Hongos2016.pdf

Biología Molecular:HONGOS FITOPATÓGENOS
Dra. Natalia Inés Almasia
Fitopatología Molecular 2016
REINO FUNGI (HONGOS)








Organismos eucarióticos, omnipresentes y cosmopolitas.
Pueden ser saprobio, parásitos o simbiontes.
Su nutrición es por absorción.
Se reproducen por medio de esporas, sexuales o asexuales, móviles o inmóviles .
El talo (soma o cuerpo vegetativo) puede ser unicelular o filamentoso.
Casi todos son organismos aerobios, aunque algunas levaduras son anaerobias
facultativas, y algunos son fermentadores obligados.
Forman un grupo muy heterogéneo y polifilético.
Poseen una pared de Quitina.
Molécula de Quitina
Acetilamina
Tinción con calcofluor (que se une a la quitina)
Clasificación del reino de los hongos
Generalmente se basa en los siguientes criterios:
• Morfología de las estructuras reproductivas
• Tipos de esporas formadas
• Características del ciclo de vida
• Morfología del talo
Antiguas Clasificaciones del reino de los hongos
Desde la década de 1990, cambios dramáticos han ocurrido en la clasificación de los hongos
Adaptado de Blackwell et al. 2009, “Tree of Life Web
Project “ (http://tolweb.org/Fungi/). Ver también Hibbett et
al 2007 para una discusión de los cambios en los grupos
Zygomycota y Chytridiomycota.
Nuevas técnicas de clasificación del reino de los hongos
Clasificación incluyó
195 taxones
(rRNA genes nucleares ,
rRNA genes mitocondriales
y otros genes tales como
“housekeepings”)
Nuevas técnicas
Nuevos hongos descubiertos
Hongos - CSIC.- 11-5-2011.- Diferentes técnicas utilizadas permiten diferenciar en el mismo campo
del microscopio las distintas células de hongos y sus características. El nuevo grupo, bautizado
como cryptomycota ("hongos ocultos" en griego) a la espera de una clasificación formal.
Eventos comunes en la mayoría de los ciclos de vida de los hongos.
 Colonizadores de la tierra.
 Importantes descomponedores.
 Unas 50 especies son parásitos de los animales.
 Algunas toxinas pueden causar serias enfermedades o micosis en el hombre.
 Importancia comercial: alimentos, bebidas, antibióticos.
 Fitopatógenos :generan grandes problemas para la agricultura e importantes
pérdidas económicas.
Si bien menos del 10% de los hongos conocidos (100.000) pueden colonizar plantas vivas
(Knogge, 1996), hay miles de especies de hongos fitopatógenos (8.000) que en conjunto son
responsables del 70% de todas las enfermedades conocidas de las plantas.
Alternaria violae en hojas de Viola.
Casi todos los hongos fitopatógenos pasan parte de su ciclo de vida sobre
la planta hospedante y parte en el suelo o en restos de plantas en el suelo.
Ciclo biológico
de un típico
fitopatógeno
comprende una
fase epifítica y
una fase
patogénica
La sobrevida y el desarrollo de los hongos dependen fundamentalmente de las
condiciones de temperatura y humedad del ambiente. (-5°C a 45°C micelio libre
vs. esporas). Esto es así especialmente en patógenos que tienen una fase epifítica
la cual depende de la disponibilidad de agua sobre la superficie de la planta.
Int Microbiol (2002) 5: 169–175
Cambio de color:
Manchas foliares
Desarrollo anormal
de tejidos:
Abolladura, enrollamiento , deformación
Costras
Pérdida de turgencia:
Ruptura de la epidermis:
Marchitamiento
Pústulas
Sustitución de órganos : (florales por esporas o granos por esclerocios)
Signos : Observación de estructuras del patógeno (como esporulación)
Muerte celular:
Manchas foliares necróticas (círculos concéntricos,
centros claros, puntuaciones negras y bordes oscuros )
Cribado: agujeritos típicos (perdigonada)
Cancro (lesiones típicas)
Tizón
Momia (“momificación” de estructuras como los frutos)
Podredumbre húmeda
Podredumbre seca
Muerte de planta
El uso intensivo de monocultivos con pequeña
diversidad genética hizo que las principales
variedades comerciales sean susceptibles a
muchas enfermedades.
Las enfermedades pueden reducir el RENDIMIENTO
en varias formas:
Causando la muerte prematura del follaje
Inhibiendo el crecimiento
Reduciendo la eficiencia fotosintética
Disminuyendo el transporte de fotosintatos
Causando pudrición de las raíces y/o tubérculos
• Tizón tardío de la papa.
• Mildiú de la vid
• Mohos que afectan frutas
• Sarna del manzano
• Marchitamiento Cítricos • Viruela de la alfalfa
• Royas
• Carbones
• Fusariosis
• Rhizoctoniasis
2012
Top 10’ based on scientific/economic importance
Missing out on the Top 10, including Phakopsora pachyrhizi and Rhizoctonia solani.
It will be interesting to see in future years how perceptions change and what fungi will
comprise any future Top 10.
Para la identificación de hongos fitopatógenos es necesario la observación de sus
estructuras somáticas (plasmodios, micelios, esclerocios) y reproductivas (cuerpos
fructíferos ). Mediante la técnica de cámara húmeda y/o aislamiento es posible inducir
la aparición de estas estructuras.
Clásico
Micelio de Phytophthora sp. sobre fruto de tomate.
Esclerocios de Sclerotinia sclerotiorum.
Apotecios de Sclerotinia sclerotiorum.
La observación de las características de las estructuras producidas y el uso de claves
taxonómicas son necesarias para determinar el género y la especie del hongo patógeno.
La roya del tallo y la roya de la corona en el cultivo de avena
(Avena sativa L.) son las enfermedades más destructivas en casi
todo el mundo. Durante 2009 y 2010 síntomas severos de
tizones foliares se observaron en lotes comerciales sembrados
con avena en varios estados de México.
A través de un análisis morfológico, molecular y pruebas de
patogenicidad se identificó a Alternaria alternata, Bipolaris
victoriae y Bipolaris sorokiniana como los agentes causales de
los tizones foliares.
La importancia de la presencia de estos hongos es que son
patógenos que pueden disminuir la producción y producen
micotoxinas dañinas para el ganado que consume la avena
como forraje.
PCR con iniciadores universales
La comparación en el BLAST de las secuencias mostraron
100 % de similaridad con la secuencia de A. alternata, 98 %
con la secuencia de Cochliobolus victoriae y 100 % a la Síntomas, signos, colonia y conidios de A. alternata (A, D, G,
J), B. victoriae (B, E, H, K) y B. sorokiniana (C, F, I, L, M),
secuencia de Cochliobolus sativus
Esto confirmó los resultados de la identificación morfológica
Las condiciones externas desfavorables
Las defensas preformadas inadecuadas
La planta no detecta al patógeno y no
se producen respuestas defensivas
inducibles o se producen tarde.
Estrategias del patógeno:
• Necrotróficos: primero matan las células del hospedante y luego
metabolizan su contenido. La muerte celular es causada a menudo
por toxinas (selectivas o no) o enzimas.
TOXINAS/ENZIMAS
Célula
Hospedante
HONGO
NECROTROFICO
METABOLITOS
Estrategias del patógeno:
•Biotróficos o hemibiotróficos: A menudo penetran en las células
por medio de la formación de estructuras especializadas. Los
hemibiotróficos primero desarrollan un sistema de este tipo, pero al
aumentar la demanda nutricional acorde al aumento de la biomasa
del hongo, pasan a un modo de nutrición necrotrófica.
HAUSTORIO
Célula Hospedante Viva !
Metabolismo modificado
HONGO
BIOTROFICO
Flujo de Nutrientes y
Agua
Formas de penetración e invasión de los
hongos fitopatógenos
Directa
A través de
aperturas
naturales
A través de
heridas
Establecimiento de la patogénesis:
1.
Unión a la superficie de la planta.
2.
Germinación sobre dicha superficie y formación de
estructuras de infección.
3.
Penetración en el hospedante.
4.
Colonización de los tejidos del hospedante.
1.
provocado por la
presencia de
sustancias químicas,
como sales disueltas,
oxígeno, etc.
Unión a la superficie de la planta.
movimiento de
crecimiento
orientado bajo la
influencia del
contacto físico.
GERMINACION
2.
Germinación y formación de estructuras de infección.
ESPORA
APRESORIO
3.
Penetración en el hospedante.
La penetración de
un hongo en el
tejido vegetal es
frecuentemente
mediada por la
acción de enzimas
degradativas
Estructuras de
penetración y
colonización del
hongo
fitopatógeno
4.
Colonización de los tejidos del hospedante.
El haustorio aumenta la superficie de contacto al provocar la
invaginación de la membrana plasmática, maximizando el flujo
de nutrientes y agua desde la planta hacia el patógeno.
Cada fase del proceso de infección requiere diferentes estadios de desarrollo e
implica la participación de diferentes “determinantes” o “factores” de patogenicidad.
Definiremos “factor de patogenicidad” a cualquier
factor que contribuya a la penetración, invasión,
colonización y/o maceración de un tejido vegetal.
Función
La caracterización de éstos proporciona información
acerca de elementos clave sobre los que intervenir a fin de
desarrollar estrategias de control duraderas y efectivas.
•Asegurar su sobrevida y proliferación
•Incrementar su poder de penetración e invasión
•Evadir los mecanismos defensivos del hospedante
Compuestos del hongo que determinan la patogénesis
Enzimas líticas
(pectinasas, celulasas,
cutinasas, degradadoras de
lignina, proteasas,
lipolíticas, etc.)
Toxinas
Aspergillus niger
Factores de Crecimiento
(auxinas, giberelinas, citocinas,
etileno, ácido abscícico, etc.)
(selectivas y no
selectivas respecto
al hospedante)
Enzimas líticas
Enzimas como cutinasas son necesaria para la penetración a través de la
cutícula, enzimas hidrolíticas extracelulares tales como endo- y exopoligalacturonasas, pectinasas, celulasas y degradadoras de lignina
reducen la pared celular vegetal, mientras que las proteasas degradan las
membranas celulares.
El objetivo de este trabajo fue analizar la inducción de enzimas extracelulares líticas
producidas por una cepa de F. solani. La actividad de la poligalacturonasas tiene
pico a los 10 días post inducción, y la de las xilanasas a los 8 y a los 13 días de
incubación a 28 ° C.
629 putative genes !!!
Factores de Crecimiento
En hongos, la ruta de biosíntesis de auxinas y citoquinas es muy similar a la de las plantas
superiores, aunque la síntesis de etileno sigue una ruta distinta.
También sintetizan giberelinas y ácido abscísico (restringido a unos pocos hongos, ej.
R.solani).
Durante un estrés biótico, la señalización hormonal vegetal está “priorizada” a la
defensa. Pero algunos patógenos toman ventajas de este sistema “imitando”
hormonas que interfieren en la respuesta. Esto les “permite” regular el
crecimiento, el desarrollo y/ó el metabolismo vegetal, aumentando la virulencia.
El GA fue identificado en Japón en
1935, como un subproducto
metabólico del fitopatógeno Gibberella
fujikuroi, que afecta al arroz; la
variedad fujikuroi de plantas
infectadas desarrolla bakanae,
causándole un exagerado crecimiento,
por lo que la planta se muere por no
soportar su propio peso.
Diferentes especies de Aspergillus, Fusarium, Penicillium y Rhizopus fueron
analizados por su producción de giberelinas y auxinas. Estas hormonas
estimulan el crecimiento y el desarrollo vegetal.
2008
Señalización hormonal vegetal “prioriza” la defensa. Pero algunos patógenos toman “ventajas”.
Toxinas selectivas
Blancos celulares de toxinas selectivas
Toxina HC
Actúa en el núcleo
Toxina AAL
Inhibe enzimas del RE (que derivan en
muerte celular programada )
Toxina T
Es ligando de una proteína mitocondrial que
causa apertura o formación de poros (deriva
en muerte celular)
Toxina Victorin
Inhibe la decarboxilasa GDC que interviene en
reacciones en cloroplastos, mitocondrias y
peroxisomas (deriva en el clivaje de RUBISCO)
Modelo de cómo la toxina induce la muerte celular mediada por ROS
Toxinas NO selectivas
Fusicoccum amygdali
(Viruela de la púa del duraznero)
Toxina Fusicocina
Su blanco es la H+ -ATPasa de membrana
(transporta H+ fuera del citosol, por medio de un
complejo INESTABLE)
Abre en forma irreversible
los estomas
Otros compuestos
“Elicitors”
El término “elicitor” se utiliza comúnmente para denominar a aquellas moléculas,
procedentes de la planta (elicitores endógenos) o del fitopatógeno (elicitores
exógenos), que son capaces de inducir respuestas estructurales y/o bioquímicas
asociadas a la resistencia de la planta frente al organismo que la ataca.
Pueden ser bióticos o químicos (abióticos). Sin embargo, hay que tener en cuenta que
en algunas publicaciones se reserva exclusivamente el término “elicitor” para aquellas
sustancias que son de origen biótico.
Elicitores biológicos
ácidos grasos
derivados de la pared
celular de la planta
como el xilano
glucósidos
péptidos
glicoproteínas
oligosacáridos procedentes de
hongos fitopatógenos (glucanos
o derivados de la quitina)
2010
PAMPs: Conserved pathogen elicitors called
“pathogen associated molecular patterns”
PRRs: Receptor proteins called
pattern recognition receptors
Effector: Pathogen
virulence molecules
PAMP-triggered immunity
Effector-triggered immunity
Ejemplo de identificación de posible “elicitor”
Pythium aphanidermatum = patógeno que causa grandes pérdidas. Cuando se lo cultiva
en suspensión libera numerosos “elicitors”, entre ellos la proteína PaNie.
Lás células vecinas a las
necróticas presentaron
refuerzo de la pared con
deposiciones de calosa y
producción de H2O2 como
parte de las RH. Asimismo
se detectó síntesis de
etileno, de fitoalexinas y de
genes de defensa
Células de
tabaco en
suspensión
incubadas con
el elicitor
presentaron RH
y muerte celular
Después del
tratamiento con
elicitor la
cromatina es
fragmentada
como parte de la
RH.
Research Group Hanns Ulrich Seitz
Ups!!
Producción de
“elicitors” dada una
infección fúngica
Reconocimiento del
patógeno
Los genes de resistencia de la planta (R)
pueden reconocer a los productos de los
genes de virulencia (Avr) del patógeno.
Respuesta hipersensible por
parte de la planta atacada.
Respuesta hipersensible
• Respuesta de defensa localizada para reconocer y eliminar al patógenos
• Se caracteriza necrosis local que restringe la diseminación sistémica
•Es acompañada por otras respuestas de la planta, entre las que se incluyen:
un estallido oxidativo
la acumulación de moléculas mensajeras intracelulares
la activación transcripcional de genes que codifican proteínas PR
Este conjunto de respuestas anexas a la respuesta hipersensible es conocida como la
"respuesta sistémica adquirida" (SAR).
Respuestas de la plantas
Respuesta inmediata
de las células
invadidas
Respuesta local
Respuesta sistémica
adquirida
Síntesis ROS, NO,
fosforilaciones,
inducción de
genes, etc.
Producción de ácido jasmónico,
etileno, fortificación de la
pared, activación de genes,
síntesis de PR, etc.
Activación de genes de
“Resistencia”, silenciamiento
postranscripcional, etc.
Respuestas de la plantas
Respuesta Local
Formación de papilas de calosa y lignina, que bloquean el avance
de los hongos (barrera física contra el patógeno)
Mock
inoculated
Inoculated
Tinciones de diaminobenzidina (arriba) que detecta ROS y de azul de tripano (abajo) que indica muerte
celular sobre hojas de Arabidopsis infectadas con diferentes patógenos:
A. La bacteria Pseudomonas syringae cepa DC3000 con (izquierda) y sin (centro) el factor de avirulencia
avrRpm1 6 horas tras la inoculación
Durante la evolución conjunta de patógenos y plantas,
se han ido seleccionando mecanismos que permiten a
ambos miembros de la interacción defenderse del otro,
fenómeno al que se suele denominar como “carrera
armamentista”, donde cada estrategia de una de las
partes de la interacción es contrarrestada por una
nueva en su contraparte.
Modelo PG/PGIP
(Pectinas)
The fungus causes many physiological or genetic disorders,
nutrient deficiencies and environmental stress in plants
Produce Lytic enzymes: pectinases, glucanases,
xylanases (Benhamou et al., 1990;Alconada & Martinez,
Fusarium
1995; Christakopoulos et al., 1996)
Produce active metabolites :
carotenoids, bikaverins, mycotoxins, phytotropins,
gibberellins and oestrogens (Bruckner et al., 1989).
React by accumulation of callose or plant cellwall components (Rodriguez-Galvez & Mendgen, 1995).
Increase of the steady-state mRNA level of
phenylpropanoid pathway enzymes (Ni et al.,1996).
Increase pathogenesis-related like proteins
(Casacuberta et al., 1992).
Increase Chitinases ( Koga et al.,1992) .
Accumulate phytoalexins (Stevensonet al., 1997).
Planta
Magnaporthe grisea
Plantas Arroz RESISTENTES
Expresion de genes de biosíntesis de
Fitoalexinas es inducida a los 2 dpi
Plantas Arroz SUCEPTIBLES
Expresion de genes de biosíntesis de
Fitoalexinas es inducida a los 4 dpi
Las fitoalexinas son compuestos antimicrobianos de bajo peso molecular
El gen reportero luciferasa
fusionado al promotor
inducible por estrés GST6
permite visualizar la
respuesta in vivo de la
planta.
• La planta es capaz de
responder aún antes de
que el contacto físico tuvo
lugar.
• Detalles microscópicos de
la infección (raíz, adhesión
del hongo, maceración de
tejido).
Hongos fusionados a proteínas fluorescentes
M. grisea penetrates
the stele. Confocal
imaging of radial
sections of a twoweek-old rice and
barley seedlings
infected with GFPtagged M. grisea.
Colonization of the root
surface of B. napus by
V. longisporum 36 hpi
Arabidopsis root
infected with a
GFP-tagged V.
longisporum at 7
dpi.
Colony of a GFP-tagged wild type isolate of R.
commune (7 dpi). In the center, fungal hyphae outline
epidermis cells (arrows). Quantification of fungal
structures is carried out by pixel counting.
2010
Modelo de
“secuestro” de
sacarosa del
hongo Ustilago
maydis
El hongo posee un cotransportador de sacarosa de alta afinidad (Srt1), presente en la membrana
plasmática de las hifas invasivas que compite por la sacaraso apoplástica con el transportador
(SUC) y con las invertasas vegetales (generan glucosa y fructosa). Esto reduce la toma de sacarosa
de las células vegetales o de hexosas del transportador STP, permitiendo al hongo derivar su fuente
de carbono primaria desde la célula viviente de la planta.
Resumiendo ??
Enfermedades fúngicas en plantas
• genes de hongos que se relacionan con susceptibilidad a la enfermedad y la
resistencia
• resistencia mediada por la expresión celular
• la respuesta hipersensible y su papel en la resistencia a enfermedades
• resistencia inducida de las plantas frente a patógenos fúngicos (mecanismos y
aplicaciones prácticas)
• proteínas relacionadas con la patogénesis
• las redes de transducción de señales vegetales
• tiempos
• afinidad y especificidad
• etc.
Complejidad !!!!
They were identified over 800 phosphoproteins per fungus
The role of fungal RNA biology during plant infection
La energía puede
proporcionar una gran
cantidad de información sobre
lo que ocurre dentro de una
hoja o fruta
Vine leaf infected by a fungus (left: photo; right: fluorescent image)
La microfotografía es una imagen de
fluorescencia de una sección delgada teñida
de trigo mostrando una pústula de roya del
trigo creciendo desde la superficie de la hoja.
2013
We envision that the assay will be useful
in the diagnoses of R. solani infection of
sugar beet and maize and in the
quantification of the inoculum of the
pathogen in plant residues and soil.
2013
RNA interference (RNAi) is a powerful approach for elucidating gene functions in a
variety of organisms, including phytopathogenic fungi.
In such fungi, RNAi has been induced by expressing hairpin RNAs delivered
through plasmids, sequences integrated in fungal or plant genomes, or by RNAi
generated in planta by a plant virus infection
Techniques utilized for
reverse genetics like targeted
gene disruption/replacement,
gene silencing, insertional
mutagenesis, and targeting
induced local lesions in
genomes will contribute
greatly to the understanding
of gene function of fungal
and oomycete pathogens.
Molecular methods for detection of plant pathogenic fungi:
Polymerase Chain Reaction (Conventional PCR, Nested-PCR, Multiplex, etc)
Isothermal amplification methods (LAMP)
Fingerprinting (RFLP, RAPD, AFLP, Microsatellites, etc)
DNA hybridisation technology (DNA arrays)
Sequencing (massive sequencing , DNA barcoding, etc)
2012
2009
Genómica comparativa
Interacción proteína-proteína
Expresión diferencial de genes
Cualquier intento de control de la enfermedad exige un conocimiento detallado tanto de
los mecanismos de infección del hongo como de los mecanismos de defensa de la planta.
Grupos de Investigación:
(Molecular Plant-Pathogen Interactions: Research Programmes)
Libros
Publicaciones en revistas
Congresos
Poster Sessions:
Plant-pathogen interactions
Últimos tres
ejemplos
recientes …
The application of invigorating next
generation sequencing strategies to study
plant–pathogen interactions has and will
provide unprecedented insight into the
complex patterns of gene activity responsible
for crop protection.
The integration of cutting edge molecular
and computational tools will provide plant
scientists with the arsenal required to
identify genes and molecules that play a role
in plant protection.
Hambruna Irlandesa de la Papa
En 1845-1849 hubo una epidemia de tizón en Irlanda que causó una de las
mayores hambrunas (más de un millón de personas) y que estimuló una fuerte
emigración (de otro millón) principalmente hacia los Estados Unidos.
Control de fitopatógenos
mediante Ingeniería Genética
Péptidos antimicrobianos:
 Poseen entre 6-50 aminoácidos con carga neta positiva.
Poseen un alto número de posibles puentes disulfuro.
Se han aislado de fuentes muy diversas (bacterias, animales y plantas).
Desafío con Rhizoctonia solani
Planta Control
Suelo No Infectado / Suelo Infectado
Línea Transgénica
Suelo No Infectado / Suelo Infectado
Control / Transgénica
Esporas de roya
Penicillium sp: Hifas en verde, esporangios
en naranja y esporas en azul.