Mecanismos de entrada de bacterias fitopatógenas ‐ Regulación estomática Gustavo Gudesblat Fitopatología Molecular 2016 TRANSPIRACION ALIMENTACION http://www.sciencephoto.com/media/30306/enlarge El intercambio de gases de las plantas con el aire ocurre a través de los estomas Cuticula cerosa Los estomas aparecieron muy temprano en la evolución en las plantas terrestres Estoma fósil 410.000.000 años J. Exp. Bot. 49: 255‐ (1998) The Plant Cell February 2010 vol. 22 no. 2 296‐306 Apertura Oscuridad Luz Cierre Acido abscísico ‐ Flagelina Arabidopsis thaliana Algunos patógenos usan los estomas como vía de colonización endofítica https://www.youtube.com/watch?v=ylSrMwpH3GI Pseudomonas syringae – Arabidopsis thaliana New Phytologist (2014) doi: 10.1111/nph.12916 Roya del café Rijo et al. (1990) Patógenos que entran por estomas de relevancia en Argentina Enfermedad Patógeno Cultivo afectado Cita Cancrosis de los cítricos Xanthomonas campestris pv. citri Cítricos (Graham et al., 2004) Pústula bacteriana Xanthomonas axonopodis pv.glycines Soja (Goradia et al., 2004) Quemazón Pseudomonas syringae pv. tabaci Soja y otras leguminosas (Melotto et al., 2006) Mancha bacteriana del tomate Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Tomate, pimiento (Ramos & Volin, 1987) Pústula bacteriana Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Poroto (Hildebrandt, 1950) Rayado Burkholderia andropogonis Maíz y sorgo (Horst, 2007) Viruela del maní Cercospora Arachidicola Hori Maní (Pedelini, 2003) Fusariosis de la espiga de trigo Fusarium graminearum Trigo, avena (Pritsch et al., 2000) Excoriosis Plasmopora viticola Vid (Cragnolini et al., 2009) Roya de la soja Phakospora pachyrhizi Soja (McLean, 1979) Roya común del maíz Puccinia sorghi Maíz, sorgo (Hughes & Rijkenberg, 1985) Roya del tallo Puccinia graminis Avena, trigo (Leonard & Szabo, 2005) http://rian.inta.gov.ar/atlas/#/Inicio ¿Cualquier patógeno puede potencialmente entrar por los estomas? ¿Es posible aumentar la resistencia a patógenos a través de limitar su entrada por estos poros? La regulación activa del cierre estomático es clave para la economía del agua de las plantas Agua: HR: 47 % ψw:-103.7 Mpa CO2: 400 ppm Prolongación de la hidratación de la planta en condiciones de sequía Optimización de la fijación de carbono en relación al agua evaporada Control de las embolias del xilema en los árboles Agua: HR: 95 % ψw: -7,04 MPa Plant Physiology. Taiz & Zeiger, 3ra ed. Las plantas C3 pierden unas 50 moléculas de agua por cada una de CO2 fijada Los estomas se abren y se cierran por ajuste osmótico de las células de la guarda Engrosamientos radiales de la pared de las CG ¿Cómo se mide la apertura o conductancia estomática? Analizador de fotosíntesis Cámara infraroja Bioensayo de apertura estomática Cierre 2h oscuridad (en 10/0 = MES pH 6,15) Inhibición de la apertura + Tratamiento 2 hs a la luz Medición de la apertura a 400 x (pasaje a 10/50) Promoción del cierre Epidermis u hoja entera Apertura 2 h a la luz (en 10/50 = MES pH 6,15) + KCl 50 mM + Tratamiento 2 hs a la luz (en 10/50) Improntas de siliconas u otros materiales (TP) Medición de la apertura a 400 x ¿Cómo responden los estomas ante la presencia de patógenos? Las celulas de la guarda son capaces de perbicir MAMPs y DAMPs (motivos moleculares derivados de microbios y generados durante la interacción con el hospedador) Ello desencadena el cierre de los estomas y limita la entrada de patógenos Los estomas pueden considerarse así como parte del sistema inmunitario de las plantas Receptores conocidos de MAMPs y DAMPs Monaghan & Zipfel, COPB 2012 FLS2 y EFR interactúan con BIK1, que fosforila y activa a RBOHD Li 2014, Kadota 2014 Macho 2014 Receptor de lipopolisacárido bacteriano Ranf, S. et al. Nat. Immunol. 16, 426–433 (2015). LORE: lipooligosaccharide-specific reduced elicitation Receptor con dominio lectina Respuestas rápidas desencadenadas por LPS (y otros MAMPs) Ranf, S. et al. Nat. Immunol. 16, 426–433 (2015). ¿Cómo evaden los patógenos la inmunidad estomática? Fusicoccum amygdali abre los estomas a traves de la inhibicion de ATPasas Frontiers in Bioscience 13, 6580‐6603, May 1, 2008 Plant Physiology, November 2004, Vol. 136, pp. 3703–3711 Cell 126, 969–980, September 8, 2006 Las bacterias y PAMPs bacterianos cierran los estomas, pero Pseudomonas syringae pv. tomato puede reabrirlos al cabo de un tiempo La reapertura es mediada por la coronatina, un análogo de la forma activa del ácido jasmónico Las mutantes de la MPK3 son insensibles al factor de Xcc para el cierre por ABA Cierre estomático por 1 h Cierre estomático por 3 h Xcc y Pst (a través de la coronatina) impiden el cierre estomático a través de la inhibición de la síntesis de ROS por NADPH oxidasas (ABA, flg22) pero no por peroxidasas (ácido salicílico) No publicado La acción del factor de Xcc depende de la presencia del receptor y componentes de señalización de la vía del ácido jasmónico No publicado ¿El factor de Xcc es un análogo de JA? La actividad se encuentra en un pico único de HPLC, y su peso molecular parece similar al de la coronatina (unos 350 daltons) The Bacterial Effector HopX1 Targets JAZ Transcriptional Repressors to Activate Jasmonate Signaling and Promote Infection in Arabidopsis. Plos Biol 2014 El efector HOPX1 de Pseudomonas syringae pv. tabaci complementa a la mutante cor‐ de Pseudomonas syringae pv. tomato y causa la degradación de los represores JAZ independientemente del proteasoma La activación de la señalización de JA es una de formas de las bacterias de suprimir las defensas dependientes de SA Pseudomonas syringae pv. tomato Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2012. 28:28.1–28.33 ¿Pero qué hace el JA en los estomas y cual es su función fisiológica? Suhita 2004 Munemasa 2007 Montillet 2013 Las mutantes coi1 responden normalmente a ABA y a MAMPs. Los patógenos necrótrofos no suelen entrar por estomas. La presencia de COI1 en los estomas sólo parece servir para permitir la acción de la coronatina y del factor de Xcc. ¿Cómo generar plantas resistentes a la entrada por estomas de Xcc y Pst ? Expresión de un miRNAartificial dirigido contra COI1 bajo un promotor específico de estomas Wager 2012 ¿Qué guía a los patógenos hacia los estomas? Hoja Impresión Puccinia triticina – Roya del trigo No publicado, colaboración Francisco Sacco, Martín Darino (INTA Castelar) Salmonella enterica tambien entra a los estoma de lechuga y se refugia en el apolasto Kroupitski 2009 Gottig 2009, PNAS control Buffer (1), 5 M XacPNP or AtPNP‐A (2 and 3, respectively), 5 M XacPNP or AtPNP‐A with 10 M methylene blue (4 and 5, respectively); and controls with NAA (6) or ABA (7). Xanthomonas campestris pv citri tiene un peptido natriuretico adquirido por transferencia horizontal que permite a la bacteria abrir los estomas y reducir la severidad de los síntomas causados ¿Un mecanismo de evasión de la respuesta estomática? Una mutante en el fitocromo de Xcc 8004 evita parcialmente cerrar los estomas y es mas virulenta Cierre por 1 hora EMBO R (2016), aceptado El exopolisacárido de Xanthomonas campestris xantano impide el cierre estomático de manera dependiente XcF XcG XcI XcL Las bacterias beneficiosas también reabren estomas, o evitan cerrarlos Colaboración Fernando Pieckenstain, Matías Romero (INTECH – UNSAM) J Immunol 2003; 171:3697‐3704 Patent US 7943316 B2 on oligos with PyNTTTTGT motif « Immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof” El oligonucleótido IMT504 se comporta como un MAMP 0,5 log (CFU/mg tissue) Botrytis lesion area (mm2) 0,6 0,4 0,3 0,2 0,1 0 control IMT 504 20ug/ml 15,00 10,00 5,00 0,00 control IMT 504 20 µg/ml Arabidopsis Col‐0 20 µg/ml = 2,6 µM. 10 8 6 Day 0 4 Day 4 2 0 Pst DC300 Stomatal aperture (µm) Root length (mm) 20,00 12 IMT 504 20µg/ml + Pst DC3000 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 C‐ ABA IMT504 IMT504 IMT504 4 ug/ml 10 20 ug/ml ug/ml Screening de mutantes en una población mutagenizada con EMS Inhibición del crecimiento de la raíz 0 µM 3 µM De 15.000 plántulas se aislaron ~30 candidatas Variación natural en la percepción de flagelina en Arabidopsis Variantes naturales resistentes a la entrada de Pst por estomas Busqueda de variantes naturales resistentes a coronatina y factor de Xcc Apertura estomática (micrones) 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Col C Col ABA Col ABA+COR Kas‐2 Kas‐2 ABA Kas‐2 ABA+COR ABA+COR http://papersplantasarg.blogspot.com.ar/