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Vectores virales basados en poxvirus
Gabriela Calamante
Vectores virales
• Son virus genéticamente modificados capaces de expresar in vivo o in
vitro el/los gen/es de interés
• Portan genes foráneos o secuencias integradas en posiciones que no
son esenciales para la replicación viral ni para la infectividad (in vitro) .
• El virus es el vehículo y el gen foráneo es el gen de interés que codifica
para la proteína que se quiere expresar.
• Se los clasifica en replicativos o no replicativos (in vivo)
• Características más importantes que deben reunir para su uso in vivo:
- No replicativos
- Inocuos
- Estables genéticamente
El 1er reporte de un
vector viral fue a
principios de los ´80
Se demostró que el virus vaccinia (poxvirus) podía ser
ingenierizado para portar y expresar genes foráneos
Desde entonces la tecnología se aplicó en diferentes
familias de virus y para una gran diversidad de genes
foráneos (incluyendo los que codifican para antígenos de
patógenos)
Vectores
virales
* Potencialmente, todos los virus podrían utilizarse como vectores.
* Diferentes virus se pueden utilizar con distintos objetivos.
* La integración puede ser importante en algunos casos, como por ej. en
terapia génica.
* En los virus con genomas de mayor tamaño se puede insertar más cantidad
de genes pero… a veces su manipulación es más compleja.
Usos
* Estudios sobre la biología molecular de los virus.
* Estudios de patogenicidad/ virulencia.
* Producción y caracterización funcional de proteínas in vitro.
* Producción de vacunas.
* Terapia génica para reemplazar el gen no funcional.
Diseño de
un vector
viral
1- es necesario estudiar el genoma del vector para identificar al
menos una región donde insertar el material genético foráneo
2- los genes de interés deben estar establemente integrados en
el genoma del vector
3- la inserción del gen foráneo debe realizarse de tal manera que
se garantice su correcta expresión (cantidad, plegamiento,
destino final, modificaciones post-traduccionales)
Poxvirus
Familia Poxviridae
Subfamilias
- Chordopoxvirinae (vertebrados)  8 géneros
Avipoxvirus (FWPV, CNPV), Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Molluscipoxvirus,
Orthopoxvirus (vaccinia, MVA), Parapoxvirus, Suipoxvirus y Yatapoxvirus.
- Entomopoxvirinae (invertebrados)
Características
• Son virus envueltos complejos que replican en el citoplasma de células
de vertebrados e invertebrados.
• El ADN viral replica en inclusiones citoplasmáticas electrodensas
(cuerpos de inclusión de Guarnieri), denominadas “factories”.
• Su genoma está formado por una molécula de ADN de doble cadena
lineal de 130-375 kpb, bajo contenido G+C (30-40%).
• La partícula viral contiene enzimas que sintetizan los ARNm
tempranos.
Organización genómica
• En los extremos poseen repeticiones terminales invertidas (inverted terminal repeat,
ITR) que son idénticas pero orientadas en forma opuesta
• Las cadenas están conectadas por regiones en forma de horquilla (contiene cientos
de ORFs) cadena polinucleotídica continua
•Región central (90-110 genes)  genes involucrados en mecanismos básicos de
replicación (replicación, transcripción, genes codificantes para proteínas estructurales
y de ensamblado, etc) : ALTA HOMOLOGIA ENTRE DISTINTOS POX
•Extremos  genes considerados no esenciales para la replicación viral,
(codificantes para proteínas involucradas en rango de hospedadores o en la
virulencia): REGION MAS VARIABLE ENTRE DISTINOS POX
Ciclo de
replicación
Citoplasma
Etapa temprana
Etapa
intermedia
Etapa tardía
Célula vecina
Un poco de
historia
- Los poxvirus jugaron un rol crucial en el desarrollo de la
virología, la inmunología y la vaccinología.
- En 1798, Edward Jenner demostró que la inoculación
deliberada en humanos del Cowpox virus protegía contra
otro poxvirus relacionado que es el agente causal de la
viruela (Smallpox virus).
- Este hallazgo fundó la ciencia de la inmunología y,
eventualmente, condujo a la erradicación de la viruela en
1980 luego de una campaña mundial de vacunación con
el virus vaccinia.
Esquema de obtención de poxvirus recombinantes
El gran tamaño de su genoma impide manipulación directa del ADN  recombinación homóloga
Vector de transferencia
pE- X - t
Sitio blanco
de inserción
poxvirus
recombinación
homóloga in vivo
poxvirus recombinante
pE- X - t
pE: promotor temprano de poxvirus
X: gen de interés.
t: terminador de transcripción y traducción
La recombinación homóloga ocurre en dos pasos
Sustitución alélica por
doble recombinación
homóloga
5’
Vector de
transferencia
VV
Inserción del plásmido originada por un
solo evento de recombinación homóloga
en la región 5’ del gen del VV
3’
5’
Gen no esencial
Inserción del plásmido originada por un
solo evento de recombinación homóloga
en la región 3’ del gen del VV
3’
5’
Gen no esencial
3’
Gen no esencial
salvaje
VV recombinante estable
VV
5’
3’
VV recombinante inestable 5´
5´ 5’
3’
5’
VV recombinante inestable 3´
3´
5´
3’
5’
3’
3´
recombinante
2do evento de
recombinación
intramolecular
VV salvaje
2do evento de
recombinación
intramolecular
VV recombinante estable
VV salvaje
Obtención de
poxvirus
recombinantes
Ingeniería
genética
1- Diseñar el vector de transferencia
Cultivo
2- Infección de un cultivo celular con el virus salvaje
Virología
1’- Subclonar el gen de interés en el vector de transferencia
2´- Transfección del vector de transferencia a las células
infectadas
recombinación
homóloga in vivo
(frecuencia 0,4 %)
Cultivo
Virología
Biología
molecular
Inmunología
3- Seleccionar los poxvirus recombinantes
4- Obtener un stock puro
5- Caracterizar genética y biológicamente los
recombinantes seleccionados
6- Evaluar su capacidad de inducir respuestas inmunes
específicas en animales (vacunas)
Elección del
sitio blanco
de inserción
1- Genes no esenciales para la replicación en cultivos
celulares
a) de función conocida
Virus vaccinia (2º generación)  genes de las enzimas timidina kinasa y
hemoaglutinina
MVA (3º generación)  pueden usarse los mismos genes como blancos de
inserción.
b) de función desconocida
Virus canarypox  orf C5 (ALVAC comercializados por Merial)
Análisis bioinformático de secuencias disponibles y búsquedas bibliográficas.
c) de función conocida  evasión de respuesta inmune (4º generación)
receptores solubles de citoquinas (IL-1, IFNg, IL-18, etc)
Elección del
sitio blanco
de inserción
(cont.)
2- Deleción de genes esenciales para la replicación en
cultivos celulares
El virus sólo puede crecer si el gen o su producto son provistos en
trans.
El virus sólo replica in vitro en una línea celular que exprese el
producto del gen delecionado.
3- Virus de replicación limitada
El virus se puede crecer in vitro en cultivos celulares de una especie.
El virus se usa como vector en otra especie en la cual es incapaz de
completar el ciclo replicativo pero es capaz de expresar el gen foráneo.


Avipoxvirus (CNPV y FWPV)
MVA y NYVAC
Elección de
los
promotores
La expresión del gen de interés debe estar
dirigida por regiones regulatorias de poxvirus
a)
Promotores
b)
Terminadores de transcripción y traducción
1) Vector viral replicativo  VV en ratones o FWPV en pollos
Se pueden usar indistintamente promotores tempranos o tardíos de
poxvirus
pE/L sintético, p7.5, p11, pATI, pATI-(7.5)3-4
2) Vector viral no replicativo  avipox o MVA en mamíferos
Sólo se pueden usar promotores tempranos de poxvirus
pH6, pE/L sintético, p7.5
pEL
t
SMC
pEL
Gen de interés
t
Selección de
los
poxvirus
recombinantes
Teniendo en cuenta que:
 la eficiencia de transfección es del 0.4%
 la frecuencia de ocurrencia de doble recombinación no se
puede cuantificar
 el virus salvaje replica normalmente
Es fundamental disponer de un sistema que permita
seleccionar los virus recombinantes con una alta eficiencia
Métodos de
selección de
los
poxvirus
recombinantes
1) Selección por resistencia a un compuesto químico
a) resistencia a antibiótico  no aplicable para el área de vacunas (a menos que se
utilice sistema loxP-cre)
b) resistencia a ácido micofenólico  selección de poxvirus recombinantes que
poseen el gen bacteriano gpt (enzima xanthine-guanine phosphoribosyltransferase)
MPA bloquea la ruta biosintética de purinas  interfiere con la replicación viral
Expresión de XGPRT en presencia de MHX  sustratos alternativos (X /H) y resistencia a MPA
Sólo los virus recombinantes replican y forman placas de lisis
Se seleccionan los eventos de simple y doble recombinación
c) resistencia a BrdU  selección de VV recombinantes TKEn presencia de la enzima TK activa, fosforilación de BrdU e incorporación al DNA viral  provoca
mutaciones  letalidad
Posibilidad de mutación espontánea a TK- (10-4)  falsos positivos
Se combina con un método de screening
Se seleccionan los eventos de doble recombinación (reemplazo alélico)
2) Screening por actividad de una enzima marcadora
Actividad de las enzimas -galactosidasa o -glucuronidasa codificada por
los genes bacterianos lac Z o uid A, respectivamente.
Screening
por
actividad
GUS
Vector de transferencia
pH6- GUS- t
pE/L-XX - t
Gen no Poxvirus
esencial
recombinación homóloga in vivo
pH6-GUSPoxvirus
t recombinante
pE/L -XX - t
200X
Número de
pasaje
% placas de lisis
azules
1er
0,1%
2do
30-70%
3ro
70-90%
4to
90-100%
5to
100%
Caracterización de los
poxvirus
recombinantes
Caracterización molecular de los poxvirus
recombinantes
Aislamiento en FEP de las placas de lisis azules
(stock 100% homogéneo)
1) Análisis mediante PCR sobre ADN total purificado de FEP infectados
o no para determinar:
A) Presencia del gen de interés
B) Pureza del stock recombinante
Caracterización de los
poxvirus
recombinantes
(cont.)
2) Evaluación de la expresión del gen de interés en FEP (ARN total o extractos proteicos)
A) RT-PCR
B) Western blot (anticuerpo específico)
C) Inmunofluorescencia (anticuerpo específico)
Caracteri- Caracterización biológica:
zación de los  Cinética de crecimiento  inserción no altere capacidad replicativa
poxvirus
 Pasajes ciegos (más de 10)  para demostrar estabilidad genética
recombi Infecciones de diferentes tipos de cultivos celulares  conserva el mismo rango de
nantes
hospedadores
(cont.)
 Inoculación en animales susceptibles  no modificó su virulencia
 Inoculación en animales no susceptibles  no produce lesiones
Single - step
Replicación de CNPV y CN-X
CNPV
CN-X
Nuestra
VIRUS CANARYPOX
experiencia… Cepa vacunal (vacuna contra diftero viruela de canario –LaDiPreVet, La Plata)
No estaba secuenciado genoma
Secuenciación shotgun e identificamos potenciales genes blanco de inserción
Utilizamos 2 sitios (CNPV048 y CNPV134)  patente nacional para estos vectores
Se obtienen y amplifican en FEP
Utilizamos como vacunas para: ratones, pollos y bovinos (contra enfermedades virales)
Dobles recombinantes (2 antígenos o antígeno + citoquina)
MVA
Usamos sitios ya descriptos (tk y ha)
Se obtienen en FEP y se amplifican en FEP o BHK-21
Utilizamos como vacunas para: ratones, conejos, pollos y bovinos
Dobles recombinantes (2 antígenos o antígeno + citoquina)
Obtención de MVA con deleción genes involucrados en evasión respuesta inmune
VIRUS FOWLPOX
Cepa vacunal (Lab. Delamer)
Sitios blancos  FPV030 (ortólogo a CNPV048) y FPV016 (rIFNg)
Se obtienen y amplifican en FEP
Utilizamos como vacunas para aves
Ventajas del uso de
poxvirus
recombinantes
como vacunas
• el virus es extremadamente estable a condiciones ambientales
adversas, por lo cual se eliminaría la necesidad de una estricta
cadena de frío para su almacenamiento y distribución
• la vacuna puede ser administrada por diferentes vías
• la capacidad de inducir respuestas tanto humorales como
celulares contra el antígeno foráneo, generando inmunidad
duradera
• la flexibilidad de empaquetamiento del genoma permite
delecionar grandes cantidades de genoma viral e insertar al
menos 25 kpb de ADN foráneo, permitiendo así crear vacunas
multivalentes
• los poxvirus recombinantes son genéticamente estables ya
que la expresión del gen heterólogo sigue siendo detectada
luego de un alto número de pasajes a baja multiplicidad de
infección en FEP
• la inmunización se consigue en ausencia de replicación viral,
se elimina así la posibilidad de una diseminación del vector en
los animales vacunados y por consiguiente no es posible la
dispersión por contacto hacia animales no vacunados o hacia el
ambiente en general.
• no se manipula el agente infeccioso en la producción de las
vacunas
Poxvirus
como
vacunas
 La inmunidad pre-existente contra el virus vector interfiere con
las dosis refuerzo:
MVA: se aplica estrategia prime-boost (combinando DNA/poxvirus)
CNPV: no, la inmunidad previa no interfiere (intrínseco del vector)
FWPV: en aves puede haber interferencia con anticuerpos maternos anti-viruela
 Cantidad de dosis y duración de la respuesta:
hay muchos y variados ejemplos (depende del antígeno y tipo de respuesta )
diferenciar entre blancos de vacunación (animales de compañía vs de producción)
 Tipo de respuesta requerida para protección
poxvirus inducen principalmente respuestas CD8+
dependiendo de la compartimentalización del antígeno  CD4+ y Acs
variabilidad cepas patógenas (expresar 1 antígeno o varios?)
 Mejorar inmunogenicidad
co-expresión de citoquinas (GM-CSF, IL-1, IL-18, IL-4)
deleción de genes involucrados en evasión de respuesta inmune
Poxvirus
recombinantes
como
vacunas
Raboral VRG:
un ejemplo
de vacuna
oral contra la
rabia en
animales
silvestres
Vacuna: Sobrenadante de cultivo de células BHK infectadas con VVTGgRAB (virus
vaccinia recombinante vivo que porta el gen de la glicoproteína G de RV))
Cebo:
50% carne fresca de pescado, 11% de aceite de pescado, 11% de un polímero sintético hidrofóbico
(produce el agregado)
un sachet de polietileno con 1 dosis de vacuna líquida
contiene un biomarcador de la toma del alimento
se almacena a 4ºC sin congelar
posee resistencia mecánica  puede lanzarse desde el aire
1989
1994
1º prueba a
campo
Conclusiones
1- VVTGgRAB es eficaz, inocuo y estable al calor  ofrece una excelente alternativa
frente las vacunas a virus rábico atenuadas que se usan en el campo
2- El cebo diseñado es atractivo, eficiente y estable
3- Diseñar estratégicamente la distribución de los cebos (temporal y espacial)
Raboral V-RG
En EEUU cada año se distribuyen más de 12 millones de dosis de RABORAL V-RG® para
prevenir la dispersión de rabia en animales silvestres (principalmente mapaches y coyotes).
 Existe transmisión pasiva de anticuerpos neutralizantes
 Las crías pueden ser vacunadas a partir de los 30 días de edad
 Los anticuerpos maternos no interferían con la inducción de protección
Vacunas
basadas en
poxvirus no
replicativos
 Sólo replican en un número limitado de tipos celulares
 No producen infección productiva al inyectarlos en aves o
mamíferos
 Existe expresión temprana de genes  inducen respuestas
inmunes específicas
DERIVADOS DE:
 Virus vaccinia:
MVA (virus vaccinia Ankara modificado): atenuado por más de 500 pasajes en FEP
NYVAC: atenuado geneticamente por deleción de 18 genes no esenciales (regulación rta
inmune y rango hospedadores)
 Avipoxvirus:
CNPV (virus canarypox)
FWPV (virus fowlpox)
MVA
NYVAC
Son vectores seguros e inmunogénicos para animales y humanos
Utilizando recombinantes que expresan luciferasa se evaluó su biodistribución en
ratones
A diferencia de WRluc, los recombinantes atenuados expresan el gen reportero
transitoriamente (MVA= 24 h, NYVAC= 72 h).
Los niveles de luciferasa en los tejidos infectados con MVAluc alcanzan un pico
antes que los infectados por NYVACluc.
Estos resultados podrian tener relevancia inmunológica cuando se usen como
vacunas.
MVA
CNPV
Confirmamos su ausencia de diseminación en pollos SPF
MVA-gDs
Candidato a vacuna contra BoHV-1
Vía:
intraperitoneal
En el grupo de animales inmunizados con MVA-gDs se observó:
a) Inducción de una respuesta inmune específica
b) Menor período de excreción de virus
c) Reducción en el número de animales que excretan virus (1 de 4)
CNPV-RG
Candidato a vacuna antirrábica
Evaluación de capacidad protectora en ratones
Estabilidad térmica del candidato vacunal
CNPV-RG liofilizado
Eficacia en modelo de desafío intracerebral en ratón
CNPV-RG indujo una respuesta inmune protectora en el modelo ratón
Próximos pasos: evaluar su inmunogenicidad en bovinos y/o animales de compañia
CNPV-VP2
Candidato a vacuna contra la enfermedad de Gumboro (evaluación en pollos SPF)
CVT INTA-Inmuner: evaluar eficacia en aves (desafío con
cepa hipervirulenta de IBDV a distintos tiempos postvacunación)
Día 1 de edad, vía subcutánea en el cuello
50 días de edad: Infección oral con IBDV (cepa vacunal
LZD de virulencia intermedia, dosis: 2,1x103
DICT50/ave)
5 dpi eutanasia y extracción de bolsas de Fabricio:
a)
c)
b)
a) Pérdida de la definición corticomedular
b) Depleción linfoide
c) Infiltrado inflamatorio
d)
e)
d) , e) histología de la bolsa de
Fabricio conservada
La vacunación al día 1 de edad con CNPV-VP2 indujo una respuesta protectora frente al desafío con una cepa de
virulencia intermedia de IBDV.
En curso: estudiar protección a diferentes edades (27 y 42 días) en pollos SPF y frente a cepas hipervirulentas de IBDV
MVA recombinantes como vacunas (review 2015)
Avipoxvirus recombinantes como vacunas (review 2015)
 No se usan adyuvantes  disminuye riesgo reacciones
inflamatorias
 En algunos casos induce protección luego de 1 dosis
 Sobrepasa los anticuerpos maternos  por ej. los antiCDV en cachorros
 Protección duradera  hasta 1 año luego de la vacunación
(FeLV, WNV)
 Puede incorporarse en formulaciones vacunales 
combinadas
 Se almacena/transporta a 4ºC
Poxvirus recombinantes como vacunas contra HIV
2011 en España finalizó la fase 1 de una vacuna contra HIV
• MVA-B que expresa gp120 (monomérica) y poliproteína Gag-Pol-Nef (GPN)
• 3 dosis i.m.
• 92.3% de respuesta celular T específica (ALTAMENTE INMUNOGENICO)
• respuesta amplia:
CD4+  contra Env (aumentó luego de 3° dosis)
CD8+  similar contra Env, Gag y GPN
• Las respuestas se mantuvieron durante 48 semanas (84.6% de los voluntarios)
2003-2009 ensayo de Fase III en Tailandia (RV144)  105 millones U$S
>16.000 individuos
Régimen prime-boost
1º inoculación: CNPV gag-protease (clado B) y gp120 (clado E)
2º inoculación: vacuna a subunidad gp120 (AIDS/VAX B/E)
Virus canarypox no es inhibido por inmunidad pre-existencia contra virus
vaccinia (vacuna contra viruela en adultos nacidos antes de 1977)
 Disminuyó la tasa de infección de HIV alrededor del 31%
 No tuvo efecto sobre la carga viral en infectados después de vacunación
PRIMERA VEZ QUE UN CANDIDATO A VACUNA CONTRA EL SIDA
MUESTRA ALGUNA EFICACIA EN PREVENIR LA TRANSMISION
DEL VIRUS
…eficacia es modesta pero primer resultado alentador en más de 2 décadas
MVA
VV
FWPV
Plataformas de la tecnología de:
1) MVA-BN® (Modified Vaccinia Ankara - Bavarian Nordic)
2) Vaccinia/Fowlpox (VF)
Desarrollan vacunas contra enfermedades infecciosas e inmunoterapia para cancer
MVA-BN se utiliza como vacuna contra viruela
Plataforma VF-Tricom 
10 VV y 8 FWPV para
diversos tipos de cáncer
En >100 pacientes (cáncer +
metástasis)
TAA: Targeted tumor-associated antigens
TRICOM (TRIad of COstimulatory Molecules)