Clase Xanthomonas 29-7-16.pdf
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Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 CURSO FITOPATOLOGÍA MOLECULAR 2016 Estudio de la interacción planta - patógeno Xanthomonas spp. - hospedador Dra. Valeria Conforte Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Género Xanthomonas Bacilos aerobios, Gram negativos, pertenecientes a la subdivisión ɣ-proteobacterias. Bacterias fitopatógenas ubicuamente distribuidas por el mundo. X. campestris pv. campestris (Fuente: http://agridr.in/tnauEAgri/eagri50/PATH272/lecture01 /0011.html) X. oryzae pv. oryzae Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) Agente causante de la cancrosis de los cítricos. Xac penetra el tejido vegetal a través de aperturas naturales (estomas) o por heridas. Genera lesiones características: cancros. Síntomas en hoja (izq.), tallo (centro) y frutos de naranjo (der.). Fuente: Gottwald et al., 2002, Plant Health Progress. Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) Agente acusante de la podredumbre negra en crucíferas. La bacteria ingresa sobre todo a través de hidátodos, aunque también de estomas, e invade el xilema causando una infección sistémica. Lesiones necróticas en forma de V, características de la enfermedad, en hoja de repollo. Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Factores de virulencia Exoenzimas (T2SS) Biofilm Toxinas bacterianas Proteínas efectoras (T3SS) Adhesinas Flagelo (Quimiotaxis – swimming) Polisacáridos Xantano Glucano cíclico β-(1,2) Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Regulación de factores de virulencia DSF DSF DSF RpfC DSF DSF RpfG DSF DSF DSF Membrana plasmática DSF di-GMP cíclico di-GMP cíclico Formación de biofilm Síntesis de factores de virulencia Swimming Formación de biofilm RpfF RpfB Ryan et al 2006. PNAS 103: 1123-1134. Curso de Fitopatología Molecular 2016 Estudio de la biosíntesis de xantano y su regulación en la planta hospedadora; su rol en la interacción con la misma. Síntesis de glucano cíclico β-(1,2) y su rol en la interacción con la planta hospedadora. Implicancia biológica del biofilm en la virulencia de Xanthomonas e identificación de nuevos genes asociados con el proceso de formación del mismo. 01/08/2016 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Xantano Estructura Cadena D-manosa Ác. glucurónico D-manosa Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 La síntesis del xantano está regulada por DSF La transcripción del grupo de genes gum esta dirigida principalmente por un promotor río arriba del gen gumB. gumB gumC gumD gumE gumF gumG gumH gumI gumJ gumK gumL gumM Expresión de la fusión gum-gusA en bacterias aisladas de la planta. Vojnov et al., 2001. MPMI 14: 768-774. Actividad de GUS Xcc 8004 Xcc rpfF Días post infección Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 El xantano es requerido para el desarollo de síntomas en la planta hospedadora. gum- N. benthamiana gum- Arabidopsis Yun et al., 2006. Plant Physiology 141:178-87 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 El xantano suprime la deposición de calosa Xcc 8004 Luz visible UV 8397 Luz visible UV 8396 Luz visible UV Agua Xantano Xantano truncado El xantano induce susceptibilidad en la planta hospedadora mediante la supresión de la deposición calosa. Yun et al., 2006. Plant Physiology 141:178-87 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 La piruvilación del xantano es escencial para la virulencia Xc1231 = no produce xantano Bianco, et al. 2016. MPMI. Aceptado. Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Glucano cíclicos β-(1,2) Son oligosacáridos osmorreguladores constituídos por D-glucosa, que forman parte del periplasma. Se incrementa su concentración a medida que disminuye la osmolaridad del medio externo. Mutantes que no sintetizan estas moléculas presentan múltiples fenotipos de acuerdo a la especie. Estructura del glucano cíclico de Xanthomonas spp. (Talaga et al., 1996) Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 El Glucano cíclico -(1,2) induce susceptibilidad en la planta Infección con Xcc de N. benthamiana pretratadas con agua o con glucano: (C) Agua + Xcc 8004; (D) Glucano + Xcc 8004 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 La mutante que no sintetiza glucano (ndvB) es menos infectiva 8004 ndvB- ndvB+ Síntomas en plantas de N. bethamiana. Deposición de calosa en hojas de N. benthamiana: (A) Xcc 8004, (B) ndvB, (C) ndvB + pretratamiento con glucano, (D) c-ndvB. Rigano et al., 2007. Plant Cell. (6):2077-89 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 El glucano cíclico actúa como una señal sistémica que suprime la defense de la planta Esquema del tratamiento: Glucano Agua ndvB ndvB local sistémico ndvB ndvB local sistémico Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 El glucano cíclico actúa como una señal sistémica que suprime la defense de la planta Local Sistémico Agua Glucano Rigano et al., 2007. Plant Cell. (6):2077-89 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 La movilización del glucano en la planta induce susceptibilidad sistémica Infiltrated leaves 800 Distant leaves 700 600 14C-Glucano 500 14C (cpm/cm2) 400 300 200 120 100 80 60 40 20 0 0 0,5 6 12 24 48 Incubation times (hours) Rigano et al., 2007. Plant Cell. (6):2077-89 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Biofilms Comunidades metabólicamente integradas se constituyen por una agrupación de microorganismos embebida en una matriz de exopolisacárido, en la cual también hay ADN y proteínas. Etapas de formación Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Técnicas utilizadas para el estudio de biofilm Tinción con Cristal Violeta Microscopía confocal Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Xanthomonas spp. forma biofilm y este proceso es regulado por el sistema de QS: estudio con mutantes rpf Día 2 Torres et al., 2007. Env. Microbiol. 9(8), 2101–2109 Día 4 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Biofilm en Xac Biofilm en superficie de hojas de limón. Microscopía confocal de del biofilm en la supercie de hojas de limón. La formación de biofilm está estrechamente relacionada con la virulencia. Rigano et al., 2007. MPMI 20 (10) 1222–1230. Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Biofilm en el cancro Rigano et al., 2007. MPMI 20 (10) 1222–1230. Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Flagelo CAPUCHÓN FILAMENTO CUERPO BASAL MOTOR GANCHO Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 • El flagelo es requerido para la adhesion y la maduración del biofilm. Ensayo de swimming en agar blando. Biofilm: adhesión (izq) y MCSL (der) Malamud et al, 2011. Microbiol. 157(Pt 3):819-29 Curso de Fitopatología Molecular 2016 Búsqueda de nuevos genes implicados en la formación de biofilm. Malamud et al, 2013. Microbiol.159 (Pt 9):1911-9 01/08/2016 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Resultados del screening de las mutantes con menor capacidad de adhesión Se hallaron 23 genes novedosos implicados en el proceso de formación de biofilm. 4 relacionados con la regulación génica 5 que codifican proteínas de membrana 8 que codifican proteínas estructurales 6 que codifican proteínas hipotéticas Algunas de las mutantes en estos genes: estan afectadas en la secreción de enzimas realizan menos swimming LA MAYORÍA ES MENOS VIRULENTA QUE LA CEPA SILVESTRE Malamud et al, 2013. Microbiol.159 (Pt 9):1911-9 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Abs 630nm Caracterización de la mutante hrpM El gen hrpM codifica para una proteína implicada en la síntesis de glucano cíclico en Xac. Perfiles de exclusión en cromatografía en columna BioGel P4. Malamud et al, 2012. MPP 13 (9):1010-8 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 La mutante hrpM no realiza swimming y es menos virulenta. Ensayo de swimming en agar blando. Xcc 306 Xcc 306 hrpM hrpM Xcc 306 Xcc 306 c-hrpM c-hrpM Ensayos de infección en hojas de limón (arriba) y en hojas de pomelo (abajo). Las fotografías fueron tomadas a los 30dpi. Xcc 306 hrpM c-hrpM Malamud et al, 2012. MPP 13 (9):1010-8 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Caracterización de la mutante xbmR (ntrC) Ensayo de swimming en agar blando. Xcc 306 ntrC c-ntrC Observación del flagelo por MET Xcc 306 ntrC c-ntrC Esta mutante no realiza swimming como consecuencia de su incapacidad de síntezar el flagelo. Yaryura et al., 2015. Environ Microbiol. 2015 Nov;17(11):4164-76 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Efecto en la virulencia de NtrC Infección de hojas de limón por dos metodologías. Yaryura et al., 2015. Environ Microbiol. 2015 Nov;17(11):4164-76 Curso de Fitopatología Molecular 2016 Para la formación de un biofilm maduro : el Sistema de QS debe ser funcional. se requiere la síntesis de xantano, siendo éste fundamental tanto para la vida epifítica como para el desarrollo del cancro. es necesaria la presencia del flagelo y la capacidad de realizar swimming. necesita de la síntesis del glucano β- (1,2). 01/08/2016 Curso de Fitopatología Molecular 2016 01/08/2016 Lab. de Fitopatología Molecular – Fund. Cassará – ICT Milstein Director Dr. Adrián Vojnov Colaboradores Miembros actuales Dra. Isabel Bianco Lic. Cristian Chazarreta Dra. Valeria Conforte Dra. Verónica de Pino Dra. Natalia Mielnichuck Dr. Pablo Torres Miembros anteriores Dr. Gustavo Gudesblat Dra. Florencia Malamud Dr. Luciano Rigano Dra. Laila Toum Dr. Pablo Yaryura Maximina Yun PhD. Dr. Atilio Castagnaro ( Estación Experimental Obispo Colombres, Tucumán) Prof. Max Dow (National University of Ireland, Cork) Dra. María Rosa Marano (Instituto de Biología Molecular y celular, CONICET – Rosario) Dr. Alexandre Morais do Amaral (Rothamsted Research Institute, UK)
