AGROBIOTECNOLOGIA CURSO 2015 Transformación Genética de Especies Vegetales Dra. Marisa LOPEZ BILBAO [email protected] Instituto de Biotecnología, INTA Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires - Para transformar una especie vegetal Mercedes R Sistema de cultivo de tejidos Eficiente y reproducible, Descendencia fértil Método de selección (Sin escapes) - Vector de Transformación (gen de interés, gen de selección, promotor, otras secuencias regulatorias) Entrega: Cepa de Agrobacterium o Gen Gun (otros métodos menos usados) Ensayos de transformación Analizar las plantas obtenidas (presencia, estabilidad y nivel de expresión del transgén) Sistemas de transferencia genética en plantas - • Sistemas de transferencia de ADN basados en vectores biológicos - Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes - Sistemas basados en virus vegetales Entrega: Cepa de Agrobacterium o Gen Gun (otros métodos menos usados) • Sistemas de transferencia directa de ADN - Transferencia por biobalística - Transferencia mediada por cationes divalentes y/o electroporación - Transferencia por microinyección Biología de Agrobacterium tumefaciens Procesos celulares involucrados en las etapas de interacción entre la bacteria y la planta Etapas de infección - Procesos celulares Agrobacterium se une a la célula húesped Reconocimiento célula célula Agrobacterium tumefaciens BI BD Formación del complejo T inmaduro, compuesto por VirD2 y la hebra T Procesamiento del ADN Hebra T Empaquetamiento del ADN Tumor de tallo provocado por Agrobacterium tumefaciens Formación del complejo T maduro, compuesto por VirD2 y la hebra T cubierta por VirE2 Transporte intercelular Formación del pilus para el transporte del complejo T dentro de la célula húesped Importación al núcleo Importación de la hebra T al núcleo de la célula húesped Integración del ADN y expresión de los genes Integración de la hebra T y la formación del tumor Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002. Biología de Agrobacterium tumefaciens - Mapa genético del plásmido Ti de octopina - Mapa genético del plásmido Ti de octopina Estructura de la región T de un plásmido Ti de octopina Mecanismos moleculares implicados en la transformación por Agrobacterium tumefaciens - 2 Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002. - Agrobacterium tumefaciens posee un sistema regulatorio de dos componentes para reconocer las células vegetales susceptibles Procesamiento de la hebra T y formación del complejo T maduro Ensamblaje de las proteínas de Agrobacterium involucradas en el transporte del complejo T - VirB2 Se requieren 600 moléculas de VirE2 para recubrir los 20 Kbp del ADN-T Una única molécula de proteína VirD2 se halla unida covalentemente al extremo 5’ del DNA. - La integración del ADN-T al genoma de la célula vegetal involucra el apareamiento no homólogo entre éste y el ADN cromosómico (1) y (3): digestión de las cadenas desplazadas de ADN de la planta por endonucleasas. (2): digestión del extremo no apareado del ADN-T por exo- o endonucleasas. (4) y (5): cortes en la cadena desapareada del ADN de la planta - Protocolos de transformación mediante Agrobacterium tumefaciens Se obtienen plantas y su descendencia portadoras del transgén Transformación transiente No se hereda y se usa para estudios en el laboratorio de función, especificidad, nivel de expresión, etc Transformación estable Transformación estable Transformación girasol Transformación tabaco Explanto inicial plantas maduras en macetas Desinfección Explanto inicial semillas Germinación en germinación Agroinfección & Co-cultivo Re1 Re2 Regeneración Re3 Kan 50 mg/L Enraizamiento Invernáculo Re4 RA - - Transformación lechuga Explanto inicial cotiledones expandidos y verdes Transformación estable - Transformación estable por floral dip en Arabidopsis - Bombardeo en hojas de cebolla Agroinfiltración en Nicotiana benthamiana Evaluación sobre el explanto inicial a los ¾ días de la agroinfección «estable» de girasol Cultivo de raíces de tabaco transformadas por Agrobacterium rhizogenes Tumor de raíces producido por Agrobacterium rhizogenes en discos de remolacha Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus No se necesita marcador de selección porque se ve directamente la raíz Protocolos de transformación mediante Agrobacterium rhizogenes - Genetic transformation of Calibrachoa excellens via Agrobacterium rhizogenes: Changing morphological traits Transformación estable - El uso de Agrobacterias implica el agregado de antibióticos para eliminar la bacteria del medio de cultivo de plantas Los más utilizados son cefotaxina, carbenicilina, timentina, augmentina. La evaluación de estos antibióticos se realiza casi al mismo tiempo que la puesta a punto del protocolo de cultivo de tejidos Sistemas de transferencia directa de ADN • Ventajas - - Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal - No requieren eliminar las células del organismo vector de los tejidos o plantas transgénicas - Requieren construcciones más simples y pequeñas - Son apropiados para estudios de expresión transitoria • Desventajas - Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén y del vector en varios sitios del genoma de las células transformadas - Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de re-arreglos en los transgenes Bombardeo de micropartículas 1984. Sandford et al., describen la técnica de bombardeo de micropartículas para la transferencia directa de ADN (Universidad de Cornell, EEUU). - Acelerador de micropartículas PDS 1000/He por descarga de helio a alta presión Modelo comercial actual Medidor de presión de helio Tubo de aceleración de gas Interruptores de control Medidor de vacío Portador del disco de ruptura Portador del macroproyectil Ensamblaje del propulsor de microproyectiles Cámara de bombardeo Células blanco Soportedel del tejido blancoblanco Soporte Válvula de medición de helio Controles del flujo de aire y de vacío • Parámetros físicos y químicos que influyen en la transferencia del ADN - Método de aceleración de las micropartículas - Naturaleza química y física, densidad y volumen de micropartículas - Naturaleza, preparación, adherencia y concentración del ADN La transformación - Vacío y distancias de bombardeo por biobalística - Diámetro de apertura de la placa de retención depende de factores físicos, - Número de bombardeos químicos • Parámetros relacionados con la construcción genética utilizada y biológicos - Vector, promotores, intrones, genes reporteros y genes marcadores de selección • Parámetros relacionados con el tejido o células blanco - - Transferencia de genes a células, tejidos y órganos vegetales - Transferencia de genes a microorganismos y organelas (cloroplastos) - Estudio de expresión transitoria - Análisis de promotores y de delección de genes - Estudio de mecanismos de expresión. y regulación de genes - Transferencia de ARN viral - Transformación genética de plantas in vivo usando una pistola génica Helios Plantas transgénicas obtenidas por bombardeo de micropartículas Transformación de Festuca arundinacea a partir de suspensiones celulares Tipos de explantos A B C D E F A B C D M P A y B: callos de maíz. C: brotes primordiales de maíz. D y E: callos y brotes de soja. F: ápice de una plántula de algodón de 4 días (M: meristema apical y P: primordio foliar). A: suspensión de células de Festuca arundinacea sobre papel de filtro antes del bombardeo. B: selección de células transformadas en medio de selección conteniendo higromicina. C y D: plántulas transgénicas de Festuca arundinacea regeneradas a partir de callos resistentes. Transferencia de ADN mediada por electroporación y/o métodos químicos Electroporación de protoplastos Pulsador de electroporación Cubetas de electroporación - A B C D E F Cultivo y regeneración de protoplastos de tabaco - Aislamiento y electroporación de protoplastos de Citrus sinensis (naranjo dulce) con el gen gfp Línea celular embriogénica usada como fuente de protoplastos Protoplasto fluorescente a las 24 h de la electroporación Protoplastos luego de la electroporación Callos embriogénicos GFP positivos a los 6 meses de la transformación Callos embriogénicos de 4 semanas derivados de protoplastos Planta regenerada a partir de callos en selección positiva - Expresión estable de genes transferidos a protoplastos de plantas por métodos químicos y/o electroporación Gen marcador de selección / agente de selección Técnica de transformación Tipo de transgénico Nicotiana tabacum Métodos químicos Plantas fértiles npt II / kanamicina Lolium multiflorum Métodos químicos Callos npt II / kanamicina Triticum monococcum Métodos químicos Callos npt II / kanamicina Brassica campestris Métodos químicos Callos npt II / kanamicina Petunia hybrida Métodos químicos Plantas npt II / kanamicina Brassica napus Electroporación Callos npt II / kanamicina Panicum maximum Electroporación Callos dhfr / metotrexato Oryza sativa (Japonica) Electroporación Plantas fértiles hpt / higromicina Dactylis glomerata Métodos químicos / Electroporación Plantas hpt / higromicina Solanum tuberosum Electroporación Plantas fértiles npt II / kanamicina hpt / higromicina als / clorosulfuron Arabidopsis thaliana Métodos químicos Plantas fértiles hpt / higromicina Oryza sativa (Indica) Métodos químicos Plantas fértiles hpt / higromicina Festuca arundinacea Métodos químicos Plantas fértiles hpt / higromicina pat / fosfinotricina Zea mays Métodos químicos Plantas fértiles npt II / kanamicina pat / fosfinotricina Especie - Para transformar una especie vegetal Sistema de cultivo de tejidos Eficiente y reproducible, Descendencia fértil Método de selección (Sin escapes) - Vector de Transformación (gen de interés, gen de selección, promotor, otras secuencias regulatorias) Entrega: Cepa de Agrobacterium o Gen Gun (otros métodos menos usados) Ensayos de transformación Analizar las plantas obtenidas (presencia, estabilidad y nivel de expresión del transgén) - La capacidad de Agrobacterium tumefaciens de introducir ADN en el genoma de la planta permitió desarrollar vectores plasmídicos basados en el plásmido Ti Vectores basados en el plásmidos T - Mapa de restricción de los plásmidos pBIN19; pPZP111; pMON10098; pGreen0029. Abreviaturas: BI: borde izquierdo; ori: origen de replicación; BD: borde derecho - diseño de vectores binarios Tamaño (kb) Sitios únicos de restricción en ADN -T Selección bacteriana Marcador de selección en: LacZ pBIN19 11777 9 Si Kanamicina pC22 17500 2 No pGA482 13200 7 pPCV001 9200 pCGN1547 Vector Origen de replicación Mobilización Movilización Agrobacterium E. coli BD pRK2 pRK2 Si Ampicilina , estreptomicina y espectinomicina BD pRi ColE1 Si No Tetraciclina BD pRK2 ColE1 Si 6 No Ampicilina BD pRK2 ColE1 Si 14440 5 Si Gentamicina BI pRi ColE1 Si pJJ1881 25700 4 No Tetraciclina BI pRK2 pRK2 Si pPZP111 8909 9 Si Cloranfenicol BI pVS1 ColE1 Si pGreen0029 4632 18 Si Kanamicina BI Tomado de: Hellens pSaand Mullineaux,pUC No Trends in Plant Science, 2000. GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation Mansour Karimi, Dirk Inzé and Ann Depicker TRENDS in Plant Science Vol.7 No.5 May 2002 Genes Reporteros Permiten ver la expresión del transgen (reportero) GUS Gen de la β glucuronidasa GFP (green fluorescent protein) Otras proteínas fluorescentes No es destructiva - Genes reporteros utilizados en transformación de plantas - Genes reporteros Abreviatura Origen Detección -glucuronidasa gus/uidA E. coli Fluorométrico (cuantitativo) o histoquímico (in situ), no radiactivo Proteína de fluorescencia verde GFP Aequorea victoria Fluorescencia, no destructiva Cloranfenicol acetiltransferasa Cat E. Coli Ensayo radiactivo sensitivo, semi cuantitativo Luciferasa Luc Photinus pyralis Luminiscencia Luciferasa luxA, luxB Vibrio harveyi Luminiscencia Ejemplo de utilización del gen reportero uid A - Promotores constitutivos vs tejido específico Promotores - • Promotores constitutivos • todos los tejidos • independiente de factores ambientales • activos entre especies y reinos • Promotores inducibles – expresión dependiente de factores externos – factores abióticos (luz, temperatura, heridas) – factores bióticos (ataque patógenos) • Promotores tejido o desarrollo específico – expresión restringida en tiempo y/o espacio – desde órganos completos durante todo el desarrollo hasta pocas células en corto tiempo – órgano especifico (semillas) - Esqueleto del vector Bordes Izquierdo y Derecho Gene de selección en bacterias (en E coli y en Agrobacterium) Genes Reporteros o Genes de Interés Promotores Terminadores Secuencias Enhancer Para transformar una especie vegetal Sistema de cultivo de tejidos Eficiente y reproducible, Descendencia fértil Método de selección (Sin escapes) - Vector de Transformación (gen de interés, gen de selección, promotor, otras secuencias regulatorias) Entrega: Cepa de Agrobacterium o Gen Gun (otros métodos menos usados) Ensayos de transformación Analizar las plantas obtenidas (presencia, estabilidad y nivel de expresión del transgén) Genes de selección Genes Marcadores ó de Selección Selección negativa Kanamicina, Higromicina, Gentamicina, Diferenciar células transformadas de las no transformadas vs Antibióticos - Selección Positiva Manosa y otros azúcares manosa-6P manosa–6P isomerasa fructosa-6P Glufosinato de amonio Glifosato Herbicidas Ejemplos de genes de selección Gen de selección Producto genético Fuente Selección nptII Neomicina fosfotransferasa Tn5 Kanamicina, G418, paromomicina, neomicina Ble Resistencia a bleomicina Tn5 y Streptoalloteichus hindustanus Bleomicina, fleomicina dhfr Dihidrofolato reductasa Plásmido R67 Metotrexato cat Cloranfenicol acetil transferasa Fago p1Cm Cloranfenicol Higromicina fosfotransferasa E. coli Higromicina B SPT Estreptomicina fosfotransferasa Tn5 Estreptomicina aacC3, aacC4 Gentamicin-3-Nacetiltransferasa Serratia marcescens; Klebsiella pneumoniae Gentamicina Fosfinotricin acetil transferasa Streptomices hygroscopicus Fosfinotricina, bialofos 5-enolpiruvilshikimato-3fosfato sintasa Petunia hybrida Glifosato aphIV bar EPSP - Ya tenemos todos los elementos necesarios, por lo que podemos armar un vector de transformación Para transformar una especie vegetal Sistema de cultivo de tejidos Eficiente y reproducible, Descendencia fértil Método de selección (Sin escapes) - Vector de Transformación (gen de interés, gen de selección, promotor, otras secuencias regulatorias) Entrega: Cepa de Agrobacterium o Gen Gun (otros métodos menos usados) Ensayos de transformación Analizar las plantas obtenidas (presencia, estabilidad y nivel de expresión del transgén) Después de los ensayos de transformación, sigue Análisis T1, T2…… Diseño experimental para los ensayos en semillas de lechuga - - 14 líneas T1 PrHaAP10 Ensayos fluorométricos Ensayos histoquímicos - Líneas T2 Tesis Diego Zavallo - ¿Y este es el final del trabajo en un laboratorio con plantas transgénicas?? Luego comienza el camino de los desafíos a los estreses, analizar la equivalencia sustantiva, observar si aparece el silenciamiento génico, la estabilidad de los transgenes, los niveles de expresión, etc. Esto en invernáculos de bioseguridad Y así comienza el camino de la desregulación (Fase I). Por último comenzar el camino de la desregulación en Fase II, que son las pruebas a campo. - Hasta el momento no existen desarrollos argentinos liberados en el mercado