limitación de fosfato y nitrógeno combinado con la elictación, inducen la producción de del precursor ajmalicina (utilizado para tratar hipertención y problemas cardiológicos). - Las líneas celulares seleccionadas son resistentes a las fuerzas de corte, posibilitando el desarrollo de cultivos a gran escala, - En los cultivos a gran escala es necesario re-circular los gases de salida. - Las suspensiones no acumulan alcaloides indólicos diméricos: vinblastina y vincristina. - Se necesitaría aumentar la productividad 40 veces respecto de la productividad específica obtenida actualmente (0,26 mg/g peso seco/día) para que el proceso sea viable. Fenilpropanoides y flavonoides: algunos casos típicos... Estructuras de vainillina y de distintas antocianinas Vainillina (1) Pelargonidina-3-glucósido R2=OH (1) Cianidina-3-glucósido R2+R3=OH (2) Delfinidina-3-glucósido R1+R2+R3=OH (3) Producción de vainillina en células y tallos de Vanilla planifolia cultivados in vitro Material Medio % Peso Seco - 0,002 Wescott et al., 1994 B5 0,7 Wescott et al., 1994 Fruto Raíces aéreas transfectadas Referencia Producción de antocianinas por células cultivadas in vitro Especie Material Medio % Peso Seco Aralia cordata Referencia Suspensión celular B5a cianidin 3-xilosilglucosido 10,3 Vitis vinifera Suspensión celular B5b Do y Cormier, 1991 Oxalis reclinata Suspensión celular MSc Crouch et al., 1993 Sakamoto et al., 1994 Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/L Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/L NAA, 0,1 mg/L cinetina, y 15 mM total N c Medio de Murashige y Skoog (1962) con 5 mg ANA y 0,5 mg/L cinetina a b Tomado de: Kurtz and Constabel, Agricultural Biotechnology, 1998. Conclusiones • Aspectos bioingenieriles a resolver: - Diseño de biorreactores especiales para cultivos de tejidos vegetales - Instrumentación y control de los bioprocesos - Diseño de biorreactores más económicos - Métodos no letales para liberación de los metabolitos secundarios - Método adecuado para la remoción in situ • Aspectos biológicos a resolver: - Conocimiento de la regulación de las rutas biosintéticas: enzimas y factores de transcripción - Conocimiento de la regulación del transporte y acumulación de los metabolitos secundarios - Conocimientos de los mecanismos de degradación del producto Referencias 1. Plant Biotechnology. Fowler, M., Gwarren,G.S. and Moo-Young, M. (eds.). Pergamon Press, 1992. 2. Plant cell and tissues culture en liquid system. Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L. Munich Hanser Publishers, 1991. Secondary products from plant tissue culture. Charlwood, B. and Rhodes, M.J.C. (ed.). Oxford University Press, 1990. Design, formulation, and optimization of media. In: Bioreactor System Design. Asenjo, J. and Merchuk, J. (ed.) Marcel Dekker Publishers, 1995. Hairy Roots, Culture and Application. Doran, P. (ed.). Harwood Academic Publishers, 1997. 3. 4. 5. 6. Bioprocess Engineering Principles. Doran, P. Academic Press, Harcout Brace and Company Publishers, 1998.
