Ale Guberman teorica 2015.pdf
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21/10/2015 Mecanismos moleculares involucrados en el mantenimiento de las propiedades fundamentales de las células madre pluripotentes Laboratorio de Regulación Génica en Células Madre Universidad de Buenos Aires Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Química Biológica IQUIBICEN, CONICET-UBA Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Alejandra Guberman [email protected] Auto-renovación Diferenciación 1 21/10/2015 2 21/10/2015 Existen distintos niveles de potencial Células Madre Totipotentes Cualquier tipo celular Organismo completo Cigoto y primeros blastómeros Células Madre Pluripotentes Todos los tipos celulares No dan organismo completo Células Madre Multipotentes Rango limitado de tipos celulares Distribuidas en el tejido adulto 3 21/10/2015 Cómo obtener ESCs? Células Madre Embrionarias (ESCs) Sobre MEFs Sobre gelatina 4 21/10/2015 Análisis de expresión de genes marcadores propios de cada estadio Detección de proteínas inmunofluorescencia Detección de mRNA RT-PCR Diferenciación in vitro Formación de Cuerpos Embrioides ESCs Endodermo Ectodermo Mesodermo Dr. SHAJI R.V 5 21/10/2015 Diferenciación in vitro de CME Formación de Cuerpos Embrioides por Hanging Drop • Células cultivadas sobre gelatina • Medio de diferenciación: SIN LIF • Hanging Drops • Cultivo de EBs en suspensión • Cultivo de EBs en adherencia sobre gelatina Ariel Diferenciación in vitro Pluripotencia Método de hanging drop Cuerpo embrioide 6 21/10/2015 Diferenciación in vivo Formación de Teratomas CME Endodermo Ectodermo Mesodermo 7 21/10/2015 Diferenciación in vivo Ratones Quimera CME Endodermo Ectodermo Mesodermo Methods to Generate Chimeric Mice from Embryonic Stem Cells. Kun-Hsiung Lee Completementación tetraploide Arriba: quimera convencional Abajo: Completementación tetraploide. Las células del receptor 4N solo forman parte de los tejidos extraembrionarios, el embrión es formado completamente por las células pluripotentes inyectadas. 8 21/10/2015 Qué son? Tipos de células madre Por qué son importantes? En el blastocisto, las células del MCI dan origen a todo el organismo En algunos tejidos adultos como M.O., músculo y cerebro, poblaciones de CM somáticas generan reemplazos. Debido a sus propiedades regenerativas, ofrecen nuevos potenciales para tratamiento de enfermedades o lesiones (medicina regenerativa) 9 21/10/2015 • Células Madre Pluripotentes Inducidas (iPSCs) Células somáticas reprogramadas a entrar en un estado similar al de ESC por ser forzadas a expresar FT importantes para mantener el estado indiferenciado ("stemness") de ESCs. iPSCs de ratón en 2006 (Takahashi and Yamanaka) iPSCs humanas en 2007 (Takahashi et al. and Yu et al.). 10 21/10/2015 11 21/10/2015 8/06 7/07 11/07 Yamanaka 2007 12 21/10/2015 Gurdon 1962 MECANISMOS MOLECULARES importantes en células madre 13 21/10/2015 Oct4, Sox2 y Nanog los factores de transcripción que mantienen el estado indiferenciado 14 21/10/2015 CME Vías de transducción de señales que regulan la pluripotencia mESC hESC 15 21/10/2015 2i g, h, Diagrams of self-replication of the pluripotent state when inductive phospho-ERK signalling is either inhibited upstream by chemical antagonists (g) or counteracted downstream by LIF and BMP (h). Inhibition of GSK3 serves a key function in augmenting self-renewal when phospho-ERK (p-ERK) is suppressed by maintaining cellular growth capacity and additionally reinforcing suppression of neural commitment. Nature. 2008 May 22;453(7194):519-23. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Ying QL1, Wray J, Nichols J, Batlle-Morera L, Doble B, Woodgett J, Cohen P, Smith A ERK1 phosphorylates Nanog and inhibits Nanog transactivation. Phosphorylation of Nanog by ERK1 induces ES cell differentiation. Phosphorylation of Nanog by ERK1 decreases Nanog stability. Phosphorylation induces binding of FBXW8 (E3 ubiquitin ligase) with Nanog reducing Nanog protein stability. 16 21/10/2015 Las Células Madre y la regulación de la Cromatina Niveles de Organización de la Cromatina 17 21/10/2015 DNA metilation 18 21/10/2015 19 21/10/2015 Distintos niveles de regulación Epigenética Las células madre tienen un patrón epigenético único 20 21/10/2015 Marca inductora Marca represora Nanog SOX2 OCT4 Chromatin Remodeling related genes OCT4, SOX2 y NANOG co-regulan genes relacionados con el remodelado de la cromatina (SMARCAD1, MYS3, SET) 21 21/10/2015 Nanog Remodelers SOX2 OCT4 XXX OSN interactúan directa o indirectamente con complejos remodeladores de la cromatina. Nanog and Oct4 interact with NuRD (HDAC), polycomb group and SWI/SNF components. Remodelers OCT4, SOX2, Nanog Factores de Pluripotencia están regulados epigenéticamente Jmjd2c (histone demethylase) induces Nanog gene expression 22 21/10/2015 Algunas evidencias de la importancia del remodelado de la cromatina en la desdiferenciación 23 21/10/2015 24 21/10/2015 RNAs no codificantes miRNAs y lncRNAs 25 21/10/2015 ncRNAs Prostemness ncRNAs antistemness -miRNAs y lncRNAs regulados por oct, sox2, Nanog 26 21/10/2015 ncRNAs Prostemness ncRNAs antistemness - miRNAs con targets TF y PRC ncRNAs Prostemness ncRNAs antistemness - lncRNAs dirigen remodeladores, actúan como tituladores de TFs, miRNAs, factores de splicing, controlan transporte núcleo-citoplasma, etc.) 27 21/10/2015 miRNA pro-stemness - miR-302 inducido por Oct4 y Sox2 en células pluripotentes - reguladores de ciclo celular son blanco de miR-302 - Inhibición miR-302 : arresto ciclo celular en hESC miRNA anti-stemness -Oct4, Sox2 y Klf4 son blanco de miR-145 - miRNAs reprimido por Oct4 en hESCs 28 21/10/2015 miRNA pro-stemness MiR-495 expression displays a temporary decreasing during mESC differentiation. Function blockade of miR-495 increases mesendoderm lineage specification. Dnmt3a is proved to be a functional target of miR-495 in mESCs. MiR-495 suppresses mesendoderm differentiation via direct targeting of Dnmt3a. 29 21/10/2015 Inactivación del cromosoma X Y los telómeros? 30 21/10/2015 “telomeric chromatin is remodeled and telomeres are elongated by telomerase during nuclear reprogramming. These findings suggest that the structure of telomeric chromatin is dynamic and controlled by epigenetic programs associated with the differentiation potential of cells, which are reversed by reprogramming” 31 21/10/2015 32 21/10/2015 Qué más hay por acá? 33 21/10/2015 34 21/10/2015 [email protected] PARA QUE SE ESTAN UTILIZANDO TRATAMIENTOS CON CELULAS MADRE? - Progenitores Hematopoyéticos (enf. sangre, inmunológicas, post-trat. cáncer) - Implantes de tejidos (cels. Madre propias del tejido regeneran lesiones) 35 21/10/2015 36 21/10/2015 37 21/10/2015 “El solo hecho de que provengan de tu cuerpo no quiere decir que sean seguras” Contaminaciones pérdida de control de ciclo celular pérdida de capacidad de diferenciarse Riesgo en extracción e inyección (daño e infección) 38 21/10/2015 Qué faltaría para terapia con CM? -Identificar los mecanismos que les permiten proliferar sin diferenciarse. - Identificar las vías que deben ser activadas para dirigir la diferenciación. - Identificar estados intermedios para aislar y expandir progenitores. - Determinar que estados son óptimos para aplicaciones diferentes a las terapéuticas. 39 21/10/2015 - Proliferar extensamente y generar suficientes cantidades de tejido. - Diferenciarse hacia los tipos deseados de célula. - Sobrevivir en el huésped después de trasplante. - Integrarse al órgano luego del trasplante. - Funcionar apropiadamente para aumentar la sobrevida del huésped. - Evitar dañar el huésped. 40
