Clase Flavio - Sistemas Expresion.pdf

Sistemas de Expresión
CyTB 2014
Flávio Silva Junqueira de Souza
www.clker.dom
Proteinas recombinantes
- una proteina recombinante es producida a partir DNA recombinante en un organismo
heterólogo que sirve de huésped
- elimina la necesidad de purificar proteinas de fuentes naturales difíciles (por ejemplo
hasta 1984 la hormona de crecimiento era purificada de pituitarias de cadáveres humanos)
- proteinas recombinantes purificadas tienen muchos usos:
proteinas para investigación (estructura, función, interacciones etc)
fármacos (hormonas, factores inhibidores de crecimiento tumoral, anticuerpos,
factores de coagulación etc)
proteinas para diagnóstico (antígenos de patógenos para tests de ELISA)
subunidades de patógenos para vacunas (HBsAg del virus de hepatitis B; toxina
pertussis inactivada de la bacteria de la tos convulsa)
enzimas industriales (quimosina para queso, amilasa para producción de etanol,
lipasas para detergentes, procesamiento de comida, etc)
Proteinas recombinantes
fármacos recombinantes aprobados para uso humano (2009)
por sistema de expresión
Ferrer-Miralles et al. (2009) Microbial Cell Factories
Proteinas recombinantes - etapas
- aislamiento del gen (cDNA) de interés (p. ej. quimosina bovina)
- inserción del gen en un vector de expresión adecuado (p. ej. vector de expresión
en levaduras)
- transformación (transiente, estable) del organismo de interés con el transgén
(p. ej. levadura)
- puesta a punto del crecimiento del organismo geneticamente modificado a escala de
laboratorio (producción de la proteina recombinante)
- análisis de la producción y calidad de la proteina (ensayos de purificación y actividad;
p. ej. actividad en el procesamiento de la caseina de la leche)
- scaling-up del proceso de producción; testeo de diferentes biorreactores y condiciones
de crecimiento del organismo transgénico
- purificación de la proteina en larga escala; testeo de la actividad de la proteina en la
aplicación adecuada (p. ej. producción de queso)
www.amsbio.com
Proteinas recombinantes - etapas
upstream y
fermentación
downstream
(purificación)
análisis y validación
de la proteina recombinante
Proteinas recombinantes - etapas
pre-tratamiento
(upstream processing)
preparación de medios y/o
sustratos, esterilización etc
fermentación
(conversión de sustratos
en productos)
principal parte del proceso,
limitante en los costos de las
otras etapas
pos-tratamiento
(downstream processing)
separación, purificación
de los productos generados
Biorreactor
- aparato o recipiente utilizado en la realización de un proceso
biotecnológico
1) fermentador: biorreactor en donde ocurre una fermentación
- fermentación: proceso por el cual microorganismos (bacterias,
levaduras, hongos, células animales, células vegetales) cultivados
en un biorreactor convierten sustancias orgánicas en biomasa o
productos útiles
2) reactor enzimático: biorreactor en donde ocurren reacciones
químicas catalizadas por enzimas (sin células)
www.albrigi.it
Biorreactor
> 600 años
producción de vino
siglo XV
fermentador para vino
siglo XXI
Biorreactor - ambiente controlado
- control de parametros de fermentación permite la optimización de la
formación del producto (proteina recombinante)
- depende del proceso y microorganismo
control
nutrientes (macro y micro)
temperatura
pH
concentración de O2
homogeneización del medio
evitar formación de espuma
Biorreactor - diseño
placa
superior
cuerpo
acero inoxidable
vidrio
Biorreactor - esquema genérico
bombeo de
acido/base
motor para
agitación
manómetro
vapor
válvula reguladora
de presión
medio
aire
panel de
control
filtro de
aire
sensores
agua de
enfriamiento
agitador
salida de
agua
camisa de
regulación de
temperatura
aerador
vapor
salida de productos
y efluentes
Sistemas de expresión
- proteinas recombinantes pueden ser expresadas en muchos organismos distintos:
bacterias: más rápido, eficiente e barato
levaduras: muy rápido y barato
hongos filamentosos: adecuado para expresión de enzimas industriales
baculovirus/células de insectos: adecuado para muchas proteinas eucariotas
células de mamíferos: más caro y lento; excelente para proteinas humanas/animales
animales transgénicos: caro y complejo; experimental
plantas transgénicas: caro y complejo; experimental
sistemas sin células (cell-free): extractos de células capaces de sintetizar proteina a
partir de mRNA sintético; usado en investigación
Sistemas de expresión - GRAS
- el Food and Drug Administration (FDA) de EEUU tiene una lista de sustancias consideradas
generally recognized as safe (GRAS) extraidas de microorganismos y usadas para el
consumo humano
- para aplicaciones en la salud humana o alimentación, es más facil aprobar nuevos
compuestos y proteinas producidos en esos organismos GRAS
- lista parcial
: Escherichia coli
: Bacillus subtilis
: Lactococcus lactis
: Saccharomyces cerevisiae
: Kluveyromyces lactis
: Pichia pastoris
: Aspergillus niger
: Aspergillus oryzae
: Mucor miehei
www.sigmanaldrich.com
Bacterias
alternativa más barata, rápida y eficiente para expresión de proteinas recombinantes
- rápida cinética de crecimiento hasta fase estacionaria. Durante la fase logarítmica el
número de células puede duplicar cada 20 minutos (condiciones ideales)
- alcanza altas densidades de células, que pueden ser aumentadas con medios adecuados
- medios de cultivo muy simples y baratos
Bacterias
alternativa más barata, rápida y eficiente para expresión de proteinas recombinantes
- rápida cinética de crecimiento hasta fase estacionaria. Durante la fase logarítmica el
número de células puede duplicar cada 20 minutos (condiciones ideales)
- alcanza altas densidades de células, que pueden ser aumentadas con medios adecuados
- medios de cultivo muy simples y baratos
- disponibilidad de muchas herramientas moleculares (vectores, promotores, tags para la
purificación de proteinas, cassettes de resistencia, mutantes) y técnicas de transformación
- genética muy conocida y disponibilidad de muchas cepas diseñadas para optimizar la
expresión de proteinas, especialmente para Escherichia coli
Jeremy Burgess
Bacterias
alternativa más barata, rápida y eficiente para expresión de proteinas recombinantes
pero:
no se forman puentes disulfuro en el citoplasma de E. coli wild-type
bacterias no glicosilan proteinas
proteinas eucariotas sobreexpresadas frecuentemente forman agregados insolubles
- cuerpos de inclusión
Jeremy Burgess
Bacterias - cuerpos de inclusión
control
proteina
recombinante
inducida
cuerpo de
inclusión
Wu et al (2011) Microb Cell Fact
cultivo de bacterias
(con proteina recombinante inducida)
centrifugación
resuspensión en buffer de lisis
sonicación
(lisado de las bacterias)
centrifugación
proteina
recombinante
soluble
fracción soluble
sobrenadante
fracción soluble
proteina en
cuerpos de
inclusión
pellet
fracción insoluble
fracción insoluble
(pellet)
Fu et al (2014) Int J Mol Sci
Bacterias - cepas
- la más usada es la BL21 y sus derivados
: deficiente en la proteasa Lon (citoplasmática)
: deficiente en la proteasa OmpT (presente en la membrana externa)
: deficiente en el sistema de restricción/modificación (mutación hsdSB)
: la cepa BL21(DE3) contiene el profago lDE3 con el gen de la T7 RNA pol (pET)
: cepas deficientes de recA (recombinasa) tienen mayor estabilidad plasmídica
Bacterias - vector
- vectores de expresión procariotas contienen:
origen de replicación: pueden ser de alta o baja copia de plásmidos
promotor/operador: para la expresión y regulación transcripcional del transgén
sitio de entrada de ribosomas (RBS): necesario a la traducción
sitio de clonado múltiplo (MCS): inserción del transgén de interés
región codificante de un tag de afinidad: facilita la purificación
región de clivaje del tag: necesario para obtener proteina no fusionada al tag
sitio de terminación de transcripción
gen de resistencia a antibiotico
Bacterias - vector
- esquema de un vector genérico para expresión en bacterias
transgén
Rosano & Ceccarelli (2014) Front Microbiol
Bacterias - ori
- origen de replicación: alto, moderado o bajo número de copias del plásmido por célula
- la expresión de una proteina recombinante a niveles muy altos puede causar un "lastre"
metábolico que dificulta el crecimento de las bacterias
- alto número de copias:
: pMB1 (mutado): 500-700 copias (plásmidos pUC)
- moderado número de copias
: pMB1: 15-60 copias (plásmidos pET)
: ColE1: 15-20 copias
- bajo número de copias
: pSC101: <5 copias
puede ser util cuando la proteina expresada es tóxica pra la bacteria
Bacterias - promotor
- promotor: en general se utilizan promotores que puedan ser regulados
- el sistema mas comun utiliza el promotor del fago T7
- presente en el los vectores pET (Novagen): activación con IPTG o lactosa
- gen de interés clonado ríoarriba del promotor T7 y el operador del operon lac
(necesita presencia de la T7 RNA pol y ausencia del represor lac)
- T7 RNA polimerasa codificada en un plásmido o en el genoma, controlada
por el promotor lacUV5 (activable por IPTG o lactosa)
- actividad de escape (leaky) del promotor puede ser controlada por una bacteria
que exprese la lisozima T7, que se une y inhibe la T7 RNA polimerasa
(plásmido pLys)
Bacterias - sistema pET
cepa: E. coli BL21(DE3)
Novagen
Bacterias - sistema araC
- promotor: en general se utilizan promotores que puedan ser regulados
L-arabinosa
- el promotor del ara operon es regulable por L-arabinosa
- presente en el los vectores pBAD (Life Technologies)
- gen de interés clonado ríoarriba del promotor
araBAD
- el dímero de la proteina AraC se une a un
operador (O2) y al sitio I1
- L-arabinosa se une al dímero, que se despega
de O2 y se une a I2, lo que inicia transcripción
- para máxima expresión es necesario depletar
el medio de glucosa para que aumente el cAMP
y se active la proteina CAP, que también se une
al promotor del plásmido
Life Technologies
Bacterias - sistema araC
- promotor: en general se utilizan promotores que puedan ser regulados
L-arabinosa
- el promotor del ara operon es regulable por L-arabinosa
- presente en el los vectores pBAD (Life Technologies)
inducción con concentraciones
crecientes de L-arabinosa
Life Technologies
Bacterias - tags de afinidad
- los tags son péptidos agregados al extremo N- o C-terminal de la proteina expresada
- pueden ser pequeños péptidos o una proteina de fusión
- sirven para:
: acompañar la expresión de la proteina por medio de anticuerpos anti-tag
: ayudan a aumentar la solubilidad de la proteina recombinante
: ayudan a la purificación de la proteina expresada
www.olympusmicro.com
Bacterias - vector
- esquema de un vector genérico para expresión en bacterias
transgén
Rosano & Ceccarelli (2014) Front Microbiol
Bacterias - tags de afinidad
- péptidos usados como tags:
: poly-Histidina - HHHHHH
: C-MYC - EQKLISEEDL
: FLAG - DYKDDDDK
: HA (hemaglutinina) - YPYDVPDYA
- proteinas usadas como tags:
: MBP - maltose-binding protein
: GST - glutathione S-transferase
: Trx - thioredoxin
: ubiquitina
: SUMO
Bacterias - tags de afinidad
- péptidos usados como tags:
: poly-Histidina - 6His tag interacciona con columnas de níquel
proteina
His tag
níquel
www.affymetrix.com
Bacterias - remoción del tag
- para obtener proteina sin el tag se pueden insertar sitios de reconocimiento de proteasas
entre el tag y la proteina recombinante
: enteroquinasa
: trombina
: factor Xa
: proteasa del tobacco etch virus (ETV)
- tratamentos químicos también son posibles
: bromuro de cianógeno (CNBr) cliva la unión peptidica C-terminal de residuos
de metionina
Bacterias - remoción del tag
- ejemplo: vectores pMAL de fusión con MBP (maltose-binding protein)
MBP
New England Biolabs
Bacterias - remoción del tag
- ejemplo: vectores pMAL de fusión con MBP (maltose-binding protein)
New England Biolabs
Bacterias - ejemplo de vector
Life Technologies
Bacterias - problemas
- algunas proteinas eucariotas pueden ser tóxicas para E. coli : proteina tiene que ser
expresada de manera muy controlada y en bajas cantidades
- preferencia de codones es distinta en bacterias y mamíferos: puede ser necesario
cambiar los codones del gen de interés antes de expresarlo
- no se forman puentes disulfuro en el citoplasma de E. coli wild-type: puede ser
necesario expresar la proteina en el periplasma o en mutantes de tioreducción
- proteinas eucariotas sobreexpresadas frecuentemente forman agregados insolubles
- cuerpos de inclusión: puede ser necesario optimizar la expresión o agregar pasos
de renaturalización de las proteinas agregadas
bacterias no glicosilan proteinas: proteinas de mamíferos glicosiladas no tienen
actividad cuando expresadas en bacterias
Bacterias - uso de codones
- si es necesario, el gen de interés
puede ser mutagenizado incluyendo
codones más comunes en bacterias
- también se pueden usar cepas de
E. coli que expresan más de los
tRNAs raros (p. ej. BL21-CodonPlus
de Agilent/Stratagene)
Bacterias - plegamiento de proteinas
DnaJ, DnaK, GrpE
cuerpos
de
inclusión
(proteina
insoluble)
GroEL
GroES
Bacterias - plegamiento de proteinas
- sobreexpresión de chaperonas puede ayudar en el plegamiento de proteinas heterólogas
- Chaperone Plasmid Kit (TaKaRa BIO) permite la sobreexpresión de GrpEL/ES y
DnaJ/K/GrpE en diferentes combinaciones
pGro7 & pKJE7: resistencia a chloramfenicol; inducción por L-arabinosa
Clontech / TaKaRa
eubacterium
lipopolisacáridos (LPS)
fosfolípidos
espacio periplasmatico
peptidoglicanos
proteinas
membrana plasmatica
Bacterias - plegamiento de proteinas
- el citosol de E. coli tiene un ambiente reductor por la acción de la glutatión reductasa (gor)
y la tiorredoxina reductasa (trxB)
- puentes disulfuro solo se forman en el periplasma por acción de las proteinas Dsb
glutatión
reductasa (gor)
tiorredoxina
reductasa (trxB)
Bacterias - plegamiento de proteinas
- el citosol de E. coli tiene un ambiente reductor por la acción de la glutatión reductasa (gor)
y la tiorredoxina reductasa (trxB)
- puentes disulfuro solo se forman en el periplasma por acción de las proteinas Dsb
- posibles soluciones:
: enviar la proteina al periplasma (fusionando un péptido señal bacteriano)
: utilizando cepas de E. coli mutantes para gor y trxB (ORIGAMI - Novagen)
Berkmen (2012) BioPharm Int
Bacterias - fármacos recombinantes
- fármacos recombinantes aprobados en E. coli incluyen (2009):
: insulina
: hormona de crecimiento
: interferon a, b, g
: calcitonina
: interleukinas 11 y 12
: subunidad B de cólera
: glucagon
: TNFa
: Activador tisular del plasminógeno (tPA)
: anticuerpos contra VEGF-A
- enzimas industriales
: quimosina bovina
Bacterias - Bacillus
- Bacillus sp tiene amplio uso en la producción industrial de enzimas
- B. subtilis, B. megaterium y B. licheniformis) son usadas para expresar proteinas
recombinantes
- Bacillus sp. son Gram+, solo tienen una membrana plasmática y poseen un eficiente sistema
de secreción de proteinas al medio. En E. coli la secreción de proteinas es menos eficiente
y las proteinas secretadas quedan atrapadas en el espacio periplasmático
- al contrario de E. coli, Bacillus no tiene una membrana de lipopolisacáridos (LPS) que es
tóxica para humanos
Bacterias - Bacillus
- Bacillus sp tiene amplio uso en la producción industrial de enzimas
- B. subtilis, B. megaterium y B. licheniformis) son usadas para expresar proteinas
recombinantes
péptido señal
ori de
Bacillus
ori de
E. coli
Clontech TaKaRa
Levaduras
alternativa eucariota más barata, rápida y eficiente para expresión de proteinas
- rápido crecimiento
- alto rendimiento de síntesis de proteinas
- medios de cultivo muy simples y baratos
- disponibilidad de muchas herramientas moleculares (vectores, promotores, señales de
secreción de proteinas) y técnicas de transformación (plásmidos, recombinación
homóloga)
- plegamiento de proteinas semejantes a mamíferos; pliega correctamente proteinas con
puentes disulfuro
- posee sistema de glicosilación (alta manosa)
- las más utilizadas son S. cerevisiae y Pichia pastoris
Levaduras - vectores
- hay tres tipos de vectores básicos
: vectores integrativos (YIp) - no se replican autonomamente; se incorporan al
genoma por recombinación homóloga
: vectores episomales (YEp) - tienen el origen de replicación 2 mm y se replican
autonomamente en la células; 10-40 copias por células; más inestables que
los YIp
: vectores centroméricos (YCp) - contienen secuencias centroméricas y se
replican autonomamente; 1-3 copias por célula
- también hay vectores de expresión con tags para facilitar la purificación
Levaduras - vectores
- ejemplo: vector episomal pYES2 binario (E. coli/S. cerevisiae)
- inducible por galactosa (promotor pGAL1)
- selección por auxotrofia de uracilo (URA3)
Life Technologies
Levaduras - vectores
- vector integrativo pHIL-S1 binario (E. coli/S. cerevisiae)
- recombinación homóloga en el locus de HIS4 confiere
capacidad de crecer en medio sin histidina (His+)
- AOX : promotor de la
alcohol oxidasa I de
Pichia pastoris
Life Technologies
Levaduras - promotores
- varios promotores constitutivos y regulables están disponibles para S. cerevisiae
Rudolph et al (2006) BioPharm Int
Levaduras metilotrópicas
- Pichia pastoris, Pichia methanolica y Hansenula polymorpha
- pueden crecer con metanol como única fuente de carbono
- las enzimas del metabolismo del methanol están bajo estrito control positivo por methanol
y son reprimidas por glucosa
- en metanol, 30% de la proteina total de P. pastoris es la alcohol oxidasa 1 (AOX1)
(promotor muy fuerte)
- Pichia alcanza densidades celulares más altas que S. cerevisiae
- promotores utilizados
: AOX1 de la alcohol oxidasa de P. pastoris
: MOX de la alcohol oxidasa de Hansenula polymorpha (MOX es desreprimido
por glicerol en presencia de glucosa, lo que permite evitar el uso de methanol)
Levaduras - glicosilación
alternativa eucariota más barata, rápida y eficiente para expresión de proteinas
pero:
el patrón de glicosilación de levaduras no es el mismo de mamíferos
- levaduras no agregan
b-1,4-galactosyl ni ácido siálico
a sus glicoproteinas
- "humanización" de P. pastoris
permite producir proteinas con
perfiles de glicosilación iguales
a los de mamíferos
- la "humanización" involucró
mutar genes endógenos de
Pichia y agregar enzimas de
glicosilación de animales
Hamilton & Gerngross (2007) Curr Op Biotech
Levaduras - glicosilación
- "glicoingeniería" de P. pastoris para permitir la transferencia de ácido siálico a proteinas
en el Golgi
Hamilton & Gerngross (2007) Curr Op Biotech
Levaduras - proteinas recombinantes
- fármacos recombinantes aprobados en S. cerevisiae incluyen (2009):
: insulina
: hormona de crecimiento
: vacuna de la hepatitis B (antígeno de superficie)
: albúmina
: hirudina
: factor de crecimiento derivado de plaquetas
: glucagon
: granulocyte-macrophage colony stimulating factor
- enzimas industriales
: quimosina bovina en Kluyveromyces lactis
: invertasa de S. cerevisiae en P. pastoris
Hongos filamentosos
- utilizados especialmente para producir enzimas industriales (alimentación, procesamento de
textiles, papel, detergentes etc)
- especies de los géneros Aspergillus y Trichoderma son las más utilizadas
- ejemplos
: lipasa de Humicola lanuginose en Aspergillus oryzae
: fitasa vegetal en Aspergillus niger
: lipasas de Rhizomucor miehi, Thermomyces lanuginosus y
Fusarium oxysporum en Aspergillus oryzae
: quimosina bovina en Aspergillus niger
www.broadinstitute.org
Baculovirus y células de insectos
- baculovirus son virus de genome de DNA doble cadena con membrana y cápsides
en forma de bastón
- el baculovirus usado como herramienta es el Autographa californica multiple nuclear
polyhedrosis virus (AcMNPV) que infecta lepidópteros
- un gen tardío del virus - el de la polihedrina - es sustituido por el gen de interés por
recombinación homóloga (en E. coli o en las células de insectos)
Baculovirus y células de insectos
- baculovirus son virus de genome de DNA doble cadena con membrana y cápsides
en forma de bastón
- el baculovirus usado como herramienta es el Autographa californica multiple nuclear
polyhedrosis virus (AcMNPV) que infecta lepidópteros
- un gen tardío del virus - el de la polihedrina - es sustituido por el gen de interés por
recombinación homóloga (en E. coli o en las células de insectos)
- células de insectos realizan el plegado correcto de proteinas de mamíferos incluyendo
puentes disulfuro
- la glicosilación es más simple (no hay agregado de ácido siálico)
Baculovirus y células de insectos
- esquema de clonado y expresión en baculovirus (Bac-to-Bac, Life Technologies)
transposición del inserto al bacmid (150 kb)
mediada por secuencias del transposónTn7
Life Technologies
Baculovirus y células de insectos
- hay un producto recombinante aprobado como fármaco (Cervarix): vacuna contra el
papilomavirus humano (HPV)
: proteinas L1 de HPV-16 y HPV-18 producidas en la linea Hi5 por baculovirus